ग्लूकोकोर्टिकॉइड-प्रेरित चूहे मॉडल में सिस्टांच डेजर्टिकोला और इसके चावल वाइन स्टीमिंग उत्पादों के न्यूरोएंडोक्राइन-प्रतिरक्षा कार्य पर अध्ययन-Ⅰ

1 परिचय

सिस्टान्चे डेज़र्टिकोलाजिसे "रेगिस्तानी जिनसेंग" कहा जाता है, एक पारंपरिक चीनी दवा है जिसका उपयोग सदियों से यांग-टॉनिक जड़ी बूटी के रूप में किया जाता रहा है।गुर्दे को सक्रिय करना और यांग को मजबूत करना[1] आठ प्रजातियाँ और एक भिन्नतासिस्टैंचे हर्बा चीन में दर्ज किया गया है और केवलसिस्टान्चे डेज़र्टिकोलावाईसी मा औरसिस्टान्चे टुबुलोसा(शेंक) वाइट के औषधीय गुणों को चीनी फार्माकोपिया [2] में दर्ज किया गया है। औषधीय अध्ययनों से पता चला है किसिस्टेन्चेस हर्बान्यूरोप्रोटेक्टिव [3], इम्यूनोमॉडुलेटरी [4], कार्डियोप्रोटेक्टिव [5], एंटीफैटीग [6], एंटी-इंफ्लेमेटरी [7], हेपेटोप्रोटेक्टिव [8], एंटीऑक्सीडेंट [9], एंटीबैक्टीरियल [10], रेचक [11], और एंटीट्यूमर प्रभाव [12] प्रदर्शित किए।इस जीनस की रिपोर्ट की गई जैविक गतिविधियों के स्पेक्ट्रम को इसकी जटिल और विविध फाइटोकेमिकल संरचना के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है।सिस्टान्चे डेज़र्टिकोलाइसमें फेनिलएथेनॉल ग्लाइकोसाइड, इरिडोइड्स, पॉलीसेकेराइड [13] आदि शामिल हैं। मूल औषधीय सामग्रियों में फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड की सामग्री सबसे अधिक है [14]।

गुर्दे को सक्रिय करने के लिए प्राकृतिक सिस्टान्चे ट्यूबुलोसा PHGS75% ECH 30% ACT 12%

चीनी मटेरिया मेडिका (सीएमएम) का प्रसंस्करण पारंपरिक चीनी चिकित्सा सिद्धांत के अनुसार उपचार, वितरण और तैयारी के लिए विभिन्न आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए एक पारंपरिक दवा तकनीक है। उन प्रसंस्कृत उत्पादों को काढ़े के टुकड़े कहा जाता है, जिनका उपयोग क्लीनिकों में किया जाता है। प्रसंस्करण का उद्देश्य कच्ची दवाओं की विषाक्तता को कम करने के लिए प्रभावकारिता को बढ़ाना है। 2015 चीनी फार्माकोपिया ने दर्ज किया कि सिस्टांचे के मोटे स्लाइस (सीडी) और चावल की शराब-स्टीम्ड सिस्टांचे (डब्ल्यूसीडी) को क्लिनिक में काढ़े के टुकड़ों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। हमारे शोध समूह ने दिखाया कि सिस्टांचे को चावल की शराब के साथ भाप में पकाने के बाद रेचक प्रभाव से राहत मिली और एंटीएजिंग और किडनी-यांग स्फूर्तिदायक प्रभाव बढ़ा। [15]

हाइपोथैलेमस-पिट्यूटरी-एड्रेनल ग्रंथि-थाइमस ग्रंथि (एचपीएटी) अक्ष का कार्य किडनी-यांग की कमी सिंड्रोम में अव्यवस्थित है [16]। किडनी-यांग की कमी वाले रोगियों में व्यापक प्रतिरक्षा शिथिलता भी होती है। एचपीए अक्ष की शिथिलता इम्यूनोडेफिशिएंसी से बहुत करीब से संबंधित है। न्यूरोएंडोक्राइन-इम्यून नेटवर्क (एनईआई) सिद्धांत से पता चलता है कि प्रतिरक्षा और न्यूरोएंडोक्राइन सिस्टम कई लिगैंड और रिसेप्टर्स साझा करते हैं [17], और हाइपोथैलेमस को न्यूरोएंडोक्राइन को प्रतिरक्षा प्रणालियों से जोड़ने के लिए धुरी माना जाता है।

इस अध्ययन में, हमने बहिर्जात कॉर्टिकोस्टेरॉइड इंजेक्शन के साथ मॉडल चूहों में किडनी-यांग की कमी को दोहराया और अंतःस्रावी-प्रतिरक्षा कार्य के परिप्रेक्ष्य से सिस्टांच डेज़र्टिकोला के विभिन्न प्रसंस्कृत उत्पादों की प्रतिक्रिया में किडनी-यांग की कमी के तंत्र की खोज की।

2। सामग्री और विधि

2.1. सामग्री और अभिकर्मक

2019 में अलाशान नीमेंगु से सिस्टैंचे डेज़र्टिकोला एकत्र किया गया था और प्रोफेसर यानजुन झाई (स्कूल ऑफ फ़ार्मेसी, लिओनिंग यूनिवर्सिटी ऑफ़ ट्रेडिशनल चाइनीज़ मेडिसिन, चीन) द्वारा सिस्टैंचे डेज़र्टिकोला वाईसी मा के सूखे मांसल तने के रूप में पहचाना गया था। वाउचर नमूनों को लिओनिंग प्रोसेसिंग इंजीनियरिंग टेक्नोलॉजी सेंटर में संरक्षित किया गया था।

एजुगोल के मानक यौगिक चेंग्दू प्योर केम-स्टैंडर्ड कंपनी लिमिटेड (चेंग्दू, चीन) से खरीदे गए; सिस्टानोसाइड एफ,इचिनाकोसाइड, सिस्टानोसाइड ए, और आइसोएक्टोसाइडमस्ट कंपनी (सिचुआन चीन) से खरीदे गए; एक्टियोसाइड डालियान माइलुन बायो. कंपनी लिमिटेड (डालियान, चीन) से खरीदा गया। एमएस-ग्रेड एसिटोनाइट्राइल और मेथनॉल मर्क केजीएए (डार्मस्टाट, जर्मनी) से खरीदे गए। एचपीएलसी-ग्रेड फॉर्मिक एसिड मर्क केजीएए (डार्मस्टाट, जर्मनी) से खरीदा गया। राइस वाइन झेजियांग ब्रांड टॉवर शाओक्सिंग वाइन कंपनी लिमिटेड (झेजियांग, चीन) से खरीदी गई।

कॉर्टिकोस्टेरोन (CAS: 50-22-6, शुद्धता > 98%, TCI शंघाई विकास लिमिटेड कंपनी), चिंकुई शिन च्यूआन गोलियां (बीजिंग टोंगरेनटैंग प्रौद्योगिकी विकास कंपनी लिमिटेड), चूहा ACTH, CRH, T, IL-6, IFN-c, TNF-, IL-2, और IL-10 ELISA जांच किट नानजिंग जियानचेंग कंपनी लिमिटेड से खरीदी गई थी। चूहा कोर्टिसोल ELISA किट BOSK कंपनी द्वारा प्रदान की गई थी, चूहा CD4 एंटीबॉडी, CD8a एंटीबॉडी (सं. 561833 और 559976), RBC लाइसेट (सोलरबायो, R1010), PBS बफर समाधान (सोलरबायो, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM, और -एक्टिन अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम प्राइमर गुआंगज़ौ इंविट्रोजन कंपनी रिवर्स द्वारा प्रदान किए गए थे ट्रांसक्रिप्शन किट (सं. RR037A) और cDNA संश्लेषण किट (सं. 10000068167) बोले लाइफ मेडिसिन प्रोडक्ट्स (शंघाई) कंपनी लिमिटेड द्वारा प्रदान किए गए थे। क्लोरोफॉर्म, आइसोप्रोपेनॉल, 75% इथेनॉल और यूरेथेन घोल सभी विश्लेषणात्मक रूप से शुद्ध थे और सिनोफार्म केमिकल रिएजेंट कंपनी लिमिटेड द्वारा उत्पादित किए गए थे। अल्ट्रा-शुद्ध पानी मिलि-क्यू सिस्टम (18.2 MΩ, मिलिपोर, MA, USA) द्वारा उत्पादित किया गया था।

2.2. प्रायोगिक उपकरण

एक एंजाइम मार्कर (थर्मो, मॉडल 3530911931), स्वचालित प्लेट वॉशर (मॉडल एचबीएस- 4009), डिजिटल डिस्प्ले पुश-पुल फोर्स मीटर (मॉडल विक्टर- 50एन), हाई-स्पीड फ्रीजिंग सेंट्रीफ्यूज (मॉडल सिग्मा 3k15), अल्ट्रामाइक्रो स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (मॉडल बी-50क्यू), जीन एम्पलीफायर (मॉडल एल96जी), रियल-टाइम फ्लोरोसेंस क्वांटिटेटिव पीसीआर (मॉडल स्टेपवन), फ्लो साइटोमीटर (मॉडल एसी66051710132), पैराफिन माइक्रोटोम (मॉडल लाइका), माइक्रोस्कोप (ओलंपस, मॉडल बीएस-53), और एक शुद्ध जल उपकरण (मॉडल एफ7जेए36507) का उपयोग किया गया।

2.3. यूपीएलसी-क्यू-टीओएफ-एमएस और औषधीय प्रयोगों के लिए नमूनों की तैयारी

WCD को उसी बैच से संसाधित किया गया थासिस्टान्चे डेज़र्टिकोलाहमारी प्रयोगशाला में। WCD की तैयारी के लिए, सूखे CD के टुकड़ों (5 मिमी मोटे) (100 ग्राम) को चावल की शराब (30 एमएल) के साथ डाला गया, 4 घंटे के लिए उच्च दबाव (1.25 kPa) पर भाप में पकाया गया और फिर 55 डिग्री पर सुखाया गया।

सीडी और डब्ल्यूसीडी के मोटे पाउडर को 0.5 घंटे के लिए 10 गुना 95% इथेनॉल में भिगोया गया, 1 घंटे के लिए हर बार 3 बार रिफ्लक्स-एक्सट्रैक्ट किया गया, और फ़िल्टर किया गया, और 3 बार फ़िल्टर किए गए मिश्रण को मिलाया गया। इथेनॉल को कम दबाव में निकाला गया, और प्रशासन के लिए अर्क प्राप्त किया गया। अर्क (1 एमएल) को 50% मेथनॉल में मिलाया गया, जिससे कुल मात्रा 20 एमएल हो गई, और सामग्री विश्लेषण के लिए 4 डिग्री पर संग्रहीत किया गया।

यौन क्रिया में सुधार के लिए प्राकृतिक सिस्टान्चे ट्यूबुलोसा PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.4. सीडी और डब्ल्यूसीडी अर्क के विश्लेषण के लिए यूपीएलसी-क्यूक्यूक्यू-एमएस शर्तें

2.4.1. LCThMS विश्लेषणात्मक शर्तें

डेटा अधिग्रहण और प्रसंस्करण करने के लिए मैसलिंक्स 4.1 एनालिस्ट सॉफ़्टवेयर के साथ UPLC-MSThMS सिस्टम का उपयोग किया गया था। विश्लेषणात्मक स्तंभ 40 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर एक एक्विटी UPLC BEH C18 (1{{10}}0 मिमी × 2.1 मिमी, 1.7 माइक्रोन) था। मोबाइल चरण 0.1% फॉर्मिक एसिड जलीय घोल (ए) और 0.1% फॉर्मिक एसिड युक्त एसिटोनाइट्राइल (बी) था। 3% बी के साथ रिल्यूशन ग्रेडिएंट 0.00–1.00 मिनट था, 3%–11.5% बी के साथ 1.01–2.00 मिनट, 12% बी के साथ 2.01–3.00 मिनट, 15% बी के साथ 3.01–4.00 मिनट, 20% बी के साथ 4.01–5.00 मिनट, 22% बी के साथ 5.01–6.00 मिनट, 25% बी के साथ 6.01–8.00 मिनट और 10% बी के साथ 8.01–9.00 मिनट था। प्रवाह दर 0.3 एमएलटीएच मिनट थी और इंजेक्शन की मात्रा 1.0 μL थी।

इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) स्रोत से सुसज्जित वाटर्स ट्रिपल क्वाड्रुपल मास स्पेक्ट्रोमीटर (ज़ेवो टीक्यूडी, वाटर्स कॉर्प, मिलफ़ोर्ड, एमए, यूएसए) का उपयोग नकारात्मक आयन मोड में किया गया था। 250 डिग्री के तापमान पर 500 LThh की प्रवाह दर के साथ विलवणीकरण गैस नाइट्रोजन थी। सभी पता लगाए गए यौगिकों को मल्टीपल रिएक्शन मॉनिटरिंग (MRM) मोड में मापा गया; तालिका 1 ऊर्जा मापदंडों को दिखाती है, और तालिका 2 विश्लेषण किए गए घटकों के लिए अंशांकन वक्र दिखाती है।

2.4.2. संदर्भ पदार्थों की तैयारी

ट्यूबुलोसाइड ए (3.02 मिलीग्राम), इचिनाकोसाइड (3.00 मिलीग्राम), 2'-एसिटाइलेक्टियोसाइड (2.34 मिलीग्राम), एक्टियोसाइड (2.45 मिलीग्राम), आइसोएक्टियोसाइड (0.61 मिलीग्राम), सिस्टेनोसाइड एफ (2.14 मिलीग्राम), सैलिड्रोसाइड (3.39 मिलीग्राम), जीनिपोसिडिक एसिड (2.84 मिलीग्राम), एजुगोल (1.58 मिलीग्राम), और कैटलपोल (2.39 मिलीग्राम) को मेथनॉल में घोलकर स्टॉक घोल तैयार किया गया। मानक घोल के लिए उपयुक्त सांद्रता प्राप्त करने के लिए स्टॉक घोल को मेथनॉल से पतला किया गया। उपयोग से पहले सभी तैयार घोलों को 4 डिग्री पर संग्रहीत किया गया।

2.5. पशु मॉडल की तैयारी और समूहीकरण

एसडी नर चूहे (180-220 ग्राम) लिओनिंग चांगशेंग बायोटेक्नोलॉजिकल कंपनी से खरीदे गए, पशु परमिट संख्या: एससीएक्सके (लियाओ) 2015-0001। सभी चूहों को 25 डिग्री और 30-50% की सापेक्ष आर्द्रता पर भोजन और पानी की मुफ्त पहुँच के साथ रखा गया था। प्रयोगों से पहले जानवरों को 7 दिनों के लिए घर में रखा गया था।

सौ चूहों को यादृच्छिक रूप से 10 समूहों में विभाजित किया गया: ब्लैंक कंट्रोल (BC) समूह, मॉडल कंट्रोल (MC) समूह, सकारात्मक नियंत्रण (PC) समूह, राइस वाइन कंट्रोल (WC) समूह, CD उच्च खुराक (CD-HD) समूह, CD मध्यम खुराक (CD-MD) समूह, CD कम खुराक (CD-LD) समूह, WCD उच्च खुराक (WCD-HD) समूह, WCD मध्यम खुराक (WCD-MD) समूह, और WCD कम खुराक (WCD-LD) समूह। CD-HDThWCD-HD, CD-MDTh WCD-MD, और CD-LDThWCD-LD की खुराक क्रमशः 5.48 gTh(kg ∙ d), 2.74 gTh (kg ∙ d), और 1.37 gTh(kg ∙ d) थी। पीसी समूह के लिए खुराक 1.646 gTh(kg ∙ d) थी, और WC समूह के लिए, 40 दिनों के लिए 1 mLTh100 g थी। प्रशासन के 6वें दिन, चूहों को कोर्टिकोस्टेरोन जल निलंबन (कोर्टिकोस्टेरोन + 0.1% डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड + 0.1% ट्वीन-80 + 0.9% सोडियम क्लोराइड) के साथ चमड़े के नीचे इंजेक्शन लगाया गया, सिवाय BC समूह [18] के। कोर्टिकोस्टेरोन की सांद्रता 5 gThL थी, और खुराक 0.1 mLTh100 g थी। BC समूह के चूहों को उसी खुराक पर इंजेक्शन द्वारा सामान्य खारा + 0.1% डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड + 0.1% ट्वीन- 80 + 0.9% सोडियम क्लोराइड दिया गया।

2.6. एचपीए अक्ष कार्यों का निर्धारण

2.6.1. वजन, तापमान और धारण शक्ति परीक्षण

प्रयोग के दौरान हर 3 दिन में वजन परीक्षण किया गया और हर 6 दिन में तापमान लिया गया। 39वें दिन, पिछले अंग की अधिकतम शक्ति को ग्रिप मीटर द्वारा मापा गया। चूहों को चिकने प्लेटफॉर्म पर रखा गया, जिससे उनका पिछला अंग पोल को पकड़ सके। जब पूंछ खींची जाती है तो चूहे सहज रूप से किसी भी वस्तु को पकड़ लेते हैं ताकि पीछे की ओर बढ़ने से रोका जा सके जब तक कि खींचने वाला बल पकड़ से अधिक न हो जाए। जब चूहे की पकड़ ढीली हो जाती है, तो प्रीएम्पलीफायर स्वचालित रूप से अधिकतम पकड़ बल रिकॉर्ड कर सकता है।

2.6.2. सीरम में टी, सीआरएच, एसीटीएच, कॉर्ट और कोर्टिसोल के स्तर का निर्धारण

अंतिम प्रशासन के एक घंटे बाद, चूहों को यूरेथेन समाधान (20 gTh100 mL) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा बेहोश कर दिया गया। फिर, रक्त के नमूने एकत्र किए गए, सीरम प्राप्त करने के लिए 15 मिनट के लिए 3500 आर पर सेंट्रीफ्यूज किया गया, और -20 डिग्री पर संग्रहीत किया गया। निर्माता के निर्देशों के अनुसार चूहे एलिसा किट के साथ टी, सीआरएच, एसीटीएच, कॉर्ट और कोर्टिसोल की सांद्रता को मापा गया।

2.6.3. माइक्रोस्कोप अवलोकन

एड्रेनल ग्रंथि ऊतक की रूपात्मक संरचना को HE धुंधलापन द्वारा देखा गया। एड्रेनल ऊतक को 10% पैराफॉर्मेल्डिहाइड में स्थिर किया गया, इथेनॉल में निर्जलित किया गया, ज़ाइलीन घोल द्वारा पारदर्शी बनाया गया, पारंपरिक तरीकों से एम्बेड किया गया, 4 माइक्रोन मोटी स्लाइस में काटा गया, ज़ाइलीन घोल से डीवैक्स किया गया, इथेनॉल ग्रेडिएंट के साथ हाइड्रेट किया गया, और फिर हेमाटोक्सिलिन और ईओसिन धुंधलापन घोल से रंगा गया। ज़ाइलीन के साथ पारदर्शी होने के बाद, प्लेट को तटस्थ गोंद से सील कर दिया गया और माइक्रोस्कोप के नीचे देखा गया।

2.6.4. अधिवृक्क ग्रंथि में बैक्स, बीसीएल-2, कैस्पेस-3, फास, और फासएल प्रोटीन अभिव्यक्ति का इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधलापन

फॉर्मेलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड चूहे के एड्रेनल सेक्शन को 4 μm की मोटाई पर काटने के बाद डीपैराफिनाइज़ किया गया और फिर से हाइड्रेट किया गया। अंतर्जात पेरोक्सीडेज गतिविधि को रोकने के लिए, सेक्शन को 10 मिनट के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड ब्लॉक में प्रीइंक्यूबेट किया गया था। सेक्शन को 0.01 M साइट्रेट (pH 6.0) में डुबोया गया और उबलने तक गर्म किया गया। प्रक्रिया को 5-10 मिनट के बाद दोहराया गया। ठंडा होने के बाद, सेक्शन को PBS (pH 7.2-7.6) से 1-2 बार धोया गया, लगभग 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दिया गया, और PBS (pH 7.2-7.6) से 2-3 बार धोया गया। 5% BSA अवरोधक घोल को कमरे के तापमान पर मिलाया गया, और सेक्शन पर अतिरिक्त तरल को 20 मिनट बाद हिलाकर हटा दिया गया। FasTh FasL, Bcl-2ThBax, और caspase-3 (1:100 PBS से पतला) के लिए विशिष्ट तनु प्राथमिक एंटीबॉडी मिलाए गए और 37 डिग्री पर 1 घंटे या 4 डिग्री पर रात भर इनक्यूबेट किया गया। खण्डों को PBS (pH 7.2–7.6) से 2–3 बार धोया गया। फिर, बायोटिनाइलेटेड बकरी एंटी-माउस IgG मिलाया गया, और खण्डों को 20–37 डिग्री पर 20 मिनट के लिए सुखाया गया और PBS (pH 7.2–7.6) से 4 बार 5 मिनट के लिए धोया गया। PBS में अच्छी तरह धोने के बाद, खण्डों को अभिकर्मकों A और B के मिश्रण के साथ 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया, PBS के साथ 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया

यौन उत्तेजना बढ़ाने के लिए प्राकृतिक सिस्टान्चे ट्यूबुलोसा PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.7. प्रतिरक्षा कार्यों का निर्धारण

2.7.1. प्रतिरक्षा अंग सूचकांक की गणना

अंतिम प्रशासन के एक घंटे बाद, चूहों को यूरेथेन समाधान (20 gTh100 mL) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा बेहोश कर दिया गया, और फिर प्लीहा और थाइमस ग्रंथि को हटा दिया गया और तुरंत एक बाँझ हुड में तौला गया। प्लीहा या थाइमस का वजन गुणांक (%) - प्लीहा या थाइमस वजन (मिलीग्राम) शरीर का वजन (ग्राम)।

2.7.2. परिधीय रक्त में टी लिम्फोसाइट उपसमूहों का पता लगाना

स्प्लेनोसाइट्स और हेमोसाइट्स को मोनोक्लोनल एंटीबॉडीज एंटी-सीडी4 (पीई) और एंटी-सीडी8 (एफआईटीसी) के साथ अंधेरे में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। एरिथ्रोसाइट लाइसेट के 2 एमएल जोड़े गए, और घोल को भंवर द्वारा मिलाया गया। घोल को 10 मिनट के लिए अंधेरे में छोड़ दिया गया और 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया। सतह पर तैरनेवाला पदार्थ त्याग दिया गया, और फिर घोल को बर्फ के ठंडे पीबीएस से 3 बार धोया गया और पीबीएस पारगम्य घोल में फिर से निलंबित कर दिया गया। प्रत्येक मैब धुंधला होने के 1 घंटे के भीतर फ्लो साइटोमेट्री द्वारा कम से कम 10,000 कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया।

2.7.3. सीरम में IL-10, IL-6, IL-2, TNF- और IFN-c के स्तर का निर्धारण

अंतिम प्रशासन के एक घंटे बाद, चूहों को यूरेथेन समाधान (20 gTh100 mL) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा बेहोश कर दिया गया, और उदर महाधमनी से रक्त लिया गया। सीरम प्राप्त करने के लिए रक्त को 3500 r पर 15 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया और -20 डिग्री पर संग्रहीत किया गया। निर्माता के निर्देशों के अनुसार चूहे एलिसा किट के साथ IL-10, IL-6, IL-2, TNF-, और IFN-c की सांद्रता का पता लगाया गया।

2.8. हाइपोथैलेमस और हाइपोफिसिस ऊतकों में CaM की अभिव्यक्ति

TRIzol द्वारा हाइपोथैलेमस और हाइपोफिसिस ऊतकों से कुल RNA निकाला गया। निर्माता के निर्देशों के अनुसार कुल RNA के 10 μL पर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किया गया। dsDNA-बाइंडिंग डाई (प्रोमेगा, यूएसए) और CFX 96 रियल-टाइम पीसीआर सिस्टम (बायो-रेड, यूएसए) की उपस्थिति में qPCR के माध्यम से cDNA की समान मात्रा का विश्लेषण किया गया ताकि 10 मिनट के लिए 95 डिग्री पर प्रारंभिक सक्रियण, 15 सेकंड के लिए 95 डिग्री पर विकृतीकरण के 40 चक्र और 1 मिनट के लिए 60 डिग्री पर एनीलिंग एक्सटेंशन की स्थितियों के तहत विभिन्न जीनों को देखा जा सके।

CaM और -actin के लिए प्राइमर तालिका 1 में दिए गए हैं, और -actin को आंतरिक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। प्रत्येक नमूने को लक्ष्य जीन और -actin के बीच महत्वपूर्ण थ्रेसहोल्ड (Ct) में अंतर का उपयोग करके सामान्यीकृत किया गया था। परिणाम का वर्णन करने के लिए निम्नलिखित समीकरण का उपयोग किया गया था: ΔΔCt - (Ct लक्ष्य जीन - Ct -actin जीन) प्रायोगिक समूह - (Ct लक्ष्य जीन - Ct -actin जीन) नियंत्रण समूह। फिर प्रत्येक नमूने के mRNA स्तरों की तुलना 2- ΔΔCt लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति का उपयोग करके की गई। प्रत्येक समूह के परिणामों का औसत निकाला गया (तालिका 3)।

2.9. सांख्यिकीय विश्लेषण

सभी डेटा का विश्लेषण SPSS सॉफ़्टवेयर (संस्करण 19.0, SPSS इंस्टिट्यूट इंक., शिकागो, IL) का उपयोग करके किया गया। समूहों के बीच अंतर का विश्लेषण एकतरफा दोहराए गए माप विश्लेषण (ANOVA) के साथ किया गया। परिणामों को ग्राफपैड प्रिज्म सॉफ़्टवेयर (संस्करण 6.0, सैन डिएगो, CA, USA) का उपयोग करके माध्य ± मानक विचलन (SD) के रूप में व्यक्त किया गया। 0.05 से कम P मान वाले अंतरों को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना गया।

3. प्रायोगिक परिणाम

3.1. UPLC-QqQ-MSविश्लेषण

सर्वोत्तम पृथक्करण, शिखर आकार और कम विश्लेषण समय प्राप्त करने के लिए, हमारे प्रारंभिक प्रयोग में स्तंभ, मोबाइल चरण और ग्रेडिएंट प्रोग्राम सहित क्रोमैटोग्राफ़िक स्थितियों का अध्ययन किया गया। MRM मोड वाले विशिष्ट क्रोमैटोग्राम चित्र 1 में प्रस्तुत किए गए हैं।

तालिका 4 से हम देख सकते हैं कि डब्ल्यू.सी.डी. में फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड की मात्रा, सी.डी. की तुलना में बढ़ गई, विशेष रूप से इचिनाकोसाइड और एक्टियोसाइड के लिए, जबकि डब्ल्यू.सी.डी. में इरिडोइड्स की मात्रा कम हो गई।

3.2. एचपीए अक्ष कार्य के लिए विनियमन

3.2.1. वजन, तापमान और धारण शक्ति परीक्षण

MC समूह और प्रायोगिक समूहों के चूहों में कॉर्टिकोस्टेरोन दिए जाने के बाद धीरे-धीरे किडनी-यांग की कमी के लक्षण दिखाई दिए। वजन कम होना, हाइपोथर्मिया, बालों की चमक कम होना, मूड खराब होना, प्रतिक्रिया में देरी और पानी की खपत और गतिविधि में उल्लेखनीय कमी जैसे लक्षण CD और WCD समूहों में काफी हद तक सुधरे। चित्र 2(a) वजन में होने वाले बदलावों को दर्शाता है। प्रत्येक दवा समूह का वजन बढ़ा, खासकर CDHD और WCD-HD समूहों में। MC समूह में वजन में वृद्धि सबसे कम थी। चित्र 2(b) तापमान में होने वाले बदलावों को दर्शाता है, जो MC समूह में सबसे कम थे, और WCD-HD, WCD-MD और WCD-LD समूहों में तापमान में वृद्धि हुई।

चित्र 2(सी) से पता चलता है कि बीसी समूह और प्रत्येक प्रायोगिक समूह के लिए धारण शक्ति में वृद्धि हुई, और डब्ल्यूसीडी-एमडी समूह में यह सबसे अधिक थी, जिसने दर्शाया कि किडनी-यांग की कमी से प्रेरित कमजोरी के लक्षण प्रशासन के बाद बेहतर हो गए।

3.2.2. टी, सीआरएच, एसीटीएच, कॉर्ट और कॉर्टिसोल के स्तर

चित्र 3 दर्शाता है कि बीसी समूह की तुलना में चूहे के सीरम में टी, सीआरएच, एसीटीएच और कॉर्ट का स्तर कम हो गया (पी < 0.01) और एमसी समूह में कोर्टिसोल का स्तर कम हो गया (पी < 0.05)। एमसी समूह की तुलना में, डब्ल्यूसीडी-एचडी और डब्ल्यूसीडी-एमडी समूहों में टी का स्तर बढ़ा (पी < 0.01), डब्ल्यूसीडी-एलडी, डब्ल्यूसीडी-एमडी और डब्ल्यूसी समूहों में सीआरएच का स्तर बेहतर हुआ (पी < 0.01), सीडी-एचडी, डब्ल्यूसीडी-एमडी और डब्ल्यूसीडी-एचडी समूहों में एसीटीएच की मात्रा बढ़ी (पी < 0.01), सीडी-एमडी, डब्ल्यूसीडी-एमडी और डब्ल्यूसीडी-एचडी समूहों में कॉर्ट स्तर उन्नत हुआ (पी < 0.01) और सीडीएचडी और डब्ल्यूसीडी-एलडी समूहों में बढ़ा (पी < 0.05), और प्रत्येक दवा समूह में कोर्टिसोल का स्तर बढ़ा।

3.2.3. माइक्रोस्कोप अवलोकन के परिणाम

अधिवृक्क ग्रंथि ऊतक को कॉर्टिकल परत और मेडुला परत में विभाजित किया जा सकता है। कॉर्टिकल परतों में गोलाकार, बंडल और जालीदार परतें शामिल हैं। कोशिकाओं में अधिक लिपिड होते हैं, और मेडुला परत में ज्यादातर फियोक्रोमोसाइटोमा कोशिकाएं और थोड़ी मात्रा में रेशेदार ऊतक होते हैं। जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है, हमने पाया कि BC समूह में सब कुछ सामान्य था, जबकि MC समूह में, अधिवृक्क प्रांतस्था में स्पष्ट हाइपरप्लासिया, सेलुलर शोष और बढ़ता घनत्व था। बल्बनुमा पट्टी मोटी हो गई, और पारभासी प्रावरणी क्षेत्र, संकीर्ण ज़ोना रेटिकुलरिस और छोटी कोशिकाओं ने असमान रंग और केशिका जमाव दिखाया। PC समूह में, कॉर्टिकल और मेडुलर सीमाएँ दिखाई दे रही थीं। गोलाकार और बंडल बैंड की कोशिकाएँ समान रूप से व्यवस्थित थीं, और रूपात्मक संरचना बहाल हो गई थी। WCD समूहों में भी यही बेहतर बहाली देखी गई, और WCD-MD समूह में प्रभाव WCD-HD और WCD-LD समूहों की तुलना में बेहतर थे। सी.डी. समूहों में अधिवृक्क ग्रंथि की आकृति विज्ञान, डब्ल्यू.सी.डी. समूहों की तुलना में उतना अच्छा नहीं था।