सारकार्य

पृष्ठभूमि: तेजी से अध्ययनों ने मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी)-व्युत्पन्न एक्सोसोम के चिकित्सीय प्रभाव की सूचना दी है जिसके द्वारा प्रोटीन और एमआईआरएनए की विशेषता होती है। हालाँकि, मानव भ्रूण स्टेम सेल (hESCs) और मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (hiPSCs) से प्राप्त एक्सोसोम के प्रोटिओमिक्स और miRNA प्रोफाइल अस्पष्ट बने हुए हैं।

सिस्टैंच का ग्लाइकोसाइड हृदय और यकृत के ऊतकों में एसओडी की गतिविधि को भी बढ़ा सकता है, और प्रत्येक ऊतक में लिपोफसिन और एमडीए की सामग्री को काफी कम कर सकता है, विभिन्न प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन रेडिकल्स (ओएच-, एच₂ओ₂, आदि) को प्रभावी ढंग से हटा सकता है और डीएनए क्षति से बचा सकता है। ओएच-रेडिकल्स द्वारा। सिस्टैंच फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स में मुक्त कणों की एक मजबूत सफाई क्षमता होती है, विटामिन सी की तुलना में उच्च कम करने की क्षमता होती है, शुक्राणु निलंबन में एसओडी की गतिविधि में सुधार होता है, एमडीए की सामग्री कम होती है, और शुक्राणु झिल्ली समारोह पर एक निश्चित सुरक्षात्मक प्रभाव पड़ता है। सिस्टैंच पॉलीसेकेराइड डी-गैलेक्टोज के कारण प्रयोगात्मक रूप से वृद्ध चूहों के एरिथ्रोसाइट्स और फेफड़ों के ऊतकों में एसओडी और जीएसएच-पीएक्स की गतिविधि को बढ़ा सकते हैं, साथ ही फेफड़ों और प्लाज्मा में एमडीए और कोलेजन की सामग्री को कम कर सकते हैं और इलास्टिन की सामग्री को बढ़ा सकते हैं। डीपीपीएच पर एक अच्छा सफाई प्रभाव, वृद्ध चूहों में हाइपोक्सिया का समय बढ़ाना, सीरम में एसओडी की गतिविधि में सुधार करना, और प्रयोगात्मक रूप से वृद्ध चूहों में फेफड़ों के शारीरिक अध: पतन में देरी करना, सेलुलर रूपात्मक अध: पतन के साथ, प्रयोगों से पता चला है कि सिस्टैंच में अच्छी एंटीऑक्सीडेंट क्षमता है और त्वचा की उम्र बढ़ने वाली बीमारियों को रोकने और उनका इलाज करने के लिए एक दवा बनने की क्षमता रखती है। साथ ही, सिस्टैंच में इचिनाकोसाइड में डीपीपीएच मुक्त कणों को साफ़ करने की एक महत्वपूर्ण क्षमता है और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों को साफ़ कर सकता है, मुक्त कट्टरपंथी प्रेरित कोलेजन गिरावट को रोक सकता है, और थाइमिन मुक्त कट्टरपंथी आयनों की क्षति पर भी अच्छा मरम्मत प्रभाव पड़ता है।

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【अधिक जानकारी के लिए:george.deng@wecistanche.com / व्हाट्सएप:86 13632399501】

तरीकों: इस अध्ययन में, हमने क्लासिक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन और एक 0.22-μm फ़िल्टर के माध्यम से, इसके बाद रूढ़िवादी पहचान के माध्यम से hESCs, hiPSCs और मानव गर्भनाल मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं (hUC-MSCs) से एक्सोसोम को अलग किया। टेंडेम मास टैग लेबलिंग और लेबल-मुक्त सापेक्ष पेप्टाइड मात्रा निर्धारण ने मिलकर उनके प्रोटिओमिक्स को परिभाषित किया। MiRNA प्रोफाइल निर्धारित करने के लिए उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण किया गया था। फिर, हमने एक्सोसोम कार्गो द्वारा नियंत्रित प्रमुख जैविक प्रक्रियाओं और मार्गों की पहचान करने के लिए एक जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण किया। अंत में, तीन प्रकार के एक्सोसोम में प्रोटीन और एमआईआरएनए के वास्तविक भार का पता लगाने के लिए वेस्टर्न ब्लॉट और आरटी-क्यूपीसीआर का प्रदर्शन किया गया।

परिणाम: हमारे अध्ययन के आधार पर, तीन प्रकार के एक्सोसोम के कार्गो परिष्कृत जैविक प्रक्रियाओं में योगदान करते हैं। इसकी तुलना में, एचईएससी एक्सोसोम (एचईएससी-एक्सोस) विकास, चयापचय और एंटीएजिंग को विनियमित करने में बेहतर थे, और एचईएससी एक्सोसोम (एचईएससी-एक्सोस) में एचईएससी-एक्सोस के समान जैविक कार्य थे, जबकि एचयूसी-एमएससी एक्सोसोम (एचयूसी-एमएससी-एक्सोस) प्रतिरक्षा विनियमन में अधिक योगदान दिया।

निष्कर्ष: हमारे अध्ययन में प्रस्तुत डेटा तीन एक्सोसोम के प्रोटीन और miRNA परिदृश्य को परिभाषित करने में मदद करता है, सिस्टम स्तर पर व्यवस्थित और व्यापक नेटवर्क विश्लेषण के माध्यम से उनके जैविक कार्यों की भविष्यवाणी करता है, और प्रीक्लिनिकल और क्लिनिकल में एक्सोसोम चयन को अनुकूलित करने के लिए विभिन्न क्षेत्रों में उनके संबंधित संभावित अनुप्रयोगों को प्रकट करता है। परीक्षण.

कीवर्ड: मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाएँ, मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाएँ, मानव गर्भनाल मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाएँ, एक्सोसोम, प्रोटिओमिक्स, miRNA

परिचय

एक्स्ट्रासेल्यूलर वेसिकल्स (ईवी) कोशिकाओं द्वारा सक्रिय रूप से स्रावित होने वाले छोटे वेसिकल्स हैं, जिनमें मुख्य रूप से एक्सोसोम, माइक्रोवेसिकल्स (एमवी) और एपोप्टोटिक निकाय होते हैं [40, 56, 57]। वे शरीर के कई तरल पदार्थों, जैसे लार, स्तन के दूध, रक्त, मस्तिष्कमेरु द्रव, पित्त और मूत्र में व्यापक रूप से वितरित होते हैं [57]। उनमें से, एक्सोसोम में 40-200 एनएम के व्यास के साथ एक लिपिड बाईलेयर, सुक्रोज ग्रेडिएंट में 1.13-1.18 ग्राम/एमएल का उत्प्लावन घनत्व और एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत एक कप के आकार की उपस्थिति होती है [21, 53]। प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड और लिपिड सहित विभिन्न बायोएक्टिव यौगिक, कोशिकाओं के बीच एक्सोसोम के अंतरकोशिकीय संचार कार्य को संपन्न करते हैं [16, 17]। लिपिड बाइलेयर एक नाजुक अवरोध है जो एक्सोसोम की सामग्री को शरीर के तरल एंजाइमेटिक अध: पतन से बचाता है [49]। स्थिर एक्सोसोम अंग और प्रजनन विकास, एंटीजन प्रस्तुति, न्यूरोनल संचार, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, उम्र बढ़ने के नियमन और कोशिका प्रसार [57, 62] सहित पैरासरीन गतिविधि के माध्यम से जटिल शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं में मध्यस्थता कर सकते हैं।

एक्सोसोम का गठन और रिलीज एक पूरी तरह से विनियमित प्रक्रिया है, और एक्सोसोम-एनकैप्सुलेटेड सामग्री की छंटाई विभिन्न प्रोटीनों के एकत्रीकरण द्वारा होती है [22, 47]। एक्सोसोम निर्माण के लिए कई प्रोटीन महत्वपूर्ण हैं, जिसमें परिवहन के लिए आवश्यक एंडोसोमल सॉर्टिंग कॉम्प्लेक्स (ईएससीआरटी), टेट्रास्पैनिन (सीडी 9, सीडी 63 और सीडी 81), एपोप्टोसिस-लिंक्ड जीन 2- इंटरैक्टिंग प्रोटीन एक्स (एलिक्स), और ट्यूमर की संवेदनशीलता शामिल है। जीन 101 (टीएसजी101) [38, 55]। एक्सोसोम की इंट्रासेल्युलर तस्करी प्रोटीन की एक श्रृंखला की सामूहिक गतिविधि से प्रेरित होती है, जिसमें आणविक स्विच आरएबी जीटीपेज़ और साइटोस्केलेटल प्रोटीन, जैसे एक्टिन और ट्यूबुलिन [24] शामिल हैं। इसके बाद, एक्सोसोम स्राव को SNARE कॉम्प्लेक्स और सिनैप्टोटैग्मिन परिवार [22] द्वारा पूरक किया जाता है। अनुसंधान ने निर्धारित किया है कि एक्सोसोम का उभरना और गिरना कैल्शियम गतिविधि और ईएससीआरटी भर्ती पर निर्भर करता है [15]। एक संदेशवाहक के रूप में, एक्सोसोम रिलीज सेलुलर फिजियोलॉजी और पैथोलॉजिकल परिवर्तनों, जैसे सक्रियण, पीएच परिवर्तन, हाइपोक्सिया, विकिरण क्षति, या सेल तनाव [61] के जवाब में सेल क्रॉसस्टॉक में शामिल होता है।

एक्सोसोम के घटकों और उनके संभावित शारीरिक और रोग संबंधी कार्यों को उजागर करने के लिए, प्रोटिओमिक, ट्रांसक्रिप्टोमिक और अन्य तकनीकों का उपयोग अक्सर विभिन्न प्रजातियों, ऊतकों और कोशिकाओं से एक्सोसोम आरएनए और प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए किया जाता है [44]। एक्सोसोम प्रोटिओमिक्स विश्लेषण में आम तौर पर तीन चरण शामिल होते हैं: एक्सोसोम का अलगाव, शुद्धिकरण और लक्षण वर्णन, मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके प्रोटीन घटकों की पहचान, और कच्चे डेटा विश्लेषण [14]। सेलुलर स्थिति प्रोटीन संरचना और एक्सोसोम की प्रचुरता को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करती है। वर्तमान में, प्रोटीन लक्षण वर्णन और प्रचुरता का विश्लेषण करने के लिए मात्रात्मक प्रोटिओमिक तकनीकों का उपयोग एक्सोसोम उत्पादन के अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट करने और कोशिकाओं में एक्सोसोम की शारीरिक और रोग संबंधी भूमिकाओं के बारे में हमारी समझ को गहरा करने के लिए किया जाता है [39]। उनमें से, मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स प्रौद्योगिकियों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, जिसमें मुख्य रूप से लेबल-मुक्त और स्थिर आइसोटोप-लेबल विधियां शामिल हैं [13, 42]। miRNAs छोटे बायोएक्टिव अणु हैं जो विभिन्न जीवन गतिविधियों से निकटता से जुड़े हुए हैं। उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण तकनीक को उच्च संवेदनशीलता और परिशुद्धता की विशेषता है और इसका miRNA अनुक्रमण (18-30 एनटी) [6] में व्यापक अनुप्रयोग है। वर्तमान प्रौद्योगिकी के विकास को देखते हुए, एक्सोसोम के प्रोटीन और एमआईआरएनए प्रोफाइल को विच्छेदित करने में कोई बाधा नहीं है।

hESCs और hiPSCs में उच्च विभेदन क्षमता है [36]। हालाँकि, उपचार में उनका प्रत्यक्ष अनुप्रयोग घातकता और नैतिक मुद्दों के जोखिम के कारण सीमित है [31]। इसके विपरीत, मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) का क्लिनिकल सेटिंग्स में कई बीमारियों में हस्तक्षेप के लिए व्यापक अनुप्रयोग है [8]। हालाँकि, उनके प्रत्यक्ष उपयोग को अभी भी कई सीमाओं का सामना करना पड़ता है, जिसमें कम जीवित रहने की दर, प्रतिरक्षाविज्ञानी अस्वीकृति और सुरक्षा मुद्दे शामिल हैं [8, 43]। वर्तमान में, एक्सोसोम पर उनकी जैव सुरक्षा, स्थिरता, गैर-एनुप्लोइडी और कम इम्युनोजेनेसिटी [51] के कारण बहुत अधिक ध्यान दिया गया है। पिछले अध्ययनों ने विभिन्न ऊतकों और प्रोटिओमिक और miRNA प्रोफाइल वाले उनके एक्सोसोम से प्राप्त MSCs की घटक तुलना का दस्तावेजीकरण किया है [59]। गोंग एट अल. प्रोटिओम के संदर्भ में एचईएससी बाह्यकोशिकीय पुटिकाओं (ईवी) के नियामक नेटवर्क को भी दर्शाया गया है, लेकिन दूसरों पर ध्यान केंद्रित किए बिना केवल उम्र बढ़ने से संबंधित मार्गों में [19]। क्वेस्टा एट अल. मानव फोरस्किन फ़ाइब्रोब्लास्ट्स (एचएफएफ) से प्राप्त एचआईपीएससी के ईवी प्रोटिओमिक एटलस को बुना गया [45]। हालाँकि इन अध्ययनों ने आंशिक रूप से ईवीएस के प्रोटीन घटकों की सूचना दी है, लेकिन उन्होंने केवल एक्सोसोम पर ध्यान केंद्रित नहीं किया है, और उनका व्यापक प्रोटिओमिक विश्लेषण स्पष्ट रूप से व्यक्त नहीं किया गया है। विशेष रूप से, miRNA प्रोफाइल का अभी तक वर्णन नहीं किया गया है। इसे संबोधित करने के लिए, वर्तमान अध्ययन में hESCs, hiPSCs और hUC-MSCs से अलग किए गए एक्सोसोम को उनके अनुसंधान और नैदानिक ​​​​अनुप्रयोग के लिए नवीन अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए उनके प्रोटिओम और miRNA प्रोफाइल को लक्षित करने के लिए आगे की जांच के लिए चुना गया था।

तरीकों

एक्सोसोम की तैयारी और लक्षण वर्णन

hESCs और hiPSCs को ncTarget मीडियम (कैट नं. आरपी 0 1020; नुवासेल लिमिटेड, चीन) में संवर्धित किया गया था, जबकि hUC-MSCs की तीसरी पीढ़ी को सीरम-मुक्त मिशन hMSC माध्यम (कैट नं.) में संवर्धित किया गया था। RP02010; नुवासेल. लिमिटेड, चीन)। इसके बाद, एक्सोसोम शुद्धि के लिए लॉगरिदमिक विकास चरण (~ 80 प्रतिशत संगम) में कोशिकाओं के सतह पर तैरनेवाला का 350 एमएल एकत्र किया गया था। एक्सोसोम को मान्यता प्राप्त सेंट्रीफ्यूजेशन और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन की एक श्रृंखला द्वारा निकाला गया था, जैसा कि पहले बताया गया है [34, 52]। संक्षेप में, वातानुकूलित मीडिया (सीएम) को एकत्र किया गया और अलग करने के लिए ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन (10 मिनट के लिए 300×जी, 15 मिनट के लिए 2×जी, 30 मिनट के लिए 17×जी) के अधीन किया गया। कोशिका अवशेष। एकत्रित सतह पर तैरनेवाला से एक्सोसोम को Ti45 रोटर (बेकमैन कूल्टर, यूएसए) का उपयोग करके 70 मिनट के लिए 100, 000×g पर पिलाया गया। फिर उन्हें 0.22-μm MF-मिलिपोर™ मेम्ब्रेन फिल्टर (सिग्मा, यूएसए) का उपयोग करके अगले निस्पंदन के लिए पीबीएस में फिर से निलंबित कर दिया गया। निस्पंद को 70 मिनट के लिए 100,000×g पर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के अधीन किया गया था। अगले विश्लेषण के लिए अंतिम एक्सोसोम गोली को पीबीएस में पुनः निलंबित कर दिया गया। पृथक एक्सोसोम की सांद्रता और आकार को मापने के लिए एक गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस) प्रणाली (व्याट टेक्नोलॉजी, यूएसए) का उपयोग किया गया था।

ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम)

जैसा कि पहले बताया गया है, पृथक एक्सोसोम की आकृति विज्ञान का वर्णन करने के लिए टीईएम स्कैनिंग की गई थी। पुनर्निलंबित एक्सोसोम (पीबीएस के 10 यूएल में 1 यूजी) को कार्बन-लेपित तांबे के ग्रिड (200- जाल) पर लगाया गया था और 2 मिनट के लिए उस पर सोखने की अनुमति दी गई थी, इसके बाद डबल-आसुत पानी के साथ दो बार धोया गया था। फिर, ग्रिडों को 1 मिनट के लिए 2 प्रतिशत यूरेनिल एसीटेट समाधान के 8 μL के साथ नकारात्मक रूप से दाग दिया गया। प्राकृतिक रूप से सूखने के बाद, नमूनों की जांच 120 केवी पर टेक्नाई स्पिरिट सिस्टम (थर्मो फिशर, यूएसए) का उपयोग करके की गई।

अदभुत प्रकाश फैलाव

एक्सोसोम के आकार वितरण को निर्माता के निर्देशों (271-DPN) के अनुसार एक गतिशील प्रकाश स्कैटरोमीटर (व्याट टेक्नोलॉजी, यूएसए) का उपयोग करके नैनोकण ट्रैकिंग विश्लेषण के माध्यम से वर्णित किया गया था, जैसा कि पहले बताया गया था [23]। संक्षेप में, एक्सोसोम गोली को पीबीएस के 100 μL में पुनः निलंबित कर दिया गया था। उपरोक्त एक्सोसोम के दस, 50 μL को पीबीएस के 1450 μL में जोड़ा गया और 30 एस के लिए भंवर में डाला गया। एक्सोसोम (1.5 एमएल) को 30 सेकंड के लिए 25 डिग्री पर संतुलन के लिए एक डिस्पोजेबल क्युवेट में स्थानांतरित किया गया था। फैलाव अपवर्तक सूचकांक मान 1.37 था, और जेड-औसत और पॉलीडिस्पर्सिटी (पीडीआई) दोनों ने एक्सोसोम कणों का आकार निर्धारित किया। प्रत्येक नमूने के लिए वृक्ष-स्वतंत्र माप लिया गया।

टेंडेम मास टैग (टीएमटी) लेबलिंग और लेबल-मुक्त सापेक्ष पेप्टाइड मात्रा का ठहराव (एलएफक्यू) विश्लेषण

Total protein was extracted from exosomes, and the concentration was quantified using the Bradford method.  The samples were separated by 12.5% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).  The protein suspensions were digested with trypsin (cat.   no. 9002-07-7; Sigma, USA) in 40 μL of tetraethylammonium bromide (TEAB) buffer for 12  h at 37  °C and then labeled with TMTsixplex™ isobaric label reagent set (cat. no. 90061; Thermo Fisher, USA). TMT-labeled peptides were fractionated by reversed-phase chromatography using an Agilent 1260 Infinity II HPLC system  (Agilent Technology, USA). LC-MSC/MS analysis was performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. (Hangzhou,  China). Briefly, the analysis was completed using the combination of a Q Exactive Plus mass spectrometer and Easy nLC (Thermo Fisher, USA). Survey scans were acquired at a resolution of 70,000 at m/z 200. MS/MS   spectra were captured by the MASCOT engine using the built-in software Proteome Discoverer 2.4. Label-free relative peptide quantification analysis was also performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. as previously reported  [27]. Briefly, the digested proteins of exosomes were separated by HPLC and detected by mass spectrometry.  Raw files from technical and biological replicates were filtered, de novo sequenced, and assigned with protein ID   using PEAKS 8.0 by searching against the human SwissProt database. Tree-independent exosome samples were subjected to TMT or label-free assay. The final protein profiles of exosomes were determined by overlapping the data of TMT (mascot score>60, abundance>100, और पी<0.05) and label-free (at least two tests results>0 और पी<0.05).

Differentially expressed proteins (DEPs) were considered valid after the data were normalized by protein loading and differential p-value false discovery rates (FDR) corrected [30]. In particular, the proteins with log2|fold change|>1 (|log2FC|>1), साथ ही सांख्यिकीय महत्व (पी<0.05), were classified as enriched in exosomes.

miRNA प्रोफ़ाइल विश्लेषण

mirVana™ miRNA आइसोलेशन किट (बिल्ली संख्या AM1560; थर्मो फिशर, यूएसए) का उपयोग करके पृथक एक्सोसोम से कुल आरएनए निकाला गया था। आरएनए नमूनों को एलसी-बायो टेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड द्वारा किए गए miRNA माइक्रोएरे परख के लिए गुणवत्ता निरीक्षण के अधीन किया गया था। कच्चे डेटा का विश्लेषण पहले की रिपोर्ट के अनुसार किया गया था [9]। विभेदित रूप से व्यक्त miRNAs को पी-वैल्यू पर उम्मीदवार miRNAs के रूप में चुना गया था<0.05 and |log2FC|>2. Data were omitted if they corresponded to questionable miRNAs, according to previous reports or in-house validated miRNAs [12]. The miRNA target genes were determined by the overlap of prediction of Targetscan and miRanda databases under the restriction of threshold value>90 (टारगेटस्कैन) और अधिकतम मुफ्त ऊर्जा<−10 (miRanda).

जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण

मैक्सक्वांट सॉफ़्टवेयर पैकेज (v1.6.0) का उपयोग करके कच्चे डेटा का विश्लेषण किया गया था, और स्विस-प्रोटे_मानव डेटा को संदर्भ (20,600 प्रोटीन) (प्रोटिओम आईडी: UP000005640) के रूप में सेट किया गया था। . पहचाने गए प्रोटीनों को उनके जैविक और कार्यात्मक गुणों को निर्धारित करने के लिए कोबास विश्लेषण [60] शर्तों के आधार पर जीन ओन्टोलॉजी (जीओ) और क्योटो एनसाइक्लोपीडिया ऑफ जीन्स एंड जीनोम्स (केईजीजी) में मैप किया गया था। आर सॉफ्टवेयर (संस्करण 3.6.1) में साइटोस्केप सॉफ्टवेयर और आईग्राफ पैकेज का उपयोग सिग्नलिंग मार्गों के बीच एक्सोसोम प्रोटीन या एमआईआरएनए के इंटरवॉवन नेटवर्क को खींचने के लिए किया गया था।

सांख्यिकीय विश्लेषण

सभी प्रयोग तीन प्रतियों में प्रदर्शित किए गए थे। प्रोटीन और miRNAs की मात्रात्मक पुनरावृत्ति को प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए), सापेक्ष मानक विचलन और पियर्सन के सहसंबंध गुणांक के माध्यम से बढ़ाया गया था। परिणामों का विश्लेषण एक अयुग्मित छात्र के टी-परीक्षण का उपयोग करके किया गया। डेटा को माध्य (SEM) की औसत मानक त्रुटि के रूप में व्यक्त किया जाता है। *P पर P-मान को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001.

परिणाम

एक्सोसोम अलगाव और पहचान

अतिरिक्त फ़ाइल 1 में तीन मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं की संस्कृति और पहचान का वर्णन किया गया था। एक्सोसोम को तीन प्रकार की स्टेम कोशिकाओं के वातानुकूलित मीडिया से अलग किया गया था (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र एस 1) और आकृति विज्ञान, कण आकार, एकाग्रता के आधार पर पहचान की गई थी। और सतह मार्कर [19]। टीईएम ने खुलासा किया कि इन एक्सोसोम में एक कप के आकार की आकृति विज्ञान (छवि 1 ए) था, और डीएलएस ने खुलासा किया कि उनका आकार वितरण 50-200 एनएम (छवि 1 बी) के भीतर था। वेस्टर्न ब्लॉटिंग ने संकेत दिया कि पृथक एक्सोसोम में सकारात्मक मार्कर CD63, TSG101, और HSP70 थे, लेकिन नकारात्मक मार्कर कैलनेक्सिन नहीं थे (चित्र 1C)। प्रत्येक एचईएससी में एचआईपीएससी के समान एक्सोसोम उपज थी, और दोनों एचयूसी-एमएससी (छवि 1 डी) की तुलना में अधिक थे। टेस परिणामों से संकेत मिलता है कि प्रतिनिधि एक्सोसोम को गिरफ्तार कर लिया गया था, आकार में कोई अंतर नहीं था; हालाँकि, तीन प्रकार की स्टेम कोशिकाओं से पृथक एक्सोसोम की सांद्रता में अंतर पाया गया।

साझा और टॉप-लोडेड प्रोटीन की जैव सूचना विज्ञान

The SDS-PAGE and quantitative analyses revealed that while the protein concentrations of hESC-Exos and hiPSC-Exos were not different, they were both higher than those of hUC-MSC-Exos (Additional file 1: Fig.  S2A and B). The PCA plot indicated that exosomes had good uniformity within each group (Additional file 1:  Fig. S2C). The peptide fragments digested via enzymatic hydrolysis passed the quality inspection (Additional file 1: Fig. S2D–G) and then were subjected to the next bioinformatics analysis. Moreover, the proteins of three exosomes were mainly located in the extracellular region,   followed by the cytoplasm (Additional file 1: Fig. S2H).  To describe the protein profiles of the three types of exosomes, we integrated the TMT (Additional file 2) and label-free data (Additional file 3) under the conditions of mascot score>60 and abundance>100 (TMT assay)   and abundance of at least two repetitions>0 (लेबल-मुक्त परख)। अंत में, क्रमशः hESC-Exos, hiPSC-Exos, और hUC-MSC-Exos के प्रोटीन प्रोफाइल का विश्लेषण करने के लिए 554, 437 और 911 बीजों का चयन किया गया (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र S3A)। फिर इन उम्मीदवारों को साझा प्रोटीन का चयन करने के लिए वेन आरेख परख के अधीन किया गया (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र। S3B)। जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण से पता चला कि 303 साझा प्रोटीन इन सिग्नलिंग मार्गों में विनियमन पर हावी हैं, जिसमें एक्टिन साइटोस्केलेटन, फोकल आसंजन, पीआई 3 के-एकेटी, कार्बन चयापचय आदि का विनियमन शामिल है (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र। एस 3 सी)। जीओ विश्लेषण ने यह भी संकेत दिया कि साझा प्रोटीन बाह्यकोशिकीय एक्सोसोम, झिल्ली, प्रोटीन बाइंडिंग और बाह्यकोशिकीय क्षेत्र में समृद्ध थे, (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र। S3D)।

Furthermore, the top-loaded proteins were selected from the candidates with high FDR confidence (TMT   assay) and abundance of each repetition>0 (लेबल-मुक्त परख) (चित्र 2ए)। इन परिणामों के आधार पर, क्रमशः 163, 187 और 451 प्रोटीनों को hESC-Exos, hiPSC-Exos और hUC-MSC-Exos में जांचा गया (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र S3E)। फिर हमने तीन प्रकार के एक्सोसोम के अभिव्यक्ति प्रचुरता वक्र का वर्णन किया और एक्सोसोम में लोडेड प्रोटीन के शीर्ष दस जीन प्रतीकों की पहचान की (चित्र 2बी)। वांअत्यधिक भरे हुए प्रोटीन को कोबास एल्गोरिदम के आधार पर जैव सूचना विज्ञान के अधीन किया गया था। तीन प्रकार के एक्सोसोम के सभी प्रोटीओम एक जटिल सिग्नलिंग पाथवे नियामक नेटवर्क में शामिल थे, और शीर्ष 20 मार्गों को -लॉग10 (पी-वैल्यू) (चित्र 2सी-ई) के मूल्य के आधार पर क्रमबद्ध किया गया था। सभी प्रोटिओम बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम)-रिसेप्टर इंटरैक्शन और पीआई3के-एकेटी सिग्नलिंग मार्गों में समृद्ध थे। प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) विश्लेषण से पता चला कि एचईएससी-एक्सोस और हाईपीएससी-एक्सोस दोनों में शीर्ष-लोडेड प्रोटीन थेकोशिका चक्र और चयापचय मार्ग में समृद्ध किया गया, जबकि एचयूसी-एमएससी-एक्सोस में शीर्ष-भरे प्रोटीन प्रतिरक्षा विनियमन-संबंधित मार्गों (छवि 2F-H) में समृद्ध थे।

एक्सोसोम प्रोटिओमिक्स की जोड़ीवार तुलना

प्रत्येक दो एक्सोसोम प्रोटिओम के बीच अंतर का मूल्यांकन करने के लिए, हमने अद्वितीय और ओवरलैपिंग प्रोटीन-कोडिंग जीन समूहों को पहचानने के लिए एक वेन आरेख का निर्माण किया। साझा प्रोटीन-कोडिंग जीन को तब ज्वालामुखी और हीटमैप विश्लेषण और जीएसईए के अधीन किया गया था, और अलग-अलग व्यक्त प्रोटीन को पी पर फ़िल्टर किया गया था<0.05 and  |log2FC|≥1. Comparison of hESC-Exos and hiPSC-Exos  (Additional file 1: Fig. S4A) revealed that their unique clusters were both enriched in ECM-receptor interaction and complement and coagulation cascades (Additional file 1: Fig. S4B and C) while overlapping clusters participated in multiple signaling pathways, including metabolic, cell cycle, and Hippo pathways (Fig. 3A). Significant differentially expressed protein-coding genes are presented in the volcano plot (Fig. 3 B). Heatmap analysis revealed that Cluster 1 proteins related to developmental biology, TGF-β signaling, and pluripotency regulation were enriched in hESC-Exos. Proteins in Cluster 2,   which were mainly enriched in hiPSC-Exos, were related to taurine and hypotaurine metabolism, RNA transport,   thiamine metabolism, and folate biosynthesis (Fig. 3 C).  GSEA further emphasized the more important role of hESC-Exos in developmental biology and cell cycle compared to hiPSC-Exos (Additional file 1: Fig. S5).

एचईएससी-एक्सोस और एचयूसी-एमएससी के बीच तुलना (छवि एस4 डी) से पता चला कि एचईएससी-एक्सोस के अद्वितीय प्रोटीन-कोडिंग जीन क्लस्टर मुख्य रूप से ईजीएफआर, टीजीएफ-, सेल चक्र, प्लुरिपोटेंसी विनियमन और डब्ल्यूएनटी में शामिल थे। सिग्नलिंग (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र S4E)। इसके विपरीत, एचयूसी-एमएससी-एक्सोस अद्वितीय समूहों को कई इम्यूनोरेग्यूलेशन-संबंधित सिग्नलिंग मार्गों जैसे कि पूरक प्रणाली, सूजन विनियमन और माइक्रोबियल संक्रमण (अतिरिक्त फ़ाइल 1: छवि एस 4 एफ) में समृद्ध किया गया था। ओवरलैपिंग क्लस्टर ईसीएम-रिसेप्टर इंटरैक्शन, पूरक और जमावट कैस्केड और पीआई 3 के-एकेटी सिग्नलिंग (छवि 3 डी) में अत्यधिक समृद्ध थे। ज्वालामुखी प्लॉट hESC-Exos और hUC-MSC-Exos (चित्र 3E) के बीच अंतर को दर्शाता है। एचयूसी-एमएससी-एक्सोस (क्लस्टर 1) में अपग्रेड किए गए प्रोटीन मुख्य रूप से पूरक प्रतिक्रिया, प्राकृतिक किलर सेल गतिविधि और रैप 1 और पीपीएआर सिग्नलिंग में शामिल थे। इसके विपरीत, hESC-Exos अपग्रेडेड प्रोटीन मुख्य रूप से PI3K-AKT, MAPK और AMPK सिग्नलिंग (छवि 3F) में शामिल थे। जीएसईए ने प्लुरिपोटेंसी (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र S6A और D) में hiPSC-Exos की उच्च नियामक क्षमता और इम्यूनोरेग्यूलेशन में hESC-Exos की उच्च नियामक क्षमता की पुष्टि की, जिसमें प्राकृतिक किलर सेल-मध्यस्थ साइटोटॉक्सिसिटी (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र S6B और E) शामिल है। और COVID का विनियमन19-SARS-CoV2 (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र S6C और F)।

HiPSC-Exos और hUC-MSC-Exos तुलना (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र। S4G) से पता चला कि अद्वितीय hiPSCExos प्रोटीन-कोडिंग जीन सेट गैर-होमोलॉगस एंड-ज्वाइनिंग, TGF- और विटामिन B6 चयापचय (अतिरिक्त) के साथ महत्वपूर्ण रूप से जुड़ा हुआ था। फ़ाइल 1: चित्र S4H), जबकि hUC-MSC-Exos मुख्य रूप से इम्यूनोरेग्यूलेशन-संबंधी मार्गों में शामिल था (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र S4I)। उनके ओवरलैपिंग प्रोटीन ने ईसीएम-रिसेप्टर इंटरैक्शन, पूरक और जमावट कैस्केड और पीआई 3 के-एकेटी सिग्नलिंग (छवि 3 जी) के विनियमन में भी भाग लिया। ज्वालामुखी भूखंड विभेदित रूप से व्यक्त प्रोटीन प्रस्तुत करता है (चित्र 3H)। हीटमैप में क्लस्टर 1 प्रोटीन ने संकेत दिया कि hUCMSC-Exos मुख्य रूप से प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और AMPK सिग्नलिंग मार्ग को नियंत्रित करता है जबकि hiPSC-Exos मुख्य रूप से कोशिका चक्र और इंसुलिन, हिप्पो और mTOR सिग्नलिंग मार्ग को नियंत्रित करता है (चित्र 3 I)। जीएसईए ने विकासात्मक प्रक्रियाओं (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र S7A और D) और प्लुरिपोटेंसी के रखरखाव (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र S7B और E) के नियमन में hiPSC-Exos की प्रमुख भूमिका का समर्थन किया, जबकि hUC-MSC-Exos थे ज्यादातर इम्यूनोरेग्यूलेशन प्रक्रिया में शामिल हैं (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र। S7C और F)।

ओवरलैपिंग प्रोटिओम की जैव सूचना विज्ञान

इसके बाद, हमने तीन एक्सोसोम प्रकारों के साझा प्रोटिओम की जांच की। कुल मिलाकर, 309 प्रोटीन-कोडिंग जीन (चित्र 4ए) जीओ और केईजीजी विश्लेषण के अधीन थे। परिणामों ने संकेत दिया कि तीन एक्सोसोम प्रकारों के बीच साझा प्रोटीन-कोडिंग जीन सेट मुख्य रूप से सेलुलर प्रोटीन चयापचय प्रक्रियाओं, सिग्नलिंग रिसेप्टर बाइंडिंग, एटीपी बाइंडिंग, एनएडी बाइंडिंग, घाव भरने और लिपिड चयापचय प्रक्रियाओं (छवि) सहित बाह्य गतिविधियों और जैविक प्रक्रियाओं में शामिल थे। 4बी). उन्होंने PI3K-AKT, ग्लाइकोलाइसिस/ग्लूकोनोजेनेसिस, हिप्पो, ऑक्सीटोसिन, HIF-1, सेल चक्र और AMPK पाथवे (चित्र 4C) जैसे सिग्नलिंग मार्गों के जटिल नियामक नेटवर्क के निर्माण में भी योगदान दिया। इन प्रोटिओमिक और कैनोनिकल सिग्नलिंग मार्गों के बीच जटिल नियामक संबंध थे (चित्र 4D)। बबल प्लॉट कैनोनिकल सिग्नलिंग मार्ग में प्रत्येक प्रोटीन क्लस्टर की अलग-अलग प्रचुरता का प्रमाण देता है। जबकि hESC-Exos और hiPSC-Exos में सेल चक्र और AMPK सिग्नलिंग पथों के संदर्भ में hUC-MSC-Exos की तुलना में अधिक मजबूत नियामक क्षमताएं हो सकती हैं, hUC-MSC-Exos का VEGF और NF-κB सिग्नलिंग पथों पर प्रमुख नियामक प्रभाव हो सकता है (अतिरिक्त) फ़ाइल 1: चित्र S8)।

हीटमैप विश्लेषण से साझा प्रोटीन की अभिव्यक्ति में अंतर का पता चला (चित्र 4ई)। क्लस्टर ए में, पीआई3के-एकेटी, हिप्पो, वीईजीएफ और बी-सेल रिसेप्टर सिग्नलिंग मार्गों में शामिल प्रोटीन को एचयूसी-एमएससीएक्सओएस और एचईएससी-एक्सोस में समृद्ध किया गया था। क्लस्टर बी में प्रोटीन मुख्य रूप से पीपीएआर सिग्नलिंग, कोलेस्ट्रॉल चयापचय और आईजीए उत्पादन के विनियमन में भाग लेते थे और एचईएससी-एक्सोस में समाप्त हो गए थे। एचयूसी-एमएससी-एक्सोस में मुख्य रूप से क्लस्टर सी प्रोटीन शामिल थे, जो पूरक प्रतिक्रिया, माइक्रोबियल संक्रमण, एचआईएफ -1 सिग्नलिंग, एमएपीके सिग्नलिंग, चयापचय पथ और एनएफ-κबी मार्ग को नियंत्रित करते थे। क्लस्टर डी में प्रोटीन, जो हाईपीएससी-एक्सोस में समृद्ध थे, ने रास सिग्नलिंग, ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन और एमटीओआर सिग्नलिंग को विनियमित करने में भाग लिया। क्लस्टर ई में प्रोटीन hUC-MSCExos की तुलना में hiPSC-Exos और hESC-Exos दोनों में अधिक प्रचुर मात्रा में थे, और वे साइट्रेट चक्र, कोशिका चक्र, इंसुलिन सिग्नलिंग, फैटी एसिड चयापचय और AMPK सिग्नलिंग जैसी कई चयापचय प्रक्रियाओं में शामिल थे। . क्लस्टर एफ में प्रोटीन ने कैल्शियम पुनर्अवशोषण, ग्लाइकोलाइसिस/ग्लूकोनियोजेनेसिस, एड्रीनर्जिक सिग्नलिंग और पाइरूवेट चयापचय को विनियमित करने में भाग लिया और एचयूसी-एमएससीएक्सओएस और एचआईपीएससी-एक्सोस दोनों में समाप्त हो गए। विभिन्न समूहों में प्रोटीन अतिरिक्त फ़ाइल 4 में सूचीबद्ध हैं।

तीन एक्सोसोम प्रकारों की miRNA प्रोफ़ाइल

तीन एक्सोसोम प्रकारों के एमआईआरएनए प्रोफाइल की जांच करने के लिए, कुल आरएनए को बाद के व्युत्क्रम प्रतिलेखन के लिए 5' और 3' सिरों को जोड़ने के लिए एक्सोसोम से अलग किया गया था। प्राप्त सीडीएनए का उपयोग पुस्तकालय निर्माण और व्यापक परीक्षण के लिए किया गया था। hESC-Exos, hiPSC-Exos, और hUC-MSC-Exos में RNA अखंडता संख्या (RIN) क्रमशः 2.7, 2.6 और 2.6 थी (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र S9A)। आरएनए सांद्रता के निर्धारण से पता चला कि एचईएससी-एक्सोस आरएनए लोड पर हावी है, इसके बाद हाईपीएससी-एक्सोस और एचयूसी-एमएससीईएक्सओएस (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र। एस9बी) हैं। मात्रात्मक रूप से miRNAs की पुनरावृत्ति का मूल्यांकन करने के लिए पियर्सन के सहसंबंध गुणांक (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र। S9C) और PCA (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र। S9D) का उपयोग किया गया था। हीटमैप्स का उपयोग तीन एक्सोसोम प्रकारों (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र S9E) में विभेदित रूप से व्यक्त miRNAs और P पर विभेदित रूप से व्यक्त miRNAs की संख्या का प्रतिनिधित्व करने के लिए किया गया था।<0.05 or 0.01,   was evaluated between each two exosome types (Additional file 1: Fig. S9F). Based on the sequencing results, the top 20 miRNAs in each of the three exosome types were identified (Fig. 5 A–C). In hESC-Exos, has-miR-302 dominated the read counts and comprised has-miR-302b-3p,   has-miR-302a-5p, and has-miR-302d-3p (Fig.  5A). The three miRNAs with the highest read counts were has-miR- 372-3p, has-miR-371a, and has-miR-302a in hiPSC-Exos and has-miR-21-5p (Fig.  5B), has-miR-146a-5p, and hasmiR-320a-3p in hUC-MSC-Exos (Fig. 5C).

जैविक प्रक्रियाओं में शामिल miRNAs की जांच करने के लिए, शीर्ष miRNAs को P पर फ़िल्टर किया गया था<0.05 and read count>आगे लक्ष्य जीन भविष्यवाणी के लिए 1000। समृद्ध जीनों को फिर GO और KEGG विश्लेषण के अधीन किया गया। परिणामों ने संकेत दिया कि hESC-Exos miRNAs ने निम्नलिखित प्रक्रियाओं को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित किया है: Rap1, PI3K-AKT, कैल्शियम, हिप्पो, cAMP, ErbB, फॉक्सो, सेल चक्र, AMPK सिग्नलिंग मार्ग, आदि (KEGG विश्लेषण) (चित्र 5D), और कोशिका चक्र, एकाधिक जीव विकास, इंट्रासेल्युलर सिग्नल ट्रांसडक्शन, सेल भेदभाव, उम्र बढ़ना, Wnt सिग्नलिंग और फैटी एसिड चयापचय। (जैविक प्रक्रिया) (चित्र 5जी)। HiPSC-Exos miRNAs के लक्ष्य जीन संवर्धन ने संकेत दिया कि निम्नलिखित प्रक्रियाओं को महत्वपूर्ण रूप से विनियमित किया गया था: PI3K-AKT, Rap1, Ras, कैल्शियम, हिप्पो, cAMP, और cGMP-PKG सिग्नलिंग मार्ग, आदि (KEGG विश्लेषण), और कोशिका चक्र, एकाधिक जीव विकास, फॉस्फोराइलेशन, कोशिका विभेदन, कोशिका प्रवासन, और हाइपोक्सिया की प्रतिक्रिया। (जैविक प्रक्रिया) (चित्र 5एच)। HUC-MSC-Exos miRNAs के नियामक नेटवर्क में, सबसे प्रशंसनीय जैविक प्रक्रियाएं थीं: Rap1, Ras, PI3K-AKT, कैल्शियम, cAMP, हिप्पो, कोशिका चक्र, JAK-STAT, और HIF-1 सिग्नलिंग मार्ग . (केईजीजी विश्लेषण) (चित्र 5एफ), और फॉस्फोराइलेशन, इंट्रासेल्युलर सिग्नल ट्रांसडक्शन, एटीपी बाइंडिंग, सेल डिवीजन, लिपिड मेटाबॉलिज्म, टी सेल सह-उत्तेजना, घाव भरना, एनएफ-κबी बाइंडिंग और सूजन प्रतिक्रिया। (जैविक प्रक्रिया) (चित्र 5 I)। शीर्ष पांच miRNAs के नेटवर्क और उनके नियामक मार्गों को भी दर्शाया गया था (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र S10)।

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