सिंगल-सेल ट्रांसक्रिपटॉमिक्स प्रारंभिक और चयनात्मक पोडोसाइट चोट के बाद बाधित किडनी फ़िल्टर सेल-सेल इंटरैक्शन का खुलासा करता है

परिणाम

Single-Cell Profiling of >29,000 ग्लोमेरुलर-समृद्ध किडनी कोशिकाएं

के लिए वर्तमान एकल-कोशिका प्रोटोकॉलपूरी किडनी की पहचान<2.5% glomerular cells,9 and although a शुद्ध ग्लोमेरुलर तैयारीचुंबकीय मोतियों का उपयोग इस आबादी को समृद्ध बनाता है,22 यह अन्य कोशिका को पकड़ने में विफल रहता हैगुर्दे के प्रकारयह रुचिकर हो सकता है। इन निष्कर्षों को विस्तारित करने और पोडोसाइट चोट से पहले और बाद में गुर्दे के पूरे सेलुलर परिदृश्य के संदर्भ में ग्लोमेरुलस के भीतर सेल-सेल इंटरैक्शन की विस्तृत समझ विकसित करने के लिए ग्लोमेरुली को समृद्ध करने और अतिरिक्त किडनी सेल प्रकारों को पकड़ने के लिए एक छलनी विधि का उपयोग किया गया था।

सेल प्रकार-विशिष्ट तरीके से पोडोसाइट एब्लेशन के प्रारंभिक ट्रांसक्रिप्शनल प्रभावों की पहचान करने के लिए, scRNAseq के साथ प्रदर्शन किया गया थागुर्दे का ऊतकडॉक्सीसाइक्लिन उपचार के 1 सप्ताह के बाद क्रमिक छनाई द्वारा एकत्र किए गए डब्ल्यूटी और आईसीटीसीएफपॉड / चूहों से (चित्र 1ए)। चार डब्ल्यूटी जानवरों (चार जैविक प्रतिकृति) और चार आईसीटीसीएफपॉड/जानवरों के गुर्दे के ऊतकों से फ़िल्टरिंग के बाद कुल 14,783 डब्ल्यूटी और 14,727 आईसीटीसीएफपॉड/कोशिकाएं प्राप्त हुईं (पूरक चित्र एस1, ए और बी; पूरक तालिकाएं एस1 और एस2)। यूएमआई की संख्या और माइटोकॉन्ड्रियल रीड्स के प्रतिशत के कारण प्रभावों को हटाने के लिए डेटा को सामान्य किया गया था। डब्ल्यूटी और आईसीटीसीएफपॉड/नमूनों के एकीकरण के बाद, नौ समूहों का पता लगाने के लिए क्लस्टरिंग के कम रिज़ॉल्यूशन का उपयोग किया गया था (चित्र 1बी)। डब्ल्यूटी और आईसीटीसीएफपॉड/नमूनों की जैविक प्रतिकृतियां सभी समूहों के बीच वितरित की गईं (पूरक चित्र एस2, एसी)। ग्लोमेरुलस के सभी प्रकार की कोशिकाओं, साथ ही अतिरिक्त किडनी कोशिका प्रकारों की पहचान स्थापित और डेटा-व्युत्पन्न मार्करों (चित्र 1C; पूरक तालिका S3; पूरक चित्र S3A) का उपयोग करके की गई थी।

ग्लोमेरुलर कोशिकाएं, सभी बरामद कोशिकाओं के कुल 82.1% का प्रतिनिधित्व करती हैं [36.9% पोडोसाइट्स, 42.1% ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं (जीईसी), 2.7% मेसेंजियल कोशिकाएं, और 0.36% पीईसी] को अलग और पुन: व्यवस्थित किया गया (चित्र 1डी) . पोडोसाइट्स के चार क्लस्टर, जीईसी के पांच क्लस्टर, और मेसेंजियल कोशिकाओं और पीईसी के एक-एक क्लस्टर, कैनोनिकल सेल-प्रकार मार्करों को व्यक्त करते हुए, पहचाने गए (चित्र 1ई; पूरक चित्र एस3बी)। डब्ल्यूटी और आईसीटीसीएफपॉड/नमूनों की जैविक प्रतिकृतियां सभी समूहों में वितरित की गईं (पूरक चित्र एस2, डीएफ; पूरक तालिका एस4)। जैसा कि अनुमान लगाया गया था, यह देखते हुए कि पोडोसाइट-विशिष्ट सीटीसीएफ विलोपन से 2 सप्ताह में हिस्टोलॉजिकल रूप से पता लगाने योग्य पोडोसाइट हानि होती है, 13 iCTCFpod / नमूनों में डब्ल्यूटी नमूनों की तुलना में पोडोसाइट्स का कम प्रतिशत होता है (चित्र 1F; पूरक तालिका S5)। iCTCFpod / नमूनों में WT नमूनों (पूरक तालिका S5) की तुलना में 13.1% कम पोडो साइटें, 11.9% अधिक GECs और 1.5% अधिक मेसेंजियल कोशिकाएं थीं। पीईसी ने योगदान दिया<1% to either of the iCTCFpod / or WT samples. This finding suggests that disruption of transcriptional programs critical for podocyte survival precedes histologically detectable podocyte injury and loss and highlights the power of scRNAseq in discerning subtle changes that can be missed by histologic analysis.

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पोडोसाइट-विशिष्ट प्रेरक सीटीसीएफ विलोपन से सभी ग्लोमेरुलर कोशिका प्रकारों में जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन होता है

iCTCFpod / और WT कोशिकाओं (पूरक तालिका S6) की तुलना करते हुए 11 समूहों में से प्रत्येक में विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषण किया गया था। यदि जीन किसी दिए गए क्लस्टर में कम से कम 1 {3 }}% कोशिकाओं में पाए जाते हैं, तो उन्हें अलग-अलग रूप से व्यक्त माना जाता है, जिसमें न्यूनतम निरपेक्ष लॉग फोल्ड परिवर्तन 0.1 और एक समायोजित पी <{7}} होता है। 05. Ctcf को चार पॉडोसाइट समूहों में से प्रत्येक में अलग-अलग रूप से व्यक्त किया गया था, क्रमशः 0.390, 0.189, 0.331 और 0.303 के औसत लॉग फोल्ड परिवर्तन के साथ। प्रत्येक क्लस्टर में कोशिकाओं की संख्या का नमूना लिया गया और 11 समूहों के बीच विभेदित रूप से व्यक्त जीन की संख्या की तुलना करने के लिए विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषण दोहराया गया। पोडोसाइट समूहों में सबसे अधिक भिन्न रूप से व्यक्त जीन थे, इसके बाद जीईसी -1 और जीईसी -2 (चित्र 1जी) थे। जीईसी के शेष तीन समूहों में, मेसेंजियल कोशिकाओं और पीईसी के साथ, बहुत कम विभेदित जीन थे (चित्रा 1जी), यह सुझाव देते हुए कि सभी ग्लोमेरुलर समूहों में से जीईसी -1 और जीईसी -2 सबसे अधिक प्रभावित थे। सीटीसीएफ विलोपन संचालित पोडोसाइट चोट के अनुक्रम द्वारा।

विशिष्ट पोडोसाइट और एंडोथेलियल सेल क्लस्टर में रोग-संबंधित जीन प्रोग्राम की पहचान की गई

इस अध्ययन में सबसे पहले यह जांचने की कोशिश की गई कि व्यक्तिगत पोडोसाइट क्लस्टर चोट पर कैसे प्रतिक्रिया करते हैं। चार पोडोसाइट समूहों में से प्रत्येक में विभेदित रूप से व्यक्त जीन के एक वेन आरेख से पता चला कि पोडोसाइट 1 में चार पोडोसाइट समूहों में सबसे विशिष्ट रूप से व्यक्त जीन थे (चित्रा 2 ए; पूरक तालिका एस 7)। यह अवलोकन कि चार पोडोसाइट समूहों में से एक अधिक प्रमुख रूप से प्रभावित था, पूर्व हिस्टोलॉजिक डेटा के अनुरूप है, जो दर्शाता है कि चोट लगने पर सभी पोडोसाइट समान गंभीरता से प्रभावित नहीं होते हैं और सेल राज्यों की विविधता को आणविक रूप से चिह्नित करने के लिए scRNAseq की शक्ति पर प्रकाश डालता है। समान कोशिका प्रकार.23

पोडोसाइट 1 क्लस्टर (पूरक तालिका S8) में CTCF हानि के परिणामस्वरूप समृद्ध जीन कार्यक्रमों की पहचान करने के लिए एक ओवररिप्रजेंटेशन विश्लेषण किया गया था। शीर्ष समृद्ध शब्दों को परस्पर अतिव्यापी जीन सेटों को क्लस्टर करने के लिए एक संवर्धन मानचित्र के साथ देखा गया था (चित्रा 2 बी)। समृद्ध शब्दों का एक प्रमुख समूह माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन था, जिसमें एटीपी संश्लेषण, माइटोकॉन्ड्रियल संगठन, इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला और ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरीेशन (चित्रा 2 बी) शामिल थे। ये डेटा पोडोसाइट चोट के संकेत के रूप में माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन की ओर इशारा करते हुए हाल के काम का विस्तार करते हैं। इसके अलावा, मानव आनुवंशिकी ने पोडोसाइट्स में माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों के महत्व की ओर इशारा किया है, जिसमें CoQ बायोसिंथेसिस मार्ग (PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ6,) में कई उत्परिवर्तन शामिल हैं। और एडीसीके4) जो मुख्य रूप से बच्चों में नेफ्रोटिक सिंड्रोम का कारण बनता है।25,26 इसलिए यह माना गया है कि पोडोसाइट माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन उन सभी बीमारियों से जुड़ी एक प्रमुख कोशिका स्थिति का प्रतिनिधित्व कर सकता है जो पोडोसाइट हानि से उत्पन्न होती हैं।24 डेटा इस धारणा के लिए एकल समर्थन प्रदान करता है -सेल रिज़ॉल्यूशन, सुझाव देता है कि माइटो चॉन्ड्रियल डिसफंक्शन पोडोसाइट्स की एक विशिष्ट आबादी में सबसे प्रारंभिक चोट की स्थिति का प्रतिनिधित्व कर सकता है, जिससे पोडोसाइट हानि हो सकती है।

पोडोसाइट 1 क्लस्टर (पूरक तालिका S8) में CTCF हानि के परिणामस्वरूप समृद्ध जीन कार्यक्रमों की पहचान करने के लिए एक ओवररिप्रजेंटेशन विश्लेषण किया गया था। शीर्ष समृद्ध शब्दों को परस्पर अतिव्यापी जीन सेटों को क्लस्टर करने के लिए एक संवर्धन मानचित्र के साथ देखा गया था (चित्रा 2 बी)। समृद्ध शब्दों का एक प्रमुख समूह माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन था, जिसमें एटीपी संश्लेषण, माइटोकॉन्ड्रियल संगठन, इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला और ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरीेशन (चित्रा 2 बी) शामिल थे। ये डेटा पोडोसाइट चोट के संकेत के रूप में माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन की ओर इशारा करते हुए हाल के काम का विस्तार करते हैं। इसके अलावा, मानव आनुवंशिकी ने पोडोसाइट्स में माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों के महत्व की ओर इशारा किया है, जिसमें CoQ बायोसिंथेसिस मार्ग (PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ6,) में कई उत्परिवर्तन शामिल हैं। और एडीसीके4) जो मुख्य रूप से बच्चों में नेफ्रोटिक सिंड्रोम का कारण बनता है।25,26 इसलिए यह माना गया है कि पोडोसाइट माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन उन सभी बीमारियों से जुड़ी एक प्रमुख कोशिका स्थिति का प्रतिनिधित्व कर सकता है जो पोडोसाइट हानि से उत्पन्न होती हैं।24 डेटा इस धारणा के लिए एकल समर्थन प्रदान करता है -सेल रिज़ॉल्यूशन, सुझाव देता है कि माइटो चॉन्ड्रियल डिसफंक्शन पोडोसाइट्स की एक विशिष्ट आबादी में सबसे प्रारंभिक चोट की स्थिति का प्रतिनिधित्व कर सकता है, जिससे पोडोसाइट हानि हो सकती है।

ओवररिप्रेजेंटेशन विश्लेषण (चित्रा 2 बी) से समृद्ध शब्दों के मुख्य समूहों में से एक साइटोस्केलेटल संगठन के साथ-साथ सेल-मैट्रिक्स आसंजन के लिए संबंधित एकल समृद्ध शब्द था। एक्टिन साइटोस्केलेटन पोडोसाइट्स की अनूठी और जटिल संरचना को बनाए रखने में एक आवश्यक भूमिका निभाता है, और जीबीएम के साथ आसंजन पोडोसाइट फ़ंक्शन के लिए आवश्यक है।27 परिपक्व फोकल आसंजनों में सैकड़ों प्रोटीन होते हैं जो एक्टिन साइटोस्केलेटन, री रिसेप्टर मैट्रिक्स बाइंडिंग, इंट्रासेल्युलर सिग्नल ट्रांसडक्शन को जोड़ते हैं। , और एक्टिन पोलीमराइजेशन। पोडोसाइट 1 में सबसे अधिक डाउन-रेगुलेटेड जीन में से एक Rhpn1 (पूरक चित्र S4A) था, जो पोडोसाइट साइटोस्केलेटन गतिशीलता स्थापित करने और पोडोसाइट फुट प्रक्रिया वास्तुकला को बनाए रखने के लिए एक आवश्यक घटक है। Arp2/3 जटिल घटक Arpc3, एक्टिन पोलीमराइजेशन का चालक है, पोडोसाइट 1 क्लस्टर में विनियमित किया गया था (चित्र 2C; पूरक चित्र S4B)। कॉम्प्लेक्स के एक अतिरिक्त घटक, Actr2 के लिए एक जीन को भी पोडोसाइट 1 और पोडोसाइट 4 दोनों में अपग्रेड किया गया था। इसके अलावा, वासल, जिसका प्रोटीन उत्पाद, N-WASP, Arp2/3 कॉम्प्लेक्स को सक्रिय करता है और रखरखाव के लिए आवश्यक है विवो29 में पोडोसाइट फ़ुट प्रक्रियाओं को पोडोसाइट 1, पोडोसाइट 3 और पोडोसाइट 4 में भी अप-विनियमित किया गया था। साइटोस्केलेटल रेगुलेटर अर्घडिया, जिसका विलोपन चूहों में नेफ्रोटिक सिन ड्रोम से जुड़ा हुआ है, 30 को पोडोसाइट 1 में डाउन-रेगुलेट किया गया था (चित्र) 2सी). दो Rho GTPases के अभिव्यक्ति स्तर

चित्र 3 पोडोसाइट क्लस्टर Col4a5 को नियंत्रित करता है। ए: वाइल्ड-टाइप (डब्ल्यूटी) पोडोसाइट 1 कोशिकाओं की तुलना में इंड्यूसिबल पोडोसाइट-विशिष्ट सीटीसीएफ विलोपन (iCTCFpod /) पोडोसाइट 1 कोशिकाओं में Col4a5 को काफी हद तक विनियमित किया गया था। कोलेजन प्रकार IV ɑ5 (COL4A5) रिसेप्टर्स को मेसेंजियल कोशिकाओं और ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल सेल (जीईसी) उपसमूहों 1 से 4 में दृढ़ता से व्यक्त किया गया था। एरोहेड का आकार रिसेप्टर की सापेक्ष अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करता है। बी: संकरण श्रृंखला प्रतिक्रिया (एचसीआर) की मात्रा का ठहराव। Col4a5 को iCTCFpod / Nphs2-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में WT Nphs{{20}}व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की तुलना में काफी हद तक विनियमित किया गया था। चार WT और चार iCTCFpod/चूहों का मूल्यांकन किया गया। तीन छवियों से सभी ग्लोमेरुली की मात्रा निर्धारित की गई। C: HCR द्वारा मूल्यांकन के अनुसार WT और iCTCFpod / जानवरों के ग्लोमेरुली में Col4a5 अभिव्यक्ति। *पी <0.0001 (वेल्च सुधार के साथ दो-पूंछ वाला टी-परीक्षण)। मूल आवर्धन, 40; 63 (बॉक्सिंग क्षेत्रों का विस्तार) (सी)। स्केल बार्स Z 50 मिमी (सी)। आईएफआई, इम्यूनोफ्लोरेसेंट इमेजिंग।

GEC-1 and GEC-2 had nearly as many differentially expressed genes as podocyte clusters 2 to 4, whereas the remaining GEC clusters, mesangial cells, and PECs had fewer differentially expressed genes. Therefore, these two endothelial clusters were most affected by podocyte injury. GEC-1 expressed >600 विशिष्ट रूप से भिन्न रूप से व्यक्त जीन (पूरक चित्र S6A; पूरक तालिका S9)। अधिक प्रतिनिधित्व विश्लेषण से संकेत मिलता है कि जीईसी में विशिष्ट रूप से भिन्न रूप से व्यक्त जीन को कोशिका प्रवासन और आसंजन (पूरक चित्र एस6, बी और सी; पूरक तालिका एस10) के लिए जीन कार्यक्रमों में समृद्ध किया गया था। इन एना लाइसेस ने पॉडोसाइट चोट की प्रतिक्रिया के रूप में जीईसी में होने वाले शुरुआती ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों का खुलासा किया।

मॉडलिंग इंटरसेलुलर कम्युनिकेशन से प्रारंभिक पोडोसाइट चोट के जवाब में सेल प्रकारों के बीच महत्वपूर्ण इंटरैक्शन का पता चलता है

कई अलग-अलग सेल समूहों में बाधित जीन कार्यक्रमों की पहचान करने के बाद, अध्ययन ने यह समझने की कोशिश की कि ग्लोमेरुलर सेल-सेल क्रॉसस्टॉक पॉडोसाइट चोट से कैसे प्रभावित था। अध्ययन ने सबसे पहले पोडोसाइट, जीईसी और मेसेंजियल सेल क्लस्टर में अलग-अलग रूप से व्यक्त जीन की सूची की जांच की। दो प्रमुख ऑटोक्राइन प्रोसर्वाइवल लिगेंड्स, वेजफा और पीडीजीएफबी की अभिव्यक्ति, साथ ही पीडीजीएफबी रिसेप्टर, पीडीजीएफआरबी की अभिव्यक्ति बाधित हो गई थी (पूरक तालिका एस 6)। सभी पोडोसाइट समूहों में वेजफ़ा अभिव्यक्ति कम हो गई थी (अर्थात लॉग फोल्ड परिवर्तन 0.034 और 0.149 के बीच)। इसके विपरीत, सभी जीईसी समूहों में पीडीजीएफबी की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई थी (मीन लॉग फोल्ड परिवर्तन 0 के बीच। 031 और 0.140), और रिसेप्टर पीडीजीएफआरबी को मेसेंजियल कोशिकाओं में अप-विनियमित किया गया था (मीन लॉग फोल्ड परिवर्तन) 0.155). इस विश्लेषण से पता चला कि पोडोसाइट की चोट से प्रोसर्वाइवल लिगैंड वेग्फा की अभिव्यक्ति में कमी आती है, जो जीईसी को नकारात्मक रूप से प्रभावित करती है। क्षतिपूर्ति करने के लिए, जीईसी प्रोसर्वाइवल लिगैंड पीडीजीएफबी को विनियमित कर सकते हैं, जिससे रिसेप्टर पीडीजीएफआरबी को विनियमित करने के लिए मेसेंजियल कोशिकाएं ट्रिगर हो सकती हैं।

NicheNet, एक नया एल्गोरिदम जो यह अनुमान लगाता है कि अभिव्यक्ति डेटा से प्राप्त लिगैंड रिसेप्टर इंटरैक्शन सिग्नलिंग और नियामक नेटवर्क के पहले से मौजूद ज्ञान को एकीकृत करके विशिष्ट लक्ष्यों को कैसे प्रभावित कर सकता है, इसका उपयोग लिगैंड-रिसेप्टर इंटरैक्शन और उनके अनुमानित लक्ष्य जीन की अधिक गहराई से जांच करने के लिए किया गया था।20 NicheNet को लागू किया गया था पोडोसाइट्स और जीईसी के साथ-साथ मेसैन जियाल कोशिकाओं और जीईसी के बीच बातचीत में मॉडल जो संभावित रूप से पोडोसाइट चोट (चित्रा 4 ए) की सेटिंग में जीईसी में विभेदित रूप से व्यक्त जीन (लक्ष्य जीन) को प्रेरित कर सकता है। इस विश्लेषण के लिए, प्रत्येक कोशिका प्रकार के सभी समूहों को एक एकल क्लस्टर में संयोजित किया गया था। मेसेंजियल कोशिकाओं और/या पोडोसाइट्स द्वारा व्यक्त शीर्ष अनुमानित लिगैंड प्लियोट्रोफिन (पीटीएन), एंजियोपोइटिन 2 (एंग्प्ट2), कोल4ए1, संवहनी कोशिका आसंजन अणु 1, हड्डी मोर्फोजेनेटिक प्रोटीन 4 (बीएमपी4), एफ्रिन बी1, संयोजी ऊतक विकास कारक और सेमाफोरिंग थे। 3ई (सेमा3ई) (चित्र 4बी)। जीईसी रिसेप्टर्स का अभिव्यक्ति पैटर्न जिसके माध्यम से ये लिगैंड कार्य करने के लिए जाने जाते हैं, लिगैंड गतिविधि विश्लेषण के बगल में मैप किए गए थे। इसके अलावा, पूर्वानुमानित लक्ष्य जीन जिन्हें WT नियंत्रणों की तुलना में iCTCFpod / GECs में भिन्न रूप से व्यक्त किया गया था, उन्हें भी मैप किया गया था। चित्र 4बी के परिणामों को चित्र 4, सी और डी में वृत्ताकार भूखंडों के रूप में संक्षेपित किया गया है।

इस विश्लेषण से कई लिगेंड, रिसेप्टर्स और लक्ष्य जीन उल्लेखनीय थे। प्लियोट्रोफ़िन, एक लिगैंड जो मेसेंजियल कोशिकाओं में अत्यधिक अभिव्यक्त होता है (चित्र 4B), एक स्रावित वृद्धि कारक है जो प्रोटीन टायरोसिन फॉस्फेट रिसेप्टर प्रकार बी को बांध और बाधित कर सकता है, बढ़े हुए टेक (Tie2)/Angpt137 और Kdr (Vegfr2)/Vegfa38 के माध्यम से एंडोथेलियल सेल प्रवासन को उत्तेजित कर सकता है। संकेतन. तदनुसार, टेक को जीईसी में काफी हद तक विनियमित किया गया था (चित्र 4बी)। Angpt2, जो मेसेंजियल कोशिकाओं में अत्यधिक अभिव्यक्त होता है, Tek का एक विरोधी लिगैंड है, जो Angpt1.39 के बंधन को रोकता है क्योंकि Angpt1 सिग्नलिंग को पोडोसाइट अस्तित्व को बढ़ावा देने के लिए जाना जाता है और Angpt1/Angpt2 अनुपात का विघटन DKD के विकास में योगदान देता है,40 यह लिगैंड रिसेप्टर विश्लेषण जीईसी में घातक टेक सिग्नलिंग को पोडोसाइट चोट के शुरुआती परिणामों में से एक के रूप में इंगित करता हुआ प्रतीत हुआ

इस अध्ययन में कई ग्लोमेरुलर कोशिकाओं में टाइप IV कोलेजन अभिव्यक्ति में प्रमुख परिवर्तन भी पाए गए (चित्रा 4बी)। आम तौर पर स्वस्थ पोडोसाइट्स द्वारा उत्पादित, कोलेजन IV हेट इरोट्रिमर्स ग्लोमेरुलर विकास के दौरान ɑ1ɑ1ɑ2 से ɑ3ɑ4ɑ5 तक संक्रमण करते हैं, जो उचित जीबीएम गठन और कार्य के लिए आवश्यक है। 33,34 मेसेंजियल मैट्रिक्स के विस्तार के साथ-साथ Col4a1 का अप-विनियमन अक्सर देखा जाता है। DKD.41,42 वर्तमान विश्लेषण में, Col4a1 को मेसेंजियल कोशिकाओं और GECs (लिगैंड हीटमैप की औसत अभिव्यक्ति) (चित्र 4B) दोनों द्वारा व्यक्त किया गया था और WT नियंत्रणों की तुलना में iCTCFpod / GECs में विशेष रूप से अप-विनियमित किया गया था। इन आंकड़ों से पता चलता है कि जीईसी पॉडोसाइट चोट की स्थिति में Col4a1 को विनियमित करते हैं, जिससे कठोर, फ़ाइब्रोटिक जीबीएम हो सकता है जो सेगमेंटल स्केलेरोसिस के विकास में योगदान देता है।33

Bmp4 NicheNet विश्लेषण (चित्र 4, BD) द्वारा पहचाना गया एक अत्यधिक व्यक्त मेसेंजियल लिगैंड था। बीएमपी गुर्दे के विकास और बीमारी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।43 बीएमपी4 चूहों में मधुमेह अपवृक्कता की सेटिंग में अप-विनियमित होता है,42 और एक एंटी-बीएमपी4 एंटीबॉडी के साथ मधुमेह वाले चूहों का इलाज कोल4ए1 और मेसेंजियल मैट्रिक्स विस्तार के अप-नियमन को रोकता है। .44 विशेष रूप से रुचिकर, मेसेंजियल बीएमपी4 को जीईसी स्मैड6 अभिव्यक्ति (चित्र 4बी) को ट्रिगर करने के लिए पाया गया। Smad6 की अभिव्यक्ति BMPs से प्रेरित है और एक नकारात्मक फीडबैक लूप में, Smad6 विशेष रूप से BMPs को रोकता है, जिसमें BMP4.45 भी शामिल है Smad6 को WT नियंत्रणों की तुलना में iCTCFpod / GECs में डाउन-रेगुलेट किया गया था, जो पोडोसाइट चोट की सेटिंग में एंडोथेलियल कोशिकाओं में बढ़े हुए BMP सिग्नलिंग का सुझाव देता है। .

पोडोसाइट्स में पहचाने गए प्राथमिकता वाले लिगेंड्स में से एक Sema3e (चित्रा 4, बीडी) था। क्लास 3 सेमाफोरिन स्रावित प्रोटीन होते हैं जो विभिन्न प्रकार की जैविक प्रक्रियाओं में कार्य करते हैं, जिनमें एंजियोजेनेसिस, लिम्फैंगियोजेनेसिस और रोग शामिल हैं। 46 सेमा 3 ए को मानव डीकेडी, 47 में विनियमित किया जाता है और सेमा 3 जी को हाल ही में एक पोडोसाइट-विशिष्ट जीन के रूप में पहचाना गया था जो पोडोसाइट्स को सूजन से बचाता है। विवो में। 48 पोडोसाइट में Sema3e की भूमिका अस्पष्ट बनी हुई है। वर्तमान विश्लेषण से पहले से अज्ञात रिसेप्टर-लिगैंड जोड़ी का पता चला है, जिससे पोडोसाइट सेमा3ई जीईसी पर plexinD1 के साथ बातचीत करके पोडोसाइट चोट की सेटिंग में कई डाउनस्ट्रीम जीन लक्ष्यों को ट्रिगर करता है (चित्रा 4, सी और डी)।

कई नए पहचाने गए GEC लक्ष्य जीनों में से, Hes1 और Cx3cl1 भी GEC -1 (चित्र 4, BD; पूरक चित्र S6) में समृद्ध आसंजन जीन कार्यक्रमों में पाए गए। Hes1 नॉच सिग्नलिंग का एक लक्ष्य है, जो विकासशील किडनी में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, लेकिन पुनर्सक्रियन से फाइब्रोसिस हो सकता है। Cx3cl1 एक केमोकाइन है जो मुख्य रूप से ग्लोमेरुलर एंडोथेलियम द्वारा निर्मित होता है जो अपने रिसेप्टर, Cx3cr1 के लिए एक कीमोआट्रैक्टेंट और आसंजन अणु के रूप में कार्य करता है। मोनोन्यूक्लियर और सर्कुलेटरी लिम्फैटिक ल्यूकोसाइट्स पर सर्वव्यापी रूप से व्यक्त किया गया है। 50 Cx3cl1 को इसमें फंसाया गया हैगुर्दे की विभिन्न बीमारियाँ, शामिलडीकेडी, IgA नेफ्रोपैथी, और ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस.50 Hes1 और Cx3cl1 दोनों को WT नियंत्रणों की तुलना में iCTCFpod / GECs में अप-विनियमित किया गया था, यह सुझाव देते हुए कि GECs प्रोइन्फ्लेमेटरी और प्रोफाइब्रोसिस कार्यक्रमों को अप-विनियमित करके पोडोसाइट चोट का जवाब देते हैं।

अंत में, क्योंकि निकेनेट विश्लेषण में पहचाने गए कई लिगेंड और लक्ष्य डीकेडी में शामिल हैं, कृंतक मॉडल के साथ-साथ मनुष्यों दोनों में, डेटा सेट की तुलना प्रारंभिक मानव डीकेडी के एकल नाभिक ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा सेट से की गई थी।10 एक विशिष्ट तुलना मानव और माउस कोशिका समूहों के बीच विभेदित रूप से व्यक्त जीन की की गई थी। मानव डीकेडी जीईसी में 138 विभेदित रूप से व्यक्त जीनों में से, 25 जीनों की पहचान माउस iCTCFpod / एंडोथेलियल कोशिकाओं में भी की गई, जिनमें Col4a1 (पूरक चित्र S7; पूरक तालिका S11) भी शामिल है। साथ में, इन परिणामों से पता चलता है कि मानव डीकेडी में अक्सर बाधित होने वाले एंडोथेलियल सेल कार्यक्रमों को चयनात्मक पोडोसाइट एब्लेशन के माध्यम से प्रारंभिक ग्लोमेरुलर चोट के माउस मॉडल में आंशिक रूप से पुन: उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, इन परिणामों से पता चलता है कि, पोडोसाइट्स के अलावा, जटिल और अत्यधिक की प्रगति को रोकने या धीमा करने के लिए संभावित एंडोथेलियल विशिष्ट लक्ष्य और चिकित्सीय रणनीतियाँ हो सकती हैं।प्रचलित गुर्दे की बीमारियाँ, जैसे किडीकेडी.