थियाफ्लेविन-विनियमित इमड कंडेनसेट कंट्रोल ड्रोसोफिला इंटेस्टाइनल होमियोस्टेसिस और एजिंग

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सारांश

काली चाय दुनिया में सबसे अधिक सेवन किया जाने वाला चाय पेय है और लगातार यह बताया गया है कि इसमें एंटी-एजिंग लाभ होते हैं। हालांकि, क्या थिएफ्लेविन्स, काली चाय के अर्क में एक प्रकार के विशिष्ट फाइटोकेमिकल्स, उम्र बढ़ने को नियंत्रित करने में शामिल हैं और उपभोक्ताओं में जीवनकाल काफी हद तक अज्ञात है। इस अध्ययन में, हम दिखाते हैं कि थिएफ्लेविन्स उम्र की शुरुआत आंतों के रिसाव और डिस्बिओसिस को रोकने में लाभकारी भूमिका निभाते हैं, इस प्रकार ड्रोसोफिला में उम्र बढ़ने में देरी होती है। यंत्रवत् रूप से, थिएफ्लेविन्स फल मक्खी की आंतों में Imd संकेतों के अतिसक्रियण को नकारात्मक रूप से नियंत्रित करने के लिए Imd के घनीभूत संयोजन को विनियमित करते हैं। इसके अलावा, थियाफ्लेविन चूहों में डीएसएस-प्रेरित कोलाइटिस को रोकता है, यह सुझाव देता है कि थियाफ्लेविन आंतों की अखंडता को संशोधित करने में एक भूमिका निभाते हैं। कुल मिलाकर, हमारे अध्ययन से एक आणविक तंत्र का पता चलता है जिसके द्वारा थिएफ्लेविन्स इमड सहसंयोजन को नियंत्रित करने के माध्यम से आंत होमोस्टेसिस की संभावना को नियंत्रित करते हैं।

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परिचय

उम्र बढ़ने, व्यक्तिगत अंग प्रणालियों में शारीरिक कार्यों में गिरावट और बीमारी और मृत्यु के बढ़ते जोखिम की विशेषता, अणुओं, कोशिकाओं और ऊतकों को नुकसान का संचय शामिल है (अलवेज़ एट अल।, 2011; बार्टके एट अल।, 2019; एंजेट अल।, 2017)। उम्र बढ़ने की प्रक्रिया में देरी और उम्र को लम्बा करने के लिए जैविक गिरावट को रोकने वाली कार्यात्मक सामग्री या रसायनों की पहचान निस्संदेह महत्वपूर्ण है (बार-आर्डो एट अल।, 2017; कपही एट अल।, 2017)। पिछले अध्ययनों ने बताया है कि काली चाय, दुनिया में सबसे अधिक खपत की जाने वाली चाय, में महत्वपूर्ण गतिविधियाँ होती हैं जो उम्र बढ़ने में देरी करती हैं (कैमरून एट अल।, 2008; फी एट अल।, 2017; कुमार और रिज़वी, 2017; नौमोवस्की एट अल।, 2019) ; पेंग एट अल।, 2009; जिओ एट अल।, 2020)। काली चाय के अर्क के साथ आहार अनुपूरक प्रयोगात्मक जानवरों जैसे कि कीड़े (फीट अल।, 2017), फल मक्खियों (पेंग एट अल।, 2009; साइट अल।, 2011), चूहों (साइट अल।, 2011) के जीवनकाल को कुशलता से बढ़ाता है। ; जिओ एट अल।, 2020), और चूहे (कुमार और रिज़वी, 2017)।

यह सर्वविदित है कि काली चाय के अर्क में मुख्य रूप से दो प्रकार के फाइटोकेमिकल्स होते हैं, अर्थात् कैटेचिन और थियाफ्लेविन्स (टीएफ) (कैमरून एट अल।, 2008; कोंडो एट अल।, 2019; ली एट अल।, 2013), जिनमें से उत्तरार्द्ध काली चाय के उत्पादन में ऑक्सीकरण प्रक्रिया के दौरान अंतर्जात पॉलीफेनोल ऑक्सीडेज और पेरोक्सीडेज द्वारा कैटेचिन से उत्पादित होते हैं (ली एट अल।, 2013)। अध्ययनों की एक श्रृंखला ने ऑक्सीडेटिव तनाव और उम्र से संबंधित सूजन में सुधार और ऊतक क्षति को कम करने के माध्यम से कैटेचिन की एंटीएजिंग भूमिका की पहचान की है (कैमरून एट अल।, 2008; नीयू एट अल।, 2013; पेंग एट अल।, 2009; सी एट अल।) .2011; वानर एट अल।, 2015)। हालांकि, उम्र बढ़ने के लिए TFs के योगदान पर कार्यात्मक अध्ययन कैटेचिन पर बहुत पीछे रह गए हैं, क्योंकि चिकित्सा अध्ययन के लिए काली चाय की पत्तियों से पर्याप्त मात्रा में TFs निकालना मुश्किल है (Takemoto और Takemoto, 2018)। हाल ही में, TFs के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए कई बायोसिंथेटिक तरीके विकसित किए गए हैं (Takemoto and Takemoto,2018), जिससे TFs के सटीक जैविक प्रभावों और अंतर्निहित नियामक तंत्रों का पता लगाना संभव हो गया है।

हाल ही में, डेटा के बढ़ते सेट ने उम्र बढ़ने और जीवन काल के मॉड्यूलेशन में आंतों की महत्वपूर्ण भूमिकाओं पर प्रकाश डाला है (गुओ एट अल।, 2014; जेजी एट अल।, 201 9; मेनार्ड और वेन्कोव, 2018; रोथेनबर्ग और झांग, 201 9; सालाजार एट अल।) ,2018)। आंतों का उपकला, जो एक चयनात्मक बाधा के रूप में कार्य करता है, पोषक तत्वों, आयनों और पानी के अवशोषण की अनुमति देता है और सूक्ष्मजीवों, आहार प्रतिजनों और पर्यावरण विषाक्त पदार्थों सहित हानिकारक संस्थाओं के साथ मेजबान संपर्क को सीमित करता है (कैपो एट अल।, 2019; निकोलसन एट अल। , 2012; रयू एट अल।, 2010)। व्यक्तियों में एक उच्च-टर्नओवर ऊतक के रूप में, आंत्र पथ सहजीवी सूक्ष्म जीवों के लिए सबसे अच्छा रहने का वातावरण प्रदान करता है, जिसमें प्राकृतिक अवायवीय स्थिति, प्रचुर मात्रा में पोषक तत्व और एक उपयुक्त तापमान और पीएच शामिल हैं।

चित्र 1. थिएफ्लेविन्स ड्रोसोफिला के जीवनकाल को लम्बा खींचते हैं और चढ़ाई की क्षमता को बढ़ाते हैं

(ए और बी) मादा फल मक्खियों को मानक खाद्य पदार्थों के साथ सुसंस्कृत किया गया था जिन्हें 1 मिलीग्राम / एमएल या 2.5 मिलीग्राम / एमएल थिएफ्लेविन्स (टीएफ) के साथ पूरक किया गया था या बिना टीएफ के बेसल के रूप में। मक्खियों को हर दूसरे दिन नए मीडिया युक्त ताजा शीशियों में स्थानांतरित कर दिया गया था, और मृत मक्खियों ने पूरे वयस्क जीवन काल में स्कोर किया है, मादा मक्खियों की उत्तरजीविता वक्र (ए) और औसत दीर्घायु (बी) का विश्लेषण और दिखाया गया था।

(कैंड डी) महिला w18 को मानक ड्रोसोफिला खाद्य पदार्थ (संदर्भित बेसल) या क्रमशः 1mg/ml या 2.5mg/ETF के पूरक खाद्य पदार्थों के साथ खिलाया गया था। संकेतित उम्र (क्रमशः 10 दिन, 30 दिन, 40 दिन और 50 दिन) में मक्खियों के छह स्वतंत्र समूहों को कैफे (सी) और फ्लोरेसिन फीडिंग (डी) assays के अधीन किया गया था। मूल्य, शरीर में विशिष्ट जीवाणु प्रजातियों द्वारा कब्जा कर लिया गया निचे (बोनफिनी एट अल।, 2016; बुचोन एट अल।, 2013; निकोलसन एट अल।, 2012)। इस बीच, ये सहजीवी सूक्ष्मजीव और उनके मेटाबोलाइट भी प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से पोषक तत्व प्रसंस्करण को प्रभावित करते हैं; पाचन और अवशोषण; ऊर्जा संतुलन; प्रतिरक्षा कार्य; जठरांत्र विकास और परिपक्वता; और कई अन्य महत्वपूर्ण शारीरिक गतिविधियाँ (बोनफिनी एट अल।, 2016; ब्रोडरिक, 2016; मेनार्ड और वीवीन्कोव, 2018; निकोलसन एट अल।, 2012)। दो सहजीवन के बीच पारस्परिक रूप से लाभकारी संबंध आंतों के सूक्ष्म-पारिस्थितिकी तंत्र की स्थिरता और गतिशील संतुलन को बनाए रख सकते हैं (बोनफिनी एट अल।, 2016; ब्रोडरिक, 2016; ब्रोडरिक एट अल। 2014; गुओ एट। 2014; मे-नार्ड और वेनकोव, 2018; निकोलसन एट अल।, 2012)।

सिस्टैन्च एंटी-एजिंग कर सकता है

अध्ययनों की एक श्रृंखला से पता चला है कि आंतों के माइक्रोबायोटा होमियोस्टेसिस को बनाए रखने के लिए जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया महत्वपूर्ण है और अकशेरुकी से कशेरुक (गिलौएट अल।, 2016; गुओ एट अल।, 2014; रयू एट अल।, 2006, 2010; विजय-) तक संरक्षित है। कुमार एट अल।, 2010)। ड्रोसोफिला में, दो प्रमुख सिग्नलिंग मार्ग, अर्थात् टोल और प्रतिरक्षा की कमी (आईएमडी) मार्ग, जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में शामिल हैं (लू एट अल।, 2020; मायलीमाकीट अल।, 2014; वैलेन एट अल।, 2011)। विशेष रूप से, ड्रोसोफिला टोल मार्ग स्तनधारी इंटरल्यूकिन -1 रिसेप्टर (IL -1 R) और MyD 88- निर्भर टोल-जैसे रिसेप्टर (TLR) मार्गों के साथ समानताएं साझा करता है, जबकि Imd मार्ग समान है स्तनधारियों में ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर रिसेप्टर (TNFR) मार्ग और TRIF पर निर्भर TLR मार्ग (इम्लर, 2014; Myllymaki et al।, 2014; Valanne et al।, 2011)। ये दो रास्ते एनएफ-केबी ट्रांसक्रिप्शन कारकों (इम्लर, 2014; मायलीमाकी एट अल।, 2014; वैलेन एट अल।, 2011) के सक्रियण के माध्यम से रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स (एएमपी) की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करते हैं।bioflavonoidsImd सिग्नलिंग मार्ग आम तौर पर ग्राम-नकारात्मक जीवाणु संक्रमण द्वारा सक्रिय होता है और इसके परिणामस्वरूप एएमपी के एक और सेट की अभिव्यक्ति होती है, जैसे कि एटासिन, सेक्रोपिन, और डिप्टेरिसिन (क्लेनो और सिल्वरमैन, 2014; मायलीमाकी एट अल।, 2014)। इन एएमपी की अभिव्यक्ति के लिए इमड पाथवे में पेप्टिडोग्लाइकन रिकग्निशन प्रोटीन (पीजीआरपी) -एलसी रिसेप्टर और रिलेश के सिग्नल-डिपेंडेंट क्लीवेज और न्यूक्लियर ट्रांसलोकेशन की आवश्यकता होती है, एक एनएफ-केबी फैमिली ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर (क्लेनो और सिल्वरमैन, 2014; मायलीमाकी एट अल।) 2014)। हाल के एक अध्ययन से पता चला है कि बैक्टीरियल पेप्टिडोग्लाइकेन्स (क्लेनो एट अल।, 2017) की मान्यता पर ड्रोसोफिला इमड मार्ग के सक्रियण के लिए एमाइलॉयड गठन की आवश्यकता होती है। हालाँकि, क्या यह Imd घनीभूत अन्य जैविक प्रक्रियाओं में शामिल है, जैसे आंतों के होमियोस्टेसिस रखरखाव और उम्र बढ़ने के नियमन, काफी हद तक अज्ञात है।

वर्तमान अध्ययन में, हमने आंतों की अखंडता और उम्र बढ़ने को नियंत्रित करने में TFs की भूमिकाओं की जांच के लिए पशु मॉडल के रूप में फल मक्खियों और चूहों का उपयोग किया। हमने दिखाया कि TFs आंतों की स्टेम कोशिकाओं के उम्र-शुरुआत के अतिप्रसार में देरी करते हैं, आंत माइक्रोबायोम के डिस्बिओसिस से बचाते हैं, और Imd सिग्नलिंग मार्ग के सक्रियण को रोकते हैं, इस प्रकार ड्रोसोफिला में जीवनकाल को लम्बा खींचते हैं। आगे के यंत्रवत अध्ययनों से संकेत मिलता है कि TFs Imd सिग्नलिंग में नकारात्मक योगदान करते हैं, इसके सर्वव्यापीकरण के बजाय Imd के संघनन को अवरुद्ध करने के माध्यम से हो सकता है। इसके अलावा, हमने पाया कि चूहों में DSS- प्रेरित कोलाइटिस को रोकने में TFs अत्यधिक प्रभावी हैं। एक साथ लिया गया, हमारे निष्कर्ष Imd व्यवहार को संशोधित करने में TFs की एक संभावित भूमिका को प्रकट करते हैं, जो आंतों के होमियोस्टेसिस और जीवनकाल विस्तार में उनके सकारात्मक योगदान का महत्वपूर्ण कारक हो सकता है।

परिणाम

थिएफ्लेविन्स का आहार पूरक ड्रोसोफिला के जीवनकाल को बढ़ाता है

यह जांचने के लिए कि क्या थिएफ्लेविन्स (TFs) ड्रोसोफिला में उम्र बढ़ने और जीवन काल को प्रभावित करते हैं, हमने मादा w'118 मक्खियों को मानक पालन खाद्य पदार्थों के साथ उठाया जो कि 1mg/mL या2.5mg/ml TFs के साथ पूरक थे और जैसा कि पहले वर्णित किया गया था (जी एट अल) ।, 2019)। मक्खियों को एक समान मात्रा में TFs विलायक (H2O) के साथ पूरक आहार खिलाया जाता है जिसे नियंत्रण माना जाता है। जैसा कि चित्र 1क में दिखाया गया है, TFs (1 mg/mL) की अपेक्षाकृत कम सांद्रता के आहार में वृद्धि ने फल मक्खी के जीवनकाल को थोड़ा लंबा कर दिया, और TFs (2.5 mg/mL) की उच्च सांद्रता का जीवनकाल विस्तार पर काफी सकारात्मक प्रभाव पड़ा। विशेष रूप से, TFs (2.5 मिलीग्राम/एमएल) की उच्च सांद्रता के दीर्घकालिक उत्थान के परिणामस्वरूप मादा मक्खियों (चित्रा 1बी) के औसत जीवनकाल में लगभग 8 दिनों का उन्नयन हुआ, जो ड्रोसोफिला में दीर्घायु को विनियमित करने में टीएफसिन की लाभकारी भूमिका का सुझाव देता है। इसी तरह के परिणाम तब प्राप्त हुए जब हमने पुरुष w'*'''8 मक्खियों (आंकड़े S1A और S1B) के जीवनकाल पर अतिरिक्त TFs के संभावित प्रभावों का परीक्षण किया।

चित्रा 2. थिएफ्लेविन्स ड्रोसोफिला में उम्र-शुरुआत आंत की शिथिलता और माइक्रोबायोटा डिस्बिओसिस को रोकते हैं

(ए और बी) आंतों की अखंडता के नुकसान को स्मर्फटेस्ट द्वारा 10 दिन, 30 दिन, 40 दिन और 50 दिनों की महिला w18 वयस्कों की उम्र में परख लिया गया था। गैर-स्मर्फ और स्मर्फ के उदाहरण (ए) में दिखाए गए थे। विभिन्न संकेतित समूहों में स्मर्फ के प्रतिशत का विश्लेषण किया गया और (बी) में दिखाया गया।

(सी) विभिन्न संकेतित समूहों से महिला w18files में 16एस rRNA जीन के qPCR द्वारा सहेजे गए जीवाणु प्रचुरता का विश्लेषण किया गया और दिखाया गया।

(DF) कॉमेन्सल बैक्टीरियल 16S rRNA जीन की सीक्वेंसिंग की गई। बैक्टीरियल टैक्सा (डी) के अनुपात, मुख्य माइक्रोबियल टैक्सा (एफ) का एक हीट मैप, और गैमप्रोटोबैक्टीरिया (एफ) के सापेक्ष बहुतायत का विश्लेषण और प्रस्तुत किया गया।

चित्र 2. जारी रखा

(जी और एच) 10 दिनों और 40 दिनों की उम्र में नियंत्रण के रूप में 2.5 मिलीग्राम / एमएल टीएफ या बिना टीएफ के खिलाए गए संकेतित मादा मक्खियों से हिम्मत को विच्छेदित किया गया था। जीएफपी संकेतों (जी) के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा मिडगुट स्लाइड्स की छवियां कैप्चर की गईं। जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं के प्रतिशत को दर्शाने वाला सांख्यिकीय विश्लेषण (एच) में दिखाया गया है।

(I) संकेतित मादा मक्खियों से हिम्मत एकत्र की गई और फॉस्फोराइलेटेड हिस्टोन 3 (पीएच 3) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए इम्यूनोस्टेनिंग एसेज़ के अधीन किया गया, पीएच की मात्रा निर्धारित करने वाले सांख्यिकीय परिणाम 3- प्रति आंत सकारात्मक कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया और दिखाया गया। बी, सी, एच, और में, डेटा का विश्लेषण दो-पूंछ वाले छात्र के परीक्षण द्वारा किया जाता है और इसे ± SEM.NS के रूप में दिखाया जाता है, महत्वपूर्ण नहीं, * पी<><0.001. see="" also="" figure="">

ईटीएफ को कड़वा स्वाद के लिए जाना जाता है, और आम तौर पर फल मक्खियों और स्तनधारियों (यामाजाकी एट अल।, 2014; यांग एट अल।, 2018) सहित दोनों उपभोक्ताओं द्वारा कड़वे खाद्य पदार्थों से परहेज किया जाता है। हमने तब यह स्पष्ट करने की कोशिश की कि क्या टीएफ ड्रोसोफिला भोजन के सेवन को प्रभावित कर सकते हैं, क्योंकि पिछले अध्ययनों ने साबित कर दिया है कि आहार प्रतिबंध से कशेरुक और अकशेरुकी दोनों में विस्तारित जीवनकाल होता है (हुड्री एट अल।, 2019; कपही एट अल।, 2017; मोगर-रीशर एट अल।) ।, 2020)। ऐसा करने के लिए, हमने पहले कैफे परख का प्रदर्शन किया, एक तरल माध्यम युक्त केशिका फीडर का उपयोग करके सीधे और सटीक रूप से फीडिंग दर को मापने के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला दृष्टिकोण, जैसा कि पहले वर्णित है (जा एट अल।, 2007)। जैसा कि चित्र 1C और S1C में दिखाया गया है, TFs (क्रमशः 1 मिलीग्राम/एमएल और 2.5 मिलीग्राम/एमएल) के आहार पूरकता ने परीक्षण की गई मक्खियों के भोजन की खपत में शायद ही कोई बदलाव किया हो। इसकी और पुष्टि करने के लिए, हमने फिर फ़्लोरेसिन को फ़ूड ट्रेसर (रेरा एट अल।, 2012; वांग एट अल।, 2005) के रूप में उपयोग किया और एक प्राकृतिक फीडिंग परख (डेनिलोव एट अल।, 2015) का प्रदर्शन किया। जैसा कि आंकड़े 1D और S1D में दिखाया गया है, हम TFs पूरकता और भोजन सेवन के स्तर के बीच किसी भी संबंध का निरीक्षण करने में विफल रहे। एक साथ लिया गया, हमारे परिणामों ने सुझाव दिया कि जीवन काल को लंबा करने में TFs की लाभकारी भूमिका ड्रोसोफिला में आहार प्रतिबंध के कारण नहीं हो सकती है।

ड्रोसोफिला ऊर्जा होमियोस्टेसिस को प्रभावित करने के लिए अतिरिक्त टीएफ डिस्पेंसेबल हैं

यह सुझाव दिया गया है कि काली चाय पॉलीफेनोल्स लिपिड और सैकराइड पाचन, अवशोषण और सेवन को रोककर मोटापे को रोकने पर सकारात्मक प्रभाव डालती है, इस प्रकार कैलोरी की मात्रा को कम करती है (कैमरून एट अल।, 2008)। हमने तब यह स्पष्ट करने की कोशिश की कि क्या टीएफ-विनियमित एलड्रोसोफिला जीवनकाल विस्तार पोषक तत्वों के अवशोषण और ऊर्जा भंडारण में परिवर्तन के कारण है। ऐसा करने के लिए, हमने सबसे पहले ट्राईसिलेग्लिसराइड (TAG) के स्तर की जांच की, जो सबसे अधिक पाए जाने वाले लिपिड मेटाबोलाइट्स (टेननेसेन एट अल।, 2014) में से एक है, मादा मक्खियों में उनके पूरे जीवन में पहले से वर्णित (फैन एट अल।, 2017)।सिस्टैंच खरीदेंजैसा कि चित्र 1E में दिखाया गया है, TFs के उपचार ने विभिन्न आयु बिंदुओं पर समग्र TAG बहुतायत को शायद ही प्रभावित किया हो। जब हमने हेक्सोकाइनेज किट (Li et al।, 2018; Ten-nessen et al।, 2014) द्वारा ग्लाइकोजन सामग्री और परिसंचारी कार्बोहाइड्रेट (ग्लूकोज और ट्रेहलोस) की मात्रा का पता लगाया, तो परिणामों से पता चला कि नमूनों के बीच कोई स्पष्ट परिवर्तन नहीं था। TFs उपचार के बिना (आंकड़े 1F-1H)। ध्यान दें, जब हमने पशु मॉडल (आंकड़े S1E-S1H) के रूप में पुरुष w118 का उपयोग करते हुए चयापचय फेनोटाइप की जांच की, तो लगातार परिणाम प्राप्त हुए। सामूहिक रूप से, इन आंकड़ों ने सुझाव दिया कि ड्रोसोफिला के पूरे जीवनकाल में कार्बोहाइड्रेट और ऊर्जा होमोस्टैसिस के नियमन के लिए TFs का आहार अनुपूरक डिस्पेंसेबल है।

हमने पहले से वर्णित (डिलियन एट अल।, 2017; स्टैट्स एट अल।, 2018) के रूप में तेजी से पुनरावृत्त नकारात्मक जियोटैक्सिस (रिंग) परीक्षण करके आहार टीएफ हस्तक्षेप के तहत ड्रोसोफिला के प्राकृतिक जीर्णता के कैनेटीक्स की जांच की। जैसा कि आंकड़े 1l,1J, S1l, और S1J में दिखाया गया है, TFs पूरक समूहों में वृद्ध (40 दिन) w1118 (महिला और पुरुष दोनों) के चढ़ाई सूचकांक में उल्लेखनीय रूप से सुधार हुआ (महिलाओं में लगभग 12 प्रतिशत की वृद्धि और पुरुषों में लगभग 18 प्रतिशत की वृद्धि) ) नियंत्रण समूहों के साथ तुलना में, यह सुझाव देता है कि टीएफ संभावित रूप से ड्रोसोफिला चढ़ाई और लोकोमोटर गतिविधियों में सुधार करते हैं।

Theaflavins उम्र की शुरुआत आंत रिसाव और माइक्रोबायोटा डिस्बिओसिस को रोकता है

पिछले अध्ययनों से पता चला है कि फ्रूट फ्लाई लोकोमोटर गतिविधियाँ और जीवनकाल मेजबान स्वास्थ्य की स्थिति से अत्यधिक संबंधित हैं, जैसे कि सेक्स, आहार, आयु और जीनोटाइप (कारुसो एट अल।, 2013; हेइंट्ज़ और मैयर, 2014)। हाल ही में, साक्ष्य की कई पंक्तियों ने साबित कर दिया है कि आंतों के इमड सिग्नलिंग होमियोस्टेसिस को संरक्षित करने से आईएससी और अग्रदूत कोशिकाओं के अति-प्रसार को रोकने और उम्र की शुरुआत आंतों के उपकला शिथिलता में देरी से आंत की अखंडता में सुधार होता है, जो बदले में जीव के स्वास्थ्य में सकारात्मक योगदान देता है (क्लार्क एट अल। , 2015; गुओ एट अल।, 2014)। ड्रोसोफिला में, एक छोटा जीवनकाल आंतों के उपकला अवरोध की शिथिलता के साथ निकटता से जुड़ा हुआ है, और उम्र बढ़ने के दौरान इस बाधा की अखंडता के विकास के परिणामस्वरूप जीवन काल का विस्तार होता है (क्लार्क एट अल।, 2015; गुओट अल।, 2014; जेट अल।, 2019)। इस प्रकार, हमने यह निर्धारित करने की कोशिश की कि क्या TFs Smurf परख करके आंत की अखंडता को बदल देते हैं, एक विधि जिसे पहले वर्णित किया गया है (क्लार्क एट अल।, 2015; रेरा एट अल।, 2011)। जैसा कि चित्र 2कमें दिखाया गया है, परीक्षण किए गए फल मक्खियों जिसमें नीले रंग पाचन तंत्र तक सीमित थे, को गैर-स्मर्फ (चित्र 2कमें बाएं पैनल) के रूप में संदर्भित किया गया था। यदि नीले रंग देखे गए थे

चित्रा 3. जारी रखा

(ईजी) हिम्मत को 2.5 मिलीग्राम / एमएल टीएफ के साथ या टीएफ के बिना 10 दिन, 30 दिन, 40 दिन और 50 दिन की उम्र में बेसल के रूप में खिलाई गई महिला w1118 फाइलों से अलग किया गया था। कुल आरएनए को निकाला गया और एआरटी-पीसीआर विश्लेषण के अधीन किया गया। डिप्टेरिसिन (एफ), एटासिन (एफ) और सेक्रोपिन ए1 (जी) के एमआरएनए अभिव्यक्ति स्तरों का विश्लेषण किया गया और दिखाया गया। ईजी में, डेटा का विश्लेषण दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट द्वारा किया जाता है और इसे ± SEM.NS के रूप में दिखाया जाता है, महत्वपूर्ण नहीं, *p<><><0.001. see="" also="" figure="">

पेट में हिम्मत से रिसते हुए, मेजबानों को स्मर्फ (चित्र 2कमें दायां पैनल) के रूप में गिना जाता था। पिछले निष्कर्षों के अनुरूप (क्लार्क एट अल।, 2 0 15), उम्र बढ़ने के दौरान स्मर्फ के अनुपात में धीरे-धीरे वृद्धि हुई (चित्र 2बी)। दिलचस्प बात यह है कि दोनों महिलाओं में आयु-मिलान नियंत्रण (8.2 प्रतिशत से 3.7 प्रतिशत, 19.4 प्रतिशत से 15.6 प्रतिशत, और समूहों के लिए 35.4 प्रतिशत से 27.1 प्रतिशत तक) की तुलना में टीएफ़-खिलाए गए समूहों में स्मर्फ वयस्कों के अनुपात में बहुत कमी आई थी। 30 दिन, 40 दिन, और 50 दिन, क्रमशः, चित्र2बी) और पुरुष वयस्क (2.7 प्रतिशत से 0.9 प्रतिशत तक, 6.9 प्रतिशत से 0.9 प्रतिशत तक, और 8.3 प्रतिशत से 2.7 प्रतिशत तक 30 वर्ष की आयु में) दिन, 40 दिन, और 50 दिन, क्रमशः, चित्रा S2A), यह दर्शाता है कि TFs वृद्ध फल मक्खियों में आंतों की बाधा की शिथिलता को रोक सकता है। ध्यान दें, हमने पुरुषों में स्मर्फ प्रतिशत में बड़ी कमी देखी (लगभग 65.8 प्रतिशत, 86.9 प्रतिशत, और 67.4 प्रतिशत, 30 दिन, 40 दिन, और 50 दिनों की उम्र में, क्रमशः) उम्र की तुलना में। -मिलान वाली मादाएं (क्रमशः 30 दिन, 40 दिन और 50 दिन की उम्र में लगभग 54.1 प्रतिशत, 19.5 प्रतिशत और 23.3 प्रतिशत की कमी), जिसका अर्थ है कि नर मक्खियों में आंतों के रिसाव को कम करने में टीएफ बेहतर भूमिका निभा सकते हैं।

पिछले अध्ययनों ने सुझाव दिया है कि उम्र-शुरुआत आंतों की बाधा की शिथिलता अक्सर आंत माइक्रोबायोटा (क्लार्क एट अल।, 2015; गुओ एट अल।, 2014) के डिस्बिओसिस के साथ सहसंबद्ध होती है। इस प्रकार, हमने TFs अनुपूरण के बाद आंतों के कॉमेन्सल जीवाणु संरचना की जांच की। हमने पहले सार्वभौमिक प्राइमरों का उपयोग किया और बैक्टीरियल 16S rRNA जीन स्तरों को निर्धारित करने के लिए मात्रात्मक पीसीआर प्रयोग किए। जैसा कि चित्र 2C में दिखाया गया है, वृद्ध कटौती में, TFs हस्तक्षेप समूहों से कुल जीवाणु आबादी ने नियंत्रणों की तुलना में एक आश्चर्यजनक कमी (लगभग 45 प्रतिशत -55 प्रतिशत) दिखाई, यह सुझाव देते हुए कि TFs पूरकता शायद उम्र बढ़ने के दौरान माइक्रोबायोटा विस्तार को पूर्व-वेंट करती है . फिर, हमने टीएफ के साथ आहार अनुपूरक के कारण आंतों के माइक्रोबियल समुदाय में होने वाले परिवर्तनों की विस्तार से जांच करने के लिए मेटागेनोमिक्स का प्रदर्शन किया। जैसा कि आंकड़े 2डी -2 एफ में दिखाया गया है, गैमप्रोटोबैक्टीरिया का अनुपात, जिसका विस्तार आंतों की बाधा विफलता (क्लार्क एट अल।, 2015) के साथ निकटता से जुड़ा हुआ पाया गया था, स्पष्ट रूप से वृद्ध आंतों में टीएफ पूरकता से कम हो गया था। लगभग 7 प्रतिशत की कमी), जिसका अर्थ है कि टीएफ ड्रोसोफिला में उम्र बढ़ने के दौरान आंत माइक्रोबायोटा के होमोस्टैसिस में सकारात्मक योगदान देते हैं।

Theaflavins ड्रोसोफिला में आंतों के प्रोलिफेरेटिव होमियोस्टेसिस में सुधार करते हैं

We further examined the intestinal integrity of flies that were treated with or without TFs. First, we employed the widely-used P{Esg-Gal4}/P{Uasp-GFP};{Tub-Gal80*s}strain(referred to as esgts>GFP), जिसमें आंतों के स्टेम सेल (ISCs) और पूर्वज कोशिकाओं को GFP के साथ लेबल किया गया था। जैसा कि Figs2G और 2H में दिखाया गया है, TFs हस्तक्षेप समूहों में 40 दिनों (20 हिम्मत की गणना की गई) में GFP-पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या आयु-मिलान नियंत्रणों (लगभग 47.6 प्रतिशत और) की तुलना में बहुत कम (लगभग 29.7 प्रतिशत) थी। 19 हिम्मत गिने गए), यह सुझाव देते हुए कि TFs ISCs के आयु-शुरुआत अतिप्रसार को रोक सकते हैं। इसके अलावा, हमने फॉस्फो-हिस्टोन 3 (पीएच 3) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए इम्यूनोस्टेनिंग प्रयोग किए, जो आंत के ऊतकों में माइटोटिक कोशिकाओं के लिए एक विशिष्ट मार्कर है। हमने नियंत्रण से उन लोगों की तुलना में वृद्ध TFs-पूरक वयस्कों (औसत संख्या 20.6 थी) से हिम्मत में कम पीएच 3-सकारात्मक कोशिकाओं का अवलोकन किया (औसत संख्या 39.5, चित्र 2 थी)। एक साथ लिया गया, हमारे परिणाम बताते हैं कि TFs के साथ आहार अनुपूरक आंतों के प्रोलिफ़ेरेटिव होमियोस्टेसिस को ठीक करता है और उम्र की शुरुआत माइक्रोबायोटा डिसप्लेसिया को रोकता है, इस प्रकार ड्रोसोफिला में उम्र बढ़ने में देरी करता है।

Theaflavins आंतों के Imd संकेतों को नकारात्मक रूप से नियंत्रित करता है

अंतर्निहित आणविक तंत्र का पता लगाने के लिए जिसके द्वारा TFs ड्रोसोफिला आंत होमियोस्टेसिस में सकारात्मक योगदान करते हैं, हमने TFs के साथ या बिना इलाज किए गए महिला w1118 वयस्कों से आयु-मिलान आंतों के नमूनों का उपयोग करते हुए RNA-seq विश्लेषण किया। टुकड़े प्रति किलोबेस प्रति मिलियन (एफपीकेएम) विश्लेषण ने सुझाव दिया कि समग्र जीन अभिव्यक्ति पैटर्न दो प्रयोगात्मक समूहों(चित्रा 3ए)के बीच समान थे। हालांकि, आगे के अंतर अभिव्यक्ति विश्लेषण ने कुल 229 विभेदित रूप से व्यक्त जीनों की पहचान की, जिनमें से 99 को अपग्रेड किया गया और 126 को डाउनग्रेड किया गया (चित्र 3बी)। दिलचस्प बात यह है कि इन जीनों के जीन ऑन्कोलॉजी विश्लेषण से पता चला है कि टीएफएस (चित्रा 3 सी) के साथ आहार अनुपूरक द्वारा प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मार्ग को अत्यधिक बदल दिया गया था।

ड्रोसोफिला में, जन्मजात प्रतिरक्षा संकेतन मार्ग उम्र-शुरुआत आंत होमियोस्टेसिस और दीर्घायु (क्लार्क एट अल, 2015; गुओ एट अल, 2014) को विनियमित करने में एक प्रमुख भूमिका निभाने के लिए सिद्ध हुए हैं। हमने तब जन्मजात प्रतिरक्षा संकेतों के डाउनस्ट्रीम रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स (एएमपी) के अभिव्यक्ति पैटर्न की जांच करने पर ध्यान केंद्रित किया। के रूप में दिखाया

चित्रा 4. जारी

(डी) शुद्ध इमड प्रोटीन 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर TFs (50 uM, 100 uM, और 200 uM, क्रमशः) के विभिन्न सांद्रता के साथ ऊष्मायन किया गया था। नमूनों को तब संकेतित तरंग दैर्ध्य (430 एनएम पर उत्तेजना, 450 एनएम से 550 एनएम तक 5 एनएम की एक भट्ठा चौड़ाई के साथ उत्सर्जन) का उपयोग करके प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रम विश्लेषण के अधीन किया गया था। बेसलाइन नियंत्रण के रूप में TFs के बिना एक नमूने का उपयोग किया गया था।

（E and F）Lysates of guts from NP11>Myc-Imd मक्खियों को 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर TFs（100μM） के साथ तैयार और ऊष्मायन किया गया था। IMD प्रोटीन समुच्चय का विश्लेषण करने के लिए SDD-AGE-ऊपरी पैनल E) और SDS-PAGE (E में निचला पैनल) assays का प्रदर्शन किया गया। लोडिंग नियंत्रण के रूप में ट्यूबुलिन का उपयोग किया गया था।सिस्टैंचडेंसिटोमेट्री विश्लेषण विभिन्न नमूनों में इमड कंडेनसेट की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया गया था, और परिणाम (एफ) में दिखाए गए थे। (छ) टीएफएस नमूने का एक प्रतिनिधि क्रोमैटोग्राम।

H और I） शुद्ध फ्लैग-Imd प्रोटीन प्रत्येक नमूने के लिए TFs, TF1, TF2a, TF2b, या TF3（100 μM के साथ ऊष्मायन किए गए थे या संकेत के अनुसार 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बफर नियंत्रण की समान मात्रा के साथ थे। नमूनों को तब एसडीडी-एजीई (एच में ऊपरी पैनल) और एसडीएस-पेज (एच में निचला पैनल) के अधीन किया गया था ताकि आईएमडी के एकत्रीकरण पैटर्न को निर्धारित किया जा सके। विभिन्न नमूनों में इमड कंडेनसेट की मात्रा निर्धारित करने के लिए डेंसिटोमेट्री विश्लेषण किया गया और ( ) में दिखाया गया। सी, एफ, और आई में, डेटा का विश्लेषण दो-पूंछ वाले छात्र के परीक्षण द्वारा किया जाता है और इसे ± SEM के रूप में दिखाया जाता है। *** पी< 0.001.="" see="" also="" figure="">

चित्र 3डी में, डिप्टेरिसिन ए (डीपीटीए), डिप-टेरिसिन बी (डीपीटीबी), एटासिन ए (एटीए), सेक्रोपिन ए1 (सीईसीए1), सेक्रोपिन ए2 (सीईसीए2) सहित प्रतिरक्षा की कमी (आईएमडी) मार्ग द्वारा नियंत्रित एएमपी जीन, और cecropin C (Cece), नियंत्रण समूहों की तुलना में TFs-उपचारित समूहों में उल्लेखनीय रूप से (39.4 प्रतिशत, 72.3 प्रतिशत, 10.5 प्रतिशत, 86.5 प्रतिशत, 99.8 प्रतिशत, और 36.1 प्रतिशत, क्रमशः) कम हो गए थे। RNA-seq विश्लेषण से प्राप्त परिणामों की और पुष्टि करने के लिए, हमने चार अलग-अलग आयु बिंदुओं पर प्राप्त ड्रोसोफिला आंत नमूनों में Imd- संबंधित AMP जीन के सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तरों को निर्धारित करने के लिए एक मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (gRT-PCR) किया। जिसमें 10 दिन, 30 दिन, 40 दिन और 50 दिन शामिल हैं। जैसा कि चित्र 3E-3G में दिखाया गया है, कुछ जीनों के mRNA अभिव्यक्ति स्तर, जिनमें डिप्टेरिसिन, एटासिन, और सेक्रोपिन A1 शामिल हैं, TFs-उपचारित में (लगभग 35.9 प्रतिशत -66.6 प्रतिशत) काफी कम हो गए थे। वृद्ध हिम्मत। सामूहिक रूप से, हमारे डेटा से पता चला है कि TFs ने उम्र बढ़ने के दौरान ड्रोसोफिला आंत कोशिकाओं में Imd सिग्नलिंग मार्ग के सक्रियण को संभावित रूप से रोक दिया था।

Theaflavins Imd पाथवे के ट्रांसक्रिप्शनल रेगुलेशन या Imd के सर्वव्यापीकरण के लिए डिस्पेंसेबल हैं

हमने TFs और Imd के बीच संबंध की जांच करने की मांग की और पहले वर्णित (Lan et al।, 2020) के रूप में सरफेस प्लास्मोन रेजोनेंस (SPR) परख का प्रदर्शन किया। जैसा कि चित्र 4ए में दिखाया गया है। TFs ने 8.078 uM के अनुमानित Kp स्थिरांक पर शुद्ध Imd प्रोटीन के साथ मध्यम बाध्यकारी आत्मीयता प्रदर्शित की। फिर हम यह निर्धारित करने के लिए प्रवृत्त होते हैं कि TFs आंतों के Imd सिग्नलिंग मार्ग को कैसे नियंत्रित करते हैं। RNA-seq डेटा से ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण के परिणामों के आधार पर, हमने पाया कि Imd सिग्नलिंग मार्ग में प्रमुख नियामक कारकों, जैसे कि PGRP-LC, Imd, और Relish के अभिव्यक्ति स्तर, TFs उपचार (चित्र S3A) द्वारा शायद ही बदले गए थे। ) हमने आगे मक्खियों से आंत के नमूने एकत्र किए जो विभिन्न उम्र में TFs के साथ या बिना आहार पूरकता के अधीन थे और इन जीनों के अभिव्यक्ति पैटर्न का विशेष रूप से पता लगाने के लिए qRT-PCR प्रयोग किए। जैसा कि चित्र S3B में दिखाया गया है, कुछ जीनों के mRNA स्तर, जिनमें पुतला, फीका, tak1, pgrp-Ica, uev1a, बेंडलेस, रीलिश, imd, pgrp-sc2, tab2, ird5 केनी और diap2 शामिल हैं, नियंत्रण समूहों के बीच समान थे। और TFs हस्तक्षेप समूह, यह सुझाव देते हैं कि TFs ट्रांसक्रिप्शनल स्तर पर Imd संकेतों को विनियमित करने में शामिल नहीं हैं।

इसके बाद, हमने Imd ubiquitination प्रोफाइल की जांच की क्योंकि पिछले अध्ययनों ने सुझाव दिया है कि Imd पाथवे में डाउनस्ट्रीम सिग्नल ट्रांसडक्शन के लिए Imd का ubigui-tination आवश्यक है (Myllymaki et al।, 2014; Zhou et al।, 2005)। हमने पहले इन विट्रो E1 शिफ्टिंग परख की और पाया कि TFs के साथ उपचार का E1 और ubiquitin की एंजाइमी प्रतिक्रियाओं पर संयुग्मित E1 / Ub (चित्र S4A) बनाने के लिए कोई स्पष्ट प्रभाव नहीं है। इसके अलावा, हमने ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं को प्लास्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया, जिसमें फ्लैग-टैग किए गए Imd को HA-टैग किए गए Ub के साथ व्यक्त किया गया और फिर TFs के साथ या बिना कोशिकाओं का इलाज किया। इसके अलावा सर्वव्यापी assays ने सुझाव दिया कि TFs पूरकता ने सुसंस्कृत कोशिकाओं (आंकड़े S4B और S4C) में सर्वव्यापी Imd के स्तर को मुश्किल से प्रभावित किया। विवो में TFs और Imd ubiquitination के बीच संबंधों को निर्धारित करने के लिए, हमने ट्रांसजेनिक फ्लाई P {NP1-Gal4}/P{Uasp-Myc-Imd};P{Tub-Gal80*} (जिसे NP1* कहा जाता है) का उपयोग किया। s > Myc-Imd), जिसमें एक Myc-टैग की गई Imd प्रोटीन आंत की कोशिकाओं (चित्र S4D) में अत्यधिक व्यक्त की गई थी। हमारे सर्वव्यापी प्रयोगों से पता चला है कि टीएफ के साथ आहार अनुपूरक आंत के ऊतकों (आंकड़े S4D और S4E) में Imd के सर्वव्यापीकरण को संशोधित करने के लिए डिस्पेंसेबल था। एक साथ लिया गया, हमारे परिणामों ने संकेत दिया कि TFs Imd के सर्वव्यापी पैटर्न को प्रभावित न करके ड्रोसोफिला इमड संकेतों को नकारात्मक रूप से नियंत्रित करते हैं।

Theaflavins Imd घनीभूत विधानसभा को रोकता है

हाल ही के एक अध्ययन ने सुझाव दिया कि इमद मार्ग में डाउनस्ट्रीम जीन की सक्रियता के लिए इमड का एकत्रीकरण आवश्यक है (क्लेनो एट अल।, 2017)। हमने तब यह जांचने की कोशिश की कि क्या TFs की प्रक्रिया को विनियमित करते हैं

चित्रा 5. जारी

(एफ और जी) महिला w18 (आईएमडी प्लस / प्लस के रूप में संदर्भित), आईएमडी 'विषमयुग्मजी और समयुग्मक उत्परिवर्ती (क्रमशः आईएमडी प्लस/- और आईएमडी-/- के रूप में संदर्भित) मानक ड्रोसोफिला खाद्य पदार्थ (बेसल के रूप में संदर्भित) पाले गए थे। या 2.5 मिलीग्राम / एमएल (टीएफ के रूप में संदर्भित) के साथ आहार अनुपूरक और फिर जीवन काल परख जीवन रक्षा वक्र (एफ) के अधीन थे और औसत दीर्घायु (जी) का विश्लेषण और दिखाया गया था।

इन और एफ, सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए लॉग रैंक परीक्षण का उपयोग किया गया था। बीई में, और, दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए किया गया था, और डेटा ± एसईएम के रूप में श हैं। एनएस, महत्वपूर्ण नहीं, *पी<0.05, **p="" <="" 0.01,=""><0.001. see="" also="" figure="">

आईएमडी कुल गठन। सबसे पहले, हमने सुसंस्कृत S2 कोशिकाओं से Myc-टैग किए गए Imd प्रोटीन को शुद्ध किया और TFs (चित्र 4B) के विभिन्न सांद्रता वाले प्रोटीनों को इनक्यूबेट किया। दिलचस्प बात यह है कि हमने पाया कि TFs ने स्पष्ट रूप से Imd (81.7 प्रतिशत -89.7 प्रतिशत, आंकड़े 4B और 4C से कम) के एकत्रीकरण को रोक दिया, जैसा कि हमारे अर्धविक्षिप्त डिटर्जेंट agarose gel वैद्युतकणसंचलन (SDD-AGE) assays द्वारा सुझाया गया है। इस खोज की पुष्टि करने के लिए, हमने आगे थियोफ्लेविन-टी बाइंडिंग एसेज़ का प्रदर्शन किया और लगातार परिणाम प्राप्त किए (चित्र 4डी)। अंत में, हमने NP1ts> Myc-Imd ट्रांसजेनिक मक्खियों को उठाया, जिन्हें TFs के साथ या बिना आहार पूरकता के अधीन किया गया था और वृद्ध वयस्कों से आंत के नमूने एकत्र किए गए थे। SDD-AGE प्रयोगों ने सुझाव दिया कि आंतों की कोशिकाओं में TFs द्वारा Imd के एकत्रीकरण को बहुत कम कर दिया गया था (16.7 प्रतिशत -22 प्रतिशत, आंकड़े 4E, और 4F की कमी)।

यह निर्धारित करने के लिए कि TFs Imd कंडेनसेट असेंबली को नियंत्रित करने में कैसे योगदान करते हैं, हमने TFs को HPLCanal-ysis के अधीन किया और पाया कि उनमें मुख्य रूप से चार प्रकार के मोनोमर्स (चित्र 4G), अर्थात्, थियाफ्लेविन (TF1), थियाफ्लेविन 3-O-gallate ( TF2a), theaflavin 3'-O-gallate (TF2b), और theaflavin 3,3'-di-O-gallate (TF3), जो पिछली रिपोर्टों के अनुरूप थे (Li et al।,2013; Takemoto and Takemoto,2018) . फिर, हमने इनमें से प्रत्येक रसायन को शुद्ध इमडप्रोटीन के साथ इनक्यूबेट किया और एसडीडी-एजीई प्रयोग किए। जैसा कि आंकड़े 4H और 4l में दिखाया गया है, इन सभी TFmonomers के उपचार के परिणामस्वरूप TFs, TF1, TF2a, TF2b, और TF3 के लिए क्रमशः 59.5 प्रतिशत, 60.9 प्रतिशत, 58.4 प्रतिशत .58.2 प्रतिशत और 55.8 प्रतिशत की उल्लेखनीय कमी आई है। आईएमडी कुल स्तर। सामूहिक रूप से, हमारे परिणामों ने सुझाव दिया कि TFs संभवतः Imd संघनन के व्यवहार को नियंत्रित करके ड्रोसोफिला Imd सिग्नलिंग मार्ग को नकारात्मक रूप से नियंत्रित करते हैं।

Theaflavins एक Imd-निर्भर तरीके से ड्रोसोफिला के जीवनकाल का विस्तार करते हैं

To examine whether TFs prolong Drosophila lifespan depending on their regulatory role in Imd, we specifically knocked down Imd in gut tissues using the transgenic flies P{NP1-gal4)PITub-gal80*}/P{Uasp-imd-IR(KK)} (referred to as Imd RNAi). As shown in Figures 5A and 5B, dietary supplementation of TFs extended the lifespan of controls (elevation of nearly 7.2 days in the mean lifespan), whereas prevention of Imd expression in guts apparently reversed the lifespan extension caused by TFs. Consistent results were obtained when we utilized male Imd RNAi and control flies to perform lifespan assays (Figures S5A and S5B). Further qRT-PCR assays showed that the mRNA expression levels of AMP genes at ages of 10 days, 30 days, 40 days, and 50 days, including diptericin, attacin, and cecropin A1.hardly changed in the gut tissues of Imd RNAi flies(Figures 5C-5E), whereas additional TFs caused reductions of 31%-72.3% in mRNA abundances of these genes in samples from control groups. To confirm these results from Imd RNAi flies, we first performed lifespan assays using w18(control, referred to as imd+/+), imd' heterozygous (referred to as imd+/-), and homozygous(referred as imd-/-)mutant flies. We found that TFs addition extended lifespan and increased mean life longevity of imd+/-flies (elevation of nearly 6.2 days, Figures 5F and 5G). However, this lifespan extension effect by TFs was almost abolished in imd-/-flies (Figures 5F and 5G). Next, we performed lifespan assays utilizing Relish RNAi(NP1's>Relish RNAi and control(NP1ts>प्लस) मक्खियों। क्योंकि Relish Imd-downstream AMP जीन एक्सप्रेशन (Myllymaki et al।, 2014) के लिए जिम्मेदार प्रमुख ट्रांसक्रिप्शन कारक है। जैसा कि Fiqures S5C और S5D में दिखाया गया है। TFs के आहार जोड़ ने स्पष्ट रूप से नियंत्रण मक्खियों की लंबी उम्र को लम्बा खींच दिया, और जीवनकाल में इस विस्तार को Relish RNAi मक्खियों में काफी हद तक रोका गया। सामूहिक रूप से, हमारे डेटा ने संकेत दिया कि टीएफ के आहार अनुपूरक आंतों के इमड संकेतों के आधार पर ड्रोसोफिला जीवनकाल की संभावना में सकारात्मक योगदान देते हैं।

यह देखने के लिए कि क्या TFstill द्वारा जीवन काल का विस्तार एक अक्षीय पृष्ठभूमि में होता है, हमने अक्षीय परिस्थितियों में w1118 महिलाओं का उपयोग करके जीवन काल का प्रदर्शन किया। जैसा कि आंकड़े S5E और S5F में दिखाया गया है, TFs (1 mg/mL और 2.5 mg/mL) की विभिन्न सांद्रता को जोड़ने से w18 वयस्कों में मृत्यु दर और औसत जीवन दीर्घायु के अनुपात पर शायद ही कोई प्रभाव पड़ा हो। क्योंकि अक्षीय पालन की स्थिति काफी हद तक प्रचुर मात्रा में माइक्रोबायोटा को रोक सकती है, इस प्रकार कटौती (क्लार्क अल।, 2015) में इमड संकेतों को प्रतिबंधित करती है, हमारे डेटा ने सुझाव दिया कि टीएफ लंबे समय तक ड्रोसोफिला जीवनकाल आंत माइक्रोबायोटा-विनियमित जन्मजात प्रतिरक्षा संकेतों के मॉड्यूलेशन के माध्यम से हो सकता है।

चित्र 6. Theaflavins CD-1 चूहों में DSS-प्रेरित बृहदांत्रशोथ को कम करता है

(ए) टीएफएस उपचार ने सीडी के विभिन्न समूहों -1 चूहों में पानी की खपत को प्रभावित नहीं किया।

(बीडी) टीएफ (क्रमशः 1 मिलीग्राम/एमएल, 2.5 मिलीग्राम/एमएल, और 5 मिलीग्राम/एमएल) के विभिन्न सांद्रता के गैवेज प्रशासन ने सीडी में डीएसएस के कारण बृहदान्त्र की कमी और प्लीहा के विस्तार में सुधार किया -1 चूहों। प्रतिनिधि चित्र (बी) और बृहदान्त्र (सी) और प्लीहा (डी) के सांख्यिकीय विश्लेषण दिखाए गए थे। (ई) TFs (1 मिलीग्राम/एमएल, 2.5 मिलीग्राम/एमएल, और 5 मिलीग्राम/एमएल, क्रमशः) के विभिन्न सांद्रता के प्रशासन ने सीडी -1 चूहों में डीएसएस द्वारा प्रेरित आंत रिसाव को रोका। (एफ और जी) चूहों के संकेतित समूहों से कोलन एकत्र किए गए थे। टीएनएफए (एफ) और आईएल -6 (जी) के एमआरएनए अभिव्यक्ति स्तरों का पता लगाने के लिए कुल आरएनए को निकाला गया और क्यूआरटी-पीसीआर assays के अधीन किया गया।

(एचएल) चूहों के विभिन्न समूहों से बृहदान्त्र लंबे समय तक एकत्र किए गए थे और एचई धुंधला assays के अधीन थे। माइक्रोस्कोपी द्वारा नमूनों की जांच की गई, और संकेतित नमूनों के प्रतिनिधि चित्र HL） प्राप्त किए गए और दिखाए गए। स्केल बार, 40 माइक्रोन। (एम-क्यू') एसईएम छवियां विभिन्न संकेतित नमूनों से कोलन के माइक्रोट्रिचोम दिखा रही हैं। स्केल बार, 50 um (MQ) और 4 um (M'-Q')।

सीजी में, डेटा का विश्लेषण दो-पूंछ वाले छात्र के परीक्षण द्वारा किया जाता है और इसे ± SEM.NS के रूप में दिखाया जाता है, महत्वपूर्ण नहीं, *p<><><0.001. see="" also="" figure="">

Theaflavins सीडी में डीएसएस-प्रेरित बृहदांत्रशोथ को कम करता है -1 चूहों

स्तनधारियों में आंतों के होमियोस्टेसिस को बनाए रखने में टीएफ की संभावित भूमिका की जांच करने के लिए, सीडी -1 चूहों का उपयोग डेक्सट्रान सल्फेट सोडियम (डीएसएस) द्वारा कोलाइटिस को प्रेरित करने के लिए किया गया था। चूहों को चार सप्ताह के लिए नियंत्रण के रूप में TFs (1 g/L, 2.5 g/L, या 5 a/L) या पानी की अलग-अलग सांद्रता में इंट्रागैस्ट्रिक रूप से प्रशासित किया गया, इसके बाद 7 दिनों के लिए पीने के पानी में 2 प्रतिशत DSS के साथ उपचार किया गया। यह देखने के लिए कि क्या TFs चूहों के विभिन्न समूहों में DSS की पीने की मात्रा को प्रभावित करते हैं, हमने हर दिन चूहों के पीने की निगरानी की। जैसा कि Fiqure6A में दिखाया गया है, TFs उपचार DSS- प्रेरित कोलाइटिस चूहों में पेय की खपत को प्रभावित करने के लिए डिस्पेंसेबल है, DSS- उपचारित चूहों ने दस्त और / या हेमटोचेज़िया के साथ कोलाइटिस सिंड्रोम प्रस्तुत किया, जिन्हें खुराक पर निर्भर TFs उपचार (आंकड़े S6A-S6E) द्वारा रोका गया था।ऑस्ट्रेलियाइसके अलावा, TFs के साथ हस्तक्षेप ने DSS के कारण बृहदान्त्र की लंबाई में कमी को बचाया और प्लीहा (आंकड़े 6B -6D) के विस्तार में सुधार किया।

हमने तब इन चूहों के आंतों के अवरोध कार्य की जांच के लिए डेक्सट्रान-4000-FITC (FITC-DX) का उपयोग किया था। जैसा कि चित्र 6ई में दिखाया गया है, डीएसएस-उपचारित समूहों के चूहों ने रक्त के नमूनों में एफआईटीसी-डीएक्स की उच्च सांद्रता दिखाई, जो इन जानवरों में आंत के रिसाव को दर्शाता है, हालांकि, टीएफ के साथ हस्तक्षेप ने पाचन अंगों से एफआईटीसी-डीएक्स के परिवहन को महत्वपूर्ण रूप से रोक दिया। संचार प्रणाली (56.1 प्रतिशत -77.5 प्रतिशत, चित्र 6E) से कम। विशेष रूप से, TFs के प्रशासन ने सामान्य परिस्थितियों में चूहों की आंत पारगम्यता में परिवर्तन नहीं किया (चित्र S6F)। क्योंकि सूजन माउस मॉडल के बृहदांत्रशोथ के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, हमने आगे qRT-PCR प्रयोग किए, जिसमें दिखाया गया कि TFs उपचार ने DSS-उपचारित चूहों (आंकड़े 6F और 6G) की आंतों में IL -6 और TNF अभिव्यक्तियों को काफी कम कर दिया।

बृहदान्त्र में पैथोलॉजिकल परिवर्तनों का और विश्लेषण करने के लिए, हमने हेमटॉक्सिलिन-एओसिन (एचई) धुंधला परख का प्रदर्शन किया। जैसा कि Figs6H-6L और S6G-S6J में दिखाया गया है, DSS- प्रेरित गंभीर उपकला क्षति को खुराक पर निर्भर तरीके से TFs उपचार द्वारा स्पष्ट रूप से ठीक किया गया था। इन आंतों के नमूनों की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग ने आगे लगातार परिणाम प्रदान किए (आंकड़े 6M -6 Q 'और S6K-S6N')। एक साथ लिया गया, हमारे निष्कर्षों ने संकेत दिया कि टीएफ कीड़े और स्तनधारियों दोनों में आंतों के अवरोध समारोह की रक्षा करने में लाभकारी भूमिका निभाते हैं।

बहस

इस अध्ययन में, हमने आंतों के होमियोस्टेसिस और दीर्घायु और अंतर्निहित आणविक तंत्र को संशोधित करने में टीएफ के शारीरिक कार्यों की जांच की। हमने दिखाया कि TFs के साथ आहार अनुपूरक आंतों के माइक्रोबायोटा की उम्र-शुरुआत डिस्बिओसिस की रोकथाम और आंत उपकला शिथिलता की देरी में सकारात्मक योगदान देता है, इस प्रकार ड्रोसोफिला के जीवनकाल को लम्बा खींचता है। हमारे इन विट्रो और इन विवो मैकेनिस्टिक अध्ययनों से पता चला है कि TFs संभवतः Imd के सहसंयोजन को अवरुद्ध करके Imd सिग्नलिंग मार्ग को नियंत्रित करने में एक नकारात्मक भूमिका निभाते हैं। इसके अलावा, हमने पाया कि DSS- प्रेरित बृहदांत्रशोथ को सीडी -1 चूहों में TFs पूरकता द्वारा कुशलता से कम किया जा सकता है। हमारे परिणाम इस धारणा का समर्थन करते हैं कि TFs अकशेरुकी और कशेरुक दोनों में आंतों के होमियोस्टेसिस में लाभकारी रूप से योगदान करते हैं।

थिएफ्लेविन के साथ आहार अनुपूरक ड्रोसोफिला के जीवनकाल को बढ़ाता है

चाय की खपत दुनिया भर में लोकप्रिय है और पानी की खपत के बाद दूसरे स्थान पर है (रोथेनबर्ग और झांग, 2019)। कई अध्ययनों ने अक्सर प्रयोगात्मक और नैदानिक ​​​​दृष्टिकोणों (कैमरून एट अल।, 2008; नीयू एट अल।, 2013; पेंग एट अल।, 2009; रोथेनबर्ग और झांग। 2019; स्पिंडलरेट अल।, 2013; ताकेमोटो) दोनों के माध्यम से शारीरिक कार्यों पर ध्यान केंद्रित किया है। और ताकेमोटो, 2018; उन्नो एट अल।, 2020; झोउ एट अल।, 2020। यह बड़े पैमाने पर दिखाया गया है कि चाय लिपिड स्तर को कम करके और मोटापा-रोधी प्रभावों के माध्यम से स्वास्थ्य को लाभ पहुंचाती है, और चाय में मुख्य कार्यात्मक यौगिक कैटेचिन हैं, विशेष रूप से एपिगैलोकैटेचिन गैलेट (ईजीसीजी) (अब्बास और विंक, 2009; मॉडर्नेलि एट अल।, 2015; नीयू एट अल।, 2013; वैगनर एट अल।, 2015; जिओंग एट अल।, 2018)। पिछले अध्ययनों ने यह भी संकेत दिया है कि ग्रीन टी और काली चाय फल मक्खियों (साइट अल।, 2011; वैगनर एट अल।, 2015), कीड़े (फी एट अल।, 2017; जिओंग एट अल।, 2018), और चूहों (इमरान एट अल) के स्वास्थ्य काल और जीवनकाल को बढ़ा सकती है। .,2018; Niu etal.2013) और मुख्य नियामक तंत्र ROSsignals के मॉड्यूलेशन के माध्यम से EGCG द्वारा ऑक्सीडेटिव तनाव की प्रभावी रोकथाम है।सिस्टैंच लाभ,हालांकि, क्या TFs, काली चाय में विशिष्ट "सुनहरे" यौगिकों के रूप में, उम्र बढ़ने को नियंत्रित करने में भूमिका निभाते हैं और जीवनकाल काफी हद तक अज्ञात रहता है। यह अध्ययन सम्मोहक साक्ष्य प्रदान करता है जो दर्शाता है कि भोजन के सेवन को प्रभावित करने के लिए TFs का हस्तक्षेप डिस्पेंसेबल है, और आहार के माध्यम से TFs का दीर्घकालिक उत्थान नर और मादा फल मक्खियों दोनों में जीवनकाल का विस्तार करता है। ये निष्कर्ष स्तनधारी दीर्घायु में TFs के कार्यों पर आगे के अध्ययन के लिए दिशानिर्देश प्रदान करते हैं।

Theaflavins उम्र-शुरुआत माइक्रोबायोटा डिस्बिओसिस में सुधार करते हैं और आंतों के होमियोस्टेसिस को बढ़ावा देते हैं प्रोलिफेरेटिव होमियोस्टेसिस और पुनर्योजी क्षमता का प्रगतिशील असंतुलन उम्र बढ़ने और उम्र की शुरुआत की बीमारियों की एक बानगी है (क्लार्क एट अल।, 2015; हेन्ट्ज़ और मैयर, 2014; मेनार्ड और वेन्कोव, 2018; रेरा) एट अल। 2012)। पुरानी सूजन होमियोस्टेसिस के नुकसान और उम्र बढ़ने वाले जीवों में कैंसर की घटनाओं में वृद्धि के साथ जुड़ी हुई है (बार्टके एट अल।, 2019; कपही एट अल।, 2017; जिओ एट अल।, 2020)। यह आंतों के उपकला (गुओ एट अल।, 2014; मेनार्ड और वेन्कोव, 2018) जैसे बाधा उपकला में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। उम्र बढ़ने की आंत में उम्र से संबंधित डिसप्लेसिया के विकास के लिए एक मॉडल के साथ, हमने दिखाया कि उम्र बढ़ने की बाधा उपकला में मेजबान-कॉमेंसल इंटरैक्शन में सुधार स्वास्थ्य और जीवनकाल को बढ़ावा दे सकता है। हमने उम्र बढ़ने के दौरान आंतों के कार्य और माइक्रोबायोटा की गतिशीलता को परखने के लिए कई गैर-प्रमुख तरीकों का इस्तेमाल किया। सबसे पहले, Smurf परख ने उम्र बढ़ने के दौरान उपकला अवरोध शिथिलता को विनियमित करने में TFs की सकारात्मक भूमिका का संकेत दिया। फिर, कई ट्रांसजेनिक मक्खियों का उपयोग करके इम्यूनोस्टेनिंग परख से पता चला कि TFs ने ISCs के अति-प्रसार और विभेदित कोशिकाओं के कारोबार में देरी की। अंत में, माइक्रोबायोम के अनुक्रमण ने सुझाव दिया कि TFs आंतों के कॉमेन्सल माइक्रोफ्लोरा के आयु-शुरुआत विस्तार को कम कर देते हैं। इन परिणामों ने दृढ़ता से संकेत दिया कि TFs आंत के होमियोस्टेसिस को बनाए रखते हुए मेजबान की उम्र बढ़ने की प्रक्रिया में देरी करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।

Theaflavins Imd सिग्नलिंग को नकारात्मक रूप से विनियमित करके आंत में अत्यधिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को कम करता है

यह सुझाव दिया गया है कि बैरियर एपिथेलिया (गुओ एट अल।, 2014; मेनार्ड और वेन्कोव, 2018) के दीर्घकालिक होमियोस्टेसिस को सुनिश्चित करने के लिए आंत प्रतिरक्षा समारोह और माइक्रोबायोटा के बीच नाजुक संतुलन बनाए रखा जाना चाहिए। पिछले अध्ययनों से यह भी पता चला है कि आंत में पुरानी अत्यधिक सूजन बैरियर एपिथेलिया में उम्र से संबंधित शिथिलता से जुड़ी है और उम्र बढ़ने की पहचान है (क्लार्क एट अल।, 2015; गुओ एट अल।, 2014; जी एट अल।, 2019) . इस प्रकार, इस तरह के एपिथेलिया में जन्मजात प्रतिरक्षा होमियोस्टेसिस को संरक्षित करके एक स्वस्थ कॉमन्सल आबादी को बनाए रखना स्वास्थ्य और दीर्घायु को बढ़ावा देने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है (बोनफिनी एट अल।, 2016; ब्रोडरिक, 2016; क्लार्क एट अल।, 2015)। आणविक तंत्र का पता लगाने के लिए जो TFs उम्र बढ़ने में देरी करते हैं, हमने TFs उपचार के साथ या उसके बिना विच्छेदित आंतों का उपयोग करके RNA-seq विश्लेषण किया। हमारे डेटा ने सुझाव दिया कि टीएफ-इलाज वाले जानवरों की तुलना में नियंत्रण फल मक्खियों की आंतों में अत्यधिक व्यक्त जीनों का समूह "प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया" जीन के रूप में वर्गीकृत जीन से समृद्ध था। आगे के जैव सूचनात्मक विश्लेषण और गेट-पीसीआर assays से पता चला है कि TFs के आहार जोड़ द्वारा Imd- संबंधित AMP जीन की अभिव्यक्ति नाटकीय रूप से बाधित थी। आंतों में असामान्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए डीएसएस का उपयोग करने वाले सीडी -1 माउस प्रयोगों के परिणामों ने इस धारणा की पुष्टि की कि टीएफ आंतों की सूजन के खिलाफ रक्षक के रूप में कार्य करता है।

Theaflavins Imd . की अमाइलॉइड असेंबली का निर्धारण करके संकेतों को दबा देता है

TFs Imd सिग्नलिंग मार्ग को नकारात्मक रूप से कैसे नियंत्रित करते हैं? ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण के परिणामों के आधार पर, हमने पाया कि इमड सिग्नलिंग मार्ग में प्रमुख कारकों के ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन के लिए टीएफ डिस्पेंसेबल हैं। रुचि के अनुसार, हमने SPR परख द्वारा शुद्ध Imd प्रोटीन के साथ TFs के स्पष्ट बंधन संबंध का अवलोकन किया, जिसने एक संभावना का सुझाव दिया कि TFs, Imd प्रोटीन व्यवहार या इसके बाद के अनुवाद-संबंधी संशोधन प्रक्रिया को नियंत्रित करने में भूमिका निभा सकते हैं। पिछले अध्ययनों ने आईएमडी सिग्नल ट्रांसडक्शन (क्लेनो और सिल्वरमैन, 2014; माइलीमाकी एट अल।, 2014) में सर्वव्यापकता की एक महत्वपूर्ण भूमिका पर प्रकाश डाला है, और इमड सिगनलिंग (मायलीमाकी एट अल।, 2014; थेवेनॉन) को गहन रूप से बंद करने में आईएमडी सर्वव्यापकता परिणामों की रोकथाम। एट अल।, 2009)। हालाँकि, हमारे इन विट्रो और विवोयूबिकिटेशन assays में पता चला है कि TFs शायद ही Imd के सर्वव्यापी पैटर्न को प्रभावित करते हैं। हाल के एक अध्ययन से पता चला है कि बैक्टीरियल पेप्टिडोग्लाइकेन्स (क्लेनो एट अल।, 2017) की मान्यता पर ड्रोसोफिला इमड मार्ग के सक्रियण के लिए अमाइलॉइड गठन की आवश्यकता होती है। दिलचस्प बात यह है कि हमारे SDD-AGE और ThTbinding assays ने सुझाव दिया कि Imd के सहसंयोजन को TFs द्वारा रोका जाता है। आंत कोशिकाओं में इमद के खटखटाने या उत्परिवर्तन द्वारा इमड एकत्रीकरण की रोकथाम ने जीवनकाल विस्तार पर टीएफ के लाभकारी प्रभावों को स्पष्ट रूप से उलट दिया। हमारी खोज की और पुष्टि करने के लिए, यह जांचना दिलचस्प होगा कि क्या TFs फल उड़ने वालों में जीवनकाल बढ़ाने के लिए अधिक कार्यात्मक नहीं हैं, जब संरक्षित क्रिप्टिक RHIM (cRHIM, अमीनो एसिड 118 से 121h तक) Imd के रूपांकन को विशेष रूप से नष्ट कर दिया जाता है, इस निष्कर्ष के आधार पर कि आईएमडी में अपराध इसके एकत्रीकरण और अमाइलॉइड गठन के लिए आवश्यक है (क्लेनो एट अल।, 2017)। फिर भी, हमारा अध्ययन आंतों के होमियोस्टेसिस और उम्र बढ़ने की प्रक्रिया को नियंत्रित करने में TFs की एक महत्वपूर्ण भूमिका पर प्रकाश डालता है, शायद Imd सहसंयोजन को संशोधित करके। भविष्य के अध्ययनों को यह पता लगाने पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए कि इमड के कौन से अवशेष या क्षेत्र टीएफ से बंधे हैं और यह बाध्यकारी परिणाम इमड संक्षेपण की रोकथाम में कैसे होता है। इसके अलावा, स्तनधारी प्रणाली में हमारे निष्कर्षों ने संकेत दिया कि टीएफ प्रभावी रूप से बहिर्जात जहरीले रासायनिक डीएसएस के कारण होने वाली सूजन से बृहदान्त्र की रक्षा कर सकते हैं, आंतों के होमियोस्टेसिस को बनाए रखने में टीएफ की एक संरक्षित नियामक भूमिका का सुझाव देते हैं। यह जांचना सार्थक है कि क्या टीएफ स्तनधारी ऊतकों में प्रोटीन असेंबली को नियंत्रित करने में भूमिका निभाते हैं।

यह लेख zhongwenxie@ahau.edu.cn से निकाला गया है