एंट-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic एसिड की उच्च सामग्री Adenostemma Lavenia (L.) O. Kuntze Leaf Extract में: Vivo परख में प्रारंभिक के साथ

संपर्क करें: ऑड्रे हू WhatsApp / hp: 0086 13880143964 ईमेल:audrey.hu@wecistanche.com

Akie Hamamoto, Ryosuke Isogai, Miwa Maeda, Masumi Hayazaki, Eito Horiyama, Shigeo Takashima , मामोरू Koketsu और हिरोशी Takemori *

सारांश:पृष्ठभूमि: Ent-11α-hydroxy-15-oxo-Kaur-16-en-19-oic acid(11αOH-KA) एक multifunctional है जैव रासायनिक कुछ फर्न, Pteris semipinnata, और इसकी congeneric प्रजातियों में पाया जाता है। हालांकि एक संख्या 11αOH-KA के चिकित्सीय अनुप्रयोगों का प्रस्ताव किया गया है (उदाहरण के लिए, विरोधी कैंसर, विरोधी सूजन, औरत्वचा वृष् ठन), इन फर्न में 11αOH-KA की सामग्री उच्च नहीं है। Adenostemma lavenia (एल.) O. Kuntze, एक Asteraceae, को भी 11αOH-KA शामिल करने की सूचना दी गई है। काढ़ा (गर्म पानी) अर्क) ए Lavenia के पूरे पौधों के भड़काऊ विकारों के लिए एक लोक उपाय के रूप में प्रयोग किया जाता है, जैसे कि हेपेटाइटिस और निमोनिया, यह सुझाव देते हुए कि 11αOH-KA के लिए जिम्मेदार घटक हो सकता है इस पौधे के औषधीय गुण। तरीके: पानी के अर्क की विरोधी मेलानोजेनिक गतिविधियों के ए. लेवेनिया लीव और टेरिस डिस्पर कुंजे (पी. सेमीपिनाटा का एक संज्ञेय) पत्तियों की तुलना माउस में की गई थी B16F10 मेलेनोमा कोशिकाएं। की राशि11αOH-KAतरल क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके मापा गया था स्पेक्ट्रोमेट्री। C57BL / 6J चूहों को ए लेवेनिया पत्ती के पानी के अर्क और रक्त के साथ इलाज किया गया था 11αOH-KA की सांद्रता को मापा गया था। ए. लेवेनिया के पानी के अर्क की विवो प्रभावकारिता में पत्ती का मूल्यांकन बालों के रंग की निगरानी करके इसकी विरोधी मेलानोजेनिक गतिविधि के अनुसार किया गया था। परिणाम: हालांकि दोनों अर्क (ए Lavenia और पी dispar Kunze) उच्च विरोधी melanogenic गतिविधियों से पता चला, केवल ए. लेवेनिया में 11αOH-KA की उच्च मात्रा थी, जो सूखी पत्ती के वजन का लगभग 2.5% था। 11αOH-KA को दो चरणों में A. Lavenia पत्तियों से शुद्ध किया जा सकता है: क्लोरोफॉर्म के बाद पानी निष्कर्षण वितरण। ए. लेवेनिया पत्ती के पानी के अर्क के साथ चूहों का उपचार रंजकता को दबा देता है उनके बालों में। निष्कर्ष: चूहों की जांच की छोटी संख्या के बावजूद, वर्तमान प्रारंभिक दबे हुए बाल रंजकता के परिणाम से पता चलता है कि ए. लेवेनिया पत्ती के पानी के अर्क और घटक जो संभवतः इसके लिए जिम्मेदार है - 11αOH-KA - मौखिक सौंदर्य प्रसाधनों के लिए नई सामग्री हैं। परिणाम कार्यात्मक खाद्य पदार्थों और इलाज के तरीकों के भविष्य के विकास में भी सहायक हो सकते हैं Hyperpigmentation विकारों से पीड़ित रोगियों, जैसे melasma के रूप में.

खोजशब्दों: 11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic acid;प्रति-मेलानोजेनेसिस;त्वचा वृष् ठन; कार्यात्मक भोजन; चिकित्सा संयंत्र; Adenostemma Lavenia; Pteris dispar Kunze;टायरोसिनेस; B16F10 मेलेनोमा

Cistanche tyrosinase गतिविधि को रोकता है

1. परिचय

के लिए विरोधी मेलानोजेनिक अभिकर्मकों पर अध्ययनत्वचा वृष् ठनऔर एंटी-एजिंग अधिक हो गए हैं अक्सर, विशेष रूप से खाद्य पदार्थों (फल, सब्जियों, और चिकित्सा जड़ी बूटियों) में सामग्री के लिए [1]। की एक संख्या polyphenols और terpenes और उनके स्रोतों को कार्यात्मक के रूप में विकसित और व्यावसायीकृत किया गया है खाद्य पदार्थ और पूरक।

डायटरपेन / कौरीन एंट -11α-hydroxy-15-oxo-kaur-kaur-16-en-19-oic एसिड (11αOH-KA), में पाया जाता है फर्न की पत्तियां (Pteris semipinnata [2-5], Pteris livida [6]) और Compositae (Gochnatia decora [7]), भी है विरोधी मेलानोजेनिक अभिकर्मकों के लिए एक आकर्षक उम्मीदवार [5]. अपनी व्यापक शारीरिक गतिविधियों के बावजूद (उदाहरण के लिए, एंटी-कैंसर और एंटी-इंफ्लेमेशन) [8-11], विवो प्रभावकारिता में केवल कुछ ही रिकॉर्ड हैं 11αOH-KA, इसकी विरोधी मेलानोजेनिक क्षमता सहित, संभवतः इसकी दुर्लभता और प्रतिबंधित संख्या के कारण स्रोतों का।

संरचना-गतिविधि संबंध अध्ययन, दोनों इन विट्रो और सुसंस्कृत कोशिकाओं में, की पहचान की है 11αOH-KA में moieties अपनी कार्यात्मक गतिविधियों (चित्रा 1) को लागू करने के लिए महत्वपूर्ण है। का प्रतिस्थापन में 19 वें स्थान पर कार्बोक्सी समूह11αOH-KAमिथाइल या हाइड्रोक्सी समूहों द्वारा इस यौगिक को परिवर्तित करता है उच्च कैंसर विरोधी गतिविधियों के साथ एक यौगिक के लिए, जो इंगित करता है कि 19-कार्बोक्सिल समूह कमजोर हो जाता है इस यौगिक की सेलुलर विषाक्तता [5,10,12]। इसके विपरीत, 16 वें स्थान पर एल्केन समूह, कीटोन 15 वें स्थान पर समूह, और 11α स्थिति में हाइड्रॉक्सी समूह एपोप्टोटिक गतिविधियों को बढ़ाता है सिग्नलिंग मार्ग को सक्रिय करके [10,12]। हालांकि, इन moieties अपरिहार्य नहीं हैं कौरेन के सेल मृत्यु संकेतों के लिए। विरोधी भड़काऊ गतिविधि के लिए संरचनात्मक आवश्यकताओं रहे हैं कैंसर विरोधी गतिविधि के लिए उन लोगों के समान, आम सेलुलर लक्ष्यों के माध्यम से क्रॉसस्टॉक का सुझाव देते हैं, जैसे कि नाभिकीय कारक कप्पा बी (NF-πB) [12]।

Tyrosinaseमेलेनिन संश्लेषण [13,14] में एक दर-सीमित एंजाइम है। एंजाइम अनुक्रमिक उत्प्रेरित करता है प्रतिक्रियाएं: tyrosine के रूपांतरण l-3,4-dihydroxyphenylalanine, l-Dopa, और फिर dopaquinone करने के लिए। हमने बताया है कि 11αOH-KA tyrosinase जीन की अभिव्यक्ति को रोकता है, जिसके परिणामस्वरूप एक का दमनमेलानोजेनेसिसB16F10 माउस मेलेनोमा कोशिकाओं में [5]. 11α-hydroxy के moieties, 15-oxo, और 11αOH-KA में 16-en इसके लिए अपरिहार्य हैंप्रति-मेलानोजेनेसिसगतिविधि, जो एक है अन्य गतिविधियों की तुलना में 11αOH-KA की संरचनात्मक आवश्यकताओं की विभिन्न विशेषताएं, जैसे कैंसर विरोधी या विरोधी भड़काऊ गतिविधियों के रूप में।

इस प्रकार, इसकी एंटी-मेलानोजेनिक गतिविधि के संदर्भ में, 11αOH-KA कौरेनों के बीच एक अद्वितीय यौगिक है। दुर्भाग्य से, Pteris dispar Kunze, हमारे पिछले स्रोत के11αOH-KA, केवल एक छोटी राशि शामिल है इस यौगिक [5], और इस फर्न के साथ-साथ पी. सेमीपिनाटा (एक संज्ञेय) [4,15], का कोई रिकॉर्ड नहीं है मानव विषयों में उपयोग इसके अलावा, पिछले सभी प्रयोगों में, कार्बनिक सॉल्वैंट्स (मिथाइल या एथिल) अल्कोहल, क्लोरोफॉर्म, या हेक्सेन) का उपयोग 11αOH-KA निकालने के लिए किया जाता था, बिना किसी रिकॉर्ड के उपयोग के जलीय निष्कर्षण.

लगभग 40 साल पहले, एक अमेरिकी समूह ने एडेनोस्टेम्मा में 11αOH-KA और इसके डेरिवेटिव की खोज की थी Lavenia (L.) O. Kuntze (an Asteraceae) [16]. हालांकि ए. लावेनिया का पर्याप्त अध्ययन नहीं किया गया है संभावित संदूषकों के जोखिम के बारे में (उदाहरण के लिए, अकार्बनिक प्रदूषक [17] और माध्यमिक मेटाबोलाइट्स कवक [18,19]) द्वारा पत्तियों और अन्य भागों में उत्पादित, पूरे पौधे का पाउडर (जिसका नाम मा ज़ी हू है) क्या है? चिकित्सा डॉक्टरों की अनुमति के तहत संयुक्त राज्य अमेरिका में बेचा गया (उत्पादों को प्राप्त किया जा सकता है) QualiHerb, Cerritos, CA, संयुक्त राज्य अमेरिका से: पूरक सामग्री चित्रा S1). इसलिए, इस अध्ययन में, को मापने के द्वारा11αOH-KAसामग्री और इसकी विरोधी melanogenic गतिविधियों की प्रभावकारिता का मूल्यांकन, हमने आंतरिक सौंदर्य प्रसाधनों में उपयोग के लिए ए. लेवेनिया पत्ती के पानी के अर्क की क्षमता की जांच की, साथ ही साथ कार्यात्मक खाद्य पदार्थों की एक नई श्रेणी के रूप में [20-22] जिसका उपयोग पीड़ित रोगियों के इलाज के लिए किया जा सकता है इस तरह के melasma के रूप में hyperpigmentation विकारों. आज तक, केवल tranexamic एसिड (एक हेमोस्टैटिक दवा) है हाइपरपिग्मेंटेशन विकारों के लिए एक आंतरिक दवा के रूप में उपलब्ध है [23,24]।

हम यहां रिपोर्ट करते हैं कि ए लेवेनिया के पत्तों में उच्च स्तर पर 11αOH-KA होता है (लगभग 2.5% पत्तियों का सूखा वजन)। ए. लेवेनिया पत्ती का पानी का अर्क कुशलतापूर्वक दबा देता हैमेलानोजेनेसिसमें B16F10 कोशिकाओं, और11αOH-KAपानी की 50% एंटी-मेलानोजेनिक गतिविधियों के लिए जिम्मेदार हो सकता है निकालना। ए. लेवेनिया पत्ती के पानी के अर्क के साथ चूहों के मौखिक उपचार के परिणामस्वरूप दमन होता है उनके बाल पिगमेंटेशन।

2. सामग्री और तरीके

2.1. ए. लेवेनिया का प्रसार

चूंकि ए. लेवेनिया को जापान के अधिकांश क्षेत्रों में एक लुप्तप्राय प्रजाति के रूप में सूचीबद्ध किया गया है, इसलिए हमने इस पौधे को सुसंस्कृत किया है हमारी प्रयोगशाला के पास एक क्षेत्र। ए. लेवेनिया को 10 रोपाई से विभाजन द्वारा प्रचारित किया गया था, और लगभग 100 ग्राम जून से जुलाई 2019 तक काटी गई सूखी पत्तियों का उपयोग इस अध्ययन में किया गया था।

2.2. पानी के अर्क और इसके विश्लेषण से 11αOH-KA का शुद्धिकरण

शुद्ध 11α-OH KA (प्रामाणिक) BioBioPha (शंघाई, चीन) से खरीदा गया था। सूखी पत्ती पाउडर (100 मिलीग्राम) A. lavenia या P. dispar Kunze की पत्तियों से प्राप्त किया गया था, जिसे 1 मिलीलीटर में भिगोया गया था आसुत पानी (10-आयतन निष्कर्षण के लिए) 12 ज के लिए, और अवशेषों को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा हटा दिया गया था 10 मिनट के लिए 12,000 आरपीएम पर। परिणामी अर्क का विश्लेषण उच्च प्रदर्शन (एचपी) तरल द्वारा किया गया था क्रोमैटोग्राफी (एलसी) एक C18 ODS स्तंभ (4.6 मिमी × 50 मिमी का उपयोग कर: आरपी -18 जीपी, कांटो कागाकू, टोक्यो, जापान) 10 मिनट से अधिक 40% मेथनॉल / पानी से लेकर 100% मेथनॉल तक की ढाल के साथ। 11α-OH केए का पता लगाने 245 एनएम (A245) पर पराबैंगनी (यूवी) अवशोषण का निर्धारण करके किया गया था। 20-, 30-, और 50-मात्रा निष्कर्षण, 50 मिलीग्राम, 33 मिलीग्राम, और 20 मिलीग्राम सूखे पत्ते के पाउडर को 1 मिलीलीटर द्वारा निकाला गया था आसुत जल का।

ए. लेवेनिया में 11α-OH KA की संरचना की पुष्टि करने के लिए, कौरेनोइक एसिड को अर्ध-बड़े पर शुद्ध किया गया था पैमाना। सूखे ए लेवेनिया पत्तियों के कुल 100 ग्राम को पानी के 20 संस्करणों से दो बार निकाला गया था, CHCl3 की एक समान मात्रा को पत्तियों के पानी के अर्क में जोड़ा गया था, और 11α-OH KA बरामद किया गया था CHCl3 चरण से। बरामद CHCl3 चरण के वाष्पीकरण के दौरान, 11α-OH KA था सफेद क्रिस्टल के रूप में अवक्षेपित। इन क्रिस्टल को एक पेपर फिल्टर द्वारा बरामद किया गया था। बरामद क्रिस्टल परमाणु चुंबकीय अनुनाद (NMR) (1H-NMR (CDCl3) δ 0.95 (3H, s), 1.28 (3H, s) द्वारा विश्लेषण किया गया था, 1.05–2.22 (15H, m), 2.37 (1H, d, J = 11.9 Hz), 3.06 (1H, broad s), 4.06 (1H, d, J = 4.6 Hz), 5.27 (1H, s), और 5.87 (1H, s)). क्रिस्टल का 1H-NMR स्पेक्ट्रम प्रामाणिक 11α-OH KA के साथ संयोग था स्पेक्ट्रम (अनुपूरक सामग्री चित्रा S2 देखें).

2.3. माउस सीरम में 11αOH-KA का विश्लेषण

अल्ट्रा-प्रदर्शन एलसी (UPLC)-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) विश्लेषण के लिए विधियाँ तैयार की गई थीं [25,26] में उपयोग किए जाने वाले कई तरीकों से। संक्षेप में, चूहों (C57BL / 6J) के इलाज के लिए, ए लेवेनिया पत्तियों को निकाला गया था पानी के 30 संस्करणों के साथ। 20 मिनट के लिए 120 °C पर नसबंदी के बाद, अर्क को और पतला किया गया था पानी के 2 संस्करणों के साथ और पीने के पानी के रूप में सेवा की। 11α-OH के फार्माकोकाइनेटिक्स की जांच करने के लिए KA, 100 मिलीग्राम / किग्रा यौगिक 1% Tween 80 (कांटो कागाकू, टोक्यो, जापान) में निलंबित कर दिया गया था मौखिक रूप से प्रशासित। प्रशासन के 15-240 मिनट बाद पूंछ की नस के माध्यम से रक्त बरामद किया गया था।

माउस रक्त में 11α-OH KA को मापने के लिए, सीरम (20 μL) को 200 μL के साथ निकाला गया था एसिटोनिट्राइल । निष्कर्षण दक्षता को सामान्य करने के लिए, 18π-glycyrrhetinic एसिड के 10 nmols (कांटो कागाकू) निष्कर्षण से पहले सीरम में जोड़ा गया था। वाष्पीकरण द्वारा एसिटोनिट्राइल को हटाने के बाद, यौगिकों को मेथनॉल के 5 μL में भंग कर दिया गया था, जिसके बाद H2O के 5 μL के अतिरिक्त थे। फिर, 1 μL समाधान का उपयोग एलसी-एमएस स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस: वाटर्स ज़ेवो जी 2-एक्सएस क्यूटॉफ, वाटर्स, मिलफोर्ड, एमए) के लिए किया गया था। 11α-OH KA को अलग करने के लिए, एक C18 ODS स्तंभ (3.0 मिमी × 150 मिमी (5 μm): RP-18 GP, Kanto Kagaku) और 10 मिनट से अधिक 35% एसिटोनिट्राइल / पानी से लेकर 100% एसिटोनिट्राइल तक की एक ढाल लागू की गई थी। The MS शर्तें इस प्रकार थीं: केशिका (केवी), 2.20; नमूना कोर, 45; निष्कर्षण शंकु, 4.0. क्योंकि हम एमएस / एमएस विश्लेषण (पूरक सामग्री चित्रा S3A) के माध्यम से 11α-OH KA के टुकड़ों का पता लगाने में विफल रहा, 11α-OH KA को 0.01 Da पथ (अनुपूरक सामग्री चित्रा S3B) के साथ 331.1879 के द्रव्यमान-से-चार्ज अनुपात (m/z) की निगरानी करके केवल MS संकेतों के साथ परिमाणित किया गया था। एक मानक वक्र तैयार किया गया था 11α-OH KA (0.1-3 μM की अंतिम सांद्रता पर) के अलावा 50% मेथनॉल / पानी के लिए जो 11α-OH KA निष्कर्षण के लिए एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर सामान्य माउस सीरम से तैयार किया गया था. 18π-glycyrrhetinic एसिड के लिए इस्तेमाल की जाने वाली समान परिस्थितियों के तहत एलसी-यूवी का उपयोग करके मापा गया था 11α-OH KA माप. इन पशु प्रयोगों को पशु प्रयोग द्वारा अनुमोदित किया गया था Gifu University की समिति (H30-041)। हमने जानवरों का पालन करने के लिए चूहों की न्यूनतम संख्या का उपयोग किया कल्याण आवश्यकताओं.

2.4. Melanogenesis परख

माउस B16F10 अमेरिकी प्रकार संस्कृति संग्रह से मेलेनोमा कोशिकाओं (RIKEN, Tsukuba, जापान) Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM-उच्च ग्लूकोज (4.5 ग्राम / एल डी-ग्लूकोज) में सुसंस्कृत थे, वाको, क्योटो, जापान) और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक। कोशिकाएं थीं 37 °C पर 5% CO2 के साथ एक humidified वातावरण में incubated और हर दो दिनों के माध्यम से स्थानांतरित कर दिया गया नई संस्कृति प्लेटों के लिए ट्रिप्सिनाइजेशन।

कोशिकाओं (2 × 105 ) को 6-अच्छी तरह से प्लेट पर चढ़ाया गया था और प्रेरण से पहले 12-16 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया था कामेलानोजेनेसिस. मेलानोजेनेसिस को ए. लेवेनिया के साथ 20 μM forskolin (Fsk) द्वारा प्रेरित किया गया था पानी निकालने या 48 ज के लिए 11α-OH KA. मेलेनिन माप के अनुसार किया गया था साहित्य [5]। संक्षेप में, कोशिकाओं को फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा के साथ दो बार धोया गया था और बरामद किया गया था 2 एमएल संग्रह ट्यूबों में, 1.5 मिनट के लिए 8000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद। प्रत्येक सेल गोली थी आसुत पानी के 200 μL में निलंबित, और प्रोटीन सामग्री के माप के लिए 50 μL का उपयोग किया गया था। अवशिष्ट 150 μL को 2 M NaOH के 150 μL के साथ मिलाया गया था और फिर 45 °C पर इनक्यूबेशन द्वारा lysed किया गया था 2 घंटे के लिए। मेलेनिन को 2: 1 क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल मिश्रण के साथ निकाला गया था और एक के साथ मापा गया था spectrophotometer (Glomax Multi, Promega, Madison, WI, USA) 405 nm पर। प्रोटीन सांद्रता सेल छर्रों के एक ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक (बायो-रेड, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था और इसके लिए उपयोग किया जाता था मेलेनिन सामग्री का सामान्यीकरण.

Cistanche निकालने के प्रभाव: मेलेनिन और whitening त्वचा को रोकने

2.5. सांख्यिकीय विश्लेषण

सांख्यिकीय विश्लेषण छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके किया गया था जब डेटा के दौरान प्राप्त किया गया था एक ही प्रयोग। हमने सांख्यिकीय विश्लेषण का उपयोग नहीं किया यदि प्रयोगों को अलग-अलग पर किया गया था दिन या यदि नमूना संख्या केवल दो थी।

3. परिणाम

3.1. ए. Lavenia 11αOH-KA की एक उच्च राशि शामिल है

हमने पहले बताया था कि पी. डिस्पर कुंजे के इथेनॉल निकालने के पत्ते, 10 संस्करणों के साथ तैयार किया गया शुष्क वजन (v / w) इथेनॉल के, कुशलतासे बाधितमेलानोजेनेसिसB16F10 कोशिकाओं में, यहां तक कि 1/1000 के बाद भी तनुकरण [5]। ए. लेवेनिया सूखे पत्तों के पानी के अर्क की प्रभावकारिता की तुलना करने के लिए और कि P. disper Kunze पत्तियों के पानी के अर्क, हमने अर्क तैयार किए (पानी के 20 संस्करण (v / w सूखे) पत्तियाँ)) और उन्हें forskolin के साथ सुसंस्कृत माध्यम में जोड़ा (melanogenesis inducer-a सीएएमपी एगोनिस्ट)। दोनों अर्क कुशलतापूर्वक मेलेनिन संश्लेषण को 1/1000 कमजोर पड़ने पर भी रोकते हैं, जब मेलेनिन सामग्री का नेत्रहीन मूल्यांकन किया गया था (चित्रा 2 ए)। मेलेनिन सामग्री NaOH के बाद मापा गया था निष्कर्षण (चित्रा 2B)। 1/3000 कमजोर पड़ने पर, ए. लेवेनिया निकालने ने मेलेनिन सामग्री को 69% तक कम कर दिया नियंत्रण (केवल Fsk) की तुलना में, और P. disper Kunze निकालने से मेलेनिन सामग्री में कमी आई 41%. 1/1000 कमजोर पड़ने पर, ए. लेवेनिया निकालने ने मेलेनिन सामग्री को पूरी तरह से कम कर दिया, जबकि पी। Kunze अर्क मेलेनिन सामग्री को 60% तक कम कर देता है। यह अंतर तब नहीं देखा गया था जब अर्क 1/300 पर पतला किया गया था।

एलसी-यूवी विश्लेषण ने सुझाव दिया कि11αOH-KAA. lavenia में प्रमुख घटक था पानी का अर्क (चित्रा 2C, बाएं)। इसके विपरीत, 11αOH-KA के लिए कोई स्पष्ट चोटी का पता नहीं चला था जब P. disper Kunze निकालने का विश्लेषण किया गया था (चित्रा 2C, सही). एलसी-एमएस विश्लेषण ने सुझाव दिया कि चोटी एक तीर द्वारा इंगित 11αOH-KA (डेटा नहीं दिखाया गया है) से मेल खाता है। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि 11αOH-KA प्रमुख घटक के लिए जिम्मेदार हो सकता हैमेलानोजेनेसिसए. लेवेनिया निकालने में निषेध, जबकि ग्लाइकोसिलेटेड रूपों की तरह डेरिवेटिव [5] में मेलेनिन निषेध में प्राथमिकता से योगदान कर सकते हैं P. disper Kunze निकालने.

इसके बाद, हमने शुद्ध करने की कोशिश की11αOH-KAवितरण द्वारा। CHCl3 से 11αOH-KA निकालने में सक्षम था उच्च शुद्धता (87% से अधिक) के साथ ऊपर ए लेवेनिया पानी का अर्क (चित्रा 2 डी, बाएं)। स्पेक्ट्रा CHCl3 में क्रिस्टलीकृत पदार्थ के एनएमआर विश्लेषण प्रामाणिक के उन लोगों के समान थे 11αOH-KA (सामग्री और विधियाँ देखें). इसके विपरीत, अज्ञात यौगिकों की एक बड़ी संख्या थी P. disper Kunze पानी निकालने से निकाला (चित्रा 2 डी, दाएं). LC विश्लेषण का सारांश क्या है? चित्रा 2E में इंगित किया गया है, यह सुझाव देते हुए कि ए. लेवेनिया 11αOH-KA का एक आकर्षक स्रोत है।

3.2. A. lavenia से 11αOH-KA का उपयुक्त निष्कर्षण

इंटरनेट पर मिली जानकारी के अनुसार, ए. लेवेनिया के सभी भागों (पत्ती, तना और जड़) चीन और ताइवान में हर्बल दवाओं के रूप में उपयोग किया जाता है। 11αOH-KA के लिए सबसे अच्छी शर्तों को निर्धारित करने के लिए ए lavenia से निष्कर्षण, हम पहले जांच की जो संयंत्र के भागों इस यौगिक में समृद्ध हैं. पानी के अर्क अकेले पत्तियों या हवाई भागों से तैयार किए गए थे। वहीमेलानोजेनेसिसपर परख B16F10 कोशिकाओं से पता चला है कि हवाई भागों (तनों और पत्तियों) से तैयार अर्क कम था एंटी-मेलानोजेनिक गतिविधि की तुलना में जो अकेले पत्तियों से तैयार की गई है (चित्रा 3 ए, बाएं)। यह सुझाव देता है कि उपजी (जो शुष्क वजन के 90% से अधिक के लिए खाते हैं) में कम होते हैं11αOH-KA, जो था एलसी-यूवी विश्लेषण (चित्रा 3 ए, दाएं) द्वारा पुष्टि की गई।

इसके बाद, हमने जांच की कि निष्कर्षण के लिए पानी की कितनी मात्रा का उपयोग किया जाना चाहिए। प्रत्यक्ष स्पष्ट रूप से पानी की एक छोटी मात्रा (10 गुना) समृद्ध हो सकती है11αOH-KA(चित्र 3बी)। हमने अनुमान लगाया कि कम पानी में 11αOH-KA की घुलनशीलता अवशेषों में इस यौगिक को बनाए रखने में मदद कर सकती है। अधिकतम पुनर्प्राप्ति पानी में 11αOH-KA का अवलोकन किया गया था जब पानी के 30 से अधिक संस्करणों का उपयोग किया गया था (चित्र3C)। इसलिए, पानी में 11αOH-KA की अधिकतम वसूली और संवर्धन को ध्यान में रखते हुए, हमने 30 का उपयोग किया बाद के प्रयोगों में पानी की मात्रा।

चीन और ताइवान में, ए. लेवेनिया को गर्म पानी में निकाला जाता है, जिसके माध्यम से थर्मल स्थिरता 11αOH-KA की जांच की गई थी। पानी के अर्क को 10 या 20 मिनट के लिए 90 °C या 120 °C पर इनक्यूबेट किया गया था, और 11αOH-KA सामग्री एलसी-यूवी द्वारा विश्लेषण किया गया था। इन थर्मल उपचारों ने एक बड़े का उत्पादन किया अवसादन की मात्रा, संभवतः विकृत प्रोटीन से मिलकर। वही11αOH-KAमें सामग्री घुलनशील अंश को स्पष्ट रूप से बढ़ाया गया था (चित्रा 3 डी), जो हटाने का परिणाम हो सकता है तलछट सामग्री।

3.2.1. αOH-KA A. Lavenia पानी निकालने एंटी-मेलानोजेनिक के लिए जिम्मेदार में यौगिक है B16F10 कक्षों में गतिविधि

जब पत्ती का 1 ग्राम पानी के 30 संस्करणों में निकाला गया था, तो 11αOH-KA की सामग्री लगभग थी 0.6 मिलीग्राम / एमएल (1.8 एमएम)। के योगदान की डिग्री निर्धारित करने के लिए11αOH-KAA. lavenia पानी में विरोधी melanogenic गतिविधि के लिए निकालने, प्रामाणिक 11αOH-KA के विभिन्न सांद्रता में परीक्षण किया गया था B16F10 कोशिकाओं. दृश्य परीक्षा (चित्रा 4A) और मेलेनिन सामग्री का माप (चित्रा 4B) पता चला है कि पानी के अर्क (चित्रा 4 ए, ऊपरी सेट) जो के संदर्भ में एक ही प्रभावकारिता दिखाते हैं प्रामाणिक 11αOH-KA अकेले के रूप में विरोधी मेलानोजेनिक गतिविधि (चित्रा 4A, निचला सेट) केवल एक आधा शामिल है की मात्रा11αOH-KA. इन परिणामों से पता चलता है कि निकालने में 11αOH-KA ने लगभग योगदान दिया निकालने के विरोधी melanogenic गतिविधि का 50%. अन्य 50% 11αOH-KA से व्युत्पन्न किया जा सकता है डेरिवेटिव, जैसे ग्लाइकोसाइड रूप, जो 11αOH-KA की कम सामग्री की व्याख्या भी कर सकते हैं पी disper Kunze विरोधी melanogenic गतिविधि के मामले में अपनी उच्च प्रभावकारिता के बावजूद निकालने (चित्रा 2).

Cistanche निकालने के प्रभाव: विरोधी उम्र बढ़ने और whitening त्वचा

3.2.2. αOH-KA A. lavenia निकालें विरोधी Melanogenic गतिविधि के लिए जिम्मेदार में यौगिक है चूहों में

सौंदर्य प्रसाधनों के लिए एक सामग्री के रूप में ए. लेवेनिया के भविष्य के विकास के लिए प्रारंभिक परिणाम प्राप्त करने के लिए, हम चूहों की एक छोटी संख्या का उपयोग कर vivo विश्लेषण में प्रदर्शन किया. हमने पहले फार्माकोकाइनेटिक्स की जांच की चूहों में 11αOH-KA का। पानी का सेवन लगभग 25 ग्राम बॉडीवेट के साथ चूहों में लगभग 4 मिलीलीटर दैनिक था। A. lavenia के पानी के अर्क में 11αOH-KA की अधिकतम घुलनशीलता (देखें) चित्रा 3C, 20-30 वॉल्यूम पानी: 0.6 मिलीग्राम / एमएल) सैद्धांतिक रूप से इस की 100 मिलीग्राम / किग्रा दैनिक खुराक प्रदान कर सकता है कौरेनोइक एसिड (0.6 मिलीग्राम / एमएल 11αOH-KA के 4 एमएल 2.4 मिलीग्राम / दिन बनाया; माउस द्वारा 2.4 मिलीग्राम का सामान्यीकरण शरीर के वजन (25 ग्राम) के परिणामस्वरूप 96 मिलीग्राम / किग्रा)। इसलिए, हमने 100 मिलीग्राम / किग्रा के साथ चूहों का इलाज करने का फैसला किया 11αOH-KA (1% Tween 80 के 200 μL में निलंबित)।

मौखिक उपचार के साथ11αOH-KAइसके परिणामस्वरूप रक्त में इसकी तेजी से उपस्थिति (15 मिनट के भीतर) हुई (चित्र 5A)। एकाग्रता तक पहुंच गया और B16F10 कोशिकाओं में एक प्रभावी खुराक को बनाए रखा। यह परिणाम इंगित करता है कि 11αOH-KA पाचन तंत्र के माध्यम से अवशोषित किया जा सकता है। हालांकि, तथ्य यह है कि 60 मिनट के भीतर एकाग्रता में कमी इस यौगिक के तेजी से उत्सर्जन का सुझाव देती है।

अगला, हमने चूहों में 11αOH-KA के पुराने प्रभावों की जांच की। के बाद से भी 11αOH-KA के 0.6 मिलीग्राम / mL पीने के पानी में तेजी से अवक्षेपित अगर11αOH-KAशुद्ध था, हम ए lavenia पानी का परीक्षण करने का फैसला किया निकालना। हालांकि, ए लेवेनिया पानी निकालने में कड़वा स्वाद के साथ अज्ञात सामग्री हो सकती है। इसलिए, अर्क को पानी के दो संस्करणों के साथ और पतला किया जाना था (अंतिम मूल्य के साथ) 11αOH-KA के लिए 0.3 मिलीग्राम / एमएल, लगभग 50 मिलीग्राम / किग्रा / दिन)। चूहों को पानी से इलाज किया गया था 1 सप्ताह के लिए अर्क, और उनके रक्त के नमूने तब एकत्र किए गए थे (चित्रा 5 बी)। LC-MS विश्लेषण का पता चला एक अर्ध-प्रभावी एकाग्रता पर रक्त में 11αOH-KA. P. dispar Kunze पानी निकालने कि था ए. लेवेनिया पानी निकालने के रूप में एक ही प्रक्रिया द्वारा तैयार किया गया था भी जांच की गई थी। पी dispar Kunze निकालने के साथ इलाज चूहों के रक्त में 11αOH-KA की सामग्री की तुलना में 10 गुना कम था चूहों की एक lavenia निकालने के साथ इलाज किया.

वयस्क चूहों में, बालों की वृद्धि कई महीनों के लिए टेलोजन चरण के दौरान रुकती है, और नई वृद्धि (एनाजेन) बेतरतीब ढंग से विभिन्न क्षेत्रों में केवल कुछ दिनों के दौरान होता है [27]। इसलिए, जांच करने के लिए का प्रभावमेलानोजेनेसिसअवरोधक, यौगिकों (अवरोधकों) के साथ उपचार की अवधि चाहिए संबंधित (उदाहरण के लिए, कई महीनों)। इसके विपरीत, डाउनी बालों को वयस्क बालों के साथ तुल्यकालिक रूप से बदल दिया जाता है 3-4-सप्ताह पुराने (डब्ल्यू) चरण के दौरान। इसलिए, जब 3W चूहों को 2 सप्ताह के लिए अवरोधकों के साथ इलाज किया जाता है, पर प्रभावमेलानोजेनेसिसनए उगाए गए बालों के रंजकता (रंग) से मूल्यांकन किया जा सकता है (यानी, पहले वयस्क बाल) 5W-6W [28] पर।

जब चूहों को दो सप्ताह (3W-4W) के लिए पीने के पानी के माध्यम से ए. लेवेनिया निकालने के साथ इलाज किया गया था, उनके रंजकता को नए उगाए गए बालों (चित्रा 5 सी) में दबा दिया गया था। इसके विपरीत, उनकी आंख पिगमेंटेशन प्रभावित नहीं हुआ था। चूहों में बालों के रंजकता का दमन नहीं देखा गया था पी dispar Kunze निकालने के साथ इलाज किया. इन परिणामों से पता चलता है कि ए. लेवेनिया पत्ती निकालने हो सकता है एंटी-मेलानोजेनिक पदार्थ होते हैं, संभवतः 11αOH-KA, जो विवो में प्रभावी होते हैं, जबकि P. dispar Kunze पत्ती निकालने, संभवतः में अमीर11αOH-KAडेरिवेटिव, विवो में प्रभावी नहीं हो सकता है।

cistanche लाभ: विरोधी ऑक्सीकरण

4. चर्चा

हमने पाया कि ए. लेवेनिया के पत्तों में 11αOH-KA (लगभग 2.5% ) की उच्च मात्रा होती है सूखी पत्ती के वजन)। पानी कुशलतापूर्वक 11αOH-KA निकाला, इस की हाइड्रोफोबिक प्रकृति के बावजूद यौगिक। चूंकि पानी में 11αOH-KA 20 मिनट के लिए 120 °C पर स्थिर था, इसलिए हमने पानी के अर्क को निष्फल कर दिया ए. लेवेनिया पत्ती और इसे चूहों को प्रशासित किया। परिणामों ने की उपस्थिति की पुष्टि की11αOH-KAमें चूहों का रक्त और विवो में एक विरोधी मेलानोजेनिक अभिकर्मक के रूप में पानी के अर्क की शक्ति।

ए. लेवेनिया में 11αOH-KA और इसके डेरिवेटिव की उपस्थिति 1979 [16] और 1990 [29] में रिपोर्ट की गई थी। तब से, इंडोनेशिया के केवल एक अध्ययन ने सामग्री के व्यापक विश्लेषण की सूचना दी है ए. लेवेनिया में [30]। हालांकि, उन सामग्रियों में कोई 11αOH-KA की पहचान नहीं की गई थी। इसके अलावा, कोई अध्ययन नहीं 11αOH-KA के भौतिक गुणों पर, जिसे A. lavenia से शुद्ध पानी द्वारा निकाला जा सकता है, है पाया गया।

भारत में लोक उपचार के बारे में एक समीक्षा लेख ए. लेवेनिया पानी के अर्क को उपचार के रूप में संदर्भित करता है पाचन तंत्र विकार [31]। "ए लेवेनिया" या इसके चीनी नाम के लिए एक इंटरनेट खोज ने कुछ सुझाव दिया एक गर्म पानी निकालने के माध्यम से एक विरोधी भड़काऊ हर्बल दवा के रूप में इस पौधे के लाभकारी उपयोग (यानी, एक के रूप में) काढ़ा) (उदाहरण के लिए, हेपेटाइटिस के लिए, फुफ्फुसीय सूजन (एलर्जी और क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी) रोग), और त्वचा की सूजन)। हालांकि, ए. लेवेनिया की जैविक गतिविधियों पर कोई औपचारिक रिपोर्ट नहीं अर्क या इस संयंत्र की पारिस्थितिक स्थिति PubMed में पाए गए थे. हमारे शहर (Gifu, जापान) में, ए. lavenia एक लुप्तप्राय प्रजाति के रूप में सूचीबद्ध है। ए. लेवेनिया की दुर्लभता का विश्लेषण करना और विकसित करना मुश्किल हो सकता है हर्बल दवा और कार्यात्मक भोजन के रूप में अपनी क्षमता.

दूसरी ओर, की लाभकारी क्षमता11αOH-KA, पी. सेमीपिनाटा से शुद्ध किया गया है, किया गया है इन विट्रो और विवो में निर्धारित [8-11]। यद्यपि हमने पी में 11αOH-KA की सामग्री की जांच नहीं की। semipinnata, हमें लगता है कि यह सामग्री A. lavenia में उस की तुलना में बहुत अधिक नहीं हो सकती है क्योंकि P. semipinnata, P. disper Kunze से निकटता से संबंधित है। इसके अलावा, इन के उपयोग पर कोई रिकॉर्ड नहीं हैं मानव विषयों में फर्न, यहां तक कि इंटरनेट पर भी। इस पृष्ठभूमि से पता चलता है कि ए. लैवेनिया हो सकता है इन फर्न की तुलना में एक हर्बल दवा के रूप में अधिक क्षमता यदि 11αOH-KA को नैदानिक क्षमता के लिए दिखाया गया है।

की क्षमता पर अध्ययन11αOH-KAएक विरोधी कैंसर के रूप में अपनी गतिविधियों पर ध्यान केंद्रित किया गया है [2,10,11,32] और विरोधी भड़काऊ [11,33] एजेंट. हालांकि, यह भी सच है कि 11αOH-KA की खुराक की आवश्यकता है इन गतिविधियों के लिए 20 μM से अधिक हैं, जो अपेक्षाकृत उच्च है। इसके विपरीत, की एक एकाग्रता पर 1 μM से कम, कौरेन एंट-11α-hydroxy-16-Karen-15-one, जिसमें एक मिथाइल समूह है 11αOH-KA में कार्बोक्सिल समूह के बजाय 19-स्थिति, मानव के खिलाफ उच्च एपोप्टोटिक गतिविधि दिखाती है एचएल -60 मोनोसाइट्स [12]। इन मतभेदों से पता चलता है कि 19-स्थिति सेलुलर का एक निर्धारक हो सकती है विषाक्तता [5]।

यद्यपि एंटी-ट्यूमर और विरोधी भड़काऊ गतिविधियां विभिन्न प्रकार के कौरन [7,34-36] में पाई जाती हैं, 11αOH-KA की विशिष्ट विशेषता एक प्रकार की एंटी-मेलानोजेनिक गतिविधि है [5]। कई प्राकृतिक यौगिकों, जैसे फ्लेवोनोइड्स और टेर्पेनोइड्स, को संशोधित करने के लिए पाया गया हैमेलानोजेनेसिसबदलने से माइक्रोफ्थाल्मिया प्रतिलेखन कारक (एमआईटीएफ) की अभिव्यक्ति, जो मेलानोजेनिक के लिए आवश्यक है कार्यक्रम [13,14].। इन यौगिकों के विपरीत, कौरेन्स में कोई एमआईटीएफ मॉड्यूलेटर नहीं पाया गया है या कौरेनोइक एसिड।

11αOH-KAकी अभिव्यक्ति को दबादेता हैटायरोसिनेसजीन अपनी प्रमोटर गतिविधि को कम करके। यद्यपि 11αOH-KA MITF की अभिव्यक्ति या गतिविधि के स्तर को नहीं बदलता है, 11αOH-KA दबा देता है एक MITF-बाध्यकारी-तत्व-निर्भर तरीके से tyrosinase जीन प्रमोटर गतिविधि [5]. दिलचस्प B16F10 कक्षों में MITF के overexpression के परिणामस्वरूप 11αOH-KA-मध्यस्थता रद्द हो जाती है Tyrosinase प्रमोटर गतिविधि का दमन, यह सुझाव देते हुए कि 11αOH-KA एक अज्ञात भर्ती कर सकता है MITF-बाइंडिंग तत्व के लिए दमनकारी. इसके अलावा, वह तंत्र जिसके द्वारा 11αOH-KA दबा देता हैटायरोसिनेसप्रमोटर गतिविधि उस गतिविधि से अलग हो सकती है जो साइटोटॉक्सिसिटी की ओर ले जाती है क्योंकि एंटी-मेलानोजेनिक गतिविधि तब भी देखी जाती है जब B16F10 कोशिकाओं को 11αOH-KA के 1.2 μM के साथ इलाज किया जाता है। (चित्र 4)।

प्राथमिक केराटिनोसाइट्स से बने एक मानव त्रि-आयामी त्वचा मॉडल को शामिल करने वाले अनुसंधान और मेलानोसाइट्स से पता चलता है कि 1 mM का सामयिक उपयोग11αOH-KAपूरी तरह से त्वचा को दबादेता है रंजकता [5]। एंटी-मेलानोजेनिक गतिविधि के संदर्भ में, 11αOH-KA का 1 mM किसके बराबर है? सूखे ए. लेवेनिया पत्ती के लगभग 6.6 मिलीग्राम / एमएल (0.66%) (चित्र3)। इस संदर्भ में, ए. लावेनिया एक के लिए कॉस्मेटिक वस्तुओं का आकर्षक स्रोतत्वचा वृष् ठन. इसके अलावा, ए लेवेनिया का उपयोग एक लोक चिकित्सा के रूप में किया जाता है, और 11αOH-KA विरोधी melanogenic के लिए अपनी प्रभावी खुराक (सांद्रता) के बीच एक व्यापक मार्जिन है गतिविधि और cytotoxicity.

महत्वपूर्ण रूप से, tranexamic एसिड (एक हेमोस्टैटिक दवा) मेलेनिन जमाव को दबाने के लिए पाया गया है मानव त्वचा में और melasma [23,24] के इलाज के लिए एक मौखिक दवा के रूप में प्रयोग किया जाता है। दिलचस्प बात यह है कि चूहों के फर tranexamic एसिड के साथ इलाज काले से भूरे रंग में रंग बदल गया [37]. वर्तमान अध्ययन में, हमने यह भी दिखाया गया है कि ए लेवेनिया पत्ती का एक पानी का अर्क बाल रंजकता (काले) को कुशलतापूर्वक दबा सकता है भूरे रंग में) चूहों में जब मौखिक रूप से दिया जाता है, तो यह सुझाव देते हुए कि ए लेवेनिया पत्ती को दोनों में विकसित किया जा सकता है मेलास्मा से पीड़ित रोगियों के लिए आंतरिक सौंदर्य प्रसाधन और कार्यात्मक खाद्य पदार्थ [20-22]। आगे के अध्ययन ए Lavenia अर्क के सेलुलर लक्ष्यों के बारे में आवश्यक हैं और11αOH-KAसाथ ही उनकी सुरक्षा भी।

सिस्तानचे की गोलियाँके लिएत्वचा वृष् ठन