आरएनए एम6 ए रीडर वाईटीएचडीएफ2 एनके सेल एंटीट्यूमर और एंटीवायरल इम्युनिटी भाग 6 को नियंत्रित करता है

मेटास्टैटिक मेलेनोमा मॉडल और एमसीएमवी चुनौती

B16F10 कोशिकाओं (105) को चूहों में अंतःक्षिप्त किया गया। इंजेक्शन के 14 दिन बाद, चूहों को पोस्टमॉर्टम विश्लेषण के लिए इच्छामृत्यु दे दी गई। फेफड़े में मेटास्टेटिक नोड्यूल्स का मैक्रोस्कोपिक रूप से विश्लेषण किया गया और उनकी गिनती की गई। B16F10 सेल लाइन हुआ यू (सिटी ऑफ होप, लॉस एंजिल्स, सीए) द्वारा प्रदान की गई थी। Ythdf2ΔNK और Ythdf2WT चूहों को स्मिथ स्ट्रेन MCMV (2.5 × 104 PFU) के आईपी इंजेक्शन से संक्रमित किया गया था, जिसे अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (VR -1399) से खरीदा गया था। परिधीय रक्त के नमूने संक्रमण के बाद 0, 4 और 7 दिनों में सबमांडिबुलर पंचर के माध्यम से प्राप्त किए गए थे।

पल्मोनरी मेटास्टेसिस नोड्यूल अन्य स्थानों से घातक ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा गठित नोड्यूल को संदर्भित करते हैं जो रक्त या लसीका प्रणाली के माध्यम से फेफड़ों में चले जाते हैं। कई रोगियों के लिए, यह फेफड़ों के कैंसर की एक सामान्य अभिव्यक्ति है।

हालाँकि, हालांकि फेफड़े के मेटास्टेसिस नोड्यूल मरीजों के शारीरिक स्वास्थ्य के लिए खतरा पैदा करते हैं, लेकिन इसके और स्मृति के बीच कोई सीधा संबंध नहीं है। इसलिए, हमें सक्रिय रूप से फेफड़ों के कैंसर और फेफड़ों के मेटास्टेसिस नोड्यूल्स की चुनौतियों का सामना करना चाहिए, और नकारात्मक भावनाओं और चिंता को हमारे शारीरिक और मानसिक स्वास्थ्य को प्रभावित नहीं करने देना चाहिए।

वहीं, हम कुछ सकारात्मक तरीकों से याददाश्त को बनाए रख सकते हैं और उसमें सुधार भी कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, कुछ स्मृति प्रशिक्षण करें, जैसे गणितीय गणना करना, पढ़ना, संगीत सुनना, गेम खेलना आदि। इसके अलावा, अच्छी जीवनशैली का पालन करना, जैसे नियमित व्यायाम, पर्याप्त नींद लेना, स्वस्थ भोजन करना आदि भी कर सकते हैं। हमारी याददाश्त में सुधार करें.

सबसे महत्वपूर्ण बात सकारात्मक दृष्टिकोण रखना है। इससे कोई फर्क नहीं पड़ता कि आपको किन कठिनाइयों का सामना करना पड़ता है, आपको अपनी ताकत और अपने तंत्रिका तंत्र के लचीलेपन पर विश्वास करना चाहिए, और सकारात्मक समायोजन और प्रतिक्रियाओं के माध्यम से, आप अंततः कठिनाइयों पर सफलतापूर्वक काबू पा लेंगे।

संक्षेप में, हालांकि फेफड़ों में मेटास्टेटिक नोड्यूल्स शारीरिक स्वास्थ्य के लिए खतरा पैदा करते हैं, लेकिन वे सीधे तौर पर स्मृति से संबंधित नहीं हैं। हमें इसका सकारात्मक रूप से सामना करना चाहिए और अपनी जीवनशैली को समायोजित करके और एक अच्छा दृष्टिकोण बनाए रखते हुए अपनी याददाश्त को बनाए रखना और सुधारना चाहिए। यह देखा जा सकता है कि हमें याददाश्त में सुधार करने की आवश्यकता है, और सिस्टैंच डेजर्टिकोला याददाश्त में काफी सुधार कर सकता है, क्योंकि सिस्टैंच डेजर्टिकोला न्यूरोट्रांसमीटर के संतुलन को भी नियंत्रित कर सकता है, जैसे एसिटाइलकोलाइन और विकास कारकों के स्तर को बढ़ाना। ये पदार्थ याददाश्त और सीखने के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं। इसके अलावा, सिस्टैंच डेजर्टिकोला रक्त प्रवाह में भी सुधार कर सकता है और ऑक्सीजन वितरण को बढ़ावा दे सकता है, जो यह सुनिश्चित कर सकता है कि मस्तिष्क को पर्याप्त पोषक तत्व और ऊर्जा प्राप्त हो, जिससे मस्तिष्क की जीवन शक्ति और सहनशक्ति में सुधार हो। यह देखा जा सकता है कि हमें याददाश्त में सुधार करने की आवश्यकता है, और सिस्टैंच डेजर्टिकोला याददाश्त में काफी सुधार कर सकता है, क्योंकि सिस्टैंच डेजर्टिकोला न्यूरोट्रांसमीटर के संतुलन को भी नियंत्रित कर सकता है, जैसे एसिटाइलकोलाइन और विकास कारकों के स्तर को बढ़ाना। ये पदार्थ याददाश्त और सीखने के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं। इसके अलावा, सिस्टैंच डेजर्टिकोला रक्त प्रवाह में भी सुधार कर सकता है और ऑक्सीजन वितरण को बढ़ावा दे सकता है, जो यह सुनिश्चित कर सकता है कि मस्तिष्क को पर्याप्त पोषक तत्व और ऊर्जा प्राप्त हो, जिससे मस्तिष्क की जीवन शक्ति और सहनशक्ति में सुधार हो।

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परिधीय रक्त, प्लीहा और यकृत में वायरल लोड को मापने के लिए, क्यूपीसीआर विश्लेषण के लिए QIAGEN DNeasy रक्त और ऊतक किट का उपयोग करके डीएनए को अलग किया गया था। निम्नलिखित प्राइमरों का उपयोग किया गया: MCMV-IE1,59-AGCCACCAACATTGACCACGCAC-39 (आगे) और MCMVIE1, ​​59-GCCCCAACCAGGACACACAACTC-39 (रिवर्स)।

आईएल के साथ विवो माउस उपचार में-15

IL-15 के साथ विवो माउस उपचार के लिए, Ythdf2ΔNK और Ythdf2WT चूहों को 5 दिनों के लिए 2 μg आईपी पुनः संयोजक मानव IL -15 (cat.no. 745101; राष्ट्रीय कैंसर संस्थान) के साथ इंजेक्ट किया गया था। उपचारित और नियंत्रण चूहों को प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए इच्छामृत्यु दी गई।

फ़्लो साइटॉमेट्री

जैसा कि पहले बताया गया है, Ythdf2ΔNK और Ythdf2WT चूहों के बीएम, रक्त, प्लीहा, यकृत और फेफड़े से एकल-कोशिका निलंबन तैयार किए गए थे (वांग एट अल।, 2018 बी)। फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण और सेलसॉर्टिंग क्रमशः एलएसआरफोर्टेसा एक्स -20 और एफएसीएसएरियाफ्यूजन फ्लो साइटोमीटर (बीडी बायोसाइंसेज) पर किया गया था।

नोवोएक्सप्रेस सॉफ्टवेयर (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज) का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया।

बीडी बायोसाइंसेज, बायोलेजेंड, इनविट्रोजन, या सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी से निम्नलिखित प्रतिदीप्ति डाई-लेबल एंटीबॉडी का उपयोग किया गया: CD3ε (145-2C11), CD19 (1D3), Gr-1 (RB6-8C5 ),टीईआर-119 (टीईआर-119), सीडी11सी (एन418), सीडी4 (जीके1.5), सीडी8 (53-6.7),सीडी122 (5एच4), सीडी132 (टीयूजीएम2), एनके1.1 (पीके136), सीडी11बी (एम1/70), सीडी27 (एलजी.3ए10), सीडी117 (2बी8), सीडी127 (एसबी/199), सीडी135 (ए2एफ10.1), केएलआरजी1 (2एफ1), सीडी45 ({{46) }}F11), CD45.1 (A20), CD45.2 (104), IFN- (XMG1.2), 2B4 (m2B4), ग्रैनजाइम B (QA16A02), पेरफोरिन(S16009A), Ly49H (3D10), Ly49D ( 4e5), CD69 (H1.2F3), CD226(TX42.1), NKG2D (CX5), NKG2A (16A11), NKp46 (29A1.4), TIGIT(1G9), PD-1 (J43), एनेक्सिन V, Ki67 (b56), Tbet (4b10), और Eomes (WD1928), फॉस्फो-p44/42 Erk1/2 (Thr202/Tyr204, #9101), फॉस्फो-एक्ट (Ser473, #5315), फॉस्फो-S6 राइबोसोमल प्रोटीन ,फॉस्फो-स्टेट3 (Tyr705, #9145), और फॉस्फो-स्टेट5 (Tyr694,#9539)।

एनके सेल प्रसार के मूल्यांकन के लिए, कोशिकाओं को प्राप्तकर्ता चूहों में स्थानांतरित करने से पहले निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार 5 माइक्रोएम सीटीवी (इनविट्रोजन) के साथ लेबल किया गया था। Ki67, Tbet, और Eomes का इंट्रासेल्युलर स्टेनिंग फॉक्सपी3/ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर स्टेनिंग किट (eBioscience) के साथ फिक्सिंग और पारगम्यीकरण द्वारा किया गया था।

फॉस्फोराइलेटेड प्रोटीन का पता लगाने के लिए, शुद्ध स्प्लेनिक एनके कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए पुनः संयोजक मानव आईएल (50 एनजी / एमएल) के साथ इलाज किया गया और फिर फॉसफ्लो फिक्स बफर I के साथ तय किया गया, इसके बाद फॉसफ्लो पर्म बफर III (बीडी बायोसाइंसेज) और स्टेनिंग के साथ पारगम्यीकरण किया गया। एंटीबॉडीज.

दत्तक कोशिका स्थानांतरण

एनके सेल परिपक्वता पर Ythdf2 की कमी के प्रभाव का आकलन करने के लिए, CD45.1 या Ythdf2ΔNK CD45.2 चूहों से 1:1 अनुपात पर 5 × 106 BM कोशिकाओं का मिश्रण Rag2 -/-Il2rg -/- चूहों में स्थानांतरित किया गया था। प्रत्यारोपण के बाद 8 सप्ताह में प्राप्तकर्ताओं के पुनर्गठन का प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मूल्यांकन किया गया था।

लिम्फोपेनिया-प्रेरित होमोस्टैटिक प्रसार प्रयोगों के लिए, CD45.1 या Ythdf2ΔNK CD45.2 चूहों से समान संख्या में शुद्ध स्प्लेनिकएनके कोशिकाओं को Rag2 -/-Il2rg -/- चूहों में स्थानांतरित किया गया, जिसके बाद तिल्ली में स्थानांतरित WT और Ythdf2ΔNK NK कोशिकाओं के सापेक्ष प्रतिशत का आकलन किया गया। संकेतित समय बिंदुओं पर प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा Rag2-/-Il2rg-/- प्राप्तकर्ताओं का।

मेटास्टैटिक मेलानोमा मॉडल के लिए, Ythdf2ΔNK या Ythdf2WT चूहों से 106 IL -2-विस्तारित NK कोशिकाओं को Rag2 -/-Il2rg -/- चूहों में iv इंजेक्ट किया गया। 1 दिन बाद, B16F10कोशिकाओं (105) को चूहों में इंजेक्ट किया गया। इंजेक्शन के 14 दिन बाद, चूहों को पोस्टमॉर्टम विश्लेषण के लिए इच्छामृत्यु दी गई। कुछ प्रयोगों में, स्थानांतरण से पहले कोशिका प्रसार का पता लगाने के लिए कोशिकाओं को CTV (5 µM, Invitrogen) के साथ लेबल किया गया था।

विवो तस्करी परख में

बीएम से परिधीय रक्त में एनके सेल की तस्करी का पता लगाने के लिए, 1 माइक्रोग्राम iv एपीसी-लेबल एंटी-सीडी45 एंटीबॉडी को C57BL/6 चूहों में इंजेक्ट किया गया था। एंटीबॉडी इंजेक्शन के दो मिनट बाद, चूहों को तुरंत इच्छामृत्यु दे दी गई, और कोशिकाओं को सीडी3 और एनके1.1 एंटीबॉडी से रंगने के बाद बीएम कोशिकाओं को फ्लो साइटोमेट्री के लिए एकत्र किया गया। पैरेन्काइमल एनके कोशिकाओं की पहचान सीडी45 धुंधलापन की कमी से की गई, जबकि साइनसॉइडल एनके कोशिकाओं की पहचान सीडी45 लेबलिंग की उपस्थिति से की गई। इसलिए, साइनसोइड्स (सीडी45+) में एनके कोशिकाओं का अनुपात पैरेन्काइमल क्षेत्रों (सीडी45−) में एनके कोशिकाओं का अनुपात एक स्थिर अवस्था में बीएम टॉपपरिफेरल रक्त से एनके सेल की तस्करी को इंगित करता है।

वास्तविक समय आरटी-क्यूपीसीआर और इम्युनोब्लॉटिंग

आरएनए को आरनेसी मिनी किट (क्यूआईएजीएन) का उपयोग करके अलग किया गया और फिर निर्माता के निर्देशों के अनुसार जीडीएनए इरेज़र (तकरा बायो) के साथ प्राइमस्क्रिप्ट आरटी रिएजेंट किट के साथ सीडीएनए में रिवर्स ट्रांसक्राइब किया गया। एमआरएनए अभिव्यक्ति स्तरों का विश्लेषण एसवाईबीआरग्रीन पीसीआर मास्टर मिक्स और क्वांटस्टूडियो 12K फ्लेक्स रियल-टाइमपीसीआर सिस्टम (दोनों थर्मो फिशर साइंटिफिक से) का उपयोग करके किया गया था। प्राइमर अनुक्रम तालिका S1 में सूचीबद्ध हैं।

इम्यूनोब्लॉटिंग मानक प्रक्रियाओं के अनुसार किया गया था, जैसा कि पहले बताया गया है (डेंगेट अल., 2015; यू एट अल., 2006)। निम्नलिखित एंटीबॉडी का उपयोग किया गया: METTL3 (बिल्ली नं। 15073-1-AP; प्रोटीनटेक), METTL14 (बिल्ली नं। 26158-1-AP; प्रोटीनटेक), YTHDF1 (बिल्ली नं। 17479-1-AP ; प्रोटीनटेक), YTHDF2 (बिल्ली नं. RN123PW; MBL), YTHDF3 (बिल्ली नं. 25537-1-AP; प्रोटीनटेक), ALKBH5 (बिल्ली नं. ab195377; Abcam), FTO (बिल्ली नं. ab124892; एबकैम), एमडीएम2 (कैट नं. 33-7100; इन्विट्रोजन), टीडीपी{{17 }} (कैट नं. पीए{{18 }}; इनविट्रोजन), और -एक्टिन (कैट नं. {{20) }}आईजी; प्रोटीनटेक)।

siRNA नॉकडाउन परख

IL-2–expanded NK cells were transfected with Accell mouse Tardbp siRNA (cat. no. E-040078-00-0005; Dharmacon) or Mdm2 siRNA (cat. no. E-041098-00-0005; Dharmacon) using Accell delivery media (Dharmacon) according to the manufacturer's instructions in the presence of IL-15 (50 ng/ml). The Accell eGFP control pool was used as siRNA control. The transfection efficiency was >प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मापा गया 90%। जीननॉकडाउन दक्षता क्यूपीसीआर और इम्युनोब्लॉटिंग द्वारा निर्धारित की गई थी। जैसा कि ऊपर वर्णित है, अभिकर्मक के बाद 3डी, कोशिका एपोप्टोसिस और प्रसार का प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया।

लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर परख

Ythdf2 प्रमोटर क्षेत्र -2, 000 bp से लेकर +100 bp तक TSS को म्यूरिन एनके कोशिकाओं से प्रवर्धित किया गया था और एपीजीएल उत्पन्न करने के लिए एपीजीएल {{4}बेसिक लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर वेक्टर (पेमरेगा) में क्लोन किया गया था। {5}}Ythdf2 रिपोर्टर प्लास्मिड। एटीसीसी से खरीदी गई HEK293T कोशिकाओं को ट्रांसफेक्शन दक्षता के सामान्यीकरण के लिए पीजीएल 4- Ythdf2 रिपोर्टर प्लास्मिड के साथ-साथ STAT5a या STAT5b ओवरएक्सप्रेशन प्लास्मिड या एम्प्टी वेक्टर के साथ पीआरएल-टीके रेनिला रिपोर्टर प्लास्मिड (पेमरेगा) के साथ सहसंक्रमित किया गया था। अभिकर्मक के 24 घंटे बाद कोशिकाओं को लसीका के लिए एकत्र किया गया, और ड्यूल-ल्यूसिफ़ेरेज़ सिस्टम (पेमरेगा) के साथ ल्यूसिफ़रेज़ गतिविधि को फ्लोरीमेट्रिक रूप से निर्धारित किया गया। Ythdf2promoter और STAT5a और STAT5b ओवरएक्सप्रेशन प्लास्मिड की क्लोनिंग के लिए प्राइमर अनुक्रम तालिका S1 में सूचीबद्ध हैं।

चिप परख

निर्माता के निर्देशों के अनुसार पियर्स मैग्नेटिक चिप किट (कैट नंबर 26157; थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करके चिप परीक्षण किया गया। संक्षेप में, 5 × से प्राप्त क्रॉस-लिंक्ड डीएनए-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को अवक्षेपित करने के लिए अनंत-एंटी-फॉस्फो-स्टेट5 (टीआईआर694, कैट नं. 9351; सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजीज) या संबंधित नियंत्रण सामान्य खरगोश आईजीजी की समान मात्रा का अलग से उपयोग किया गया था। 106 शुद्ध माउस प्राथमिक एनके कोशिकाएं जिन्हें 1 घंटे के लिए आईएल -15 (50 एनजी/एमएल) के साथ पूर्व-उपचारित किया गया था। क्रॉसलिंकिंग के उलट होने के बाद, संकेतित एंटीबॉडी द्वारा प्रतिरक्षित डीएनए का परीक्षण क्यूपीसीआर द्वारा किया गया था। सभी प्राइमरों के अनुक्रम तालिका S1 में सूचीबद्ध हैं।

पूर्व विवो साइटोटोक्सिसिटी परख

एनके कोशिकाओं की पूर्व विवो साइटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन मानक 51Crrelease assays द्वारा किया गया था। माउस लिंफोमा सेल लाइनें आरएमए-एस (एमएचसी क्लास आइडेफिशिएंट) और आरएमए (एमएचसी क्लास I पर्याप्त) कोशिकाएं, आंद्रे'वेइलेट (मैकगिल यूनिवर्सिटी, मॉन्ट्रियल, कनाडा) का एक उपहार, एस्टारगेट कोशिकाओं का उपयोग किया गया था। चूहों का इलाज पॉलीइनोसिनिक के आईपी इंजेक्शन से किया गया: पॉलीसिटिडिलिक एसिड [पॉली (आई: सी); 200 माइक्रोग्राम/चूहे] 18 घंटे के लिए। पॉली (I: C) -सक्रिय NK कोशिकाओं को EasySepMouse NK सेल आइसोलेशन किट (STEMCELL Technologies) का उपयोग करके प्लीहा से अलग किया गया था। शुद्ध किए गए एनके कोशिकाओं को आईएल -2 (50 यू/एमएल) की उपस्थिति में 5:1, 2.5:1, और 1.25:1 के अनुपात में लक्ष्य कोशिकाओं के साथ सहसंवर्धित किया गया।

m6A-सेक

शुद्ध स्प्लेनिक एनके कोशिकाओं को 7 दिन के लिए इन विट्रो में आईएल -2 (1, 000 यू/एमएल, बिल्ली नं। बल्क आरओ 23-6019; राष्ट्रीय कैंसर संस्थान) द्वारा विस्तारित किया गया था। कुल आरएनए को ट्राइज़ोल अभिकर्मक (थर्मो फिशरसाइंटिफिक) द्वारा 50 मिलियन आईएल -2-विस्तारित एनके कोशिकाओं से अलग किया गया था। डायनाबीड्स एमआरएनए प्यूरीफिकेशन किट (इंविट्रोजन) का उपयोग करके पॉलीएडेनाइलेटेड आरएनए को कुल आरएनए से और समृद्ध किया गया। एमआरएनए नमूनों को आरएनए विखंडन अभिकर्मकों (इन्विट्रोजन) के साथ 100-एनटी-लंबे टुकड़ों में विभाजित किया गया था।

मैग्ना मेरिप एम6ए किट (मर्क मिलिपोर) के मानक प्रोटोकॉल का पालन करते हुए एम6एंटीबॉडी (202003; सिनैप्टिक) का उपयोग करके एम6ए इम्यूनोप्रेसिपिटेशन के लिए खंडित एमआरएनए (5 μgmRNA) का उपयोग किया गया था। आरएनए को केएपीए आरएनए हाइपरप्रेप किट (रोश) के साथ लाइब्रेरी जेनरेशन के लिए आरएनए क्लीन एंड कंसंट्रेटर -5 (ज़ाइमो रिसर्च) के माध्यम से समृद्ध किया गया था। सीक्वेंसिंग को सिटी ऑफ़ होप जीनोमिक्स सुविधा में इलुमिना हाईसेक 2500 मशीन पर सिंगल रीड 50-बीपी मोड के साथ किया गया था। अनुक्रमण रीड्स को HISAT2 v101 सॉफ़्टवेयर (किम एट अल., 2015) का उपयोग करके माउसजीनोम में मैप किया गया था।

आर पैकेज एक्सोमपीक (मेंग एट अल।, 2014) का उपयोग करके इम्युनोप्रेजर्वेशन और इनपुट लाइब्रेरी के मैप्रेड प्रदान किए गए थे। इंटीग्रेटिव जीनोमिक्स व्यूअरसॉफ्टवेयर (//www.igv.org) का उपयोग करके m6Apeaks की कल्पना की गई थी। एम6ए-बाइंडिंग मोटिफ का विश्लेषण एमईएमई (https://meme-suite.org) और होमर (http://homer.ucsd.edu/homer/motif) द्वारा किया गया था। आरपैकेज चिपसीकर (यू एट अल., 2015) का उपयोग करके जीन आर्किटेक्चर के साथ प्रतिच्छेदन द्वारा कॉल की गई चोटियों को एनोटेट किया गया था।

StringTie was used to assess expression levels for mRNAs from input libraries by calculating the total exon fragments/mapped reads in millions × exon length in kb (Pertea et al., 2015). The differentially expressed mRNAs were selected with log2(fold change) >1 ऑरलॉग2(गुना परिवर्तन)<−1 and P < 0.05 using the R package edgeR (Robinson et al., 2010).

YTHDF2 RIP-seq

50 मिलियन आईएल-2-विस्तारित एनके कोशिकाओं को एकत्र किया गया और ठंडे पीबीएस के साथ दो बार धोया गया, और सेल गोली को 2 वोल्ट ऑफलिसिस बफर (10 एमएम हेप्स, पीएच 7.6, 150) के साथ लीज किया गया। एमएम केसीएल, 2 एमएम ईडीटीए, 0.5% एनपी -40, 0.5 एमएम डाइथियोथेरिटॉल, 1:100 प्रोटीज इनहिबिटरकॉकटेल [थर्मो फिशर साइंटिफिक], और 400 यू/एमएल सुपरेज-इन आरएनेज इनहिबिटर [थर्मो फिशर साइंटिफिक])।

लाइसेट को 5 मिनट तक बर्फ पर रखा गया और थेलीसेट को साफ करने के लिए 15 मिनट तक सेंट्रीफ्यूज किया गया। सेल लाइसेट का दसवां हिस्सा इनपुट के रूप में सहेजा गया था। शेष सेल लाइसेट को 5 माइक्रोग्राम एंटी-YTHDF2 (कैट.नं. RN123PW; MBL) के साथ इनक्यूबेट किया गया था, जो प्रोटीन ए मैग्नेटिक बीड्स (कैट. नं. 10001D; इन्विट्रोजन) के साथ जोड़ा गया था। हल्के घुमाव के साथ 2 घंटे तक 4 डिग्री पर। बाद में, मोतियों को 1 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा वॉशिंग बफर (50 मिमी HEPES, पीएच 7.6,200 मिमी NaCl, 2 मिमी EDTA, 0.05% NP {{19%), 0.5 मिमी डाइथियोथ्रेटोल, और 200 U/ml RNase के साथ पांच बार धोया गया। अवरोधक)।

इम्यूनोप्रेसिटेटेड नमूनों को 1% एसडीएस और 2 मिलीग्राम/एमएल प्रोटीनेज के (थर्मोफिशर साइंटिफिक) के साथ वॉश बफर में प्रोटीनेज के पाचन के अधीन किया गया था, जिसे 1 घंटे के लिए 55 डिग्री पर 1,200 आरपीएम पर हिलाकर रखा गया था। कुल आरएनए को इनपुट और इम्युनोप्रेसीपिटेटेड आरएनए दोनों से 5 वोल्ट ट्राइज़ोल अभिकर्मक और उसके बाद डायरेक्ट-ज़ोल आरएनए मिनीप्रेप (ज़ाइमो रिसर्च) जोड़कर निकाला गया था।

सीडीएनए लाइब्रेरी को केएपीए आरएनए हाइपरप्रेप किट (रोश) के साथ तैयार किया गया था और इलुमिना हाईसेक 2500 प्लेटफॉर्म पर अनुक्रमित किया गया था। आर पैकेज रिपसीकर (ली एट अल., 2013) द्वारा इम्युनोप्रेग्रेशन और इनपुट लाइब्रेरीज़ के साथ पीक कॉलिंग परिणाम उत्पन्न किए गए थे। HOMER का उपयोग चरम क्षेत्रों में डेटा वितरण के रूपांकनों को खोजने के लिए किया गया था। ChIPpeakAnno (झू एट अल।, 2010) का उपयोग करके जीन और ट्रांसक्रिप्ट वास्तुकला के साथ प्रतिच्छेदन द्वारा बुलाए गए शिखरों को एनोटेट किया गया था।

एमआरएनए स्थिरता परख

Ythdf2ΔNK और Ythdf2WT चूहों से शुद्ध स्प्लेनिक NK कोशिकाओं को IL -15 (5 0 ng/ml) के साथ संवर्धित किया गया। कल्चर के 3 दिन बाद, संकेतित समय तक कोशिकाओं को एक्टिनोमाइसिन डी (5 μg/ml, कैट नं. A9415; सिग्मा) से उपचारित किया गया। उपचार के बिना कोशिकाओं का उपयोग 0 घंटे पर किया गया था। कोशिकाओं को संकेतित समय पर एकत्र किया गया था, और क्यूपीसीआर के लिए कोशिकाओं से कुल आरएनए निकाला गया था। एमआरएनए अर्ध-जीवन की गणना वेंग एट अल (2018) द्वारा पहले वर्णित विधि का उपयोग करके की गई थी। प्राइमर अनुक्रम तालिका S1 में सूचीबद्ध हैं।

ऑनलाइन डेटाबेस विश्लेषण

हमने Ythdf2 की ऊतक-विशिष्ट अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए ऑनलाइन संसाधन BioGPS (http://biogps.org) का उपयोग किया। आरएनए-सीकडेटा सेट परिग्रहण संख्या के तहत जीईओ से थे। GSE106138, GSE113214, और GSE25672। RNA-seq विश्लेषण से सामान्यीकृत डेटा निर्यात किया गया था, और जीन अभिव्यक्ति z-स्कोर को gplots Rlibrary के भीतर हीटमैप.2 फ़ंक्शन के साथ देखा गया था

आंकड़े

ग्राफपैड प्रिज्म सॉफ्टवेयर का उपयोग करके अयुग्मित छात्र के टी-परीक्षण (दो-पूंछ) किए गए। जब तीन या अधिक स्वतंत्र समूहों की तुलना की गई तो एक-तरफ़ा या दो-तरफ़ा एनोवा का प्रदर्शन किया गया। होल्म-सिडक प्रक्रिया का उपयोग करके कई तुलनाओं के लिए पी मान समायोजित किए गए थे। पी < 0.05 को महत्वपूर्ण माना गया। *, पी < {{10}}.05; **, पी <0.01; और ***, पी < 0.001.

ऑनलाइन पूरक सामग्री

चित्र. S1 IL -15 उत्तेजना, MCMV संक्रमण और ट्यूमर की प्रगति के जवाब में NK कोशिकाओं सहित प्रतिरक्षा कोशिकाओं में YTHDF2 के प्रोटीन स्तर को दर्शाता है; Ythdf2 के एनकेसेल-विशिष्ट विलोपन के साथ चूहों की पीढ़ी। चित्र S2 MCMV से संक्रमित चूहों के प्लीहा और यकृत में वायरल टाइटर्स और MCMV से संक्रमित चूहों में Ly49H+ और/या Ly49D+ NK कोशिकाओं का प्रतिशत और पूर्ण संख्या दिखाता है। चित्र S3 Ythdf2WT और Ythdf2ΔNK चूहों से NK कोशिकाओं के सक्रिय और निरोधात्मक रिसेप्टर्स के प्रसार, अस्तित्व, परिपक्वता और अभिव्यक्ति को दर्शाता है। चित्र S4 IL {{14}STAT5 सिग्नलिंग द्वारा YTHDF2 अभिव्यक्ति के विनियमन और IL -15 रिसेप्टर्स, PI3K-AKT मार्ग और Ythdf2WT और Ythdf2ΔNK से NK कोशिकाओं में MEK-ERK मार्ग की अभिव्यक्ति को दर्शाता है। चूहों। चित्र। S5 एनके कोशिकाओं में ट्रांस्क्रिप्टोम-वाइड RNA-seq, m6A-seq, और RIP-seq परख दिखाता है। तालिका S1 अध्ययन में प्रयुक्त प्राइमरों को सूचीबद्ध करती है।

डेटा उपलब्धता

RNA-seq, m6A-seq, और RIP-seq डेटा को परिग्रहण संख्या के तहत नेशनल सेंटर फॉर बायोटेक्नोलॉजी इंफॉर्मेशन GEO में जमा किया गया था। जीएसई174027. इस अध्ययन के निष्कर्षों का समर्थन करने वाले शेष डेटा अनुरोध पर संबंधित लेखकों से उपलब्ध हैं।

स्वीकृतियाँ

इस कार्य को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NS106170, AI129582, CA247550, CA163205, CA223400, CA068458, और CA210087), ल्यूकेमिया और लिम्फोमा सोसाइटी (1364-19), कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट फॉर रीजनरेटिव मेडिसिन (DISC2कोविड{{) द्वारा समर्थित किया गया था। 9}}), और ब्रेस्ट कैंसर एलायंस 2021 एक्सेप्शनल प्रोजेक्ट अवार्ड। इस कार्य को आंशिक रूप से USDAaward (USDA/NIFA 2020-67017-30843) द्वारा भी समर्थन प्राप्त था।

लेखकों का योगदान: एस. मा, जे. यू, और एम.ए. कैलीगिउरी ने इस परियोजना की कल्पना की और इसे डिज़ाइन किया। एस. मा, जे. यान, जे. झांग, और जे. यू ने प्रयोग और/या डेटा विश्लेषण किए। जेड. चेन, एल.-एस.वांग, जे.सी. सन, और जे. चेन ने अभिकर्मकों और सामग्री समर्थन में योगदान दिया। एस. मा, जे. यू, जे. चेन, और एमए कैलीगिउरी ने पेपर लिखा, समीक्षा की, और/या संशोधित किया। सभी लेखकों ने परिणामों पर चर्चा की और पांडुलिपि पर टिप्पणी की।

प्रकटीकरण: जे. चेन ने जेनोवेल बायोटेककॉर्प से "अन्य" की सूचना दी। प्रस्तुत कार्य के बाहर और जेनोवेल बायोटेक कॉर्प के वैज्ञानिक संस्थापक और रेस ऑन्कोलॉजी के वैज्ञानिक सलाहकार हैं। कोई अन्य खुलासे की सूचना नहीं दी गई।

संदर्भ

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