अग्न्याशय में परिधीय प्रशिक्षित प्रतिरक्षा का समावेश अग्नाशय के कैंसर की प्रगति को नियंत्रित करने के लिए एंटी-ट्यूमर गतिविधि को उत्तेजित करता है भाग 1

कई प्रकार के कैंसर में इम्यूनोथेरेपी की उल्लेखनीय सफलता के बावजूद, अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा को अभी तक लाभ नहीं हुआ है। अंतर्जात प्रतिरक्षा कोशिकाएं ट्यूमर-रोधी प्रतिरक्षा निगरानी के लिए महत्वपूर्ण हैं और हाल के अध्ययनों से पता चला है कि इन आबादी में स्मृति का एक रूप होता है, जिसे प्रशिक्षित सहज प्रतिरक्षा कहा जाता है, जो ट्रांसक्रिप्टोमिक, एपिजेनेटिक और मेटाबोलिक रिप्रोग्रामिंग के माध्यम से होता है।

यहाँ हम प्रदर्शित करते हैं कि यीस्ट-व्युत्पन्न पार्टिकुलेट-ग्लुकन, प्रशिक्षित प्रतिरक्षा का प्रेरक, अग्न्याशय में तस्करी करता है, जो अग्न्याशय में एक CCR 2-निर्भर प्रवाह का कारण बनता है जो प्रशिक्षित प्रतिरक्षा की विशेषताओं को प्रदर्शित करता है। इन कोशिकाओं को ट्यूमर कोशिकाओं और ट्यूमर-व्युत्पन्न कारकों के संपर्क में आने पर सक्रिय किया जा सकता है, और अग्नाशयी ट्यूमर कोशिकाओं के खिलाफ बढ़ी हुई साइटोटोक्सिसिटी दिखा सकता है। अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा के ऑर्थोटोपिक मॉडल में, -ग्लुकन उपचारित चूहों ने ट्यूमर के बोझ को काफी कम कर दिया और लंबे समय तक जीवित रहे, जो कि इम्यूनोथेरेपी के साथ संयुक्त होने पर और बढ़ जाता है। ये निष्कर्ष परिधीय प्रशिक्षित प्रतिरक्षा के गतिशील तंत्र और स्थानीयकरण की विशेषता बताते हैं और कैंसर के लिए प्रशिक्षित प्रतिरक्षा के अनुप्रयोग की पहचान करते हैं।

प्रतिरक्षा के कई कार्य हैं, जैसे कि पुरानी और क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को साफ करना: प्रतिरक्षा प्रणाली शरीर को बीमारियों से बचाने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं सहित पुरानी और क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को भी साफ कर सकती है। यह शरीर के संतुलन को भी बनाए रख सकता है: प्रतिरक्षा प्रणाली शरीर के आंतरिक वातावरण को भी संतुलित कर सकती है, प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच संतुलन बनाए रख सकती है, और ओवररिएक्शन या प्रतिरक्षा की कमी जैसी बीमारियों के उभरने से बच सकती है, इसलिए मानव शरीर के लिए प्रतिरक्षा बहुत महत्वपूर्ण है।

वहीं, हमने पाया कि सिस्टैंच डेजर्टिकोला भी रोग प्रतिरोधक क्षमता में सुधार कर सकता है। Cistanche जैविक रूप से सक्रिय अवयवों की एक किस्म से समृद्ध है, जैसे कि पॉलीसेकेराइड, फ्लेवोनोइड्स, स्टेरोल्स, आदि। ये तत्व शरीर में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गतिविधि को उत्तेजित कर सकते हैं, सेलुलर प्रतिरक्षा और हास्य प्रतिरक्षा को बढ़ा सकते हैं, और वायरस के विकास और प्रजनन को रोक सकते हैं और बैक्टीरिया। शरीर के प्रतिरोध और प्रतिरक्षा में सुधार। इसके अलावा, Cistanche में एंटीऑक्सिडेंट, एंटी-इंफ्लेमेटरी और शामक प्रभाव भी होते हैं, जो शारीरिक थकान को दूर करने और प्रतिरक्षा बढ़ाने के लिए तनाव को खत्म करने में मदद कर सकते हैं।

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अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी) का निदान एक विनाशकारी है, जिसमें पिछले 5 वर्षों1 में केवल 10 प्रतिशत रोगी जीवित रहते हैं। हालांकि 2014 के बाद से जीवित रहने की दर 6 से 10 प्रतिशत तक बढ़ गई है, अग्नाशयी कैंसर वर्तमान में उपलब्ध अधिकांश उपचारों के लिए दुर्दम्य बना हुआ है।

इसके अलावा, संयुक्त राज्य अमेरिका की जनसांख्यिकी में बदलाव के रूप में, यह अनुमान लगाया गया है कि 2030 तक अग्नाशय का कैंसर कैंसर से संबंधित मृत्यु दर का दूसरा प्रमुख कारण बन जाएगा और इस प्रकार चिकित्सकों के लिए एक महत्वपूर्ण भविष्य की चुनौती पेश करता है। अग्न्याशय का कैंसर विशेष रूप से घातक है क्योंकि शुरुआती चरणों में शायद ही कभी नैदानिक ​​​​लक्षण होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप 75-80 प्रतिशत रोगियों में उन्नत, गैर-संक्रमणीय रोग3,4 का निदान किया जाता है। यहां तक ​​कि उन रोगियों में भी जो उच्छेदन के लिए पात्र हैं, 5-वर्ष जीवित रहने की दर केवल 20-25 प्रतिशत 4 है। इसके अलावा, अग्नाशय के कैंसर ने इम्युनोथैरेपी के प्रति थोड़ी प्रतिक्रिया दिखाई है जिसने अन्य ठोस ट्यूमर5-9 में उल्लेखनीय प्रभाव दिखाया है। CTLA -4 और PD -1 अवरोधकों का उपयोग करते हुए चरण I और II नैदानिक ​​परीक्षण दोनों अकेले और संयोजन में PDAC के उपचार के लिए अप्रभावी माने गए हैं, जो संभवतः PDAC10 की गैर-इम्युनोजेनिक प्रकृति द्वारा समझाया गया है- 12.

पीडीएसी में इम्यूनोथेरेपी के सफल अनुप्रयोग के लिए एक बड़ी चुनौती इम्यूनोसप्रेसिव अग्नाशय ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) पर काबू पाना है। PDAC को घने प्रो-ट्यूमरजेनिक डिस्मोप्लास्टिक स्ट्रोमा की विशेषता है, इस स्ट्रोमा के भीतर ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज (TAMs), नियामक टी-कोशिकाओं (T-regs), और माइलॉयड-व्युत्पन्न शमन कोशिकाओं (MDSCs) जैसे इम्यूनोसप्रेसेरिव सेल सबसेट की बहुतायत है। , सक्रिय एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा कोशिकाओं की कमी, और हाइपरवास्कुलरिटी जो एक हाइपोक्सिक माइक्रोएन्वायरमेंट को उधार देती है। साथ में ये स्थितियाँ अग्न्याशय को प्रभावी ढंग से इम्युनोथैरेपी वितरित करने और इन चिकित्सीय के लिए एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को सफलतापूर्वक सक्रिय करने के लिए असाधारण रूप से चुनौतीपूर्ण बनाती हैं यदि वे वहां पहुंचती हैं। इसलिए, उपन्यास चिकित्सा विज्ञान की सख्त जरूरत है जो न केवल विशेष रूप से अग्न्याशय को लक्षित कर सकते हैं, बल्कि घने डेस्मोप्लास्टिक स्ट्रोमा में भी घुसपैठ कर सकते हैं, और इम्यूनोसप्रेसिव टीएमई के बावजूद मजबूत एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को उकसाने में सक्षम हैं।

प्रशिक्षित सहज प्रतिरक्षा प्रतिरक्षात्मक स्मृति का एक क्रमिक रूप से प्राचीन कार्यक्रम है जो हाल ही में गहन वैज्ञानिक जांच के अंतर्गत आया है। विशिष्ट प्रारंभिक उत्तेजनाओं के संपर्क में आने पर प्रशिक्षित सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं को ट्रांसक्रिपटामिक, एपिजेनेटिक और मेटाबोलिक रिप्रोग्रामिंग से गुजरना दिखाया गया है, और जब इन जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं को एक माध्यमिक विषम उत्तेजना के लिए फिर से उजागर किया जाता है, तो वे उस उत्तेजना के प्रति अधिक प्रतिक्रियाशील होने के लिए "प्रशिक्षित" होते हैं। एक बढ़ी हुई भड़काऊ प्रतिक्रिया 17-19 में प्रकट होती है। बैसिलस कैलमेट-गुएरिन (बीसीजी) वैक्सीन और प्राकृतिक यौगिक -ग्लूकन सहित कई बायोलॉजिक्स प्रशिक्षित प्रतिरक्षा को प्रेरित कर सकते हैं। हालांकि प्रशिक्षित प्रतिरक्षा के बारे में अधिकांश अध्ययन बैक्टीरिया और वायरस जैसे रोगजनकों पर एक माध्यमिक उत्तेजना के रूप में ध्यान केंद्रित करते हैं, नए अध्ययनों से पता चलता है कि ट्यूमर कोशिकाएं प्रशिक्षित प्रतिरक्षा कोशिकाओं को भी सक्रिय कर सकती हैं। तिथि करने के लिए सभी शोधों ने कैंसर के चमड़े के नीचे के मॉडल का उपयोग किया है, इसलिए यह ज्ञात नहीं है कि प्रशिक्षित जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं की उपस्थिति ठोस अंगों के भीतर ट्यूमर पर एंटी-ट्यूमर प्रभाव ला सकती है, जैसे कि अग्नाशय का कैंसर20,21।

इस अध्ययन में, हमने अप्रत्याशित रूप से पाया कि इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) ने अग्न्याशय के बड़े अनुपात में खमीर-व्युत्पन्न पार्टिकुलेट-ग्लूकन ट्रैफ़िक को इंजेक्ट किया। अग्न्याशय के लिए -ग्लूकन की सीधी तस्करी परिधीय प्रशिक्षित प्रतिरक्षा को शामिल करने के लिए पहले से अप्रचलित मार्ग पर प्रकाश डालती है। इसके अतिरिक्त, हमने परिकल्पना का परीक्षण किया कि इस तस्करी के परिणामस्वरूप अग्नाशय के कैंसर के खिलाफ एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा का समावेश हो सकता है। अकेले पीडीएसी के इलाज के लिए अधिकांश चिकित्सीय और इम्युनोथैरेपी की विफलता को देखते हुए और अग्न्याशय को इन चिकित्सीय को लक्षित करने में कठिनाई को देखते हुए, हमारे निष्कर्ष सामूहिक रूप से न केवल अग्न्याशय को लक्षित करने में बल्कि एंटी-ट्यूमर की भर्ती में भी एक संभावित सफलता प्रदान करते हैं। प्रतिरक्षात्मक रूप से ठंडे PDAC TME के ​​लिए जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाएं।

परिणाम

खमीर-व्युत्पन्न पार्टिकुलेट-ग्लूकन अधिमानतः अग्न्याशय में तस्करी करता है।

यह अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है कि बैक्टीरिया और कवक से -ग्लुकन का प्रशासन हेमेटोपोएटिक पूर्वजों और बहुशक्तिशाली पूर्वजों की संख्या और आवृत्तियों को बढ़ाता है जो माइलॉयड वंशावली के पक्षपाती हैं, जो अंततः केंद्रीय और परिधीय प्रशिक्षित प्रतिरक्षा22 को शामिल करने में एक महत्वपूर्ण कदम के रूप में कार्य करता है। . हालांकि, यह अभी तक नहीं दिखाया गया है कि प्रशासन के बाद इन प्रभावों के लिए वास्तव में -ग्लुकन ट्रैफिक कहां हैं।

इन अध्ययनों में, Saccharomyces cerevisiae से प्राप्त पूरे-ग्लूकन कणों (WGP) का उपयोग किया गया था, जो अत्यधिक केंद्रित (1,3) -ग्लूकेन्स से बने 2-4 माइक्रोन खोखले खमीर कोशिकाएं हैं। हमारे अन्य अध्ययनों में से एक में WGP -glucan का विस्तृत लक्षण वर्णन किया गया है। प्रशिक्षित प्रतिरक्षा में उपयोग किए जाने वाले ग्लूकन के अन्य रूपों के विपरीत, यह सूत्रीकरण इस मायने में अनूठा है कि यह कण है और इसके प्रभाव को लागू करने के लिए सक्रिय फागोसाइटोसिस की आवश्यकता होती है। इस पार्टिकुलेट-ग्लूकेन की तस्करी का आकलन करने के लिए, WGP को (5-(4,6- डाइक्लोरोट्रियाज़िनिल) एमिनोफ्लोरेसिन) (DTAF) के साथ टैग किया गया था और IP को वाइल्ड-टाइप (WT) C57BL/6 चूहों में इंजेक्ट किया गया था। IP प्रशासन के तीन दिन बाद (3-दिन WGP), फेफड़े, प्लीहा, वंक्षण और मेसेन्टेरिक लिम्फ नोड्स, पेरिटोनियल कैविटी कोशिकाओं और अग्न्याशय को काटा गया, बर्फ-ठंडे पीबीएस से धोया गया ताकि पेरिटोनियम से DTAFWGP को धोया जा सके। अंग की सतह का पालन किया गया है, और प्रत्येक अंग में DTAF-WGP की उपस्थिति का प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मूल्यांकन किया गया था। जबकि तिल्ली, मेसेन्टेरिक लिम्फ नोड्स, और पेरिटोनियल गुहा में अवशिष्ट DTAF-WGP के लिए DTAF-WGP की कुछ तस्करी थी, अग्न्याशय ने DTAF-WGP (छवि 1a) की एक हड़ताली और अप्रत्याशित उपस्थिति दिखाई।

इस तस्करी का और आकलन करने के लिए और यह सुनिश्चित करने के लिए कि DTAF लेबल तस्करी तंत्र में शामिल नहीं था, WGP को 89Zr के साथ रेडिओलेबल किया गया था और IP (छवि 1b) इंजेक्ट किया गया था या पेरिटोनियल मैक्रोफेज के साथ इनक्यूबेट किया गया था जो तब IP (छवि 1c) इंजेक्ट किया गया था। इंजेक्शन के बाद 48 घंटे बाद पीईटी/सीटी स्कैन का उपयोग करके चूहे की छवि ली गई और अग्न्याशय में 89जेडआर-डब्ल्यूजीपी के देखे गए अधिमान्य संचय को इंगित करने के लिए हरे घेरे का उपयोग किया जाता है। फिर एक नेक्रोस्कोपी की गई और प्रत्येक अंग के रेडियोधर्मी हस्ताक्षर को मापा गया। प्रवाह साइटोमेट्री डेटा द्वारा, 89Zr-WGP को अग्न्याशय में बड़ी मात्रा में तस्करी की गई थी और तिल्ली, यकृत और आंतों की प्रणाली में निचले स्तर में पाया गया था। पेरिटोनियल मैक्रोफेज जिन्हें 89Zr-WGP के साथ सुसंस्कृत किया गया था और फिर IP इंजेक्ट किया गया था, हालांकि शुद्ध 89Zr-WGP की तुलना में थोड़ा अधिक विविध ट्रैफ़िकिंग था, और अग्न्याशय (छवि 1d) में भी सबसे प्रमुख रूप से जमा हुआ था। पेरिटोनियल मैक्रोफेज की तस्करी WGP के साथ अग्न्याशय में लोड होने से संकेत मिलता है कि दोनों नग्न WGP के साथ-साथ मैक्रोफेज जिनके पास अग्न्याशय के लिए WGP डिस्प्ले ट्रॉपिज़्म है।

डब्ल्यूजीपी के ज्ञात रिसेप्टर की डब्ल्यूजीपी की तस्करी में निभाई गई भूमिका का आकलन करने के लिए सी-टाइप लेक्टिन रिसेप्टर, डेक्टिन -1, (डेक्टिन -1-/- चूहों) की कमी वाले चूहों को आईपी के साथ इंजेक्ट किया गया था। DTAF-WGP। WT चूहों की तुलना में, Dectin -1-/- चूहों ने WGP की मात्रा में पांच गुना कमी दिखाई जो अग्न्याशय में तस्करी की गई थी, जैसा कि फ्लो साइटोमेट्री (चित्र 1d) द्वारा मूल्यांकन किया गया था। 89ZrWGP ने IP को WT चूहों और Dectin -1-/- चूहों में भी इंजेक्ट किया है। WT जानवरों की तुलना में, Dectin -1-/- चूहों (चित्र 1e) के अग्न्याशय में 89Zr-WGP की तस्करी काफी कम थी। यह सुनिश्चित करने के लिए कि यह प्रक्रिया -ग्लूकन विशिष्ट थी, एक पॉलीस्टायरीन-आधारित लेटेक्स 3 माइक्रोन फ्लोरोसेंट कण, एक डब्ल्यूजीपी कण के समान आकार, आईपी इंजेक्ट किया गया था और अग्न्याशय (सप्लीमेंट्री अंजीर। 1 ए) में जमा नहीं पाया गया था। साथ में, ये डेटा पहले से अनैच्छिक डेक्टिन -1 निर्भर ट्रॉपिज़्म को उजागर करते हैं जिसमें अग्न्याशय के लिए ग्लूकन ट्रैफ़िक होता है।

चित्र 1 पार्टिकुलेट-ग्लुकन अग्न्याशय के लिए एक डिक्टिन -1-निर्भर तरीके से यातायात करता है। एक DTAF-WGP को IP इंजेक्ट किया गया और 3 दिन बाद विभिन्न ऊतकों (n=3) को काटा गया और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा DTAF-WGP की उपस्थिति के लिए मूल्यांकन किया गया। प्रतिनिधि डॉट प्लॉट और सारांशित डेटा दिखाए जाते हैं। *p=0.032, **p=0.0057, ****p <0.0001। b WGP को 89Zr-WGP के साथ लेबल किया गया था या c पेरिटोनियल मैक्रोफेज को 89Zr-WGP के साथ जोड़ा गया और धोया गया, इसके बाद IP इंजेक्शन लगाया गया। PET/CT इमेजिंग 48 घंटे के बाद 89Zr-WGP की तस्करी को प्रदर्शित करता है। गामा काउंटर का उपयोग करके नेक्रोस्कोपी के बाद रेडियोधर्मिता के लिए अंगों का व्यक्तिगत रूप से मूल्यांकन किया गया था। सी में, अग्न्याशय (एन=3) की तुलना में महत्व बताया गया है। **** पी <0.0001। d Dectin -1 - / - चूहों या WT चूहों को DTAF-WGP के साथ इंजेक्ट किया गया था और अग्न्याशय में DTAF-WGP के संचय का प्रवाह साइटोमेट्री (WT PBS n=3, WT WGP n {{) द्वारा मूल्यांकन किया गया था। 27}}, KO प्लस PBS n=3, KO प्लस WGP n=4)। e Dectin -1 -/− चूहों या WT चूहों (n=4) को 89Zr-WGP के साथ इंजेक्ट किया गया और 48 घंटे बाद अग्न्याशय में मात्रा का आकलन करने के लिए PET/CT का उपयोग किया गया। अग्न्याशय में इंजेक्शन की खुराक (प्रतिशत आईडी) के प्रतिशत की रिपोर्ट करके संकेत की मात्रा निर्धारित की गई थी। *पी=0.046। टकी की कई तुलनाओं के साथ एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग ए-डी में किया गया था, और ई में एक अयुग्मित, दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग किया गया था। डेटा को माध्य ± SEM के रूप में दर्शाया गया था। एनएस महत्वपूर्ण नहीं; प्रत्येक नमूना एक एकल स्वतंत्र प्रयोग से प्राप्त जैविक रूप से स्वतंत्र जानवर का प्रतिनिधित्व करता है जिसे परिणामों के सत्यापन के लिए कम से कम दो बार दोहराया गया था।

-ग्लूकन कि अग्न्याशय में तस्करी जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रवाह को उत्तेजित करती है जो प्रशिक्षित प्रतिरक्षा का एक फेनोटाइप दिखाती है।

यह पता लगाने के बाद कि -ग्लुकन अग्न्याशय की ओर ट्रॉपिज्म प्रदर्शित करता है, यह भी देखा गया कि डब्ल्यूजीपी उपचार के बाद अग्न्याशय के प्रतिरक्षा परिदृश्य में काफी बदलाव आया। अग्न्याशय के लिए WGP का आगमन CD11b प्लस माइलॉयड कोशिकाओं के एक अलग प्रवाह के साथ 3 दिन तक अग्न्याशय में था, जिनमें से कुछ में WGP (चित्र। 2a) का फागोसिटोज था।

इस खोज ने हमें यह जांचने के लिए प्रेरित किया कि IP WGP उपचार के बाद अग्न्याशय की समग्र प्रतिरक्षा आबादी कैसे प्रभावित होती है। जैसा कि पहले देखा गया है कि बीएम में प्रशिक्षित प्रतिरक्षा से जुड़े प्रतिरक्षा परिवर्तन सबसे स्पष्ट 1-सप्ताह में -ग्लूकेन22 के संपर्क में आने के बाद होते हैं, अग्न्याशय की प्रतिरक्षा प्रोफ़ाइल की जांच चूहों में 3 माइक्रोन पॉलीस्टाइरीन माइक्रोपार्टिकल या प्रशासन के 7 दिन बाद WGP। सबसे पहले, यह देखा गया कि WGP उपचार (चित्र। 2b) के बाद अग्न्याशय में CD45 प्लस प्रतिरक्षा कोशिकाओं की समग्र निरपेक्ष संख्या में लगभग सात गुना वृद्धि हुई थी। 3 सुक्ष्ममापी पॉलीस्टीरिन माइक्रोप्रार्टिकल नियंत्रण में इस तरह के प्रभाव नहीं थे (अनुपूरक चित्र। 1 बी), यह दर्शाता है कि यह प्रतिरक्षा कोशिका प्रवाह WGP विशिष्ट है। इसके अलावा, CD45 प्लस इम्यून सेल्स (सप्लीमेंट्री अंजीर। 1c) के प्रतिशत में वृद्धि देखी गई।

CD45 प्लस प्रतिरक्षा आबादी के इस विस्तार के लिए कौन से सेल प्रकार जिम्मेदार थे, इसे और अधिक वर्गीकृत करने के लिए, माइलॉयड कोशिकाओं (CD11b plus ), T-cells (CD3 plus ) की पूर्ण संख्या (चित्र। 2b) और सापेक्ष प्रतिशत (अनुपूरक चित्र। 1c) , बी-कोशिकाओं (CD19 प्लस), और NK कोशिकाओं (NK1.1 प्लस) का मूल्यांकन किया गया। अग्न्याशय में संचयी परिवर्तन पाई चार्ट द्वारा दर्शाए जाते हैं जो प्रदर्शित करते हैं कि माइलॉयड डिब्बे का विस्तार अन्य सेल आबादी के प्रतिशत में सापेक्ष कमी और WGP उपचार (छवि 2c) के बाद CD45 प्लस जनसंख्या में समग्र वृद्धि के लिए जिम्मेदार है। . हमने अगली जाँच की कि क्या CD11b प्लस प्रतिरक्षा कोशिकाओं का यह प्रवाह क्षणिक था, इसलिए IP इंजेक्शन के बाद अग्न्याशय में समग्र CD45 प्लस कोशिकाओं और CD11b प्लस कोशिकाओं का प्रतिशत 7,10, 18 और 30 दिनों में मापा गया।

अंजीर. {{0}}ग्लूकन अग्न्याशय में प्रशिक्षित माइलॉयड कोशिकाओं के प्रवाह को उत्तेजित करता है। WT चूहों द्वारा IP DTAF-WGP प्राप्त करने के 3 दिन बाद अग्न्याशय में CD45 प्लस CD11b प्लस DTAF प्लस कोशिकाओं का एक प्रतिशत। बी पीबीएस या डब्ल्यूजीपी इंजेक्शन के सात दिन बाद, सीडी 45 प्लस (एन=15), सीडी 11 बी प्लस (एन=18), सीडी 3 प्लस (एन {{1 {{3 0}) की पूर्ण संख्या }}}), CD19 प्लस (n=10), और NK1.1 प्लस (n=14) सेल दिखाए गए हैं। ****p <0.0001. सी पाई चार्ट WGP उपचार के बाद प्रमुख प्रतिरक्षा सेल आबादी के आवृत्ति परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करते हैं। d WT चूहों को PBS (n=5) या WGP (n=5) के साथ इंजेक्ट किया गया और CD45 प्लस और CD45 प्लस CD11b प्लस कोशिकाओं का प्रतिशत 7, 10, 18 और 30 दिन बाद मापा गया ( एन=3)। **p=0.0034, ****p <0.0001 (CD45), **p=0.0023 (CD11b)। CD11b प्लस जनसंख्या के भीतर F4/80 प्लस (n=10), Ly6C प्लस (n=10), और Ly6G प्लस (n=8) की पूर्ण संख्या। **पी=0.003, ****पी <0.0001। एफ आईपी पीबीएस या डब्ल्यूजीपी के सात दिन बाद एलपीएस के साथ अग्न्याशय को बहाल किया गया था। CD11b प्लस (n=28), CD11b प्लस F4/80 प्लस (n=9), और CD11b प्लस Ly6C प्लस (n=8) कोशिकाओं में TNF उत्पादन मापा गया। *p=0.024, ***p=0.0001, ****p <0.0001। जी पीबीएस या डब्ल्यूजीपी के सात दिन बाद, सीडी 45 प्लस सीडी 11 बी प्लस जनसंख्या समृद्ध हुई (एन=4)। कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए एलपीएस के साथ या बिना बहाल किया गया था। टीएनएफ और आईएल -6 उत्पादन को एलिसा का उपयोग करके मापा गया था। **** पी <0.0001। पीबीएस और डब्ल्यूजीपी-प्रशिक्षित चूहों से एच अग्नाशयी सीडी 11 बी प्लस कोशिकाओं को छांटा गया। RT-qPCR TNF (n=4), IL -6 (n=4), iNOS (PBS n=4, WGP n=3) की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया गया था। , और आईएल -10 (पीबीएस एन=4, डब्ल्यूजीपी एन=5) एमआरएनए अभिव्यक्ति स्तर। *p=0.028, **p=0.0018, ****p <0.0001। I CD11b प्लस कोशिकाओं को PBS या WGP-इंजेक्टेड चूहों (24 h) से सॉर्ट किया गया (n=4)। H3K4me3, H3K27Ac, ​​H3K27me3, और कुल H3 के लिए हिस्टोन को अलग किया गया और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (शीर्ष) या एलिसा (नीचे) के अधीन किया गया। **** पी <0.0001। j IP WGP या PBS के सात दिन बाद, अग्नाशयी CD45 प्लस CD1b प्लस आबादी को छांटा गया। RNA-Seq विश्लेषण किया गया (PBS n=3, WGP n=3)।

अलग-अलग अभिव्यक्त जीनों के p मानों का वितरण (-log10(p-value)) और तह परिवर्तन (log2 FC) का प्रतिनिधित्व किया जाता है। पीबीएस या डब्ल्यूजीपी के साथ प्रशिक्षित चूहों में सीडी11बी प्लस आबादी के के टी-एसएनई भूखंड 7 दिन पहले और साइटोफ (पीबीएस एन=3, डब्ल्यूजीपी एन=3) के साथ विश्लेषण किया गया। अयुग्मित, दो-पूंछ वाले छात्र के t-परीक्षणों का उपयोग b, e, f और h में किया गया था। डी, जी और आई में कई तुलनाओं के साथ एक-तरफ़ा एनोवा का इस्तेमाल किया गया था। डेटा को माध्य ± SEM के रूप में दर्शाया गया है। एनएस महत्वपूर्ण नहीं है। प्रत्येक नमूना एक एकल स्वतंत्र प्रयोग से प्राप्त जैविक रूप से स्वतंत्र जानवर का प्रतिनिधित्व करता है।

जबकि CD11b प्लस कोशिकाओं का प्रतिशत 7 दिन में चरम पर था, CD45 प्लस कोशिकाओं का प्रतिशत 10 दिन में चरम पर दिखाई दिया, जो यह संकेत दे सकता है कि अग्न्याशय में CD11b प्लस कोशिकाओं के प्रवाह के बाद, अन्य प्रतिरक्षा सेल प्रकारों का प्रवाह हो सकता है। अग्न्याशय में प्रतिरक्षा कोशिकाओं का प्रतिशत 30 दिन तक बेसल स्तर तक कम हो गया, यह दर्शाता है कि यह प्रवाह क्षणिक है (चित्र 2d)। माइलॉयड कंपार्टमेंट के भीतर, हमने मैक्रोफेज (F4/80 प्लस), मोनोसाइट्स (Ly6C प्लस), और न्यूट्रोफिल (Ly6G प्लस) की पूर्ण संख्या (छवि 2e) और प्रतिशत (अनुपूरक चित्र। 1c) का अवलोकन किया। अग्न्याशय में प्रतिरक्षा कोशिकाओं का प्रवाह भी WGP इंजेक्शन की खुराक पर निर्भर होना दिखाया गया था, जहां WGP की उच्च खुराक समग्र CD45 प्लस CD11b प्लस माइलॉयड कोशिकाओं और CD45 प्लस CD11b प्लस F4/80 प्लस मैक्रोफेज के बढ़ते प्रवाह से जुड़ी थी। (अनुपूरक चित्र। 1d)।

चूंकि अग्नाशयशोथ और अग्नाशयी आइलेट्स का विनाश अग्न्याशय के प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ से जुड़ा हुआ है, अग्न्याशय के एच प्लस ई को डब्ल्यूजीपी प्रशासन (सप्लीमेंट्री अंजीर। 1e) के 7 दिन बाद एसिनी की अखंडता का आकलन करने के लिए किया गया था। अग्नाशयशोथ के एक नैदानिक ​​​​मार्कर सीरम एमाइलेज को इंजेक्शन के 7 दिन बाद डब्ल्यूजीपी बनाम पीबीएस-उपचारित चूहों में भी मापा गया (सप्लीमेंट्री अंजीर। 1 एफ)। डब्ल्यूजीपी उपचार से न तो आइलेट्स और न ही सीरम एमाइलेज पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ा और देखा गया प्रतिरक्षा प्रवाह, यह दर्शाता है कि इस तंत्र में प्रतिरक्षा कोशिका प्रवाह अग्न्याशय के विनाश का कारण नहीं बनता है।

यह जांचने के लिए कि क्या WGP उपचार के बाद माउस अग्न्याशय में घुसपैठ करने वाली कोशिकाओं ने प्रशिक्षित प्रतिरक्षा का एक फेनोटाइप प्रदर्शित किया, हमने एक मानक प्रशिक्षण प्रोटोकॉल का उपयोग किया जिसमें चूहों का WGP या PBS के साथ इलाज किया गया और 7 दिनों के बाद अग्न्याशय काटा गया और फिर LPS के साथ बहाल किया गया। प्रशिक्षित प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए टीएनएफ-उत्पादन को सरोगेट मार्कर के रूप में उपयोग किया गया है। कुल मिलाकर CD11b प्लस माइलॉयड कोशिकाएं, CD11b प्लस F4/80 प्लस मैक्रोफेज, और CD11b प्लस Ly6C प्लस मोनोसाइट्स सभी को अधिक TNF- उत्पन्न करने के लिए दिखाया गया था- WGP के पूर्व जोखिम के कारण, जैसा कि TNF- प्लस कोशिकाओं और MFI (चित्र) के प्रतिशत द्वारा मूल्यांकन किया गया था। . 2च)। इन निष्कर्षों का और मूल्यांकन करने के लिए, CD11b प्लस कोशिकाओं को इन चूहों के अग्न्याशय से छांटा गया था और एलपीएस के साथ पूर्व वीवो को बहाल किया गया था, और सुपरनैटेंट्स में TNF- और IL -6 स्तरों को एलिसा द्वारा मापा गया था। PBS चूहों से CD11b प्लस कोशिकाओं की तुलना में, WGPप्रशिक्षित चूहों की कोशिकाओं, जिन्हें LPS के साथ बहाल किया गया था, ने काफी अधिक TNF- और IL -6 (चित्र। 2g) का उत्पादन किया, जो दर्शाता है कि WGP- उपचारित अग्नाशय CD11b प्लस कोशिकाओं को प्रशिक्षित किया गया था।

आरटी-पीसीआर का उपयोग करके इन परिणामों की और पुष्टि की गई, जहां पीबीएस या डब्ल्यूजीपी-प्रशिक्षित चूहों से छांटे गए अग्नाशयी सीडी11बी प्लस कोशिकाओं को अधिक टीएनएफ-, आईएल -6, आईएनओएस, और कम आईएल -10 का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया था। WGP उपचार (चित्र। 2h)। चूंकि प्रशिक्षित प्रतिरक्षा चयापचय और एपिजेनेटिक रिप्रोग्रामिंग23 से जुड़ी है, इसलिए हमने यह जांचने के लिए लैक्टेट के स्तर को मापा कि क्या ग्लाइकोलाइसिस शामिल है। वास्तव में, WGPtrained CD11b प्लस कोशिकाओं ने अप्रशिक्षित कोशिकाओं (सप्लीमेंट्री अंजीर। 1g) की तुलना में अधिक लैक्टेट का स्राव किया। हमने WGP-प्रशिक्षित CD11b प्लस कोशिकाओं के हिस्टोन संशोधनों को भी मापा। जैसा कि चित्र 2I में दिखाया गया है, WGP-प्रशिक्षित CD11b प्लस कोशिकाओं में H3K4me3 और H3K27Ac के अभिव्यक्ति स्तर में काफी वृद्धि हुई थी। यह पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (चित्र। 2i, शीर्ष) और एलिसा मात्रात्मक परख (चित्र। 2i, नीचे) दोनों द्वारा प्रकट किया गया था। साथ में इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि WGP न केवल कोशिकाओं में एक प्रशिक्षित फेनोटाइप को उत्तेजित करता है जो अग्न्याशय में यातायात करता है, बल्कि वे चयापचय और एपिजेनेटिक रिप्रोग्रामिंग से भी गुजरते हैं।

अग्न्याशय में माइलॉयड आबादी का एक निष्पक्ष और व्यापक लक्षण वर्णन प्राप्त करने के लिए पीबीएस या डब्ल्यूजीपी प्रशासन के 7 दिन बाद आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सेक) को एफएसीएस-सॉर्टेड सीडी45 प्लस सीडी11बी प्लस कोशिकाओं पर प्रदर्शित किया गया था। कुल 1459 अलग-अलग व्यक्त जीन (डीईजी) की खोज की गई, जिसमें 661 अपग्रेडेड और 798 जीन WGPtrained सेटिंग (चित्र 2j) में डाउनग्रेड किए गए। जीन सेट संवर्धन विश्लेषण (GSEA) ने TNF- और, IL -6 उत्पादन (अनुपूरक चित्र। 2a) से संबंधित रास्तों में पहले से जांचे गए अपग्रेड की पुष्टि की। प्रतिरक्षा कोशिकाओं के देखे गए प्रवाह से, ल्यूकोसाइट केमोटैक्सिस, ल्यूकोसाइट माइग्रेशन (सप्लीमेंट्री अंजीर। 2ए), मोनोसाइट केमोटैक्सिस, मैक्रोफेज माइग्रेशन, और माइलॉयड ल्यूकोसाइट माइग्रेशन (सप्लीमेंट्री अंजीर। 2 बी) से संबंधित डीईजी सभी डब्ल्यूजीपी समूह में काफी समृद्ध थे। इसके अतिरिक्त, रिएक्टोम पाथवे CLEC7A डेक्टिन -1 सिग्नलिंग और सी-टाइप लेक्टिन रिसेप्टर पाथवे काफी समृद्ध थे, जो आगे इस प्रक्रिया में डैक्टिन -1 की भागीदारी की पुष्टि करते हैं (अनुपूरक चित्र 2c)।

यह देखते हुए कि सीडी45 प्लस आबादी के विस्तार के लिए माइलॉयड आबादी को जिम्मेदार माना गया था और माइलॉयड कोशिकाएं एक विविध आबादी हैं, 7 दिन पहले पीबीएस या डब्ल्यूजीपी के साथ इलाज किए गए चूहों से अग्नाशय पर CyTOF विश्लेषण किया गया था। अग्न्याशय के भीतर सेल आबादी की पहचान की गई और उपचार समूहों के बीच तुलना की गई; टी-एसएनई भूखंडों ने संकेत दिया कि डब्ल्यूजीपी उपचार के बाद निवासी मैक्रोफेज आबादी में सापेक्ष कमी आई थी जो सीडी206 जैसे एम2 मार्करों को अत्यधिक व्यक्त करता है। हमने अग्न्याशय में कई माइलॉयड आबादी की उपस्थिति का भी अवलोकन किया, जिन्हें Ly6C प्लस मैक्रोफेज-व्युत्पन्न मोनोसाइट्स के रूप में परिभाषित किया गया था, जो भड़काऊ मोनोसाइट्स, सक्रिय मैक्रोफेज और CD206 प्लस सक्रिय मैक्रोफेज (चित्र। 2k और अनुपूरक चित्र। 2d) में घुसपैठ कर रहे थे। CD11b प्लस जनसंख्या पर गेट किए गए viSNE भूखंडों ने WGP उपचार (अनुपूरक चित्र। 2e) के बाद डेंड्राइटिक सेल (DCs), न्यूट्रोफिल और NK आबादी की अतिरिक्त वृद्धि के साथ, मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज का एक अलग विस्तार दिखाया।

इसके अतिरिक्त, ये विश्लेषण इस बात पर प्रकाश डालते हैं कि WGP प्रशिक्षण और LPS उत्तेजना के बाद, TNF मुख्य रूप से मैक्रोफेज और मोनोसाइट्स द्वारा निर्मित किया गया था, IL -6 और iNOS मुख्य रूप से मैक्रोफेज द्वारा निर्मित किए गए थे, Granzyme-B NK कोशिकाओं और मैक्रोफेज द्वारा निर्मित किया गया था, और IFN था मुख्य रूप से न्यूट्रोफिल (अनुपूरक चित्र। 2f) द्वारा निर्मित। इससे पता चलता है कि WGP उपचार के कारण कई सेल आबादी बदल जाती है, WGP द्वारा प्रशिक्षित प्राथमिक कोशिकाएं, जैसा कि बढ़ी हुई TNF अभिव्यक्ति द्वारा मूल्यांकन किया जाता है, मैक्रोफेज और मोनोसाइट्स हैं और यह कि प्रशिक्षित प्रतिरक्षा के फेनोटाइप के लिए जिम्मेदार एक भी सेल प्रकार नहीं है। अवलोकित किया गया।

यह आकलन करने के लिए कि क्या माइलॉयड सेल प्रवाह और सक्रियण की यह घटना अन्य प्रतिरक्षा आबादी पर निर्भर थी या पूरी तरह से माइलॉयड कोशिकाओं द्वारा संचालित थी, हमने विशिष्ट प्रतिरक्षा आबादी को कम कर दिया और प्रशिक्षित फेनोटाइप का अवलोकन किया। AntiCD4 और एंटी-CD8 mAbs अकेले इस्तेमाल किए गए थे और टी-कोशिकाओं को कम करने के संयोजन में, कमी की दक्षता का आकलन किया गया था (सप्लीमेंट्री अंजीर। 3 ए), और माइलॉयड कोशिकाओं के प्रशिक्षित फेनोटाइप को देखा गया था (सप्लीमेंट्री अंजीर। 3 बी, सी)। mAb PK136 का उपयोग करके NK कोशिकाओं को भी समाप्त कर दिया गया था, घटती दक्षता का मूल्यांकन किया गया था (पूरक छवि 3 डी) और प्रशिक्षित फेनोटाइप मनाया गया था (अनुपूरक चित्र 3e, एफ)। टी-कोशिकाओं और एनके कोशिकाओं की अनुपस्थिति में, माइलॉयड कोशिकाओं को अभी भी डब्ल्यूजीपी द्वारा प्रशिक्षित किया जाना देखा गया था। एनएसजी चूहों में प्रशिक्षित फेनोटाइप का भी मूल्यांकन किया गया था जिसमें बी-कोशिकाओं, टी-कोशिकाओं और एनके कोशिकाओं (अनुपूरक चित्र 3 जी, एच) की कमी थी। इन चूहों ने अभी भी प्रशिक्षित प्रतिरक्षा का एक स्पष्ट फेनोटाइप दिखाया।

अंत में, हमने Ly6G mAb का उपयोग करके न्यूट्रोफिल को समाप्त कर दिया। ग्रैन्यूलोसाइट्स की कमी के बावजूद, हमने अभी भी CD11b प्लस माइलॉयड कम्पार्टमेंट (अनुपूरक चित्र। 3i-k) में WGP- प्रेरित प्रशिक्षण का अवलोकन किया। एक साथ लिया गया, हमारा डेटा समर्थन करता है कि अग्न्याशय में घुसपैठ करने वाली माइलॉयड कोशिकाओं को अनुकूली प्रतिरक्षा आबादी, एनके कोशिकाओं या ग्रैन्यूलोसाइट्स की सहायता या प्रभाव के बिना -ग्लूकन द्वारा प्रशिक्षित किया जाता है।

एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण से प्रिनफ्लेमेटरी मैक्रोफेज/मोनोसाइट्स की विशिष्ट आबादी का पता चलता है जो अग्न्याशय पर -ग्लुकन उपचार के लिए यातायात करता है।

जैसा कि हमारे CyTOF विश्लेषणों ने WGP उपचार के बाद अग्न्याशय में पहले से मौजूद कई अप्रचलित आबादी की उपस्थिति का खुलासा किया है, अग्न्याशय में मौजूद सेल आबादी की अधिक गहराई से समझ हासिल करने के लिए, एक एकल-कोशिका RNA अनुक्रमण (scRNA-Seq) का प्रदर्शन किया गया था। WGP तीन (3-दिन WGP) और सात दिन पहले (7-दिन WGP) से उपचारित PBS-उपचारित चूहों और चूहों से सॉर्ट की गई CD45 प्लस कोशिकाओं पर। के-निकटतम पड़ोसियों और लौवेन एल्गोरिदम से उत्पन्न समूहों के साथ तीन नमूनों से एकत्रित 11, 132 कोशिकाओं का द्वि-आयामी यूएमएपी प्रतिनिधित्व 19 अलग-अलग समूहों (छवि 3 ए, बी) में विभाजित है। प्रत्येक प्रायोगिक समूह के भीतर प्रत्येक क्लस्टर की सापेक्ष आवृत्ति का आकलन किया गया।

यहाँ, क्लस्टर 3, 4, और 10 की आवृत्ति में महत्वपूर्ण वृद्धि WGP उपचार के बाद दिन 7 के साथ-साथ क्लस्टर 5 (चित्र 3 सी) के निकट गायब होने के साथ देखी गई। समय के साथ कई अन्य आबादी की सापेक्ष आवृत्तियों में भी कमी देखी गई। हालाँकि, यह स्पष्ट प्रवृत्ति अन्य आबादी की आवृत्ति में सापेक्ष वृद्धि के कारण होने की संभावना है। कुल मिलाकर, क्लस्टर 3,4,10, और 5 WGP उपचार (चित्र 3डी) के कारण सबसे महत्वपूर्ण रूप से परिवर्तित दिखाई देते हैं।

WGP उपचार के कारण समय के साथ सबसे महत्वपूर्ण रूप से परिवर्तित होने वाली आबादी पहले माइलॉयड डिब्बे का हिस्सा थी, जैसा कि CSF1R अभिव्यक्ति (चित्र 3 डी, ई) द्वारा पहचाना गया था। जैसा कि पिछले निष्कर्षों के साथ इन आंकड़ों से पता चलता है कि माइलॉयड आबादी WGP उपचार से जुड़े प्रतिरक्षा परिवर्तनों को चलाती है, डायनेमिक CSF1R प्लस क्लस्टर 3,4,10, और 5 की अधिक विस्तार से जांच की गई जैसा कि वायलिन प्लॉट्स (चित्र 3f) और डॉट द्वारा दिखाया गया है। प्रत्येक क्लस्टर (छवि 3 जी) के लिए औसत जेड-स्कोर द्वारा शीर्ष 12 मार्कर जीन का प्रतिनिधित्व करने वाले भूखंड। क्लस्टर 5, जो पीबीएस चूहों में मौजूद था लेकिन डब्ल्यूजीपी उपचार के बाद निवासी मैक्रोफेज24,25 के रूप में पहचाने जाने के बाद लगभग गायब हो गया। इस क्लस्टर ने विशेष रूप से MAF और APO को भी व्यक्त किया है जो दोनों M2 मैक्रोफेज ध्रुवीकरण26-28 से संबंधित हैं। क्लस्टर 19 समय के साथ काफी हद तक अपरिवर्तित था, इसलिए इसे अधिक विस्तार से वर्णित नहीं किया गया था, लेकिन क्लस्टर 5 के समान एक अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल प्रदर्शित की गई थी, और इस प्रकार यह ऊतक-निवासी मैक्रोफेज के सबसेट का भी प्रतिनिधित्व करता है। क्लस्टर 10, Ly6Clo मैक्रोफेज आबादी, में भी निवासी मैक्रोफेज क्लस्टर 5 के समान अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल थी, और ARG1 और FABP के उल्लेखनीय अभिव्यक्ति हस्ताक्षर थे। हम इस आबादी को पुनर्निर्मित निवासी मैक्रोफेज होने की परिकल्पना करते हैं, जिसे Ly6C अभिव्यक्ति की कमी, निवासी मैक्रोफेज आबादी की समानता और WGP उपचार के बाद निवासी आबादी के गायब होने के कारण दिया गया है। क्लस्टर 3 और 4 ने Ly6CHi घुसपैठ करने वाले मोनोसाइट्स / मैक्रोफेज के रूप में सामान्य फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन साझा किया। क्लस्टर 4 में Chil3 और Plac8 की उल्लेखनीय अभिव्यक्ति थी, जिन्हें एक साथ Ly6Ci घुसपैठ करने वाले मैक्रोफेज की पहचान करने के लिए एक अन्य समूह द्वारा पहचाना गया है।

अंत में, क्लस्टर 3, जो भोले चूहों में अनुपस्थित था और WGP उपचार के बाद सभी समूहों के बीच सापेक्ष आवृत्ति में सबसे बड़ी वृद्धि देखी गई, ने TNFAIP2, IL1B, SOD2, और PRDX5 के पर्याप्त हस्ताक्षर व्यक्त किए, जो एक जोरदार समर्थक भड़काऊ फेनोटाइप का संकेत देते हैं। इस प्रकार क्लस्टर 3 को Ly6CHi भड़काऊ घुसपैठ करने वाले मोनोसाइट्स / मैक्रोफेज के रूप में पहचाना गया। दिलचस्प बात यह है कि माइलॉयड उपसमुच्चय के भीतर, WGP उपचार के कारण वृद्धि दिखाई गई आबादी TNFAIP2 को व्यक्त करने वाली एकमात्र आबादी है, यह दर्शाता है कि अग्न्याशय में प्रवेश करने वाली कोशिकाएं संभवतः प्रशिक्षित माइलॉयड कोशिकाएं हैं।

चार गतिशील माइलॉयड समूहों में से प्रत्येक की सक्रियण स्थिति को आगे बढ़ाने के लिए, प्रो-भड़काऊ स्थिति और एक विरोधी भड़काऊ स्थिति (छवि 3h) से जुड़े जीन की सापेक्ष अभिव्यक्ति दिखाने के लिए डॉट प्लॉट का निर्माण किया गया था। क्लस्टर 3 और 4, घुसपैठ करने वाले मोनोसाइट्स / मैक्रोफेज, प्रो-इंफ्लेमेटरी दिखाए गए थे, रेजिडेंट मैक्रोफेज एंटी-इंफ्लेमेटरी थे, और क्लस्टर 10 में मैक्रोफेज ने एक मध्यवर्ती फेनोटाइप दिखाया। पिछले CyTOF और फ्लो साइटोमेट्री डेटा के साथ समझौते में, यह scRNA-Seq डेटा अग्न्याशय में इन नए पहचाने गए माइलॉयड कोशिकाओं की विशेषता बताता है, जो Ly6CLo निवासी मैक्रोफेज और प्रो-इन्फ्लेमेटरी Ly6CHi घुसपैठ करने वाले मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज की एक विषम आबादी है जो हस्ताक्षर व्यक्त करते हैं। प्रशिक्षित प्रतिरक्षा की।

अग्न्याशय में WGP-चालित अंतर्वाह और माइलॉयड कोशिकाओं का प्रशिक्षण CCR 2- पर निर्भर है और 24 घंटे के बाद WGP उपचार के रूप में होता है।

हमने अगली जांच की कि अग्न्याशय में कोशिकाओं के इस प्रवाह के लिए कौन से तंत्र जिम्मेदार थे। RNA-Seq डेटा का उपयोग केमोकाइन्स और साइटोकिन्स को चिह्नित करने के लिए किया गया था, जिनकी अभिव्यक्ति WGP उपचार (चित्र 4a) पर काफी हद तक अपग्रेड की गई थी। जबकि कई केमोकाइन और साइटोकिन्स को अपग्रेड किया गया था, अग्न्याशय में मैक्रोफेज और मोनोसाइट इनफ्लो के हमारे अवलोकन ने मोनोसाइट और मैक्रोफेज भर्ती और अस्थि मज्जा से मोनोसाइट इग्रेस में शामिल होने के कारण CCR2 में एक विशिष्ट रुचि दिखाई। CyTOF डेटा ने भी WGP उपचार (चित्र 4b) के बाद CCR 2- सकारात्मक कोशिकाओं में एक प्रमुख वृद्धि दिखाई और scRNA-Seq ने क्लस्टर 3 और 4 में CCR2 की एक अलग अभिव्यक्ति दिखाई, जो दो आबादी थी जो सबसे अलग दिखाई दी प्रशिक्षित प्रतिरक्षा के फेनोटाइप (चित्र। 4 सी)। इसके अतिरिक्त, 24 घंटे के बाद WGP उपचार, पूरे अग्नाशयी lysates ने CCL2 में 30- गुना वृद्धि दिखाई, जो CCR2 के लिए लिगैंड है और मोनोसाइट केमोटैक्सिस (छवि 4d) की मध्यस्थता में शामिल है।

RNA-Seq डेटा ने प्रतिरक्षा सेल भर्ती और तस्करी का एक स्पष्ट हस्ताक्षर दिखाया था, और इन आंकड़ों ने यह भी संकेत दिया कि WGP ने ल्यूकोसाइट्स और मोनोन्यूक्लियर सेल (चित्र 4e) के प्रसार को बढ़ा दिया। यह जांचने के लिए कि क्या अग्न्याशय तक पहुंचने के बाद CCR2 प्लस माइलॉयड कोशिकाएं फैल रही थीं, Ki67 को व्यक्त करने वाले CCR2 प्लस कोशिकाओं के प्रतिशत का मूल्यांकन PBS और WGPtreated चूहों में किया गया था। WGP उपचार के बाद समग्र प्रसार कोशिकाओं (चित्र 4f) में वृद्धि हुई और इन प्रसार कोशिकाओं का एक बड़ा प्रतिशत CD11b प्लस CCR2 प्लस (चित्र 4g) था। हमने तब CCR2 प्लस कोशिकाओं के प्रशिक्षित फेनोटाइप में योगदान की जांच की। पीबीएस या डब्ल्यूजीपी, सीसीआर2 प्लस और सीसीआर2-आबादी के साथ विवो उपचार के 7 दिनों के बाद एक प्रशिक्षित प्रतिक्रिया (छवि 4एच) के लिए मापा गया था। इस डेटा ने संकेत दिया कि WGP उपचार के बाद प्रशिक्षित अधिकांश कोशिकाएँ CCR2 प्लस थीं।

CCR2 इन -ग्लुकन प्रशिक्षित मोनोसाइट्स / मैक्रोफेज की भूमिका की जांच करने के लिए, CCR2 - / - चूहों को WGP -glucan के साथ प्रशिक्षित किया गया। CCR2 - / - चूहों ने अग्न्याशय में CD45 प्लस (चित्र। 4i) या CD45 प्लस CD11b प्लस माइलॉयड कोशिकाओं (चित्र। 4j) की आमद से नहीं गुज़रा, और TNF- उत्पादन (अंजीर) के अनुसार एक प्रशिक्षित प्रतिक्रिया नहीं दिखाई। 4k)। यह डेटा इंगित करता है कि CCR2 अग्न्याशय में जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रवास और अग्न्याशय में परिधीय प्रशिक्षित प्रतिरक्षा को शामिल करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, CCR2 मोनोसाइट्स की शुरुआती भर्ती के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन देर से भर्ती लिए इतना कम है। इस प्रकार अब तक, हमने यह भी देखा था कि WGP प्रशिक्षण के 7 दिनों के बाद, CCR2 अग्न्याशय में प्रशिक्षित माइलॉयड कोशिकाओं की भर्ती के लिए महत्वपूर्ण था। हमने अगली जांच की कि क्या यह बाढ़ WGP प्रशिक्षण के शुरुआती बिंदु पर हुई है और क्या CCR2 प्लस माइलॉयड कोशिकाओं को अग्न्याशय में भर्ती किया गया था। यह अंत करने के लिए, चूहों को पीबीएस या डब्ल्यूजीपी के साथ इलाज किया गया था, और अग्नाशय के ऊतकों का 24 और 48 घंटे बाद विश्लेषण किया गया था। आश्चर्यजनक रूप से, WGP प्रशिक्षण के बाद 24 घंटे की शुरुआत में, CD45 प्लस (सप्लीमेंट्री फ़िगर 4a), CD11b प्लस (सप्लीमेंट्री फ़िगर 4b), F4 / 80 प्लस (सप्लीमेंट्री फ़िगर 4c), Ly6C प्लस (सप्लीमेंट्री फ़िगर 4d) में वृद्धि होती है। , और CD11b plus CCR2 plus (अनुपूरक चित्र। 4e) कोशिकाएँ देखी गईं।

इसके अतिरिक्त, यह दिखाया गया कि इन माइलॉयड कोशिकाओं को WGP उपचार (सप्लीमेंट्री अंजीर। 4f) के बाद 24 घंटे की शुरुआत में प्रशिक्षित किया गया था। यह अवलोकन इन परिणामों और प्रशिक्षित प्रतिरक्षा के पहले देखे गए फेनोटाइप के बीच एक विचलन को उजागर करता है जो आमतौर पर प्रशिक्षण के बाद कम से कम 3 दिनों तक शुरू नहीं किया जाता है।

अंजीर. 4 CCR2 अग्न्याशय में प्रतिरक्षा सेल तस्करी के लिए आवश्यक है। केमोकाइन और साइटोकिन्स का एक हीटमैप जिसे आरएनए-सेक डेटा के आधार पर 7-दिन WGPट्रीटेड CD11b प्लस कोशिकाओं में अपग्रेड किया गया था। पीबीएस और 7- दिन WGP- प्रशिक्षित चूहों में CD11b प्लस अग्नाशय की आबादी का b viSNE प्लॉट, CCR2 की अभिव्यक्ति पर प्रकाश डालता है। CyTOF डेटा के साथ बनाई गई छवियां। c scRNA-Seq डेटा CCR2 को व्यक्त करने वाले माइलॉयड समूहों का एक UMAP दिखा रहा है। d CCL2 अभिव्यक्ति पूरे अग्नाशय में 24 घंटे WGP उपचार के बाद RT-PCR (n=6) द्वारा मापा जाता है। ****पी=0.0001. ई GSEA ने PBS चूहों की तुलना में 7- दिन WGP-प्रशिक्षित से CD11b प्लस अग्नाशय कोशिकाओं में ल्यूकोसाइट प्रसार से संबंधित जीनों के संवर्धन भूखंडों को उत्पन्न किया। पीबीएस को नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था और डब्ल्यूजीपी की तुलना में। f CD45 प्लस अग्नाशयी कोशिकाओं के प्रतिशत का सारांशित डेटा जो कि PBS और 7- दिन WGP-प्रशिक्षित चूहों (n=4) में Ki67 प्लस हैं। ***पी=0.0007। जी सेल को पहले CD45 प्लस Ki67 प्लस जनसंख्या पर गेट किया गया था। भूखंड CD45 प्लस Ki67 प्लस प्रसार अग्नाशय कोशिकाओं का प्रतिशत दिखाते हैं जो PBS और 7-दिन WGP-प्रशिक्षित चूहों (n=4) में CD11b प्लस CCR2 प्लस हैं। *पी=0.0261। एच पीबीएस और 7- दिन डब्ल्यूजीपी-प्रशिक्षित चूहों (एन=5) से अग्नाशयी कोशिकाओं को एलपीएस के साथ बहाल किया गया था और टीएनएफ का उत्पादन करने वाले सीसीआर2 सकारात्मक और नकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत प्रत्येक स्थिति में मापा गया था। कोशिकाओं को पहले CD45 प्लस CD11b प्लस सबसेट पर गेट किया गया था। प्रतिनिधि डॉट प्लॉट और सारांशित डेटा दिखाए गए थे। *p=0.022, **p=0.0073, ***p=0.0007। i-k WT और CCR2-/- चूहों का PBS या WGP के साथ इलाज किया गया और अग्न्याशय में I CD45 प्लस कोशिकाओं का प्रतिशत (**** p <0.0001) और j CD45 प्लस कोशिकाओं का प्रतिशत जो CD11b प्लस का मूल्यांकन किया गया था . **पी=0.0013। k TNF का उत्पादन करने वाली CD45 प्लस CD11b प्लस कोशिकाओं का प्रतिशत। प्रतिनिधि प्रवाह भूखंड और सारांशित डेटा दिखाए जाते हैं। प्रत्येक बिंदु एक माउस से डेटा का प्रतिनिधित्व करता है। ***पी=0.0002। (i-k: WT PBS n=9, WT WGP n=9, CCR2-/- PBS n=8, CCR2-/- WGP n=8)।

डी, एफ और जी में एक अयुग्मित, दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग किया गया था, जबकि एच-के में कई तुलनाओं के साथ एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग किया गया था। डेटा को माध्य ± SEM के रूप में दर्शाया गया था। एनएस महत्वपूर्ण नहीं है। एफ-के में, प्रत्येक नमूना एक एकल स्वतंत्र प्रयोग से प्राप्त जैविक रूप से स्वतंत्र जानवर का प्रतिनिधित्व करता है जिसे परिणामों के सत्यापन के लिए कम से कम दो बार दोहराया गया था।

डब्ल्यूजीपी-प्रशिक्षित अग्नाशयी घुसपैठ करने वाली माइलॉयड कोशिकाएं अग्नाशय के कैंसर से स्रावित कारकों और ट्यूमर कोशिकाओं को फागोसाइटोसिस और आरओएस-मध्यस्थता साइटोटोक्सिसिटी को बढ़ाने के लिए प्रशिक्षित प्रतिक्रियाएं प्रदर्शित करती हैं।

जैसा कि हमने दिखाया है कि प्रारंभिक उत्तेजना के रूप में WGP का उपयोग जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं में होता है जो LPS के द्वितीयक जोखिम के लिए अधिक मजबूती से प्रतिक्रिया करने के लिए प्रशिक्षित होते हैं और ये कोशिकाएं उपचार के बाद अग्न्याशय में जमा हो जाती हैं, हम जानना चाहते थे कि क्या अग्न्याशय के ट्यूमर से संबंधित माध्यमिक उत्तेजनाएं हैं इस प्रशिक्षित प्रतिक्रिया को भी प्राप्त कर सकते हैं। यह अंत करने के लिए, हमने पहले जांच की कि क्या अग्नाशयी कैंसर कोशिकाएं स्वयं WGP- प्रेरित प्रशिक्षित प्रतिक्रिया प्राप्त करने में सक्षम हैं। इस प्रश्न की जांच करने के लिए, पेरिटोनियल मैक्रोफेज को इन विट्रो में पीबीएस या डब्ल्यूजीपी के साथ सुसंस्कृत किया गया था और 7 दिनों के बाद एलपीएस के साथ बहाल किया गया था, एक भोले माउस अग्न्याशय से संवर्धित कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला, और सुसंस्कृत केपीसी कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला, जो एक सेल लाइन हैं। LSL-KrasG12D/ plus से प्राप्त C57BL/6 पृष्ठभूमि पर अग्नाशयी ट्यूमर; एलएसएल-Trp53R172H/ प्लस; Pdx 1-Cre (KPC) चूहों या Pan02 अग्नाशय के कैंसर कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए। सतह पर तैरनेवाला में TNF- उत्पादन एलिसा द्वारा मापा गया था।

सुसंस्कृत सामान्य अग्नाशयी कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला की तुलना में, जो पहले से प्रशिक्षित मैक्रोफेज को सक्रिय नहीं करता था, सुसंस्कृत केपीसी और पैन02 अग्नाशयी कैंसर कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला अधिक टीएनएफ - -उत्पादन-इन-ग्लुकन प्रशिक्षित मैक्रोफेज (अनुपूरक चित्र। 5 ए) को उत्तेजित करता है। इसके अतिरिक्त, इस संभावना को नियंत्रित करने के लिए कि फागोसाइटोसिस की प्रक्रिया स्वयं कोशिकाओं के सक्रिय होने का कारण बन सकती है, पेरिटोनियल मैक्रोफेज को 3 सुक्ष्ममापी पॉलीस्टीरिन माइक्रोपार्टिकल बीड्स के साथ सुसंस्कृत किया गया था और फिर पीबीएस या एलपीएस (सप्लीमेंट्री अंजीर। 5 बी) के साथ बहाल किया गया था। परिणामों से पता चला कि TNF का बढ़ा हुआ उत्पादन WGP प्रशिक्षण के लिए विशिष्ट था।

इसके बाद एक पूर्व विवो सेटिंग में परीक्षण किया गया था जिसमें चूहों को पीबीएस या डब्ल्यूजीपी के साथ इलाज किया गया था और 7 दिनों के बाद अग्न्याशय काटा गया था, अग्नाशयी माइलॉयड कोशिकाओं को समृद्ध किया गया था, और फिर सुसंस्कृत केपीसी (सप्लीमेंट्री अंजीर। 5 सी) या पैन02 से सुपरनैटेंट्स के साथ बहाल किया गया था। कोशिकाएं (अनुपूरक चित्र। 5d)। इससे पता चला कि विवो में डब्ल्यूजीपी ने अग्न्याशय में सीडी11बी प्लस माइलॉयड कोशिकाओं को प्रशिक्षित किया और ट्यूमर-सशर्त मीडिया के जवाब में काफी अधिक टीएनएफ- का उत्पादन किया। ट्यूमर कोशिकाएं स्वयं कई कारकों का स्राव करती हैं जो विशेष रूप से प्रशिक्षित प्रतिरक्षा में दूसरी उत्तेजना के रूप में कार्य कर सकते हैं। यह ज्ञात है कि अग्नाशयी ट्यूमर कोशिकाएं क्षति से जुड़े आणविक पैटर्न (डीएएमपी) और प्रो-भड़काऊ कारकों के उच्च स्तर को व्यक्त करती हैं, जैसे कि मैक्रोफेज माइग्रेशन इनहिबिटरी फैक्टर (एमआईएफ)। MIF एक साइटोकिन है जिसे अग्नाशय के ट्यूमर द्वारा उच्च सांद्रता में स्रावित करने के लिए जाना जाता है जो सीधे माइलॉयड कोशिकाओं पर कार्य कर सकता है।

वास्तव में, MIF KPC और Pan02 कोशिकाओं के सतह पर तैरनेवाला में मौजूद था जैसा कि एलिसा (अनुपूरक चित्र 5e) द्वारा मूल्यांकन किया गया था। इस प्रकार हमने परिकल्पना की कि MIF एक संभावित ट्यूमर-स्रावित कारक हो सकता है जो WGP- प्रेरित प्रशिक्षित प्रतिरक्षा की स्थापना में दूसरे संकेत के रूप में कार्य कर सकता है। इसकी जांच करने के लिए, विवो डब्ल्यूजीपी-प्रशिक्षित चूहों में अग्नाशयी माइलॉयड कोशिकाओं को ट्यूमर-वातानुकूलित मीडिया में मौजूद पुनः संयोजक MIF (rMIF) की समान एकाग्रता के साथ बहाल किया गया था। जैसा कि पूरक चित्र 5f में दिखाया गया है, पहले WGP के साथ प्रशिक्षित अग्नाशयी माइलॉयड कोशिकाओं ने rMIF पुनर्स्थापन पर TNF- उत्पादन बढ़ाया। सामूहिक रूप से, ये आंकड़े इस अवधारणा का सुझाव देते हैं कि अग्नाशयी ट्यूमर कोशिकाएं, घुलनशील कारकों के माध्यम से जो वे जारी करती हैं, अग्न्याशय में माइलॉयड कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए दूसरे संकेत के रूप में काम कर सकती हैं जिन्हें WGP द्वारा प्रशिक्षित किया गया है।

हमने अगली जांच की कि क्या इन डब्ल्यूजीपी-प्रशिक्षित सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं ने आंतरिक एंटी-ट्यूमर गुणों को बढ़ाया है। आरएनए सीक्वेंसिंग डेटा ने संकेत दिया कि फागोसाइटोसिस-संबंधित तंत्र को डब्ल्यूजीपी सेटिंग (छवि 5 ए) में अपग्रेड किया गया था, जिसकी हमने परिकल्पना की थी कि यह एंटी-ट्यूमर कार्यक्षमता का एक तंत्र हो सकता है। WGP प्रशिक्षण पर शीर्ष 20 समृद्ध KEGG पाथवे और जीन ओन्टोलॉजी (GO) जैविक प्रक्रियाओं को सप्लीमेंट्री टेबल्स 1 और 2 में सूचीबद्ध किया गया है। WGP-प्रशिक्षित माउस अग्न्याशय से CD45 प्लस पैन इम्यून सेल और CD11b प्लस माइलॉयड कोशिकाओं को फागोसाइटोटिक क्षमता के लिए काटा और परख लिया गया। WGP उपचार ने समग्र CD45 प्लस प्रतिरक्षा कोशिकाओं (चित्र। 5b) और CD11b प्लस माइलॉयड कोशिकाओं (चित्र। 5c) की फैगोसाइटिक क्षमता में उल्लेखनीय वृद्धि की।

इसके अलावा, विवो प्रशिक्षित माइलॉयड कोशिकाओं में केपीसी ट्यूमर कोशिकाओं (चित्र। 5 डी) के फागोसाइटोसिस में वृद्धि देखी गई। हमने तब मूल्यांकन किया कि क्या WGP द्वारा प्रशिक्षित माइलॉयड कोशिकाओं ने KPC कोशिकाओं में साइटोटॉक्सिसिटी को बढ़ाया है। RNA-Seq डेटा ने संकेत दिया कि प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) बायोसिंथेटिक प्रक्रियाओं से संबंधित डीईजी और आरओएस चयापचय प्रक्रियाओं के सकारात्मक विनियमन को डब्ल्यूजीपी-उपचारित माइलॉयड कोशिकाओं (छवि 5e) में काफी समृद्ध किया गया था।

परिणामस्वरूप, हमने अनुमान लगाया कि WGP द्वारा ROS उत्पादन के अपग्रेडेशन के परिणामस्वरूप KPC ट्यूमर कोशिकाओं में अग्नाशयी माइलॉयड सेल साइटोटोक्सिसिटी में वृद्धि होगी। इस परिकल्पना का पता लगाने के लिए, अग्न्याशय से CD11b प्लस कोशिकाओं को -glucan प्रशिक्षित या अप्रशिक्षित चूहों से अलग किया गया और 24 घंटे के लिए ल्यूसिफरेज-एक्सप्रेसिंग KPC कोशिकाओं (KPCLuc plus) के साथ चढ़ाया गया। डब्ल्यूजीपी-प्रशिक्षित मायलॉइड कोशिकाओं ने केपीसी ट्यूमर कोशिकाओं की ओर तीन गुना बढ़ी हुई साइटोटोक्सिसिटी दिखाई, और आरओएस अवरोधक एन-एसिटाइल सिस्टीन (एनएसी) का उपयोग करके आरओएस उत्पादन के निषेध ने साइटोटोक्सिसिटी (छवि 5 एफ) में डब्ल्यूजीपी-एलिसिटेड वृद्धि को पूरी तरह से निरस्त कर दिया। आरओएस-प्रेरित लिपिड पेरोक्सीडेशन एपोप्टोसिस, ऑटोफैगी और फेरोप्टोसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इस प्रकार हमने साइटोटोक्सिसिटी पर उनके प्रभाव की जांच करने के लिए दो अतिरिक्त आरओएस इनहिबिटर, ट्रॉक्स और डेफेरोक्सामाइन (डीएफओ) का इस्तेमाल किया।Trolox और DFO के जोड़ ने WGPtrained CD11b प्लस सेल-मध्यस्थता साइटोटोक्सिसिटी (चित्र। 5g) को महत्वपूर्ण रूप से बाधित किया, सुझाव दियाकि आरओएस-प्रेरित लिपिड पेरोक्सीडेज कम से कम आंशिक रूप से इस आरओएस-मध्यस्थता साइटोटोक्सिसिटी में शामिल है।

चित्र 5 WGP-प्रशिक्षित अग्नाशय घुसपैठ करने वाली माइलॉयड कोशिकाएं बढ़ी हुई फैगोसाइटोसिस और ROS-मध्यस्थता साइटोटोक्सिसिटी दिखाती हैं। पीबीएस चूहों की तुलना में 7-दिन WGP-प्रशिक्षित से CD11b प्लस कोशिकाओं में फैगोसाइटोसिस के सकारात्मक नियमन से संबंधित संवर्धन प्लॉट (GSEA) और जीन का हीटमैप। b CD45 प्लस अग्न्याशय कोशिकाओं का प्रतिशत जो PBS (n=10) और 7- दिन WGP (n=9) चूहों में pHrodo ग्रीन स्टैफ ऑरियस कण को ​​phrodo के MFI के साथ फैगोसाइट करता है ग्रीन स्टैफ ऑरियस कण। प्रत्येक बिंदु एक माउस से डेटा का प्रतिनिधित्व करता है। *p {{10}}.043, ****p <0.0001। c CD11b प्लस माइलॉयड अग्नाशयी कोशिकाओं का प्रतिशत जो PBS (n=13) और 7-दिन WGP (n=13) चूहों में एक phrodo ग्रीन स्टैफ ऑरियस कण को ​​फागोसाइट करता है। कोशिकाओं को पहले CD45 प्लस जनसंख्या पर गेट किया गया था। Phrodo Green Staph Aureus कण का MFI दिखाया गया है। **पी=0.0021, ***पी=0.0002। d CD11b प्लस माइलॉयड अग्नाशय कोशिकाओं का प्रतिशत जो PBS (n=5) और 7- दिन WGP (n=5) चूहों में KPCGFP प्लस ट्यूमर कोशिकाओं को फैगोसाइट करता है। *पी=0.0103। कोशिकाओं को पहले CD45 प्लस जनसंख्या पर गेट किया गया था। GFP प्लस सिग्नल का सारांशित MFI भी दिखाया गया है। *पी=0.0379। पीबीएस चूहों की तुलना में 7- दिन WGP-प्रशिक्षित से CD11b प्लस कोशिकाओं में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की जैवसंश्लेषण प्रक्रियाओं और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की चयापचय प्रक्रियाओं से संबंधित ई संवर्धन भूखंड (GSEA) और जीन का हीटमैप। च एक साइटोटॉक्सिसिटी परख से सारांशित परिणाम जहां पीबीएस से सीडी11बी प्लस कोशिकाओं और 7- दिन डब्ल्यूजीपी-प्रशिक्षित चूहों को 1:20 केपीसीएलयूसी प्लस: सीडी11बी प्लस कोशिकाओं के 24 घंटे के अनुपात में सॉर्ट और इनक्यूबेट किया गया था। NAC का उपयोग ROS एक्सप्रेशन को ब्लॉक करने के लिए किया गया था और ट्यूमर साइटोटोक्सिसिटी का मूल्यांकन ल्यूमिनेसेंस (PBS n=3, WGP n=4) द्वारा किया गया था। जी साइटोटॉक्सिसिटी एसेज़ से सारांशित डेटा जहां 7- दिन WGP-प्रशिक्षित चूहों से CD11b प्लस कोशिकाओं को सॉर्ट किया गया और 1:20 KPCLuc प्लस के अनुपात में ऊष्मायन किया गया: CD11b प्लस सेल 24 घंटे के लिए। ट्रोक्स या डीएफओ या संबंधित वाहन नियंत्रण जोड़े गए थे और ल्यूमिनेसेंस (एन=3) को मापकर ट्यूमर साइटोटोक्सिसिटी निर्धारित की गई थी। *पी=0.0255, **पी=0.0019। बी-डी, और जी में एक अयुग्मित, दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग किया गया था और एफ के लिए कई तुलनाओं के साथ एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग किया गया था। डेटा को माध्य ± SEM के रूप में दर्शाया गया था। एनएस महत्वपूर्ण नहीं है। बी-जी में, प्रत्येक नमूना एक एकल स्वतंत्र प्रयोग से प्राप्त जैविक रूप से स्वतंत्र जानवर का प्रतिनिधित्व करता है जिसे परिणामों के सत्यापन के लिए कम से कम दो बार दोहराया गया था।

अंततः, यह डेटा पहचानता है कि अग्नाशयी ट्यूमर कोशिकाएं अग्न्याशय में WGPtrained घुसपैठ करने वाली माइलॉयड कोशिकाओं को फिर से सक्रिय करने में सक्षम हैं और ये कोशिकाएं बढ़ी हुई फागोसाइटोसिस और आरओएस-मध्यस्थता साइटोटोक्सिसिटी दिखाती हैं।

WGP-प्रेरित प्रशिक्षित प्रतिरक्षा ट्यूमर के विकास को कम करती है और अग्नाशय के कैंसर के ऑर्थोटोपिक मॉडल में जीवित रहती है।

हमने अगली जांच की कि क्या अग्न्याशय में -glucan-मध्यस्थता प्रशिक्षित जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के परिणामस्वरूप एक एंटी-ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की स्थापना होगी जो PDAC के विशेष रूप से इम्यूनोसप्रेसिव TME को दूर करने के लिए पर्याप्त हो सकती है। तदनुसार, चूहों को दिन −7 पर पीबीएस या डब्ल्यूजीपी की 1 खुराक दी गई थी, और दिन 0, 1 × 10 केपीसी या केपीसीएलुक प्लस कोशिकाओं को अग्न्याशय की पूंछ (छवि 6 ए) में ऑर्थोटोपिक रूप से प्रत्यारोपित किया गया था। दिन में 21 चूहों को इच्छामृत्यु दी गई और ट्यूमर का वजन मापा गया (चित्र 6 बी)। KPCLuc प्लस कोशिकाओं के इंजेक्शन की सेटिंग में, चूहों को ल्यूसिफरेज सब्सट्रेट के साथ इंजेक्ट किया गया था, और ट्यूमर की नकल की गई थी (चित्र। 6c)।

दोनों अध्ययनों ने WGP उपचार के परिणामस्वरूप ट्यूमर के बोझ में उल्लेखनीय कमी दिखाई, और WGP (चित्र। 6d) के साथ प्रशिक्षित चूहों में जीवित रहने में भी काफी समय लगा। डब्ल्यूजीपी-प्रशिक्षित सेटिंग (चित्र। 6e) में ट्यूमर के इम्यूनोफेनोटाइपिंग ने सीडी 45 प्लस इम्यून सेल्स, सीडी 11 बी प्लस माइलॉयड सेल्स और एफ 4/80 प्लस मैक्रोफेज में लगातार वृद्धि दिखाई। ट्यूमर के भीतर CD11b प्लस माइलॉयड कोशिकाएं (चित्र। 6f) और CD11b प्लस F4/80 प्लस मैक्रोफेज (चित्र। 6g) ने भी WGP के कारण TNF- उत्पादन में उल्लेखनीय वृद्धि दिखाई। CD11b प्लस माइलॉयड कोशिकाओं (चित्र। 6h, बाएं) की बढ़ी हुई संख्या और TNF- (चित्र। 6h, दाएं) का उत्पादन करने वाली CD11b प्लस कोशिकाओं के प्रतिशत में वृद्धि दोनों ट्यूमर के बोझ में कमी के साथ काफी सहसंबद्ध हैं। न तो सीडी 4 प्लस और न ही सीडी 8 प्लस टी-कोशिकाओं ने IFN- में वृद्धि दिखाई, आगे यह समर्थन करते हुए कि ट्यूमर के बोझ में कमी WGP- प्रशिक्षित माइलॉयड कोशिकाओं (चित्र 6i) द्वारा संचालित थी। इसी तरह के एंटी-ट्यूमर प्रभाव चूहों में भी देखे गए थे जिन्हें पैन02 ट्यूमर (सप्लीमेंट्री अंजीर। 6 ए) के साथ प्रत्यारोपित किया गया था।

आगे यह पुष्टि करने के लिए कि जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाएं देखी गई एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के लिए जिम्मेदार हैं, ऑर्थोटोपिक केपीसी ट्यूमर को एनएसजी चूहों में प्रत्यारोपित किया गया था। WT चूहों के समान, NSG चूहों ने भी WGP प्रशिक्षण के कारण ट्यूमर के आकार में महत्वपूर्ण कमी दिखाई, यह पुष्टि करते हुए कि WGP के एंटी-ट्यूमर प्रभाव जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा संचालित थे और स्वतंत्र रूप से अनुकूली प्रतिक्रियाओं (अनुपूरक चित्र। 6b) के कार्य करते थे। कलाफती एट अल। दिखाया था कि ग्रैनुलोपोइज़िस का जन्मजात प्रतिरक्षा प्रशिक्षण एंटी-ट्यूमर इम्युनिटी को बढ़ावा देता है।

जबकि हमने प्रशिक्षित प्रतिरक्षा के हमारे फेनोटाइप में ग्रैन्यूलोसाइट्स का एक महत्वपूर्ण योगदान नहीं देखा था, हमने जांच की कि क्या ग्रैन्यूलोसाइट्स न्यूट्रोफिल को कम करके और पीबीएस और डब्ल्यूजीपी-उपचारित चूहों में ट्यूमर के विकास को देखते हुए अग्नाशय के ट्यूमर में डब्ल्यूजीपी पर निर्भर कमी में शामिल हैं। अग्न्याशय के ट्यूमर के बोझ के साथ-साथ अग्न्याशय (सप्लीमेंट्री अंजीर। 6 सी) में न्यूट्रोफिल की कमी दक्षता का आकलन किया गया (सप्लीमेंट्री अंजीर। 6 डी)। हमारे परिणामों ने न्यूट्रोफिल की अनुपस्थिति में WGP समूह में ट्यूमर के आकार में उल्लेखनीय कमी दिखाई।

चित्र 6 अग्न्याशय में प्रशिक्षित प्रतिरक्षा को शामिल करने से एंटी-ट्यूमर प्रभाव पड़ता है। एक प्रायोगिक स्कीमा। b C57BL / 6 चूहों को WGP या PBS का एक एकल IP इंजेक्शन प्राप्त हुआ और 7 दिनों के चूहों को KPC अग्नाशय के कैंसर कोशिकाओं के साथ ऑर्थोटोपिक रूप से प्रत्यारोपित किया गया। ट्यूमर के प्रतिनिधि चित्र और ट्यूमर के वजन का मात्रात्मक विश्लेषण दिखाया गया है। ट्यूमर का वजन 21 दिन (पीबीएस एन=10, डब्ल्यूजीपी एन=12) पर मापा गया था। ***पी=0.0004। c C57BL / 6 चूहों (n=4) को WGP या PBS का एक एकल आईपी इंजेक्शन प्राप्त हुआ और 7 दिनों के बाद KPC प्लस ल्यूक अग्नाशय के कैंसर कोशिकाओं के साथ ऑर्थोटोपिक रूप से प्रत्यारोपित किया गया। 21 पोस्ट-ट्यूमर आरोपण के दिन, चूहों को आईपी ल्यूसिफरिन बायोलुमिनसेंट सब्सट्रेट दिया गया था और विवो में ट्यूमर के आकार को मापने के लिए एक फोटॉन इमेजर में रखा गया था। *पी=0.0403। डी केपीसी कोशिकाओं (एन=5) का उपयोग करके दिखाए गए प्रायोगिक स्कीमा में चूहों का अस्तित्व। **पी=0.0018। ई ट्यूमर की फेनोटाइपिंग व्यवहार्य कोशिकाओं का प्रतिशत दिखाती है जो CD45 प्लस हैं, CD45 प्लस जनसंख्या का प्रतिशत जो CD11b प्लस हैं, और CD11b प्लस कोशिकाओं का प्रतिशत जो F4/80 प्लस हैं (PBS n=10, डब्ल्यूजीपी एन=9)। *p=0.0165 (CD45), ***p=0.0001 (CD11b), **p=0.0034 (F4/80)। f PBS और 7-दिन WGP-प्रशिक्षित से CD11b प्लस कोशिकाओं में TNF उत्पादन जो LPS के साथ पुन: प्रेरित थे। TNF प्लस कोशिकाओं का प्रतिशत और TNF का MFI दिखाया गया है (PBS n=10, WGP n=9)। **पी=0.007, ***पी=0.0002। जी पीबीएस से सीडी11बी प्लस एफ4/80 प्लस कोशिकाओं में टीएनएफ उत्पादन का सारांशित डेटा और 7-दिन डब्ल्यूजीपी-प्रशिक्षित जो एलपीएस के साथ बहाल किए गए थे। TNF प्लस कोशिकाओं का प्रतिशत और TNF का MFI दिखाया गया है (PBS n=10, WGP n=9)। *पी=0.0155, ***पी=0.0001। h ट्यूमर का वजन CD45 प्लस इम्यून सेल्स के प्रतिशत के साथ सहसंबद्ध था जो CD11b प्लस (बाएं) और CD45 प्लस CD11b प्लस TNF प्लस सेल्स (दाएं) के प्रतिशत थे। (पीबीएस एन=10, डब्ल्यूजीपी एन=9)। i IFN (PBS n=10, WGP n=9) को व्यक्त करने वाले CD4 प्लस और CD8 प्लस T-कोशिकाओं के प्रतिशत का सारांश डेटा को माध्य ± SEM के रूप में दर्शाया गया था। पियर्सन सहसंबंध गुणांक का उपयोग रैखिक संघों की ताकत को मापने के लिए किया गया था और अयुग्मित, दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग अन्यथा किया गया था। एनएस महत्वपूर्ण नहीं है। प्रत्येक नमूना एक एकल स्वतंत्र प्रयोग से प्राप्त जैविक रूप से स्वतंत्र जानवर का प्रतिनिधित्व करता है जिसे परिणामों के सत्यापन के लिए कम से कम दो बार दोहराया गया था।

प्रशिक्षित CCR2 प्लस माइलॉयड कोशिकाएं एंटी-ट्यूमर तंत्र में प्राथमिक प्रभावकारी कोशिकाएं हैं।

CCR2 - / - चूहों में WGP उपचार के बाद अग्न्याशय में जन्मजात प्रतिरक्षा सेल की तस्करी और अग्नाशय माइलॉयड कोशिकाओं के प्रशिक्षण के पूर्ण निषेध को देखते हुए, हमने तर्क दिया कि CCR2 - / - चूहे भी WGP प्रशिक्षण के लाभकारी एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रभाव नहीं दिखाएंगे। . इस परिकल्पना के अनुरूप, WCR प्राप्त करने वाले CCR2 - / - चूहों ने WT चूहों की तुलना में कम ट्यूमर का बोझ (चित्र 7a) नहीं दिखाया।

इसने प्रदर्शित किया कि अग्न्याशय में प्रशिक्षित जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के WGP- संचालित प्रवाह के लिए CCR2 आवश्यक है और वे ट्यूमर-रोधी प्रभावों के लिए परिणामी हैं। हालांकि CCL 2-CCR2 सिग्नलिंग को अग्न्याशय में प्रशिक्षित मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज की भर्ती में महत्वपूर्ण माना गया था, हम यह भी जानना चाहते थे कि अस्थि मज्जा में प्रशिक्षित एचएससी की उपस्थिति और केंद्रीय रूप से प्रशिक्षित प्रतिरक्षा की पीढ़ी अकेले ऑर्थोटोपिक अग्नाशयी ट्यूमर के विकास को धीमा करने के लिए पर्याप्त था।

घुसपैठ करने वाली CCR2 प्लस माइलॉयड कोशिकाओं की प्रत्यक्ष एंटी-ट्यूमर कार्यक्षमता की पुष्टि करने के लिए, WGP-प्रशिक्षित चूहों से CCR2 प्लस और CCR 2- माइलॉयड आबादी को सॉर्ट किया गया, KPC ट्यूमर कोशिकाओं के साथ प्रवेश किया गया, और चूहों में ऑर्थोटोपिक रूप से प्रत्यारोपित किया गया। CCR2 प्लस कोशिकाओं के साथ स्वीकार किए गए ट्यूमर उन लोगों की तुलना में छोटे थे जिन्हें CCR2− कोशिकाओं के साथ स्वीकार किया गया था, आगे यह समर्थन करते हुए कि प्रशिक्षित CCR2 प्लस माइलॉयड कोशिकाएं स्वयं एंटी-ट्यूमर तंत्र (चित्र। 7b) में एक प्राथमिक प्रभावकारक कोशिका हैं। इन ट्यूमर के CyTOF विश्लेषण से पता चला है कि CCR2 प्लस प्रवेशित ट्यूमर में काफी कम CD11b प्लस माइलॉयड कोशिकाएं थीं और ट्यूमर के भीतर मौजूद CD8 प्लस T-कोशिकाओं में काफी वृद्धि हुई थी (चित्र 7c, d)। सीडी 8 प्लस टी-कोशिकाओं का अनुपात: सीसीआर 2 प्लस एडमिक्स स्थिति (छवि 7e) में सीडी 11 बी प्लस माइलॉयड कोशिकाओं में भी काफी वृद्धि हुई थी।

अंजीर. 7 डब्ल्यूजीपी उपचार और चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक मॉडल के एंटी-ट्यूमर प्रभावकारी तंत्र। एक WT और CCR2 - / - चूहों का पीबीएस या डब्ल्यूजीपी के साथ इलाज किया गया और 7 दिनों के बाद ऑर्थोटोपिक केपीसी अग्नाशयी ट्यूमर कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित किया गया। 21वें दिन ट्यूमर का वजन बताया गया है। (WT PBS n=5, WT WGP n=6, CCR2 PBS n=6, CCR2-/- WGP n=6)। **p=0.0027 (WT PBS बनाम WT WGP), *p=0.0118 (WT WGP बनाम CCR2-/- PBS), **p=0.0034 (WT डब्ल्यूजीपी बनाम सीसीआर2-/- डब्ल्यूजीपी)। b सॉर्ट किए गए CCR2 प्लस और CCR2− अग्नाशयी CD11b प्लस कोशिकाओं को WGP- प्रशिक्षित चूहों से KPC कोशिकाओं के साथ स्वीकार किया गया और ऑर्थोटोपिक रूप से प्रत्यारोपित किया गया। 21 दिन बाद ट्यूमर के आकार का मूल्यांकन किया गया (CCR2 प्लस n=5, CCR2− n=5)। *पी=0.0247। c t-SNE प्लॉट्स b से एडमिक्स ट्यूमर के CyTOF विश्लेषण द्वारा उत्पन्न होते हैं। समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर दिखाने वाले समूहों को मंडलियों द्वारा दर्शाया गया है। प्रत्येक समूह के कुल डेटा (बाएं) और प्रतिनिधि t-SNE प्लॉट दिखाए गए हैं। डी एडमिक्स ट्यूमर (पीबीएस एन=4, डब्ल्यूजीपी एन=3) में सीडी 8 प्लस और सीडी 11 बी प्लस कोशिकाओं का सारांशित प्रतिशत। *पी=0.01, **पी=0.007। ई सीडी 8 प्लस का अनुपात: एडिक्स ट्यूमर में सीडी 11 बी प्लस कोशिकाएं (पीबीएस एन=4, डब्ल्यूजीपी एन=3)। *पी=0.0474। एफ केपीसी ट्यूमर कोशिकाओं पर पीडी-एल 1 की अभिव्यक्ति, आरोपण के 21 दिन बाद केपीसी ट्यूमर में सीडी 11 बी प्लस और एफ 4/80 प्लस कोशिकाएं (केपीसी एन=5, सीडी 11 बी प्लस एन=6, एफ 4/80 प्लस एन=6)। जी डब्ल्यूजीपी और एंटी-पीडी-एल1 थेरेपी का प्रायोगिक स्कीमा। चूहे (n=5) का पीबीएस या डब्ल्यूजीपी के साथ इलाज किया गया और 7 दिनों के बाद ऑर्थोटोपिक केपीसी अग्नाशय के ट्यूमर के साथ प्रत्यारोपित किया गया। आरोपण के बाद 3, 7, और 11 दिनों में, चूहों को एंटी-पीडी-एल1 एमएबी या एंटी-चूहा आईजीजी2बी एमएबी आइसोटाइप नियंत्रण दिया गया। उत्तरजीविता की निगरानी की गई। **p=0.0018 (WGP बनाम PBS या PD-L1), **p=0.0021 (WGP बनाम WGP प्लस PD-L1)। h चिकित्सीय सेटिंग में प्रयुक्त WGP की प्रायोगिक स्कीमा। चूहे को ऑर्थोटोपिक केपीसी अग्नाशयी ट्यूमर के साथ प्रत्यारोपित किया गया था और एक बार चूहे 4 दिन में सर्जरी से ठीक हो गए थे, और 1 सप्ताह बाद 11 दिन में WGP दिया गया था। *p=0.0163। डेटा को माध्य ± SEM के रूप में दर्शाया गया था। कई तुलनाओं के साथ एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग ए और एक अयुग्मित, दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग बी, डी और ई के लिए किया गया था। जी और एच के लिए लॉग-रैंक टेस्ट का इस्तेमाल किया गया था। एनएस महत्वपूर्ण नहीं है। प्रत्येक नमूना एक एकल स्वतंत्र प्रयोग से प्राप्त जैविक रूप से स्वतंत्र जानवर का प्रतिनिधित्व करता है जिसे परिणामों के सत्यापन के लिए कम से कम दो बार दोहराया गया था।

पीडीएसी के मॉडलों में लंबे समय तक जीवित रहने के लिए डब्ल्यूजीपी एंटी-पीडी-एल1 एमएबी थेरेपी के साथ तालमेल बिठाता है।

हालांकि डब्ल्यूजीपी प्रशिक्षण के कारण ट्यूमर के बोझ में उल्लेखनीय कमी देखी गई, यह मामला है कि सभी चूहों ने घातक ट्यूमर विकसित किए। हमारे अध्ययनों से पता चला है कि WGP उपचार ने अग्न्याशय में माइलॉयड आबादी के फेनोटाइप को काफी प्रभावित किया है।

हालांकि हमने पहचान की थी कि WGP के एंटी-ट्यूमर प्रभावों के लिए जिम्मेदार प्राथमिक प्रभावकारी कोशिका CCR2 प्लस घुसपैठ करने वाली मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज हैं, हमने तर्क दिया कि ये प्रतिरक्षा परिवर्तन समग्र TME को इस तरह से प्रभावित कर सकते हैं जो अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अधिक प्रतिक्रियाशील बना सकते हैं। चेकपॉइंट नाकाबंदी चिकित्सा। विशेष रूप से, क्योंकि हमने CCR2 प्लस एडमिक्स्ड ट्यूमर (चित्र। 7c) के भीतर मौजूद CD8 प्लस T- कोशिकाओं के अनुपात में वृद्धि देखी थी और KPC ट्यूमर (चित्र। 7f) के भीतर मौजूद माइलॉयड कोशिकाओं पर महत्वपूर्ण PD-L1 अभिव्यक्ति भी देखी थी। हमने अनुमान लगाया कि WGP उपचार एंटी-PD-L1 mAb थेरेपी के प्रभावों को प्रबल कर सकता है।

यह आकलन करने के लिए कि क्या एंटी-पीडी-एल1 एमएबी थेरेपी अग्न्याशय में डब्ल्यूजीपी-प्रेरित प्रशिक्षित प्रतिरक्षा के साथ तालमेल करती है, पीबीएस या डब्ल्यूजीपी-ट्रीटेड चूहों को ऑर्थोटोपिक केसीपी ट्यूमर के साथ प्रत्यारोपित किया गया था, फिर या तो एंटी-पीडी-एल1 एमएबी या चूहा आईजीजी2बी आइसोटाइप कंट्रोल एमएबी दिया गया। जैसा कि कई क्लिनिकल परीक्षणों में दिखाया गया है, केवल एंटीपीडी-एल1 थेरेपी आईजीजी2बी आइसोटाइप कंट्रोल एमएबी उपचारित चूहों (चित्र 7जी) से परे भी लंबे समय तक जीवित रहने में विफल रही। WGPप्रशिक्षित चूहे IgG2b आइसोटाइप और एंटी-पीडी-एल1उपचारित चूहों की तुलना में काफी लंबे समय तक जीवित रहे। हालांकि, WGP और एंटी-PD-L1 का संयोजन सबसे प्रभावी ढंग से लंबे समय तक जीवित रहता है। इससे पता चलता है कि डब्ल्यूजीपी को एंटीपीडी-एल1 इम्यूनो-चेकपॉइंट नाकाबंदी चिकित्सा के साथ संयोजन करने का नैदानिक ​​​​लाभ है।

इस प्रकार अब तक, WGP के उपयोग को एक सेटिंग में वर्णित किया गया है जिसमें ट्यूमर कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करने से पहले WGP को प्रशासित किया जाता है। इस मॉडल के ट्यूमर के आकार में कमी को ध्यान में रखते हुए, हमने एक अधिक नैदानिक ​​रूप से प्रासंगिक मॉडल का भी परीक्षण किया जिसमें चूहों को ऑर्थोटोपिक केपीसी ट्यूमर के साथ प्रत्यारोपित किया गया था और उसके बाद प्रशिक्षित प्रतिरक्षा को उत्तेजित करने के लिए WGP का उपयोग किया गया था। चित्र 7h)। चिकित्सीय सेटिंग में, अग्न्याशय को प्रशिक्षित माइलॉयड कोशिकाओं के डब्ल्यूजीपी-चालित प्रवाह को भी लंबे समय तक जीवित रहने के लिए दिखाया गया था। साथ में, इन आंकड़ों से पता चलता है कि WGP का उपयोग करके अग्न्याशय में प्रशिक्षित प्रतिरक्षा की शुरुआत में अग्नाशय के कैंसर के इलाज में प्रासंगिक नैदानिक ​​​​अनुप्रयोग हैं जो आगे के शोध और जांच की आवश्यकता है।

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