सेल मेम्ब्रेन रिपेयर प्रोटीन रीनल फाइब्रोसिस को नियंत्रित करने के लिए ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर सिग्नल ट्रांसडक्शन को कैसे नियंत्रित करता है

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हाइचांग लियू

गुर्दाफाइब्रोसिस तीव्र की प्रगति के साथ जुड़ा हुआ हैगुर्दाक्रोनिक किडनी रोग की चोट। MG53, एक कोशिका झिल्ली की मरम्मत करने वाला प्रोटीन, गुर्दे की उपकला कोशिकाओं को चोट और तीव्र गुर्दे की चोट से बचाने के लिए दिखाया गया है। यहां, हमने के मॉड्यूलेशन में MG53 की भूमिका का मूल्यांकन कियागुर्दाउम्र बढ़ने वाले चूहों में फाइब्रोसिस और एकतरफा मूत्रवाहिनी अवरोध (यूयूओ) के साथ चूहों में प्रगतिशील किडनी फाइब्रोसिस का एक ज्ञात मॉडल है। MG53 के अपस्फीति के साथ चूहों ने एमजी53-उसी उम्र के बरकरार चूहों की तुलना में उम्र के साथ अधिक अंतरालीय फाइब्रोसिस विकसित किया। इसी तरह, MG53 की अनुपस्थिति में,गुर्दाफाइब्रोसिस को बाधित गुर्दे में अक्षुण्ण MG53 के साथ चूहों की तुलना में अतिरंजित अनियंत्रित गुर्दे या शम-संचालित चूहों के गुर्दे की तुलना में अतिरंजित किया गया था। मूत्रवाहिनी बाधितगुर्देMG53 की कमी वाले चूहों ने भी MG53 बरकरार चूहों से मूत्रवाहिनी बाधित गुर्दे की तुलना में काफी अधिक सूजन दिखाई। इन विट्रो प्रयोगों ने प्रदर्शित किया कि MG53 समीपस्थ ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं के नाभिक में प्रवेश कर सकता है और सीधे प्रतिलेखन कारक NF-kB के p65 घटक के साथ बातचीत कर सकता है, MG53 की अनुपस्थिति में बढ़ी हुई सूजन का संभावित विवरण प्रदान करता है। इसका परीक्षण करने के लिए, यूयूओ के अधीन चूहों को इंजीनियर कोशिकाओं या प्रत्यक्ष पुनः संयोजक प्रोटीन वितरण के माध्यम से बढ़ी हुई MG53 अभिव्यक्ति दी गई थी। इसने एनएफ-केबी सक्रियण और सूजन को कम कर दिया और किडनी फाइब्रोसिस को क्षीण कर दिया। इस प्रकार, MG53 की गुर्दे की पुरानी सूजन के उपचार में चिकित्सीय भूमिका हो सकती है और इस तरह से सुरक्षा प्रदान करती हैफाइब्रोसिसजो क्रोनिक किडनी रोग फेनोटाइप की ओर जाता है।

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ट्रांसलेशनल स्टेटमेंट क्रॉनिक इंफ्लेमेशन से फाइब्रोटिक रीमॉडेलिंग होता है जो किडनी की गंभीर चोट से क्रोनिक किडनी डिजीज में भी संक्रमण का कारण बन सकता है। प्रोटीन-भड़काऊ प्रतिलेखन कारक परमाणु कारक-केबी (एनएफ-केबी) का सक्रियण गुर्दे की सूजन के रोगजनन में शामिल है। यहां, हम सबूत देते हैं कि MG53, जो पहले से पहचाना गया सेल मेम्ब्रेन रिपेयर प्रोटीन है, सीधे NF-kB के साथ इंटरैक्ट करता है और इसकी ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को कम करता है। संयोग से, बहिर्जात रूप से प्रशासित MG53 सूजन वाले गुर्दे के फाइब्रोटिक रीमॉडेलिंग को कम कर सकता है। ये निष्कर्ष MG53 और NF-kB के बीच एक सुरक्षात्मक परस्पर क्रिया की ओर इशारा करते हैं, जो सूजन-मध्यस्थता वाले किडनी फाइब्रोसिस के विकास को दर्शाता है। प्रगतिशील किडनी फाइब्रोसिस के उपचार के लिए MG53 का औषधीय प्रशासन एक आशाजनक दृष्टिकोण हो सकता है।

गुर्दे की शिथिलता, जिसे तीव्र गुर्दे की चोट (AKI) या क्रोनिक किडनी रोग (CKD) के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है, पुरानी आबादी में एक महामारी बन गई है। 2017 में, सीकेडी का प्रसार 65 वर्ष और उससे अधिक आयु के 14.5 प्रतिशत लोगों तक पहुंच गया, जिसके परिणामस्वरूप इलाज के लिए 84 अरब डॉलर से अधिक का मेडिकेयर व्यय हुआ।^1,2एकेआई और सीकेडी वृद्ध व्यक्तियों में अधिक आम हैं, मुख्य रूप से चोट की संवेदनशीलता में वृद्धि और उम्र बढ़ने वाले गुर्दे की मरम्मत की कम क्षमता के कारण। नैदानिक ​​अध्ययनों से पता चला है कि सीकेडी एकेआई के लिए एक प्रमुख जोखिम कारक है, और, इसके विपरीत, एकेआई के एपिसोड सीकेडी की प्रगति को अंतिम चरण के गुर्दे की बीमारी की ओर तेज कर सकते हैं। वर्तमान में, AKI का उपचार मुख्य रूप से सहायक है, और स्थापित CKD का उपचार रेनिन-एंजियोटेंसिन-एल्डोस्टेरोन प्रणाली के निषेध के माध्यम से और अब संभवतः सोडियम-ग्लूकोज कोट्रांसपोर्टर -2 निषेध के माध्यम से प्रगति को धीमा करने पर केंद्रित है।^3,4

चोट की गंभीरता के आधार पर, समीपस्थ ट्यूबलर कोशिकाएं, तीव्र चोट का प्रमुख लक्ष्य, कोशिका चक्र की प्रगति में परिवर्तन से गुजर सकती हैं, 5,6 चयापचय, प्रोटीन-सूजन और प्रोफाइब्रोटिक साइटोकिन्स का स्राव, या आंशिक उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण, 8 जो यह निर्धारित करेगा कि रीमॉडेलिंग/मरम्मत सफल होगी या खराब और परिणाम किडनी फाइब्रोसिस, सीकेडी की एक बानगी।9,10 यह रीमॉडेलिंग आमतौर पर गुर्दे की सूजन की पृष्ठभूमि पर होता है,

कम संवहनी आपूर्ति, और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन का उत्पादन और इसमें उपकला कोशिकाओं का नुकसान और कोलेजन का संचय, एक-चिकनी पेशी एक्टिन और फाइब्रोनेक्टिन शामिल हैं; इसका गुर्दा समारोह में गिरावट के साथ एक उच्च संबंध भी है।

पुरानी सूजन फाइब्रोटिक रीमॉडेलिंग की ओर ले जाती है जो एकेआई से सीकेडी में संक्रमण को भी कम कर सकती है। 11–13 संचयी शोध संक्रमण, चोट के कारण गुर्दे की सूजन के रोगजनन में परमाणु कारक-केबी (एनएफ-केबी) प्रतिलेखन कारक की भागीदारी का सुझाव देता है। या प्रत्यारोपण। 11,12,14 विहित एनएफ-केबी मार्ग का सक्रियण एनएफ-केबी (आईकेबी) किनेज के अवरोधक के सक्रियण के साथ शुरू होता है, जिससे फास्फोरिलीकरण और आईकेबीए का क्षरण होता है और एनएफ-केबी हेटेरोडिमर्स का परमाणु अनुवाद होता है।15 गुर्दे की उपकला कोशिकाओं में एनएफ-केबी संकेतन की सक्रियता और घुसपैठ करने वाली प्रतिरक्षा कोशिकाओं को पैथोफिजियोलॉजिकल ट्रिगर्स द्वारा प्राप्त किया जा सकता है जैसे कि लिपोपॉलीसेकेराइड्स (एलपीएस) या इस्किमिया-रीपरफ्यूजन चोट के संपर्क में आना। 16 आणविक प्रोफाइलिंग अध्ययन एनएफकेबी1 को किडनी फाइब्रोसिस के एक प्रमुख चालक के रूप में प्रकट करते हैं।¹⁷किडनी ट्यूबलर कोशिकाओं के अलावा, जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाएं जैसे मैक्रोफेज और डेंड्राइटिक कोशिकाएं भी गुर्दे की चोट, सूजन और फाइब्रोटिक रीमॉडेलिंग में योगदान करती हैं।^13,18–20

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बढ़ते सबूत बताते हैं कि मांसपेशी-व्युत्पन्न स्रावी कारक (यानी, मायोकिंस) गुर्दे की बीमारियों की प्रगति को प्रभावित करने के लिए ऊतक क्रॉसस्टॉक के माध्यम से प्रणालीगत शरीर क्रिया विज्ञान को संशोधित करते हैं।²¹MG53 (जिसे TRIM72 भी कहा जाता है) कोशिका झिल्ली की मरम्मत में एक महत्वपूर्ण कार्य के साथ एक मांसपेशी-समृद्ध त्रिपक्षीय आकृति (TRIM) प्रोटीन है। 22,23 TRIM परिवार के प्रोटीन में प्रतिरक्षा संकेतन के नियमन से लेकर ऊतक मरम्मत तक के विविध कार्य हैं।²⁴MG53-मध्यस्थ झिल्ली की मरम्मत कंकाल की मांसपेशी की तीव्र चोट को कम करने में शामिल है,²⁵गुर्दे,²⁶हृदय,²⁷ फेफड़े, 28 दिमाग,^29,30और त्वचा।³¹हमारे पिछले अध्ययनों ने गुर्दे में MG53 अभिव्यक्ति के निम्न स्तर की पहचान की, जो AKI सुरक्षा में एक प्रमुख घटक है, और MG53 (mg53 / ) में चूहों की कमी तनाव-प्रेरित AKI के लिए अतिसंवेदनशील थी।²⁶हमने हाल ही में यह भी प्रदर्शित किया है कि संचलन में MG53 की निरंतर ऊंचाई ऊतक की चोट की मरम्मत और पुनर्जनन को बढ़ाती है। प्रगतिशील CKD के दौरान किडनी फाइब्रोसिस को संशोधित करने में किडनी-विशिष्ट और बाहरी परिसंचारी MG53 की सापेक्ष भूमिका अभी भी अज्ञात है।

हाल ही में, सूजन के निषेध के माध्यम से ऊतक संरक्षण को संशोधित करने में MG53 की एक उभरती हुई भूमिका, विशेष रूप से NF-kB सिग्नलिंग के मॉड्यूलेशन के माध्यम से विकसित हुई है। उदाहरण के लिए, MG53 TLR4 / NF-kB मार्ग को बाधित करके LPS- प्रेरित न्यूरोटॉक्सिसिटी और न्यूरो-सूजन को कम करता है, और कार्डियक MG53 कार्डियो हाइपरट्रॉफी के दौरान इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रीमॉडेलिंग को नियंत्रित करने के लिए KChIP2 अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है। इसके अलावा, हमने MG53 के दोहरे कार्य का प्रदर्शन किया। सुबलेथल इन्फ्लुएंजा ए वायरस के संक्रमण के दौरान एक घातक हाइपरइन्फ्लेमेटरी प्रतिक्रिया को रोकना, जो अत्यधिक इंटरफेरॉन-बी उत्पादन की विशेषता है, आईआरएफ3/एनएफ-केबी सक्रियण के दमन के माध्यम से और मैक्रोफेज में एब्स्ट्रैक्ट इंट्रासेल्युलर सीए2þ सिग्नलिंग के निषेध के माध्यम से। इसके अलावा, इन्फ्लूएंजा ए की घातक खुराक पर वायरस संक्रमण, MG53 को मृत्यु दर और फेफड़ों की क्षति को रोकने के लिए दिखाया गया था, न कि सीधे तौर पर वायरल टाइटर्स को प्रभावित करके बल्कि साइटोकाइन स्टॉर्म (इंटरफेरॉन-बी, इंटरल्यूकिन -6, और इंटरल्यूकिन -1 बी) को नकारात्मक विनियमन के माध्यम से कम करके। NLRP3 की सूजन और फेफड़ों के पायरोप्टोसिस की रोकथाम। 36 इसके अलावा, बहिर्जात MG53 के उच्च खुराक वाले पुराने उपचार को NF-kB के दमन से जोड़ा गया था। - वृद्ध हृदय में मध्यस्थता सूजन। 37 इन अध्ययनों से पता चलता है कि MG53 सूजन के दौरान असमान NF-kB सिग्नलिंग को संशोधित कर सकता है, लेकिन क्या यह गुर्दे की सूजन के संदर्भ में होता है, इसका अध्ययन नहीं किया गया है।

हमने माना कि MG53 NF-kB की ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को संशोधित करके गुर्दे की सूजन को नियंत्रित करता है और ऐसा करने से गुर्दे की फाइब्रोसिस को कम किया जा सकता है जो पुरानी सूजन के परिणामस्वरूप होता है। इसी परिकल्पना के समाधान के लिए यह अध्ययन किया गया है।

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विधि

पशु अध्ययन

जानवरों के साथ सभी प्रयोग प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य गाइड संस्थान का पालन करते हैं और ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का पालन करते हैं। आयु-मिलान जंगली प्रकार (WT) या mg53^-/-129S1 / SvImJ स्ट्रेन के गैर-लिटरेमेट्स का उपयोग उम्र-निर्भर और एकतरफा मूत्रवाहिनी अवरोध (UUO) -इन्फेक्टेड किडनी फाइब्रोसिस के मॉड्यूलेशन में MG53 की भूमिका को स्थापित करने के लिए किया गया था। C57B6 / J चूहों (9-10 सप्ताह) को जैक्सन लैब्स से खरीदा गया था।

गुर्दे की चोट के अध्ययन के लिए, चूहों (9-12 सप्ताह) को गुर्दे की फाइब्रोसिस को प्रेरित करने के लिए यूयूओ के अधीन किया गया था। चूहे को आइसोफ्लुरेन (1.5 प्रतिशत -2.0 प्रतिशत) के माध्यम से संवेदनाहारी किया गया ताकि संज्ञाहरण के एक गहरे विमान को सुनिश्चित किया जा सके। UUO प्रक्रिया बाएं मूत्रवाहिनी को 5-0 सर्जिकल रेशम के साथ प्रकाशित प्रोटोकॉल के अनुसार दो बार लिगेट करके की गई थी। 38 शाम के चूहों में केवल पेट की त्वचा का चीरा था। प्रतिरोधी गुर्दे की चोट पर rhMG53 के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, UUO चूहों के 1 समूह ने rhMG53 (2 mg/kg) को पूंछ शिरा इंजेक्शन के माध्यम से UUO सर्जरी के तुरंत बाद शुरू किया (दिन 0) और फिर प्रतिदिन 7 दिनों के लिए, 2 के साथ। 9 और 11 दिनों में अतिरिक्त खुराक। यूयूओ चूहों के एक नियंत्रण समूह ने उसी अनुसूची के अनुसार खारा इंजेक्शन प्राप्त किया। यूयूओ सर्जरी के बाद 12 दिन में चूहे मारे गए थे, किडनी को फॉस्फेट-बफर खारा के साथ सीटू में सुगंधित किया गया था, और यूयूओ किडनी से ऊतक के नमूने और ऊतक विज्ञान और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए contralateral गुर्दे एकत्र किए गए थे।

अलग-अलग अध्ययनों में, WT और mg53^-/-चूहों ने यूयूओ या शम सर्जरी करवाई और ऑपरेशन के 7 दिन बाद उन्हें मार दिया गया। MG53 को सेल-आधारित थेरेपी दृष्टिकोण का उपयोग करके चूहों को दिया गया था। 39 RAW 264.7 मैक्रोफेज 24 घंटे के लिए डॉक्सीसाइक्लिन (DOX) पर निर्भर विज्ञापन tPA-MG53-चेरी वायरल कणों से संक्रमित थे। संक्रमित कोशिकाओं ({{10}} /100 एमएल खारा प्रति माउस की सांद्रता में) सर्जरी के तुरंत बाद चूहों में पूंछ की नस इंजेक्ट की गई (दिन 0 इंजेक्शन)। चूहे को 0, 1, 3, और 6 दिनों में Ad-tPA-MG53 ट्रांसड्यूस्ड RAW कोशिकाओं के 4 इंजेक्शन मिले। दिन 0 सेल इंजेक्शन के तुरंत बाद, चूहों को एक समूह में यादृच्छिक रूप से प्राप्त किया गया था और एक समूह जिसे DOX प्राप्त नहीं हुआ था (2) मिलीग्राम/एमएल 5 प्रतिशत सुक्रोज घोल में) उनके पीने के पानी में 7 दिनों के लिए और फिर मार डाला। ऊतक विज्ञान, आरएनए और प्रोटीन विश्लेषण के लिए यूयूओ किडनी और contralateral किडनी से ऊतक के नमूने एकत्र किए गए थे।

सांख्यिकीय विश्लेषण डेटा को साधन-एसडी के रूप में व्यक्त किया जाता है। 2 प्रायोगिक बुनियादी अनुसंधान एच ली एट अल की तुलना करते समय समूहों के भीतर एक तुलना छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके की गई थी। MG53 किडनी फाइब्रोसिस में NF-kB को नियंत्रित करता है 2 किडनी इंटरनेशनल (2 0 21) -, ----समूह और 1-2 से अधिक समूहों के लिए विचरण का विश्लेषण (ग्राफपैड प्रिज्म 8.2; ग्राफपैड) इसके बाद बोनफेरोनी या होल्म-सिडक बहु तुलना परीक्षण तदर्थ। P <0.05 का="" मान="" सांख्यिकीय="" रूप="" से="" महत्वपूर्ण="" माना="" जाता="">

अनुपूरक तरीके हिस्टोलॉजिक मूल्यांकन, सीरम क्रिएटिनिन मापन, प्लास्मिड निर्माण, सेल कल्चर और प्राथमिक ट्यूबलर एपिथेलियल सेल अलगाव, एडेनोवायरस तैयारी और सेल संक्रमण, एनएफ केबी पी 65 परमाणु अनुवाद परख, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और कन्फोकल इमेज, एनएफ-केबी ल्यूसिफरेज रिपोर्टर परख, साइटोकाइन सहित पूर्ण तरीके। एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख, ऊतक विभाजन, इम्युनोब्लॉटिंग, कोइम्यूनोप्रेजर्वेशन, क्वांटिटेटिव रियल-टाइम पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (सप्लीमेंट्री टेबल S1), और rhMG53 प्रोडक्शन सप्लीमेंट्री मेथड्स में हैं।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा अर्क: गुर्दे की बीमारी का इलाज

परिणाम

MG53 के अपस्फीति के साथ चूहे उम्र पर निर्भर किडनी फाइब्रोसिस विकसित करते हैं

हमने mg53 में गुर्दे के कार्य और फाइब्रोसिस पर उम्र बढ़ने के प्रभाव की तुलना की^-/-और WT चूहों। हमने अपने पिछले अवलोकन की पुष्टि की कि यद्यपि MG53 के साथ और बिना युवा चूहों (2 महीने) के सीरम क्रिएटिनिन स्तर काफी भिन्न नहीं थे, पुराने (16-20 महीने) mg53-/-चूहों ने आयु-मिलान वाले डब्ल्यूटी नियंत्रण (चित्रा 1 ए) की तुलना में काफी अधिक सीरम क्रिएटिनिन का प्रदर्शन किया। ट्राइक्रोम धुंधला के आधार पर, हमने पाया कि mg53-/-डब्ल्यूटी चूहों की तुलना में चूहों में किडनी फाइब्रोसिस अधिक था, जो 5 महीने की उम्र से शुरू होता है और 20 महीने की उम्र (चित्रा 1 बी और सी) तक जारी रहता है। इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला का उपयोग ल्यूकोसाइट्स, मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज की घुसपैठ पर 2- महीने और 5- महीने पुराने माउस किडनी (चित्रा 1 डी और ई) में एमजी53 के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। युवा WT और mg53-/- चूहों की किडनी में इंट्रारेनल ल्यूकोसाइट्स के समान स्तर थे, लेकिन 5-महीने के चूहों में WT किडनी की तुलना में mg53 / किडनी में काफी अधिक भड़काऊ कोशिकाएं पाई गईं।

इसके अलावा, चिकनी पेशी एक्टिन और फ़ाइब्रोनेक्टिन के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, 2 बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन जो आमतौर पर किडनी फाइब्रोसिस के क्षेत्रों में पाए जाते हैं, गुर्दे के ग्लोमेरुली और ट्यूबलोइंटरस्टिटियम में धुंधला (3- से 8- गुना) बढ़ा हुआ दिखाया गया है। {4}}महीने पुराना मिलीग्राम53-/- चूहों की तुलना 10-महीने पुराने WT चूहों (सप्लीमेंट्री फिगर S1) से की जाती है।

UUO बढ़े हुए गुर्दे की सूजन और फाइब्रोसिस को mg53-/- चूहों में प्रेरित करता है। इम्युनोब्लॉटिंग द्वारा पता लगाए गए किडनी MG53 के स्तर में UUO (चित्र 2a) के 7 दिन बाद काफी वृद्धि हुई है। mg53-/- UUO किडनी ने WT UUO किडनी (चित्र 2b) की तुलना में 30 प्रतिशत अतिरिक्त ट्राइक्रोम-दाग वाले क्षेत्र के साथ अतिरंजित फाइब्रोसिस प्रदर्शित किया।

MG53 NF-kB सक्रियण और p65 परमाणु स्थानीयकरण को नियंत्रित करता है

UUO मॉडल में NF-kB (p65) की गतिविधि का मूल्यांकन किया गया था। WT और mg53 / चूहों से UUO किडनी में कुल p65 (t-p65) की संख्या में काफी वृद्धि हुई थी, लेकिन NF-kB सक्रियण, जिसे p65 के फॉस्फोराइलेशन के रूप में मूल्यांकन किया गया था, mg53 / UUO में अधिक (16- गुना) था। बेशर्म संचालित जानवरों (चित्रा 3 ए) की तुलना में डब्ल्यूटी यूयूओ किडनी (2- गुना) की तुलना में किडनी। हमने बाधित गुर्दे में वृद्धि कारक b1 (TGF-b1), प्लास्मिनोजेन एक्टीवेटर इनहिबिटर -1 (PAI -1), और कोलेजन टाइप I अल्फा 1 (Col1a1) को बदलने के सापेक्ष RNA स्तरों का विश्लेषण किया। 40 हम डब्ल्यूटी और एमजी53 / (चित्रा 3 बी) से यूयूओ किडनी में बेशर्म जानवरों और समान प्रेरण (TGF-b1, w10 गुना; PAI -1, w40 गुना; Col1a1, w40 गुना) में जीन अभिव्यक्ति के निम्न स्तर का पता लगाया। सामान्य परिस्थितियों में वृक्क प्रांतस्था में MG53 के स्थानिक वितरण की जांच करने के लिए, वृक्क ऊतक अंशों का विश्लेषण किया गया। हमने कुल निकाले गए परमाणु प्रोटीन की तुलना में नियमित रूप से 10-कुल साइटोसोल प्रोटीन को गुना अधिक प्राप्त किया। t-p65 का स्तर WT और mg 53-/- चूहों के बीच साइटोसोलिक अंश में तुलनीय था, लेकिन mg 53-/- चूहों (चित्र 3c) के परमाणु अंश में अधिक था। MG53 को साइटोसोल अंश (ट्यूबुलिन के साथ साइटोसोल मार्कर के रूप में) में पाया गया था। अप्रत्याशित रूप से, परमाणु अंश (परमाणु अंश मार्कर के रूप में हिस्टोन H3 के साथ) पर MG53 की एक महत्वपूर्ण मात्रा का पता चला था।

इस खोज की पुष्टि करने के लिए, हमने कंकाल की मांसपेशी के अंशों (सप्लीमेंट्री फिगर S2) में MG53 स्थानीयकरण की भी जांच की। हमने अपने पिछले अध्ययनों को पुन: प्रस्तुत किया जिसमें MG53 ने साइटोसोल और सार्कोलेम्मल झिल्ली (झिल्ली अंश के मार्कर के रूप में सोडियम-पोटेशियम एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट) को स्थानीयकृत किया, लेकिन कंकाल की मांसपेशी से समृद्ध परमाणु MG53 का भी पता लगाया।

MG53 ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-ए-प्रेरित ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए p65 के साथ बातचीत करता है हमारे ऊतक विभाजन परिणामों की पुष्टि करने के लिए, हमने निम्नलिखित इम्यूनोहिस्टोकेमिकल अध्ययन किए। सुसंस्कृत WT समीपस्थ ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं में, p65 मुख्य रूप से साइटोसोल में पाया गया था लेकिन MG53 (चित्रा 4 ए) की अनुपस्थिति में नाभिक के लिए स्थानीयकृत था। जब इन कोशिकाओं को 8 घंटे के लिए एलपीएस (5 मिलीग्राम) के साथ इलाज किया गया था, तो प्रो-भड़काऊ साइटोकिन स्राव WT कोशिकाओं (चित्रा 4 बी) की तुलना में mg53 / कोशिकाओं में काफी अधिक था।

क्योंकि इन आंकड़ों ने सुझाव दिया है कि MG53 भड़काऊ साइटोकाइन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए p65 के साथ बातचीत कर सकता है, p65 और MG53 के बीच एक सीधी बातचीत का मूल्यांकन कोइम्यूनोप्रेरीगेशन assays द्वारा HEK293 कोशिकाओं का उपयोग करके किया गया था जो फ्लैग-p65 और HA-MG53 के साथ कोट्रांसफ़ेक्ट थे। हमने कमजोर अंतःक्रिया का प्रदर्शन किया (चित्र 4c)। GFP-p65 और RFP-MG53 प्लास्मिड के कोट्रांसफेक्शन और कन्फोकल विश्लेषण ने p65 और MG53 (चित्र 4d) के कोलोकलाइज़ेशन की पुष्टि की। हमने तब मात्रा निर्धारित की थी कि क्या MG53 NF-kB (p65) ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को TNF-उत्तेजना के बाद एक स्थिर NF-kB / 293- GFP-Luc ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर सेल लाइन से ल्यूसिफरेज गतिविधि को मापकर प्रभावित करता है जिसे या तो pHM6 वेक्टर के साथ क्षणिक रूप से ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। या HA-MG53। रिपोर्टर कोशिकाओं में एक ट्रांसड्यूस्ड लेंटवायरस एक्सप्रेशन जुगनू ल्यूसिफरेज रिपोर्टर होता है जो सर्वसम्मति एनएफ-केबी ट्रांसक्रिप्शनल रिस्पांस एलिमेंट्स (केबी साइट) अपस्ट्रीम की 4 प्रतियों के संयोजन के साथ एक न्यूनतम साइटोमेगालोवायरस प्रमोटर द्वारा संचालित होता है। TNF-a की अनुपस्थिति में, MG53 प्रोटीन को व्यक्त करने वाली रिपोर्टर कोशिकाओं में बहुत कम आंतरिक ल्यूसिफरेज गतिविधि का पता चला था। MG53 ने TNF-a-elicited NF-kB (p65) ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को लगभग 40 प्रतिशत (चित्र 4e) से दबा दिया।

MG53 के ओवरएक्प्रेशन ने TNF पर NF-kB p65 परमाणु अनुवाद को रोका- एक उपचार NF-kB p65 को TNF पर नाभिक में स्थानांतरित किया गया- गुर्दे के समीपस्थ नलिका उपकला में एक उपचार। यह पता लगाने के लिए कि MG53 के साथ उपचार NF-kB p65 परमाणु अनुवाद को क्षीण कर सकता है या नहीं TNF-एक उत्तेजना पर, हमने HKC -8 कोशिकाओं में MG53 को या तो DOX पर निर्भर Ad-tPA-MG53 वायरल ट्रांसडक्शन के माध्यम से या पुनः संयोजक मानव MG53 (rhMG53) के साथ उपचार के माध्यम से overexpressed किया। एक एमजी 53- विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करना, DOX पर निर्भर प्रेरण के बाद MG53 को इम्युनोब्लॉटिंग द्वारा पता लगाया गया था। MG53 Ad-tPA-MG53 ट्रांसड्यूस्ड HKC-8 कोशिकाओं में बहुत उच्च स्तर पर मौजूद था,

1 एनजी rhMG53/mg सेलुलर लाइसेट के बराबर। इसके विपरीत, HKC-8 ने rhMG53 (चित्र 5a) की बहुत कम मात्रा को लिया और व्यक्त किया। HKC -8 द्वारा FL फ्लोरोसेंट-लेबल वाले rhMG53 के उत्थान की पुष्टि कन्फोकल माइक्रोस्कोपी (सप्लीमेंट्री फिगर S3) द्वारा की गई थी। टीएनएफ-ए उपचार के बाद, पी 65 सक्रियण के चरम का समय 15 से 30 मिनट (चित्रा 5 बी) था। बेसल परिस्थितियों में, NF-kB p65 मुख्य रूप से साइटोसोल में रहता था, और MG53 के ओवरएक्प्रेशन ने इसे नहीं बदला (चित्र 5c और d)। हालाँकि, TNF-एक उत्तेजना के बाद, p65 को HKC -8 कोशिकाओं में नाभिक में बदल दिया गया, जो MG53 से अधिक नहीं है। इसकी तुलना में, MG53 (चित्र 5c और d) से अधिक कोशिकाओं में p65 का परमाणु अनुवाद 33 प्रतिशत (कोशिकाओं को rhMG53 दिया गया) से 50 प्रतिशत (DOX दी गई ट्रांसड्यूस्ड सेल) तक गिर गया।

UUOmouse मॉडल में इंजीनियर RAW कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण को UUO सर्जरी के तुरंत बाद टेल वेन इंजेक्शन के माध्यम से प्रशासित 1 - 106 कोशिकाओं के साथ किया गया था। चूहों को बेतरतीब ढंग से एक समूह में विभाजित किया गया था जिसे सामान्य पेयजल (-DOX) और एक समूह जो पीने के पानी में DOX (2 मिलीग्राम / एमएल) प्राप्त करता था। UUO चूहों ने कुल 4 इंजेक्शन के लिए हर दूसरे दिन RAWe प्राप्त किया। सर्जरी के 7 दिन बाद किडनी काटी गई।

इंजीनियर रॉ के साथ संक्रमित चूहे और उसके बाद डीओएक्स इंडक्शन ने किडनी फाइब्रोसिस को काफी कम (30 प्रतिशत) प्रदर्शित किया, जिनकी तुलना में कोई कोशिका नहीं मिली या जो इंजीनियर रॉ कोशिकाओं से संक्रमित थे, लेकिन डॉक्स इंडक्शन के बिना (66 प्रतिशत फाइब्रोटिक क्षेत्र; चित्रा 6 ए और बी)।

प्रयोगों के अंत तक केवल एक छोटी RAW/Ad-tPA-MG53 आबादी रेटिकुलोएन्डोथेलियल सिस्टम की निगरानी से बची रही। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला ने पुष्टि की कि गुर्दे में DOX उपचार-प्रेरित RAW-मध्यस्थता MG53 अभिव्यक्ति (चित्र 6c)। दिलचस्प बात यह है कि रॉ-इन्फ्यूज्ड चूहों से यूयूओ किडनी और डीओएक्स-प्रेरित एमजी53 ने उन लोगों की तुलना में कम पी -65 / टी-पी 65 अनुपात (लगभग 40 प्रतिशत) का प्रदर्शन किया, जिन्हें या तो रॉ प्राप्त नहीं हुआ था या जिन्हें डीओएक्स के बिना रॉ दिया गया था (चित्र। 6डी और ई)। कम किए गए p-p65 स्तर की पुष्टि UUO किडनी (चित्र 6f) के p-p65 (S536) इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला के साथ की गई थी। हमें लगता है कि रॉ/Ad-tPA-MG53/þDOX द्वारा वितरित MG53 को परिचालित करना और किडनी समीपस्थ नलिका कोशिकाओं द्वारा आगे बढ़ना p-p65 (S536) को कम करने और UUO गुर्दे की सूजन को कम करने में भाग ले सकता है। UUO- केवल किडनी की तुलना में, TGF-b1, PAI - 1, और Col1a1 की अभिव्यक्ति UUO किडनी में DOX (कोई MG53 इंडक्शन) के बिना RAW से संक्रमित चूहों से काफी बढ़ गई थी। इन प्रोफाइब्रोटिक जीनों की ऊंचाई को संक्रमित कोशिकाओं से इम्युनोकोम्पेटेंट चूहों में एक मजबूत एलोग्राफ़्ट प्रतिक्रिया के शामिल होने के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। हालांकि, रॉ के साथ संक्रमित चूहों से यूयूओ गुर्दे और दिए गए डीओएक्स (एमजी 53 इंडक्शन) ने डीओएक्स उपचार के बिना चूहों की तुलना में काफी कम (60 प्रतिशत -72 प्रतिशत की कमी) पीएआई -1 और टीजीएफ-बी 1 और कोल 1 ए 1 के अपेक्षाकृत निचले स्तर को व्यक्त किया। 6 जी)।

rhMG53 का प्रणालीगत प्रशासन UUO के अधीन चूहों में NF-kB सक्रियण और फाइब्रोसिस विकास को कम करता है

हमने परीक्षण किया कि क्या rhMG53 ने पहले वर्णित इंजीनियर RAW सेल थेरेपी के समान एंटीफिब्रोटिक प्रभाव प्रदर्शित किया है। हमारे पूर्व फार्माकोकाइनेटिक डेटा ने rhMG53.42 के लघु, परिसंचारी अर्ध-जीवन (कृन्तकों में लगभग 90 मिनट) का संकेत दिया चूहों ने 2 से 6 मिलीग्राम / किग्रा के पुराने प्रशासन को सहन किया

rhMG5326,37 अच्छी तरह से, इसलिए चित्र 7a में दिखाई गई प्रशासन रणनीति का उपयोग किया गया था। UUO चूहों को या तो वाहन (खारा) या rhMG53 (2 मिलीग्राम/किलोग्राम) प्रतिदिन सर्जरी के बाद पहले 7 दिनों के लिए दिया गया और फिर हर दूसरे दिन जब तक वे 12 दिन नहीं मारे गए। शाम और contralateral गुर्दे लगभग बराबर t-p65 प्रदर्शित करते हैं और फाइब्रोनेक्टिन अभिव्यक्ति के स्तर, पी-पी 65 के स्तर के साथ शम गुर्दे की तुलना में contralateral गुर्दे में थोड़ा वृद्धि हुई है। UUO के बाद किडनी t-p65 बढ़ गई। खारा इलाज वाले जानवरों की तुलना में, rhMG 53- के UUO गुर्दे में p-65/t-p65 अनुपात लगभग 37 प्रतिशत कम हो गया था, जबकि IkBa में लगभग 27 प्रतिशत की वृद्धि हुई थी (चित्र 7बी और सी)। इसके अतिरिक्त, फ़ाइब्रोनेक्टिन में लगभग 33 प्रतिशत की कमी आई (चित्र 7बी और सी)। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री ने पुष्टि की कि rhMG53 उपचार के बाद UUO किडनी में मौजूद था (चित्र 7d)। rhMG 53- उपचारित UUO किडनी (चित्र 7e) में कुल फाइब्रोसिस कम हो गया था। हालाँकि, TGF-b1, PAI -1, और Col1a1 की RNA अभिव्यक्ति खारा या rhMG53 (चित्र 7f) के साथ इलाज किए गए चूहों में समान थी।

किडनी की बीमारी के इलाज में कारगर है सिस्टैन्च

बहस

MG53 एक पेशी-समृद्ध TRIM प्रोटीन है जिसे शुरू में प्लाज्मा झिल्ली मरम्मत मशीनरी के एक प्रमुख घटक के रूप में पहचाना गया। myokine.32 हमने पहले दिखाया है कि MG53 दूरस्थ अंगों में ऊतक क्षति के दौरान सूजन को नियंत्रित कर सकता है। 27,29,33,35-37 वर्तमान जांच गुर्दे को MG53-मध्यस्थ अंग सुरक्षा के दायरे का विस्तार करती है। हम यह निष्कर्ष निकालते हैं कि MG53 प्रिनफ्लेमेटरी और प्रोफाइब्रोटिक ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर NF-kB के साइटोकाइन-प्रेरित सक्रियण को अवरुद्ध करके अंतर्गर्भाशयी सूजन और किडनी फाइब्रोसिस को कम कर सकता है। यह निष्कर्ष निम्नलिखित टिप्पणियों पर आधारित है: (i) सामान्य चूहों में MG53 का आनुवंशिक विलोपन।

के परिणामस्वरूप गुर्दे के कार्य में गिरावट आई क्योंकि चूहों की आयु गुर्दे की फाइब्रोसिस में वृद्धि और ल्यूकोसाइट्स और मैक्रोफेज द्वारा गुर्दे की घुसपैठ के साथ थी; (ii) एक murine UUO किडनी इंजरी मॉडल में, MG की बाधित किडनी53-कमी वाले चूहों ने MG53-पूर्ण चूहों की तुलना में अधिक फाइब्रोसिस और सूजन का प्रदर्शन किया; (iii) टीएनएफ-ए और इंटरल्यूकिन -6एलपीएस-उपचारित समीपस्थ ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं द्वारा उत्पादन MG53 की उपस्थिति में क्षीण हो गए थे; (iv) समीपस्थ ट्यूबलर एपिथेलियल सेल लाइन में MG53 के साथ उपचार या ओवरएक्प्रेशन ने TNFa- प्रेरित NF-kB सक्रियण को p65 घटक-kB के परमाणु अनुवाद को अवरुद्ध करके कम कर दिया (MG53 को सीधे p65 से बाँधने के लिए पाया गया, यद्यपि कमजोर रूप से); और (v) p65 का फॉस्फोराइलेशन, NF-kB की सक्रियता में एक आवश्यक कदम, मैक्रोफेज में MG53 को ओवरएक्सप्रेस करने के लिए प्रेरित पुनः संयोजक MG53 के साथ इलाज किए गए UUO चूहों के बाधित गुर्दे में कम हो गया था। इसके अलावा, एनएफ-केबी सक्रियण के अवरोधक, आईकेबीए, को यूयूओ चूहों के बाधित गुर्दे में पुनः संयोजक MG53 इंजेक्शन के साथ बढ़ाया गया था।

सामान्य चूहों में MG53 का आनुवंशिक विलोपन गुर्दे पर उम्र बढ़ने के प्रतिकूल प्रभावों के लिए अनुमेय था। इससे पता चलता है कि अंतर्जात MG53 की उपस्थिति उम्र बढ़ने के दौरान सुरक्षा का आधारभूत स्तर प्रदान करती है। इसी तरह, अंतर्जात MG53 के नुकसान ने रुकावट के कारण AKI को बदतर बना दिया। UUO किडनी ने MG53 को संचित किया, संभवतः कंकाल की मांसपेशी से दूरस्थ मायोकाइन गतिविधि को दर्शाता है। यह स्पष्ट नहीं है कि चोट के दौरान गुर्दे में MG53 की मांसपेशी कैसे भर्ती की जा सकती है; हालांकि, एक क्षतिग्रस्त गुर्दा अक्सर हाइपोक्सिया विकसित करता है और ऑक्सीडेटिव तनाव से गुजरता है,^44,45संकेत जो MG53 की भर्ती के लिए काम कर सकते हैं। यदि ऐसा है, तो इस "मांसपेशी-गुर्दे-प्रतिरक्षा कोशिका" अक्ष का उपयोग गुर्दे की क्षति को कम करने के लिए किया जा सकता है। 46 वैकल्पिक रूप से, गुर्दे की कोशिकाएं बेसलाइन पर MG53 के निम्न स्तर को व्यक्त करती हैं,²⁶और, तीव्र या पुरानी चोट के दौरान, MG53 उत्पादन को अपग्रेड किया जा सकता है।

एनएफ-केबी गुर्दे की चोट और उम्र बढ़ने में सूजन और फाइब्रोसिस का एक प्रमुख ट्रांसक्रिप्शनल ड्राइवर है।^14,17,47,48हमें यह जांचने के लिए प्रेरित किया गया था कि क्या MG53 के प्रभावों की NF-kB के माध्यम से मध्यस्थता की जा सकती है क्योंकि किडनी होमोजेनेट्स के परमाणु डिब्बे में MG53 की उपस्थिति ने ट्रांसक्रिप्शनल हस्तक्षेप की संभावना का सुझाव दिया था। MG53 का परमाणु स्थानीयकरण मिसाल के बिना नहीं है। एक ट्रांसजेनिक मॉडल में मायोकार्डियल MG53 को ओवरएक्सप्रेस करते हुए, परमाणु MG53 ने ट्रांसक्रिप्शनल स्तर पर पेरोक्सिसोम प्रोलिफ़रेटर-सक्रिय रिसेप्टर-अल्फा की अभिव्यक्ति को नियंत्रित किया और कार्डियक लिपिड चयापचय को प्रभावित किया। इसके अलावा, हमने हाल ही में उम्र से संबंधित दिल की विफलता को कम करने के लिए rhMG53 ने NF-kB सक्रियण को दबा दिया। वृद्ध कार्डियोमायोसाइट्स में प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स, एपोप्टोसिस और ऑक्सीडेटिव तनाव को कम करने के माध्यम से।³⁷

MG53 कैसे p65 परमाणु / साइटोप्लाज्मिक लामबंदी को नियंत्रित करता है, इसका आणविक तंत्र स्पष्ट नहीं है। MG53 में कोई परमाणु स्थानीयकरण संकेत नहीं है, लेकिन इसमें 3 पुटीय एन-टर्मिनल ल्यूसीन-समृद्ध परमाणु निर्यात संकेत हैं, जो परमाणु निर्यात प्रोटीन निर्यात द्वारा मान्यता प्राप्त एक आकृति है।⁵⁰MG53 और p65 के बीच सीधा संपर्क NF-kB सक्रियण पर MG53 के एकमात्र या मुख्य विघटनकारी प्रभाव के रूप में कमजोर था। यद्यपि MG53 NF-kB महत्वपूर्ण घटकों के गतिशील न्यूक्लियोसाइटोप्लास्मिक बंद को प्रभावित करता प्रतीत होता है, सटीक तंत्र निर्धारित किया जाना बाकी है।

ऐसा प्रतीत होता है कि MG53-मध्यस्थता वाले रीनोप्रोटेक्शन का महत्वपूर्ण परिणाम NF-kB-मध्यस्थ सूजन के क्षीणन के माध्यम से फाइब्रोटिक रीमॉडेलिंग को कम करता है। किडनी फाइब्रोसिस एक जटिल प्रक्रिया है जिसमें विभिन्न ईसीएम प्रोटीनों के रोग संबंधी बयान शामिल हैं। 51 एमजी53 का ईसीएम प्रोटीन फाइब्रोनेक्टिन पर स्पष्ट प्रभाव पड़ता है। MG53 में UUO किडनी की कमी में फाइब्रोनेक्टिन बढ़ गया और MG53 के साथ इलाज किए गए UUO चूहों में कमी आई। MG53 की उपस्थिति और अनुपस्थिति में अन्य ECM प्रोटीन की अभिव्यक्ति को समझना अधिक कठिन है। हमने पहले दिखाया था कि rhMG53 TGF-b1/Smad सिग्नलिंग को नकारात्मक रूप से नियंत्रित करता है और इन विट्रो अध्ययन में ECM प्रोटीन के संश्लेषण को दबा देता है। विवो में, TGF b1, PAI -1, और Col1a1 टेप UUO किडनी में नहीं बढ़े हैं। mg53 / कमी वाले जानवर। वायरल प्रेरित माउस के प्रशासन के माध्यम से एमजी 53 को ओवरएक्सप्रेस करने के लिए प्रेरित यूयूओ जानवरों में इन टेपों में कमी आई

मैक्रोफेज, लेकिन जब पुनः संयोजक MG53 दिया गया, तो कोई प्रभाव नहीं देखा गया। यह केवल पर्याप्त खुराक का मामला हो सकता है क्योंकि प्राप्त इंट्रारेनल MG53 का स्तर पुनः संयोजक MG53 के विपरीत मैक्रोफेज वेक्टर दिए गए जानवरों में कहीं अधिक था। इसके अतिरिक्त, प्रोटीन के स्तर को मापा नहीं गया था, और पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल घटनाएं यूयूओ में ईसीएम को संशोधित कर सकती हैं। विशिष्ट ईसीएम प्रोटीन को संशोधित करने में MG53 की उभरती भूमिका को स्पष्ट करने के लिए और अधिक शोध की आवश्यकता है। निष्कर्ष में, इस अध्ययन ने प्रदर्शित किया है कि मायोकाइन गुर्दे जैसे दूरस्थ अंग में आधारभूत सूजन को नियंत्रित करने में मदद कर सकता है और गुर्दे की चोट की स्थिति में, सूजन को कम करने और नियंत्रित करने में मदद कर सकता है। चित्र 8 पुनर्संरक्षण में MG53 की भूमिका का एक कार्यशील मॉडल प्रस्तुत करता है। क्षति से जुड़े आणविक पैटर्न (डीएएमपी, जैसे टीएनएफ-ए) और रोगज़नक़ से जुड़े आणविक पैटर्न (पीएएमपी, जैसे एलपीएस) उत्तेजना और इस्केमिक तनाव के दौरान, एनएफ-केबी सिग्नलोसोम गुर्दे में सक्रिय होता है। MG53 NF-kB सिग्नलिंग के फॉस्फोराइलेशन और सक्रियण को रोककर, IkBa को स्थिर करके, और p65 न्यूक्लियर मोबिलाइजेशन को कम करके, प्रो-इंफ्लेमेटरी प्रोग्राम की सक्रियता को रोककर किडनी की सुरक्षा करता है। हालांकि अंतर्जात MG53 इन प्रभावों की मध्यस्थता कर सकता है, हम सुझाव देते हैं कि MG53 का चिकित्सीय रूप से उपयोग करके अधिक मजबूत सुरक्षा प्रदान की जा सकती है, जो कि UUO में चोट को कम करने के लिए बहिर्जात MG53 की क्षमता के आधार पर संभव है। आगे की जांच यह समझने के लिए जरूरी है कि इस मायोकाइन का चिकित्सकीय रूप से शोषण कैसे किया जा सकता है।

सिस्टैंच का लाभ: लीवर और एंटी-फाइब्रोसिस की रक्षा करें

खुलासा

JM की TRIM-edicine, Inc. में एक इक्विटी रुचि है, जो मानव रोगों के उपचार के लिए MG53 का विकास करती है। MG53 के उपयोग पर पेटेंट रटगर्स विश्वविद्यालय और ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी द्वारा आयोजित किए जाते हैं। अन्य सभी लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी हित घोषित नहीं किया।

आभार

इस कार्य को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) R01-DK106394 (JM, BHR, और P-HL) और NIH R01-AG062896 (P-HL औरBHR) द्वारा समर्थित किया गया था। इस परियोजना को भी आंशिक रूप से ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी (पी-एचएल) से इंट्राम्यूरल लॉकवुड फंड और नेशनल सेंटर फॉर एडवांस ट्रांसलेशनल साइंसेज (एनसीएटीएस; पी-एचएल, पुरस्कार संख्या UL1TR002733) से एक पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि एनसीएटीएस या एनआईएच के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती हो।

लेखक योगदान,

पीडी, पी-एचएल, जेएम, और बीएचआर ने अध्ययनों की कल्पना की और/या डिजाइन किया; एचएल, पीडी, पी-एचएल, जेडएल, और एक्सजेड ने प्रयोग किए, डेटा हासिल किया, और डेटा विश्लेषण किया; पीडी, पी-एचएल, और बीएचआर ने परिणामों की व्याख्या की; और पी-एचएल और बीएचआर ने पांडुलिपि का मसौदा तैयार, संशोधित और अनुमोदित किया। सभी लेखकों ने अंतिम संस्करण को पढ़ा और अनुमोदित किया।

पूरक सामग्री

अनुपूरक फ़ाइल (पीडीएफ) अनुपूरक तरीके।

तालिका S1।प्राइमर सीक्वेंस। चित्रा S1। mg53-/- चूहे उन्नत ECM प्रोटीन जमाव प्रदर्शित करते हैं। आयु-मिलान (1 0 महीने पुराना) जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) और मिलीग्राम 53- / - गुर्दे के ऊतकों को 40 6-डायमिडीनो -2- फेनिलइंडोल (डीएपीआई; नीला) के साथ दाग दिया गया था। बाएं पैनल), ए- चिकनी पेशी एक्टिन (एसएमए; हरा, दूसरा पैनल), फाइब्रोनेक्टिन (लाल, तीसरा पैनल), और विलय (दाएं पैनल)। बार 25 मिमी। वृक्क फाइब्रोसिस क्षेत्र की मात्रा (एन 3 प्रति समूह)। डेटा को साधन -एसडी के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। छात्र का टी-टेस्ट। *** पी <>

चित्रा S2।नाभिक और कोशिका द्रव्य के बीच कंकाल की मांसपेशी MG53 का वितरण। जंगली-प्रकार (WT) ormg 53-/- से प्राप्त कंकाल की मांसपेशी को कस्टम-निर्मित एंटी-MG53 एंटीबॉडी (3 mg lysates) और सेल कम्पार्टमेंट मार्कर (20 mg lysates) के साथ विभाजित और प्रतिरक्षित किया गया था। सोडियम-पोटेशियम एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेटेस का उपयोग कोशिका झिल्ली मार्कर के रूप में, हिस्टोन H3 को परमाणु मार्कर के रूप में और ट्यूबुलिन को साइटोसोल मार्कर के रूप में किया जाता है।

चित्रा S3।HKC-8 गुर्दा समीपस्थ नलिका कोशिकाएं विशेष रूप से AlexaFluor 647-लेबल rhMG53 से आगे निकल जाती हैं। rhMG53 (ट्राइमेडिसिन) और गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (BSA; थर्मोफिशर साइंटिफिक) को निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एलेक्सा फ्लोर (AF) एंटीबॉडी लेबलिंग किट (लाइफ टेक्नोलॉजीज) के साथ लेबल किया गया था। एचकेसी -8 कोशिकाओं को डेल्टा टीपीजी ग्लास-बॉटम डिश (बायोप्टेक इंक) पर डल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) में 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ लेबल प्रोटीन, बीएसए-एएफ647 (बाएं) की उपस्थिति में सुसंस्कृत किया गया था। ) और rhMG53-AF647 (दाएं), 24 घंटे के लिए। Z-स्टैक छवियों को LSM780 कन्फोकल माइक्रोस्कोप (Zeiss) से लिया गया था। छवियां व्यंजन के निचले भाग में कक्ष दिखाती हैं। बार 25 मिमी।

चित्रा S4।इंड्यूसिबल MG53स्राव में मध्यस्थता करने के लिए इंजीनियरिंग रॉ सेल। (ए) RAW कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए Ad-tPA-MG53 से संक्रमित किया गया था और बिना (doxycycline [Dox]) या Dox (þDox, 1 mg/ml) के साथ tPA-MG53 अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए अतिरिक्त 24 घंटों के लिए इलाज किया गया था। कन्फ़ोकल छवियों ने मैक्रोफेज जैसी रॉ कोशिकाओं (F4/8 0 धुंधला, हरा, शीर्ष पैनल) से MG53 अभिव्यक्ति (कस्टम-निर्मित एंटी-MG53 एंटीबॉडी, लाल, निचले पैनल) को शामिल किया। बार्स 25 मिमी। (बी, सी) संक्रमित रॉ कोशिकाओं (बी) और संबंधित संस्कृति से टीपीए-एमजी53 और एमजी53 की प्रेरित अभिव्यक्ति के लिए सेल lysates (0 .6, 3, और 6 मिलीग्राम की मात्रा में) का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। मीडिया संकेंद्रित (2, 5, और 10मिलीलीटर की मात्रा में) (सी)। rhMG53 की विभिन्न मात्राएँ (0.2, 1, 0.05, और 0.025 एनजी की मात्रा में) को मानकों के रूप में लोड किया गया था। मेगावाट, आणविक भार मार्कर।