आणविक आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी के आधार पर सिस्टैंच डेजर्टिकोला से कम आणविक भार सैकराइड्स के मैक्रोफेज सक्रियण के लिए लक्ष्य पहचान और तंत्र विश्लेषण

[अमूर्त]इस अध्ययन का उद्देश्य सिस्टैंच डेजर्टिकोला (LMSC) से कम आणविक भार सैकराइड्स के मैक्रोफेज सक्रियण के लिए लक्ष्य और लक्ष्य-शामिल तंत्र की जांच करना है। फैगोसाइटिक गतिविधि और RAW264 की कोई रिलीज नहीं। 7 कोशिकाओं का पता लगाया गया, और परिणामों से पता चला कि एलएमएससी फागोसाइटिक गतिविधि और एनओ रिलीज में काफी वृद्धि करके प्रतिरक्षा सक्रियण प्रभाव डालती है। LMSC- संयुग्मित एपॉक्सी-सक्रिय सेफ़रोज़ मोतियों को लक्ष्य प्रोटीन पर कब्जा करने के लिए आत्मीयता अभिकर्मक के रूप में तैयार किया गया था। LC-MS /MS विश्लेषण द्वारा Eef2 जैसे चौबीस प्रोटीनों की पहचान की गई। पाथवे संवर्धन विश्लेषण ने LMSC को RAW264 सक्रिय दिखाया। Fcgamma रिसेप्टर आश्रित फैगोसाइटोसिस, TNF- अल्फा NF-κB सिग्नलिंग पाथवे, ग्लाइकोलाइसिस / ग्लूकोनोजेनेसिस और साइट्रिक एसिड चक्र और श्वसन इलेक्ट्रॉन परिवहन मार्ग को विनियमित करके 7 कोशिकाएं।

[कुंजी शब्द]सिस्टैंच डेजर्टिकोला; कम आणविक भार सैकराइड्स; मैक्रोफेज सक्रियण; आणविक आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी; लक्ष्य पहचान; तंत्र विश्लेषण

डेजर्ट जिनसेंग

Cistanches Herba गुर्दे और यांग को टोन करने, सार और रक्त को लाभ पहुंचाने और आंतों और मल त्याग को पोषण देने के लिए एक प्रसिद्ध पारंपरिक चीनी दवा है। इसे "रेगिस्तान जिनसेंग" के रूप में जाना जाता है। आधुनिक विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान अनुसंधान से पता चलता है कि सिस्टैंच डेजर्टिकोला में विभिन्न प्रकार के कार्बोहाइड्रेट घटक होते हैं, जिनमें मुख्य रूप से फ्रुक्टोज सहित मोनोसैकराइड यौगिक, सुक्रोज जैसे ओलिगोसेकेराइड यौगिक और एसीडीपी -2 जैसे पॉलीसेकेराइड शामिल हैं, जो सिस्टैंच डेजर्टिकोला में भूमिका निभाने के लिए प्रभावी पदार्थ हैं। प्रतिरक्षा विनियमन, शौच, आदि [2-5]। सिस्टैंच डेजर्टिकोला पॉलीसेकेराइड को व्यापक रूप से इम्यूनोमॉड्यूलेटरी प्रभाव वाले सक्रिय अवयवों के एक वर्ग के रूप में रिपोर्ट किया गया है, जबकि कम आणविक भार शर्करा (LMSCs) जैसे ओलिगोसेकेराइड और मोनोसैकराइड का शायद ही कभी अध्ययन किया गया हो। सिस्टैंच डेजर्टिकोला में मुख्य सक्रिय घटकों के मैक्रोफेज सक्रियण पर हमारे शोध समूह द्वारा किए गए एक अध्ययन में पाया गया कि कम आणविक चीनी मैक्रोफेज सक्रियण के साथ एक प्रकार का सक्रिय घटक है, लेकिन इसका प्रतिरक्षा सक्रियण लक्ष्य और क्रिया का तंत्र अभी भी स्पष्ट नहीं है।

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आणविक आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी एक क्रोमैटोग्राफिक विधि है जो लक्ष्य अणुओं के पृथक्करण और शुद्धिकरण को विशेष रूप से उन्हें एक स्थिर चरण [6] से बांधकर प्राप्त करती है। इस पद्धति में उच्च आत्मीयता और विशिष्टता है और विशेष रूप से अत्यंत कम लक्षित उत्पाद सांद्रता वाले जटिल जैविक प्रणालियों के लिए उपयुक्त है [7]। हाल के वर्षों में, यह धीरे-धीरे प्राकृतिक दवा लक्ष्यों की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में विकसित हुआ है। इस अध्ययन में, मैक्रोफेज सक्रियण के साथ LMSC लक्ष्य प्रोटीन की पहचान करने के लिए आणविक आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी पर आधारित छोटे अणु लक्ष्य प्रोटीन कैप्चर तकनीक का उपयोग किया गया था। जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के माध्यम से, एलएमएससी की प्रतिरक्षा नियामक गतिविधि और संबंधित तंत्र का पता लगाने के लिए लक्ष्य समूह की सिग्नल नियामक मार्ग की जानकारी प्राप्त की जाती है।

1 सामग्री

1.1 सेल

माउस मैक्रोफेज लाइन रॉ 264 7 चाइनीज एकेडमी ऑफ मेडिकल साइंसेज के सेल सेंटर से खरीदी गई।

1.2 ड्रग्स और अभिकर्मक

भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) जर्मनी में पैन बायोटेक से खरीदा गया था; एंटीबायोटिक्स, DMEM हाई शुगर मीडियम, और 6 × प्रोटीन सैंपलिंग बफर Zhongke Maichen Technology Co., Ltd. से खरीदा गया था। Cistanche डेजर्टिकोला की कम आणविक भार वाली चीनी को हमारे शोध समूह द्वारा स्व-निर्मित किया गया था और HPLC द्वारा मुख्य रूप से मैनिटॉल युक्त निर्धारित किया गया था ( 16 53 प्रतिशत), सुक्रोज (8 34 प्रतिशत), फ्रुक्टोज (25 38 प्रतिशत), ग्लूकोज (7 75 प्रतिशत) और अन्य मोनोमेरिक घटक। Escherichia coli O55 से लिपोपॉलीसेकेराइड: B5, LPS, 3 - (4, 5-डाइमिथाइल थियाज़ोल-2) - 2, 5-डिफेनिलटेट्राज़ोलियम ब्रोमाइड (MTT) और {{ संयुक्त राज्य अमेरिका में सिग्मा एल्ड्रिच से 14}} प्रतिशत तटस्थ लाल घोल खरीदा गया। नाइट्रिक ऑक्साइड (NO) अभिकर्मक किट नानजिंग जियानचेंग बायोटेक्नोलॉजी रिसर्च इंस्टीट्यूट से खरीदी गई थी। स्वीडन में GE हेल्थ केयर से एपॉक्सी-एक्टिवेटेड सेफ़रोज़ जेल (6B) खरीदा गया था। रैपिड सिल्वर स्टेनिंग किट को बायोयंटियन बायोटेक्नोलॉजी रिसर्च इंस्टीट्यूट से खरीदा गया था। संयुक्त राज्य अमेरिका में थर्मो फिशर साइंटिफिक से मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए फॉर्मिक एसिड और एसीटोनिट्राइल दोनों खरीदे गए थे। अन्य सभी अभिकर्मक घरेलू विश्लेषणात्मक शुद्ध हैं।

सिस्टैंच पाउडर

1.3 उपकरण

CO2 सेल इनक्यूबेटर (सान्यो, जापान); CIX100 माइक्रोस्कोप (ओलंपस कॉर्पोरेशन, जापान); 5424R सेंट्रीफ्यूज (एपपॉर्फ, जर्मनी); स्वचालित जल शोधक (मिलिपोर, यूएसए); सनराइज बेसिक एलिसा (TECAN, स्विट्जरलैंड); THZ-C डेस्कटॉप निरंतर तापमान दोलक (सूज़ौ पेइयिंग प्रायोगिक उपकरण कं, लिमिटेड); ईएएस वाई-एनएलसी - II तरल क्रोमैटोग्राफ (थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूएसए); एलटीक्यू-ऑर्बिट्रैप आयन ट्रैप टेंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूएसए); केशिका तरल क्रोमैटोग्राफी कॉलम (माइक्रोम बायोरिसोर्स, यूएसए)।

2 तरीके

2.1 सेल संस्कृति और प्रशासन

रॉ264. DMEM उच्च ग्लूकोज माध्यम में 7 कोशिकाओं को संवर्धित किया गया जिसमें 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम और 1 प्रतिशत दोहरी एंटीबॉडी थी, और 5 प्रतिशत CO2 युक्त 37 डिग्री संतृप्त आर्द्रता निरंतर तापमान इनक्यूबेटर में रखा गया था। हर 2-3 दिनों में एक बार पास करें और प्रयोग करें जब कोशिकाएं लघुगणकीय विकास चरण में प्रवेश करती हैं। कोशिकाओं को खाली समूह, लिपोपॉलेसेकेराइड समूह, या सिस्टैंच डेजर्टिकोला के कम आणविक भार चीनी समूह में विभाजित करें। एलपीएस समूह की कोशिकाओं को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में 1 मिलीग्राम · एल -1 एलपीएस समाधान के साथ इलाज किया गया; एलएमएससी समूह कोशिकाओं को विभिन्न द्रव्यमान सांद्रता (0 25, 0. 5,1,2 जी · एल - 1 के एलएमएससी समाधान के साथ जोड़ा गया था; प्रशासन से पहले फ़िल्टर झिल्ली के साथ फ़िल्टर); रिक्त समूह कक्षों में सीरम-मुक्त कल्चर माध्यम की समान मात्रा जोड़ें ।

2.2 तटस्थ लाल विधि का उपयोग करके मैक्रोफेज फैगोसाइटिक गतिविधि का निर्धारण

रॉ264. 7 कोशिकाओं को 96-वेल प्लेट पर सीड किया गया और एलपीएस या एलएमएससी के विभिन्न सांद्रण वाले सीरम-मुक्त माध्यम या सीरम-मुक्त माध्यम से प्रतिस्थापित किए जाने से पहले रातोंरात सुसंस्कृत किया गया। 48 घंटे की खेती के बाद, कोशिकाओं को 0 075 प्रतिशत तटस्थ लाल घोल से बदल दिया गया और 4 घंटे के लिए 37 डिग्री पर ऊष्मायन जारी रखा। सतह पर तैरनेवाला को अवशोषित और त्यागें, पीबीएस के साथ दो बार धोएं, और 4 डिग्री पर कोशिकाओं को लाइसे करने के लिए सेल लाइसिस समाधान (ग्लेशियल एसिटिक एसिड इथेनॉल 1:1) का उपयोग करें। पूर्ण लिसिस के बाद, प्रत्येक कुएं (A540 एनएम) के अवशोषण को मापें।

2.3 सेल सतह पर तैरनेवाला में कोई रिहाई का पता लगाने

रॉ264. 7 कोशिकाओं को 48-वेल प्लेट पर सीड किया गया और एलपीएस या एलएमएससी के विभिन्न सांद्रण वाले सीरम-मुक्त माध्यम या सीरम-मुक्त माध्यम से प्रतिस्थापित किए जाने से पहले रातोंरात सुसंस्कृत किया गया। प्रेरण संस्कृति के 24 घंटे के बाद, सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करें और अभिकर्मक किट के निर्देशों के अनुसार प्रत्येक अच्छे सेल के सतह पर तैरनेवाला में सं सामग्री को मापें।

मैक्रोफेज व्यवहार्यता के लिए 2.4 एमटीटी परख

रॉ264. 7 कोशिकाओं को एक 96-वेल प्लेट पर टीका लगाया गया था, और रात भर की खेती के बाद, उन्हें सीरम-मुक्त माध्यम या सीरम-मुक्त माध्यम से बदल दिया गया था जिसमें एलपीएस या एलएमएससी की विभिन्न सांद्रता थी और 24 घंटे तक सुसंस्कृत किया जाता रहा। प्रत्येक अच्छे सेल को 0 इनक्यूबेट 5 जी · एल -1 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एमटीटी घोल से बदलें, फिर एमटीटी प्रतिक्रिया उत्पाद को डाइमिथाइल सल्फोक्साइड के साथ भंग करें, और तरंग दैर्ध्य पर प्रत्येक कुएं के अवशोषण को मापें एक एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख का उपयोग करके 570 एनएम।

2.5 सिस्टैंच डेजर्टिकोला लो मॉलिक्यूलर शुगर एफिनिटी मीडियम तैयार करना

संदर्भ विधि [8], एपॉक्सी-सक्रिय agarose राल 0 5 जी वजन, इसे 4 0 मिनट के लिए विआयनीकृत पानी में भंग करें, अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और जेल को पूरी तरह से बनाने के लिए प्रक्रिया को तीन बार दोहराएं स्टैंडबाय के लिए सूजन (इसकी मात्रा लगभग 1 एमएल है)। 0 लें, 1 एमएल LMSC घोल (1 g · mL - 1) या विलायक के समतुल्य आयतन के साथ 5 mL फूला हुआ एपॉक्सी-सक्रिय agarose जेल मिलाएं, और रात भर 37 डिग्री पर लगातार तापमान शेकर में इनक्यूबेट करें। सतह पर तैरनेवाला बेरंग होने तक विआयनीकृत पानी के साथ कई बार रिक्त या LMSC युग्मित agarose माध्यम को धो लें, फिर 1 एमएल इथेनॉलमाइन समाधान (1 mol · L -1) जोड़ें और इसे लगातार तापमान मिलाते हुए टेबल पर 37 डिग्री पर सील करें। दो दिन। प्रतिक्रिया पूरी होने के बाद, डबल डिस्टिल्ड वॉटर, NaCl Hac बफर, और NaCl Tris HCl बफर से प्रत्येक को 5 बार साफ करें, और अंत में बैकअप के लिए 01 प्रतिशत NP40 eluent के साथ दो बार 0 वॉश का उपयोग करें।

2.6 लक्ष्य समूहों का संवर्धन और पहचान

7 कोशिकाओं से RAW264 कुल प्रोटीन निकालने के लिए (0 5 0 को 5 जी · एल -1 में क्रमशः μ एल रिक्त माध्यम या एलएमएससी आत्मीयता माध्यम, एक रिक्त नियंत्रण समूह और एलएमएससी बाध्यकारी समूह के रूप में जोड़ें ; एक प्रतिस्पर्धी समूह की स्थापना करें जो एक साथ LMSC समाधान और LMSC आत्मीयता माध्यम जोड़ता है। प्रत्येक समूह को मिलाने के बाद, LMSC को लक्ष्य प्रोटीन से पूरी तरह से बाँधने के लिए रात भर 4 डिग्री पर इनक्यूबेट करें। प्रतिक्रिया के बाद, 0 का उपयोग करें एफ़िनिटी माध्यम को 01 से 6 बार धोएं आत्मीयता माध्यम से अवशिष्ट मुक्त प्रोटीन को हटाने के लिए प्रतिशत NP40 eluent। बाध्यकारी प्रोटीन को अलग करने के लिए 8 मिनट के लिए 98 डिग्री पर 2 × नमूना लोडिंग बफर के बराबर मात्रा में धोया हुआ आत्मीयता माध्यम जोड़ें। सतह पर तैरनेवाला चूसो, एसडीएस-पेज जेल का संचालन करें वैद्युतकणसंचलन, और फिर किट के निर्देशों के अनुसार चांदी के दाग का विश्लेषण करें।

2.7 लक्ष्य प्रोटीन समूहों की पहचान के लिए एलसी-एमएस/एमएस विधि

संदर्भ विधि [8] का उपयोग द्वि-आयामी नैनो एचपीएलसी-एलटीक्यू-ऑर्बिट्रैप/एमएस टेंडेम लीनियर आयन ट्रैप मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नैनो एचपीएलसी-एलटीक्यू-ऑर्बिट्रैप/एमएस) का उपयोग करके विशिष्ट बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान करने के लिए किया गया था। विशिष्ट विधि इस प्रकार है: सबसे पहले, ट्रिप्सिन का उपयोग लक्ष्य पेप्टाइड सेगमेंट का मिश्रण प्राप्त करने के लिए जेल के भीतर अलग-अलग व्यक्त प्रोटीन बैंड को हाइड्रोलाइज करने के लिए किया जाता है। पेप्टाइड मिश्रण को 0 बाईस μ के अधीन किया गया था, एक सूक्ष्म झिल्ली के साथ छानने के बाद, केशिका तरल क्रोमैटोग्राफी कॉलम में 10 प्रतिशत μ एल नमूना समाधान जोड़ें। क्रोमैटोग्राफिक स्थितियां: मोबाइल चरण 0 1 प्रतिशत फार्मिक एसिड जलीय घोल (ए) - एसीटोनिट्राइल (बी), ढाल क्षालन की स्थिति तालिका 1 में दिखाई गई है। मास स्पेक्ट्रम स्थिति: इलेक्ट्रिक स्प्रे वोल्टेज 1 8 केवी, सकारात्मक आयन है मोड डेटा संग्रह, पूर्ण स्कैन रेंज m/z 350-2 000 पर सेट; 35 V पर द्वितीयक टक्कर ऊर्जा सेट के साथ 15 सबसे मजबूत चोटियों पर MS/MS स्कैनिंग करें। अंत में, प्राप्त पेप्टाइड खंड डेटा को खोजने और मिलान करने के लिए SEQUEST खोज सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें।

पूर्ण आकार की मेज

नोट: प्रवाह दर सभी 300 nL · मिनट-1 हैं।

2.8 कार्य लक्ष्य समूह मार्ग और कार्यात्मक विश्लेषण

साइटोस्केप 3 में पहचाने गए लक्ष्य प्रोटीन को आयात करें 5.1 सॉफ्टवेयर में, KEGG, REACTOME पाथवे और विकी पाथवे विश्लेषण के लिए ClueGO प्लगइन का उपयोग किया गया था, और प्रजातियों को P के साथ चूहों के रूप में सेट किया गया था।<0 05 as the significance threshold, and the rest use default parameters.

2.9 सांख्यिकीय विश्लेषण

सभी प्रायोगिक डेटा x फ़ील्ड ± s में व्यक्त किए जाते हैं। ग्राफपैड प्रिज्म -6 02 का उपयोग करते हुए सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग विचरण (एनोवा) के एकतरफा विश्लेषण के लिए किया गया था, पी के साथ<0 01 having a very significant difference.

3) परिणाम और चर्चा

3.1 सिस्टैंच डेजर्टिकोला से कम आणविक चीनी RAW264 को प्रभावित करती है 7-सेल फैगोसाइटिक गतिविधि का प्रभाव

सिस्टैंच डेजर्टिकोला में मैक्रोफेज सक्रियण के सक्रिय घटकों पर हमारे शोध समूह द्वारा किए गए एक अन्य अध्ययन में, एलएमएससी मैक्रोफेज सक्रियण के साथ एक प्रकार का घटक हो सकता है।.

सिस्टैंच डेजर्टिकोला पर प्रायोगिक अध्ययन

इस प्रयोग ने पहली बार RAW264 निर्धारित करने के लिए तटस्थ लाल विधि का उपयोग किया था। 7 माउस पेरिटोनियल मैक्रोफेज की इन विट्रो कल्चर प्रणाली को LMSC के विभिन्न सांद्रता के साथ उत्तेजित किया गया था ताकि RAW264 पर LMSC के प्रभाव की जांच की जा सके। 7 सेल फागोसाइटिक गतिविधि का प्रभाव। खाली नियंत्रण समूह की तुलना में, सकारात्मक नियंत्रण दवा एलपीएस ने 48 घंटों के लिए कोशिकाओं को उत्तेजित किया, सेलुलर फैगोसाइटिक गतिविधि (पी<0 01); LMSC at 0 Each administration group of 25-2 g · L-1 significantly increased RAW264 The phagocytic activity of 7 cells (P<0 01), and exhibit dose-dependent characteristics. The above results suggest that LMSC may have activated RAW264 The role of 7 cells is shown in Figure 1.

रिक्त नियंत्रण समूह की तुलना में, 1) पी<0 01 (same as Figure 2).

अंजीर. 1 RAW264 की फैगोसाइटिक गतिविधि पर सिस्टैंच डेजर्टिकोला से कम आणविक भार सैकराइड्स का प्रभाव। 7 कोशिकाएँ

3.2 सिस्टैंच डेजर्टिकोला से कम आणविक चीनी RAW264 को प्रभावित करती है 7 कोशिकाओं में NO रिलीज का प्रभाव

NO शरीर में प्रतिरक्षा विनियामक प्रभावों वाला एक महत्वपूर्ण साइटोकाइन है [9], व्यापक रूप से RAW 264 7-कोशिका सक्रियण प्रतिक्रिया को विनियमित करने में शामिल होने की सूचना दी गई है। RAW264 पर LMSC के प्रभाव की जांच करने के लिए 7 कोशिकाओं के सक्रियण प्रभाव को निर्धारित किया गया था, और LMSC उत्तेजना के बाद सेल सतह पर तैरनेवाला में NO की सामग्री को मापा गया था। मैक्रोफेज एक्टिवेशन पॉजिटिव ड्रग के साथ LPS ग्रुप में NO रिलीज ब्लैंक कंट्रोल ग्रुप (P<0. 05) 01), similar to it, 0 RAW264 in the LMSC administration group with 3 doses of 5, 1, 2 g · L-1 The NO release of 7 cells was significantly higher than that of the blank control group (P<0. 05) 01), and it is dose-dependent, as shown in Figure 2. The above results indicate that LMSC can promote RAW264 The effect of 7 cells releasing NO confirms its macrophage activation effect.

अंजीर। RAW264 से NO रिलीज पर सिस्टैंच डेजर्टिकोला से कम आणविक भार सैकराइड्स के 2 प्रभाव। 7 कोशिकाएँ

3.3 सिस्टैंच डेजर्टिकोला से कम आणविक चीनी RAW264 को प्रभावित करती है 7-सेल व्यवहार्यता का प्रभाव

साइटोटोक्सिसिटी एक महत्वपूर्ण कारक है जो नई दवाओं के विकास को प्रतिबंधित करता है और उनकी प्रभावकारिता को प्रभावित करता है। यह जांचने के लिए कि क्या इस प्रयोग में प्रयुक्त LMSC की खुराक में संभावित साइटोटोक्सिसिटी है, LMSC प्रशासन 7 सेल व्यवहार्यता के बाद RAW264 का पता लगाने के लिए MTT विधि का उपयोग किया गया था। 0 25-2 जी · एल -1 हस्तक्षेप पर एलएमएससी RAW264 24 घंटे 7 कोशिकाओं के बाद, सेल व्यवहार्यता पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ा, और उपरोक्त परिणाम बताते हैं कि 0 25-2 जी · एल {{8 }} LMSC बनाम RAW264 7 में कोई साइटोटोक्सिसिटी नहीं है, जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है।

चित्र 3 RAW264 पर सिस्टैंच डेजर्टिकोला से कम आणविक भार सैकराइड्स के प्रभाव। 7 सेल व्यवहार्यता

3. 4 सिस्टंच डेजर्टिकोला में कम आणविक भार चीनी के मैक्रोफेज सक्रियण के लिए लक्ष्य समूहों का संवर्धन और पहचान

एपॉक्साइड-सक्रिय एग्रोस जेल एक ठोस चरण वाहक है जो व्यापक रूप से सैकराइड्स, प्रोटीन और अन्य अणुओं को हाइड्रॉक्सिल या अमीनो समूहों के युग्मन के लिए उपयोग किया जाता है। LMSC मुख्य रूप से हाइड्रॉक्सिल युक्त फ्रुक्टोज, मैनिटोल और अन्य घटकों से बना है। इस अध्ययन में, निहित हाइड्रॉक्सिल एपॉक्सी सक्रिय समूहों के साथ प्रतिक्रिया कर सकता है ताकि एलएमएससी आत्मीयता माध्यम का निर्माण करने के लिए एपॉक्सी-सक्रिय एग्रोज जेल माइक्रोस्फीयर की सतह पर सिस्टैंच डेजर्टिकोला की कम आणविक चीनी को बांधा जा सके, जैसा कि चित्र 4ए में दिखाया गया है। आणविक आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी तकनीक का उपयोग करते हुए, LMSC आत्मीयता माध्यम को RAW264 के साथ मिलाया गया था, लक्ष्य प्रोटीन समूह को सीधे पकड़ने के लिए 7 कोशिकाओं के कुल प्रोटीन अर्क को इनक्यूबेट करें। लक्ष्य समूह पर सिल्वर स्टेनिंग का प्रदर्शन किया गया, जैसा कि चित्र 4बीमें दिखाया गया है। LMSC एफिनिटी मीडियम बाइंडिंग ग्रुप के प्रोटीन बैंड अनकैप्ड LMSC ब्लैंक मीडियम ग्रुप की तुलना में काफी अधिक थे, जबकि LMSC प्रतिस्पर्धी समूह ने लक्ष्य प्रोटीन के साथ अत्यधिक मुक्त LMSC प्रतिस्पर्धी बाइंडिंग के कारण एफिनिटी मीडियम कैप्चर किए गए लक्ष्यों की संख्या को काफी कम कर दिया। इसके बाद, प्रत्येक प्रोटीन बैंड की पहचान करने के लिए एचपीएलसी एमएस/एमएस विधि का उपयोग किया गया था, और कुल 24 लक्ष्य प्रोटीन जैसे कि ईईएफ2 प्राप्त किए गए थे, जो दर्शाता है कि सिस्टैंच डेजर्टिकोला से कम आणविक चीनी इन लक्ष्य प्रोटीनों की संयुक्त कार्रवाई के माध्यम से मैक्रोफेज सक्रियण का कारण बन सकती है।

3. 5 सिस्टैंच डेजर्टिकोला में कम आणविक चीनी मैक्रोफेज के सक्रियण लक्ष्य समूह से संबंधित क्रिया के तंत्र का विश्लेषण

LMSC लक्ष्य प्रोटीन समूह में शामिल जैविक मार्गों की जांच करने के लिए KEGG, REACTOME, और Wiki सिग्नलिंग पाथवे डेटाबेस का उपयोग करके इस अध्ययन में RAW264 पैदा करने वाले Cistanche डेजर्टिकोला के कम आणविक चीनी लक्ष्य प्रोटीन की जांच करने के लिए मैक्रोफेज सक्रियण के तंत्र का विश्लेषण किया गया है। सिग्नल पाथवे संवर्धन के विश्लेषण के परिणाम चित्र 5 और तालिका 2 में दिखाए गए हैं। एलएमएससी मैक्रोफेज सक्रियण लक्ष्य प्रोटीन मुख्य रूप से 10 मैक्रोफेज सक्रियण-संबंधित सिग्नल पाथवे में भाग लेते हैं, जिन्हें निम्नलिखित 4 श्रेणियों में संक्षेपित किया जा सकता है: एफसी रिसेप्टर आश्रित फैगोसाइटोसिस, टीएनएफ-एनएफ - κB सिग्नलिंग मार्ग, ग्लाइकोलाइसिस/ग्लूकोनोजेनेसिस, साइट्रिक एसिड (TCA) चक्र, और श्वसन इलेक्ट्रॉन परिवहन।

4। चर्चा

आधुनिक शोध की रिपोर्ट है कि पारंपरिक चीनी दवाओं और प्राकृतिक दवाओं में जैविक गतिविधियों की एक विस्तृत श्रृंखला है, लेकिन उनकी जटिल रासायनिक संरचना के कारण, पारंपरिक चीनी दवाओं और प्राकृतिक दवाओं की जटिल घटक प्रणालियों की कार्रवाई के तंत्र को स्पष्ट करने में अभी भी चुनौतियां हैं। आणविक आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी के छोटे अणु लक्ष्य प्रोटीन कैप्चर तकनीक के आधार पर, यह अध्ययन रासायनिक संरचना की सामान्यता के साथ संयुक्त है कि सिस्टैंच डेजर्टिकोला (LMSC) के आणविक चीनी के मुख्य घटकों में सभी हाइड्रॉक्सिल समूह हैं, और LMSC बंधुआ एपॉक्सी सक्रिय agarose जेल माइक्रोस्फीयर का निर्माण किया है। आत्मीयता माध्यम के रूप में, मैक्रोफेज सक्रियण के साथ LMSC लक्ष्य प्रोटीन समूहों की पहचान करने और लक्ष्य समूह से संबंधित सिग्नल ट्रांसडक्शन पाथवे का विश्लेषण करने के लिए, इसके अलावा, LMSC मैक्रोफेज सक्रियण के तंत्र का पता चला था।

सिस्टंच के प्रभाव-प्रतिरक्षा में सुधार

मैक्रोफेज शरीर में एक प्रकार की महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया कोशिकाएं हैं जो दानेदार एंटीजन को फागोसिटोज कर सकती हैं। बहिर्जात उत्तेजनाओं के कारण मैक्रोफेज की सक्रियता मुख्य रूप से फागोसाइटिक फ़ंक्शन की वृद्धि और सिग्नलिंग मार्गों की एक श्रृंखला के कारण NO और अन्य कारकों की रिहाई से प्रकट होती है। LMSC खुराक पर निर्भर सुधार RAW264 7 कोशिकाओं की फैगोसाइटिक गतिविधि और NO रिलीज़ में उल्लेखनीय वृद्धि से संकेत मिलता है कि LMSC में मैक्रोफेज सक्रियण प्रभाव है। एलएमएससी मैक्रोफेज एक्टिवेशन टारगेट के सिग्नल पाथवे का समृद्ध विश्लेषण जैव सूचना विज्ञान का उपयोग करके आणविक आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा कब्जा कर लिया गया है, इसका मतलब है कि एलएमएससी रिसेप्टर निर्भर फैगोसाइटोसिस, टीएनएफ-एनएफ-κ बी सिग्नलिंग मार्ग, ग्लाइकोलाइसिस/ग्लूकोनोजेनेसिस, साइट्रिक एसिड (टीसीए) चक्र द्वारा एफसी को नियंत्रित करता है, और श्वसन इलेक्ट्रॉन परिवहन बृहतभक्षककोशिका सक्रियण भूमिका निभाते हैं।

A. आत्मीयता माध्यम का सूक्ष्म लक्षण वर्णन (बार =25 μ मीटर); B. समृद्ध लक्ष्यों का सिल्वर स्टेन्ड जेल वैद्युतकणसंचलन।

चित्र 4 सिस्टैंच डेजर्टिकोला से कम आणविक भार सैकराइड के लिए लक्ष्य की पहचान

अंजीर. 5 Cistanche डेजर्टिकोला से कम आणविक भार सैकराइड्स के लक्ष्य के लिए पाथवे संवर्धन विश्लेषण

एफसी रिसेप्टर्स सेल सतह रिसेप्टर्स हैं और मैक्रोफेज पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स [11] में से एक हैं। वे कोशिका की सतह पर स्थित होते हैं और विशेष रूप से बहिर्जात कणों को पहचान सकते हैं, जिससे वे कोशिका की सतह से बंध जाते हैं। एफसी रिसेप्टर-मध्यस्थता फागोसाइटोसिस सिग्नल ट्रांसडक्शन डाउनस्ट्रीम एक्टिन पोलीमराइजेशन और फागोसाइट गठन [11] का कारण बन सकता है। LMSC रॉ 264 7 सेल फागोसाइटिक गतिविधि में काफी सुधार करता है, जो विभिन्न Fcs के बंधन से संबंधित हो सकता है जैसे Hsp90 रिसेप्टर सिग्नलिंग संबंधित प्रोटीन Fc रिसेप्टर आश्रित फागोसाइटोसिस को विनियमित करता है। एनएफ- κ बी सिग्नलिंग मार्ग को मैक्रोफेज सक्रियण [12] के लिए एक महत्वपूर्ण सिग्नलिंग मार्ग माना जाता है। एनएफ- κ बी नाभिक में एक महत्वपूर्ण प्रतिलेखन नियामक कारक है, एनएफ- κ बी सिग्नलिंग मार्ग का सक्रियण साइटोप्लाज्म में एनएफ का कारण बन सकता है- κ बी सक्रिय होता है और नाभिक में स्थानांतरित होता है, जिससे विभिन्न साइटोकिन्स की जीन अभिव्यक्ति में मध्यस्थता होती है, और एनओ मध्यस्थ। LMSC उत्तेजना RAW 264 7 कोशिकाओं को बड़ी मात्रा में NO जारी करने का कारण बन सकती है, जो TNF से संबंधित हो सकती है, जैसे Eef 2- NF- κ B सिग्नलिंग पाथवे और अन्य संबंधित प्रोटीन NF को सक्रिय करते हैं। - κ बी सिग्नलिंग पाथवे और इससे जुड़े यूकेरियोटिक अनुवाद दीक्षा और विस्तार प्रक्रियाएं लागू की जाती हैं। इसके अलावा, एलएमएससी से संबंधित लक्ष्यों में दो कार्बोहाइड्रेट चयापचय मार्ग भी शामिल हैं: ग्लाइकोलिसिस/ग्लूकोनोजेनेसिस, साइट्रिक एसिड (टीसीए) चक्र, और श्वसन इलेक्ट्रॉन परिवहन। यह अनुमान लगाया गया है कि LMSC में फ्रुक्टोज और मैनिटोल जैसे विभिन्न कम आणविक शर्करा होते हैं, जो रॉ 264 7 कोशिकाओं को प्रभावित कर सकते हैं, ऊर्जा प्रदान करते हैं, और ग्लूकोज चयापचय से संबंधित एल्डोआ जैसे प्रोटीन को बांधते हैं, जिससे ग्लूकोज चयापचय से संबंधित मार्ग नियंत्रित होते हैं।

सारांश में, इस अध्ययन ने आणविक आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी-संबंधित लक्ष्य प्रोटीन मान्यता प्रौद्योगिकी का उपयोग करके एलएमएससी मैक्रोफेज सक्रियण के लिए 24 विभिन्न कार्यात्मक लक्ष्य प्रोटीनों की पहचान की; लक्ष्य प्रोटीन-संबंधित सिग्नलिंग मार्गों के समृद्ध विश्लेषण से पता चलता है कि एलएमएससी एफसी रिसेप्टर निर्भर फागोसाइटोसिस, टीएनएफ-एनएफ-κ बी सिग्नलिंग मार्ग और ग्लूकोज चयापचय प्रक्रिया पर अंततः रॉ 264 7 पर कार्य करता है। मैक्रोफेज सक्रियण। यह अध्ययन सिस्टैंच डेजर्टिकोला में प्रतिरक्षा विनियमन के सक्रिय घटकों और संबंधित तंत्रों को प्रकट करने के लिए सैद्धांतिक समर्थन प्रदान करता है और प्राकृतिक दवाओं में जटिल सक्रिय घटकों के लक्ष्य की पहचान और तंत्र अनुसंधान के लिए विचार भी प्रदान करता है।

तालिका 2 एलएमएससी के लक्ष्यों के लिए पाथवे संवर्धन विश्लेषण

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