अमूर्त
के synergistic निरोधात्मक प्रभावों की जांच करने के लिएसभापतित्वचा के रंजकता पर फेनिलथेनाइड ग्लाइकोसाइड्स (पीएचजी) और ग्लोब्रिडिन (जीएलए), पीएचजी के लिए पीएचजी के इष्टतम द्रव्यमान अनुपात को पहले से देखा गया थाकृत्रिम परिवेशीयTyrosinase गतिविधि अवरोध assays, 1, 1- diphenyl -2- picrylhydrazyl (dpph) कट्टरपंथी स्कैवेंजिंग, और 2,2'-Azino-bis (3-} ethylbenzothiazoline {{8} {8} scavon} scavon} {8} scavon}} scavon} तीन सेलुलर मॉडल का उपयोग करके आगे का मूल्यांकन किया गया था:

एक UVB- प्रेरित B16F10 मेलेनोजेनेसिस मॉडल मेलेनिन संश्लेषण अवरोध का आकलन करने के लिए टाइरोसिनेस गतिविधि और मेलेनिन सामग्री के माध्यम से;

एक लिपोपॉलीसेकेराइड (LPS) -इंडेड HACAT भड़काऊ मॉडल इंटरल्यूकिन -6 (il -6) और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर- (TNF-) दमन को मापकर विरोधी भड़काऊ प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए;

एक AAPH (2,2'-Azobis (2- amidinopropane) dihydrochloride- प्रेरित Hacat ऑक्सीडेटिव तनाव मॉडल सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेस (SOD) और कैटेलस (CAT) वृद्धि के माध्यम से एंटीऑक्सिडेंट गतिविधि का निर्धारण करने के लिए।

इन मॉडलों के माध्यम से इष्टतम PHGS/GLA द्रव्यमान अनुपात की पहचान की गई थी। परिणामों ने प्रदर्शित किया कि 1: 1, 5: 1, और 10: 1 के द्रव्यमान अनुपात में PHGS/GLA समाधान (फॉस्फेट-बफर खारा, पीबीएस, पीएच 6.8 में तैयार) ने महत्वपूर्ण टाइरोसिनेस निषेध और सहक्रियात्मक एंटीऑक्सिडेंट प्रभावों का प्रदर्शन किया। टाइरोसिनेस निषेध दर क्रमशः 94.37%, 92.93%और 88.06%थी; DPPH कट्टरपंथी मैला ढोने की दर 89.44%, 88.72%और 88.10%तक पहुंच गई; ABTS, स्कैवेंजिंग दरें 100.13%, 100.01%और 99.87%थीं। DMEM में 25 UG/mL पर, PHGS/GLA (1: 1, 5: 1, 10: 1) ने B16F10 या HACAT कोशिकाओं की ओर कोई साइटोटॉक्सिसिटी नहीं दिखाई। PHGS/GLA (1: 1) DMEM समाधान प्रदर्शित किया गयाश्रेष्ठ टाइरोसिनेस निषेध(23.80% अवशिष्ट गतिविधि), महत्वपूर्ण रूप सेकम मेलेनिन सामग्री(30.90%), और IL -6/tnf- रिलीज और SOD/CAT गतिविधि को बढ़ाने में अन्य अनुपात और मोनोथैरेपी को बेहतर बनाया। पीएचजी और जीएलए के synergistic संयोजन ने प्रभावी रूप से कम कियामेलेनोजेनेसिस को रोककर परिजन हाइपरपिग्मेंटेशन, सूजन को कम करना, औरएंटीऑक्सिडेंट क्षमता बढ़ाना.

कीवर्ड
सिसकलारेगिस्तानी फेनिलिथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स; ग्लोब्रिडिन; synergistic प्रभाव; एंटी-मेलेनोजेनेसिस; एंटीऑक्सिडेंट; सूजनरोधी; फार्मास्युटिकल कच्चे माल

 

 

 

सिसकलारेगिस्तानी के साथ निकालनाउच्च स्तरस्किन व्हाइटनिंग के लिए फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स

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प्रायोगिक अनुभाग

1.1 सामग्री, अभिकर्मक और उपकरण

माउस मेलेनोमा कोशिकाएंB16F10 (कैटलॉग नं।: STCC20013G -1), वुहान सर्विसबियो टेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड।

मानव अमर केराटिनोसाइट्सHACAT (कैटलॉग नं।: ICELL-H066), ICELL BIOSCIENCE INC., शंघाई, चीन।

Cistanche Phenylethanoid ग्लाइकोसाइड्स (PHGs)औरग्लाब्रिडिन (जीएलए), Shanxi Tianxingjian Biological Resical Technology Co., Ltd.

टायरोसिनेस, हेफेई बीएएसएफ बायोटेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड।

अर्बुटिन (एआरबी)औरएल tyrosine, अलादीन बायोकेमिकल टेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड, शंघाई, चीन।

1, 1- diphenyl -2- picrylhydrazyl (dpph), टोक्यो केमिकल इंडस्ट्री कंपनी, जापान।

2,2 of-azino-bis (3- ethylbenzothiazoline -6- सल्फोनिक एसिड) डायमोनियम नमक (ABTS), शंघाई युनी बायो-टेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड।

एस्कॉर्बिक एसिड (वीसी), तियानजिन दमाओ केमिकल अभिकर्मक कारखाने।

पोटेशियम पर्सल्फेटऔरनिर्जल इथेनॉल, तियानजिन ज़ीयुआन केमिकल अभिकर्मक कं, लिमिटेड।

सोडियम हाइड्रॉक्साइड, चेंगदू हुयई फार्मास्युटिकल एक्सिपिएंट मैन्युफैक्चरिंग कं, लिमिटेड।

घनत्व, शंघाई सैंपू केमिकल कंपनी, लिमिटेड।

एल रासायनिक पदार्थ, शंघाई युनी बायो-टेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड।

सेल काउंटिंग किट -8 (CCK8), बीजिंग सिनोइनविट्रोजन बायोटेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड।

ट्राइटन x -100, डिमेथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ), 2,2 ob-azobis (2- methylpropionamidine) dihydrochloride (aaph), औरलिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस), बीजिंग सोलरबियो साइंस एंड टेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड।

डीएमईएम उच्च ग्लूकोज माध्यम, थर्मो फिशर साइंटिफिक (चीन)।

भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), सिग्मा-एल्ड्रिच (शंघाई) ट्रेडिंग कंपनी, लिमिटेड।

पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान, शंघाई डैशियर बायो-टेक्नोलॉजी कं, लिमिटेड।

मानव il -6 एलिसा किट, मानव tnf- एलिसा किट, औरमानव कैट एलिसा किट, वुहान फाइन बायोटेक कं, लिमिटेड।

कुल सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज (एसओडी) परख किट, नानजिंग जियानचेंग बायोइंजीनियरिंग इंस्टीट्यूट। सभी अभिकर्मक संश्लेषणात्मक कोटि के थे।

उपयोग किए गए उपकरण:

मल्टीस्कैन एफसी फुल-वेवलेंथ माइक्रोप्लेट रीडरऔरहेराकेल 371 CO2 इनक्यूबेटर, थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूएसए।

KQ -200 VDB अल्ट्रासोनिक क्लीनर, कुन्शान अल्ट्रासोनिक इंस्ट्रूमेंट्स कं, लिमिटेड।

DVKW-D -2 डिजिटल थर्मोस्टेटिक वॉटर बाथ, बीजिंग योंगगुंगिंग मेडिकल इंस्ट्रूमेंट फैक्ट्री।

Dhg -9246 एक इलेक्ट्रिक थर्मोस्टैटिक ब्लास्ट सुखाने वाले ओवन, शंघाई जिंगहोंग प्रायोगिक उपकरण कं, लिमिटेड।

KN4006B UVB पराबैंगनी विकिरण साधन(विकिरण की तीव्रता: 8 मेगावाट/सेमी,), ज़ुजो केनूओ मेडिकल इंस्ट्रूमेंट उपकरण कं, लिमिटेड।

1.2 तरीके

सबसे पहले, पीएचजी और जीएलए को या तो फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस, पीएच =6। 8) या 50% इथेनॉल समाधान में बड़े पैमाने पर सांद्रता के साथ समाधान तैयार करने के लिए भंग कर दिया गया था{{{0}}}। 0 0 1, 0।। फिर, पीएचजी और जीएलए को अनुपात में मिलाया गयाm (phgs): m (gla)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, और 1:40, कुल द्रव्यमान एकाग्रता के साथ phgs/GLA समाधान तैयार करने के लिए0.4 g/Lके रूप में लेबल किया गयाPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40), क्रमश।

 

1.3 जैव रासायनिक प्रयोग

1.3.1 टाइरोसिनेस गतिविधि निषेध परख

एक 96- अच्छी तरह से प्लेट में,परीक्षण नमूना समाधान के 50 μL, पीबीएस के 50 μl (ph =6। 8), औरएल-टायरोसिन समाधान के 50 μL (1 ग्राम/एल)क्रमिक रूप से जोड़े गए थे। प्लेट को 10 मिनट के लिए 37 डिग्री पानी के स्नान में ऊष्मायन किया गया था। तब,5 0 tyrosinase समाधान के μl (0.4 g/l, 200 u/ml के बराबर)जोड़ा गया था, और प्लेट को फिर से 37 डिग्री पानी के स्नान में एक और 10 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया था।

अर्बुटिन (एआरबी)सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था, औरपीबीएस (ph =6। 8)रिक्त नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था।

समाधान के अवशोषण पर490 एन.एम.एक माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके मापा गया था, और इन विट्रो टाइरोसिनेस निषेध दर (%) में समीकरण (1) का उपयोग करके गणना की गई थी।

 

 

सूत्र में:

A _ प्रतिक्रियाएल-टायरोसिन समाधान, पीबीएस और टायरोसिनेस समाधान युक्त नमूना समाधान का अवशोषण है।

A _ प्रतिक्रिया नियंत्रणTyrosinase समाधान के बिना L-Tyrosine समाधान और PBS युक्त नमूना समाधान का अवशोषण है।

A _ रिक्तनमूना के बिना एल-टायरोसिन समाधान, पीबीएस, और टायरोसिनेस समाधान वाले समाधान का अवशोषण है।

A _ रिक्त नियंत्रणनमूना और टायरोसिनेस समाधान के बिना एल-टायरोसिन समाधान और पीबीएस युक्त समाधान का अवशोषण है।

1.3.2 DPPH मुक्त कट्टरपंथी मैला ढोने की गतिविधि का निर्धारण

सबसे पहले, {{{0}}}। DPPH के 0197 g (0.05 mmol) को सटीक रूप से तौला गया था और 250 मिलीलीटर निर्जल इथेनॉल में घुलित किया गया था।0। 2 mmol/l.

फिर, पीएचजी और जीएलए को 50% इथेनॉल में भंग कर दिया गया था ताकि पीएचजी और जीएलए के इथेनॉल समाधान तैयार किया जा सके।{{0}}}।। वीसी के इथेनॉल समाधान उसी तरह से तैयार किए गए थे।

इसके बाद, पीएचजी और जीएलए के इथेनॉल समाधानों को अनुपात में मिश्रित किया गया थाm (phgs समाधान): m (gla समाधान)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, 1:40विभिन्न द्रव्यमान अनुपातों के साथ पीएचजी/जीएलए के 9 इथेनॉल समाधान प्राप्त करने के लिए, के रूप में लेबल किया गयाPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40).

अंत में,प्रत्येक नमूना समाधान के 100 μlऔरDPPH काम करने वाले समाधान के 100 μLएक 96- अच्छी तरह से प्लेट में जोड़ा गया, समान रूप से मिश्रित, और 30 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर ऊष्मायन किया गया। पर अवशोषण517 एन.एम.माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके मापा गया था। वीसी का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था, और प्रत्येक प्रयोग को तीन बार दोहराया गया था।

DPPH मुक्त कट्टरपंथी मैला ढोने की दर (%) की गणना समीकरण (2) का उपयोग करके की गई थी।

 

सूत्र में:

A1नमूना समाधान + DPPH कार्य समाधान का अवशोषण है।

A250% इथेनॉल + डीपीपीएच कार्य समाधान का अवशोषण है।

A3नमूना समाधान का अवशोषण + 50% इथेनॉल है।

 

1.3.3 ABTS⁺ मुक्त कट्टरपंथी मैला ढोने की गतिविधि का निर्धारण

पहला,ABTS का 1 g (1.82 mmol)अंतिम एकाग्रता के साथ एक ABTS काम करने वाले समाधान को तैयार करने के लिए विआयनीकृत पानी में भंग कर दिया गया था7.4 मिमीोल/एल. 0। 5 ग्राम पोटेशियम persulfateएक अंतिम एकाग्रता के साथ एक पोटेशियम persulfate कार्य समाधान तैयार करने के लिए विआयनीकृत पानी में भंग कर दिया गया था2.6 मिमीोल/एल। एबीटीएस वर्किंग सॉल्यूशन और पोटेशियम पर्सल्फेट वर्किंग सॉल्यूशन के बराबर वॉल्यूम को मिश्रित किया गया था और एबीटीएस वर्किंग सॉल्यूशन तैयार करने के लिए 12 घंटे तक अंधेरे में प्रतिक्रिया करने की अनुमति दी गई थी।

फिर, पीएचजी, जीएलए, और वीसी के इथेनॉल समाधान, साथ ही पीएचजी/जीएलए इथेनॉल समाधान के अनुपात के साथPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40), धारा 1.3.2 में वर्णित विधि के अनुसार तैयार किए गए थे।

अंत में,प्रत्येक नमूना समाधान के 40 μlऔरABTS⁺ कार्य समाधान के 160 μLएक 96- अच्छी तरह से प्लेट में जोड़ा गया, समान रूप से मिश्रित किया गया, और 6 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में प्रतिक्रिया की गई। समाधान के अवशोषण पर734 एन.एम.माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके मापा गया था।

एबीटीएस मुक्त कट्टरपंथी मैला ढोने की दर (%) की गणना समीकरण (3) का उपयोग करके की गई थी।

 

 

सूत्र में:

A1नमूना समाधान + ABTS⁺ कार्य समाधान का अवशोषण है।

A2विआयनीकृत पानी + abts of वर्किंग सॉल्यूशन का अवशोषण है।

A3नमूना समाधान + विआयनीकृत पानी का अवशोषण है।

1.4 सेल प्रयोग

1.4.1 सेल संस्कृति

B16F10 और HACAT कोशिकाओं को पुनर्जीवित करने के बाद, उन्हें DMEM उच्च-ग्लूकोज माध्यम (10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान युक्त) में रखा गया और सुसंस्कृत किया गया और सुसंस्कृत किया गया37 डिग्री, 5% CO2, और70% आर्द्रता24 घंटे के लिए एक इनक्यूबेटर में। सेल विकास की स्थिति एक माइक्रोस्कोप के तहत देखी गई थी, और मध्यम परिवर्तन या पारित होने को सेल विकास की स्थिति के आधार पर आवश्यक रूप से किया गया था।

1.4.2 प्रायोगिक समूहन

लॉगरिदमिक-चरण B16F10 और HACAT कोशिकाओं को एक उपयुक्त सेल घनत्व पर 96- अच्छी तरह से प्लेटों में बीजित किया गया था और सेल पालन की अनुमति देने के लिए 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया गया था। DMEM माध्यम का उपयोग करके विभिन्न सांद्रता के साथ नमूना समाधान तैयार किए गए थे।

प्रयोगात्मक समूह इस प्रकार थे:

सामान्य समूह

मॉडल समूह

पीएचजी कम खुराक समूह(125 कुरूप/एमएल)

पीएचजीएस मध्यम-खुराक समूह(250 कुरूप/एमएल)

पीएचजीएस उच्च खुराक समूह(500 कुरूप/एमएल)

जीएलए कम खुराक समूह(6.25 कुरूप/एमएल)

जीएलए मध्यम-खुराक समूह(12.5 कुरूप/एमएल)

जीएलए उच्च खुराक समूह(25 कुरूप/एमएल)

PHGS/GLA (1: 1) समूह(25 कुरूप/एमएल)

पीएचजी/जीएलए (5: 1) समूह

पीएचजीएस/जीएलए (10: 1) समूह

के लिएB16F10 कोशिकाओं में UVB- प्रेरित पिग्मेंटेशन मॉडल, मॉडल समूह कोशिकाओं के साथ इलाज किया गया थापीबीएस के 30 μl (ph =7। 4)और एक UVB पराबैंगनी विकिरण उपकरण के तहत विकिरणितडिवाइस के नीचे 3 सेमीके लिए110 सेकंड। प्रयोगात्मक समूहों के साथ दिखावा किया गया थाविभिन्न नमूना समाधानों के 100 μlजोड़ने से पहले 1 घंटे के लिएपीबीएस के 30 μlऔर 110 सेकंड के लिए यूवीबी डिवाइस के तहत विकिरणित। सामान्य समूह को लगातार उच्च-ग्लूकोज डीएमईएम माध्यम के साथ इलाज किया गया था, और रिक्त समूह में कोशिकाएं नहीं थीं, लेकिन उन्हें समान मात्रा में माध्यम से बदल दिया गया था।

के लिएHACAT कोशिकाओं में LPS- प्रेरित सूजन मॉडल, मॉडल समूह के साथ इलाज किया गया था20 कुरूप/एमएल एलपीएस पीबीएस समाधान24 घंटे के लिए। प्रयोगात्मक समूहों के साथ दिखावा किया गया थाविभिन्न नमूना समाधानों के 100 μlजोड़ने से पहले 24 घंटे के लिए20 कुरूप/एमएल एलपीएस समाधानएक और 24 घंटे के लिए। सामान्य समूह को लगातार उच्च-ग्लूकोज डीएमईएम माध्यम के साथ इलाज किया गया था, और रिक्त समूह में कोशिकाएं नहीं थीं, लेकिन उन्हें समान मात्रा में माध्यम से बदल दिया गया था।

के लिएHACAT कोशिकाओं में Aaph- प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव मॉडल, मॉडल समूह के साथ इलाज किया गया था25 mmol/l aaph समाधान24 घंटे के लिए। प्रयोगात्मक समूहों के साथ दिखावा किया गया थाविभिन्न नमूना समाधानों के 100 μlजोड़ने से पहले 24 घंटे के लिए25 mmol/l aaph समाधानएक और 24 घंटे के लिए। सामान्य समूह को लगातार उच्च-ग्लूकोज डीएमईएम माध्यम के साथ इलाज किया गया था, और रिक्त समूह में कोशिकाएं नहीं थीं, लेकिन उन्हें समान मात्रा में माध्यम से बदल दिया गया था।

प्रत्येक समूह के साथ स्थापित किया गया था3 कुओं को दोहराएंऔर पर सुसंस्कृत37 डिग्री, 5% CO2, और70% आर्द्रताएक इनक्यूबेटर में।

1.4.3 साइटोटॉक्सिसिटी परख

साइटोटॉक्सिसिटी का उपयोग करके मापा गया थाCCK8 विधि। लॉगरिदमिक-चरण B16F10 और HACAT कोशिकाओं को पचाया गया0। 25% ट्रिप्सिन3 मिनट के लिए। पाचन को माध्यम के साथ रोक दिया गया था, कोशिकाओं को बार -बार एक घनत्व के साथ एक सेल निलंबन तैयार करने के लिए पाइप किया गया था1 × 10⁴ कोशिकाएं/एमएल। कोशिकाओं को समान रूप से 96- अच्छी तरह से प्लेटों में बीज दिया गया था100 μl प्रति कुएं, और पीबीएस को परिधीय कुओं में जोड़ा गया था। सेल पालन के बाद, नमूना समाधानों के विभिन्न सांद्रता को जोड़ा गया था, के साथ3 प्रति समूह कुओं को दोहराएं, और कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया गया था37 डिग्री, 5% CO2, और70% आर्द्रताके लिए24, 48, और 72 घंटेमाध्यम को त्यागने से पहले।

सभी समूहों के लिए,CCK8 DMEM उच्च-ग्लूकोज माध्यम के 100 μL (10% CCK8 युक्त)के लिए जोड़ा गया और ऊष्मायन किया गया60 मिनट। समाधान के अवशोषण पर450 एन.एम.माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके मापा गया था।

सेल व्यवहार्यता (%) की गणना समीकरण (4) का उपयोग करके की गई थी।

 

सूत्र में:

A _ इलाज किया गयाअच्छी तरह से युक्त कोशिकाओं, CCK8 समाधान और नमूना समाधान का अवशोषण है।

A _ रिक्तअच्छी तरह से युक्त मध्यम और CCK8 समाधान का अवशोषण है लेकिन कोशिकाओं के बिना।

A0अच्छी तरह से युक्त कोशिकाओं और CCK8 समाधान का अवशोषण है लेकिन नमूना समाधान के बिना।

1.4.4 टाइरोसिनेस गतिविधि परख

L-DOPA विधि का उपयोग टायरोसिनेस गतिविधि को मापने के लिए किया गया था। के लिए कोशिकाओं का इलाज करने के बाद48 घंटेजैसा कि धारा 1.4.2 में वर्णित है, सतह पर तैरनेवाला छोड़ दिया गया था, और कुओं को दो बार पीबीएस (ph =7। 4) के साथ धोया गया था। तब,1% ट्राइटन x -100 समाधान का 50 μlप्रत्येक कुएं में जोड़ा गया और तुरंत के लिए एक -80 डिग्री फ्रीजर में रखा गया30 मिनट। कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर पिघलाया गया था ताकि lysis को प्रेरित किया जा सके।

पूर्व-गर्म होने के बाद37 डिग्रीके लिए5 मिनट, 10 mmol/l l-dopa समाधान का 10 μlप्रत्येक कुएं में जोड़ा गया और पर ऊष्मायन किया गया37 डिग्री, 5% CO2, और 70% आर्द्रताके लिए1 घंटे। पर अवशोषण475 एन.एम.माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके मापा गया था। प्रत्येक प्रयोग को दोहराया गया थातीन बार, और टायरोसिनेस गतिविधि (%) की गणना समीकरण (5) का उपयोग करके की गई थी।

सूत्र में:

A _ प्रयोगयूवीबी विकिरण के तहत अच्छी तरह से युक्त कोशिकाओं और नमूना समाधान का अवशोषण है।

A _ सामान्ययूवीबी विकिरण के बिना अच्छी तरह से युक्त कोशिकाओं और नमूना समाधान का अवशोषण है।

A _ रिक्तअच्छी तरह से युक्त माध्यम का अवशोषण है लेकिन कोशिकाओं के बिना।

 

1.4.5 मेलेनिन सामग्री माप

NaOH Lysis विधि का उपयोग मेलेनिन सामग्री को मापने के लिए किया गया था। के लिए कोशिकाओं का इलाज करने के बाद72 घंटेजैसा कि धारा 1.4.2 में वर्णित है, सतह पर तैरनेवाला छोड़ दिया गया था, और कुओं को दो बार पीबीएस के साथ धोया गया था।10% DMSO (1 mol/l) युक्त NaOH जलीय घोल के 100 μLप्रत्येक कुएं में जोड़ा गया था, और प्लेट को एक में रखा गया था90 डिग्री ओवनके लिए1 घंटे। पर अवशोषण490 एन.एम.माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके मापा गया था। प्रत्येक प्रयोग को दोहराया गया थातीन बार, और मेलेनिन सामग्री (%) की गणना समीकरण (5) का उपयोग करके की गई थी।

 

1.5 भड़काऊ कारकों और ऑक्सीडेटिव तनाव संकेतक का मापन

के लिए कोशिकाओं का इलाज करने के बाद48 घंटेजैसा कि धारा 1.4.2 में वर्णित है,हकात कोशिकाएंप्रत्येक समूह से एक सेल स्क्रैपर का उपयोग करके एकत्र किया गया था, centrifuged, और सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था। IL -6 और TNF- की सांद्रता को एलिसा किट के निर्देशों के अनुसार मापा गया था।

के लिए कोशिकाओं का इलाज करने के बाद48 घंटे, HACAT कोशिकाओं को एक सेल स्क्रैपर का उपयोग करके एकत्र किया गया था, सेल lysis को प्रेरित करने के लिए बार-बार फ्रीज-थाव चक्र के अधीन किया गया था, और centrifuged पर12, 000 4 डिग्री पर 10 मिनट के लिए आरपीएम। सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था, और की गतिविधियोंएसओडीऔर सांद्रताबिल्लीएलिसा किट निर्देशों का उपयोग करके मापा गया।

 

1.6 संयोजन सूचकांक माप

संयोजन सूचकांक (सीआई) विधि] संयोजन सूचकांक की गणना समीकरण (6) का उपयोग करके की गई थी।

 

सूत्र में:

D1औरD2संयोजन उपचार में दो दवाओं के संबंधित सांद्रता (जी/एल) का प्रतिनिधित्व करें।x% गतिविधि.

आंदोलनप्रत्येक व्यक्तिगत पदार्थ की एकाग्रता (जी/एल) का प्रतिनिधित्व करता है जब प्राप्त करने के लिए अकेले उपयोग किया जाता हैx% गतिविधि.

संकलन सॉफ्टवेयरगणना के लिए उपयोग किया गया था:

Ci> 1एक विरोधी प्रभाव को इंगित करता है।

Ci=1एक additive प्रभाव को इंगित करता है।

Ci <1एक सहक्रियात्मक प्रभाव को इंगित करता है।

 

1.7 डेटा विश्लेषण

सभी डेटा के रूप में व्यक्त किए गए थे"मतलब ± मानक विचलन (x̄ ± s)", और चर्चाएं औसत मूल्यों पर आधारित थीं।

सांख्यिकीय विश्लेषण का उपयोग करके किया गया थाग्राफपैड प्रिज्म 9.5। 0। एक-तरफ़ा एनोवा (विचरण का विश्लेषण) का उपयोग कई समूहों के बीच तुलना के लिए किया गया था। एपी-वैल्यू <0। 05सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था।