सामान्य और सिस्टिक किडनी में नेफ्रॉन की त्रि-आयामी वास्तुकला

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थॉमस ब्लैंको^1,2,7, निकोलस गौडिन^3,7, मोहम्मद ज़ैदानी^1,4,7, मेरीम गारफ़ा त्रोरे³, फ्रैंक बिएनाइम^1,5,लिसा टुरिंस्की¹, सर्ज गरबे¹, क्लेमेंट गुयेन¹, मार्टीन बर्टिन¹, गेरार्ड फ्रीडलैंडर^1,6, फैबियोला टेर्ज़िक^1,8और मार्को पोंटोग्लियो^1,8

¹इंस्टिट्यूट नेशनल डे ला सैंटे एट डे ला रेचेर्चे मेडिकल यू1151, सेंटर नेशनल डे ला रेचेर्चे साइंटिफिक यूएमआर8253, यूनिवर्सिटी डेपेरिस, इंस्टीट्यूट नेकर एनफैंट्स मालेड्स, विभाग «क्रॉइसेंस एट सिग्नलाइजेशन», पेरिस, फ्रांस;²सर्विस डे चिरुर्गी विस्सेराले और यूरोलॉजी पेडियाट्रिक, एपी-एचपी, हॉस्पिटल नेकर एनफेंट्स मालेड्स, पेरिस, फ्रांस;³संरचना Fédérative de Recherche Necker, US24-UMS3633, पेरिस, फ्रांस; ⁴सर्विस डे नेफ्रोलोजी-ट्रांसप्लांटेशन, एपी-एचपी, होपिटल बिकोट्रे, ले क्रेमलिन-बीकोट्रे, फ्रांस;⁵सर्विस डी एक्सप्लोरेशन फोन्क्शननेलेस, एपी-एचपी, हॉस्पिटल नेकर एनफेंट्स मालादेस, पेरिस, फ्रांस; तथा⁶सर्विस डी'एक्सप्लोरेशन फोन्क्शननेलेस, एपी-एचपी, होपिटलयूरोपीन जॉर्जेस पोम्पिडो, पेरिस, फ्रांस

कीवर्ड: सिस्टिकगुर्दाबीमारी;गुर्दा; नेफ्रॉन; नेफ्रोनोफ्थिसिस; ऊतक समाशोधन

अनुवाद संबंधी वक्तव्य

समाशोधन विधियां यह समझने के लिए एक अनूठा उपकरण प्रदान करती हैं कि कैसे रूपात्मक परिवर्तन रोग संबंधी परिणामों को जन्म देते हैं।गुर्देमहत्वपूर्ण अंग हैं जो पानी, मेटाबोलाइट और इलेक्ट्रोलाइट हैंडलिंग के माध्यम से शरीर के होमियोस्टेसिस को बनाए रखते हैं, जो महत्वपूर्ण रूप से जटिल 3-की आयामी संरचना पर निर्भर हैं।नेफ्रॉन.जब इस संरचनात्मक संगठन को बदल दिया जाता है, तो वृक्क पैथोफिज़ियोलॉजी सामने आती है। वर्तमान अध्ययन में, हमने ऑप्टिकल क्लियरिंग, मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी और डिजिटल ट्रेसिंग पर आधारित एक शक्तिशाली विधि विकसित की है।गुर्दाशारीरिक और रोग स्थितियों के तहत एकल-नेफ्रॉन स्तर पर। विशेष रूप से, हम एकल . के पैमाने पर एक पॉलीसिस्टिक किडनी का पहला 3-आयामी पुनर्निर्माण प्रदान करते हैंनेफ्रॉन. इस पद्धति को कई रोग संबंधी संदर्भों पर लागू किया जा सकता है, जिससे हमें गुर्दे की खराब होने की जटिल प्रक्रिया को बेहतर ढंग से समझने की अनुमति मिलती है और इसके परिणामस्वरूप, अधिक लक्षित चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने के लिए

गुर्दा अपने परिसर के माध्यम से शरीर के होमियोस्टेसिस को बनाए रखता है3-आयामी(3 डी) नेफ्रॉन संरचना। जब इस संरचनात्मक संगठन को बदल दिया जाता है, तो गुर्दे की पैथोफिज़ियोलॉजी आती है। दीर्घकालिकगुर्दारोग गुर्दे के घावों के विकास की विशेषता है। दिलचस्प बात यह है कि पैथोलॉजिस्ट ने क्रोनिक किडनी रोगों के दौरान घावों के वितरण में व्यापक विविधता की सूचना दी है। 1,2 क्या यह इस तथ्य को दर्शाता है कि विशिष्ट नेफ्रॉन खंडों को अलग तरह से क्षतिग्रस्त किया जा सकता है, या वैकल्पिक रूप से, कि कुछ नेफ्रॉन में समग्र रूप से घायल होने की अलग-अलग संवेदनशीलता होती है, अज्ञात है। इस मुद्दे को हल करने के लिए, 3D का पुनर्निर्माण करना अनिवार्य है (तीन आयामी) का आकारनेफ्रॉनपैथोलॉजिकल संदर्भों में।

हमारे ज्ञान के लिए,नेफ्रॉनकेवल सीरियल 2डी सेक्शन का उपयोग करके पूरी तरह से पुनर्निर्माण किया गया है। 3-5 हालांकि मानक हिस्टोलॉजिकल सेक्शनिंग उच्च रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है, 3 डी पुनर्निर्माण श्रमसाध्य और प्राप्त करने में कठिन होते हैं। यह मुख्य रूप से यांत्रिक विकृतियों के कारण होता है, जो टुकड़ा करने की प्रक्रिया का एक अपरिहार्य प्रभाव है। इसके अलावा, 3डी (2डी छवियों से पुनर्निर्माण पूरे माउंटेड ऊतकों में 3डी संरचनाओं की प्रत्यक्ष इमेजिंग की अनुमति नहीं देता है।

मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी ने मोटे वर्गों में रूपात्मक परिवर्तनों का पता लगाने की हमारी क्षमता में सुधार किया है। हालांकि, प्रकाश के प्रकीर्णन के कारण उथली सुलभ गहराई एक महत्वपूर्ण सीमा है। अपवर्तक सूचकांक अंतर को कम करके, समाशोधन एजेंटों ने छवि की गहराई की क्षमता में नाटकीय रूप से सुधार किया है। इस तथ्य के बावजूद कि पहला समाशोधन एजेंट एक सदी पहले पेश किया गया था, हाल ही में कई समाशोधन प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं, ज्यादातर मस्तिष्क के लिए।9 -17 हाल के अध्ययनों ने अन्य ठोस अंगों, जैसे कि यकृत, अग्न्याशय, या की इमेजिंग के लिए अपनी क्षमता का प्रदर्शन किया हैगुर्दा.18–26

पॉलीसिस्टिकगुर्दारोग, एक आनुवंशिक रूप से विषम विकार जिसमें कई सिलिअरी जीन में उत्परिवर्तन शामिल है, सबसे आम वंशानुगत गुर्दा रोग है। 27,28 पॉलीसिस्टिकगुर्दारोग को सिस्ट के विकास की विशेषता है जो गुर्दे के पूर्ण विनाश की ओर ले जाता है। 28 माइक्रोडिसेक्शन अध्ययनों ने सुझाव दिया कि सिस्ट या तो नेफ्रॉन सेगमेंट के "आउट पुशिंग" के रूप में विकसित हो सकते हैं, जैसा कि ऑटोसोमल प्रमुख पॉलीसिस्टिक किडनी रोग में होता है; ऑटोसोमल रिसेसिव पॉलीसिस्टिक के रूप में एकत्रित नलिकाओं (सीडी) के उत्साही विस्तार के रूप मेंगुर्दाबीमारी; या विशेष रूप से मेडुलरी नलिकाओं में, जैसा कि नेफ्रोनोफ्थिसिस (एनपीएचपी) में होता है। 27,29 हालांकि, 3डी में सिस्ट कैसे विकसित होते हैं (तीन आयामी) और एक दूसरे के साथ व्यवस्थित करें और सामान्य पड़ोसी नलिकाएं अभी भी अज्ञात हैं।

यहां, हमने ऑप्टिकल समाशोधन को मल्टीफोटोन माइक्रोस्कोपी के साथ कैसे जोड़ा है, इस बारे में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए संयुक्त किया हैनेफ्रॉनशारीरिक स्थितियों में आकार और व्यवस्थित होते हैं और रोग के दौरान उन्हें कैसे संशोधित किया जाता है, जैसे कि सिस्टोजेनेसिस। हमारे परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि 3 प्रकार के होते हैंनेफ्रॉनऔर वह पोत नेफ्रॉन स्थानिक संगठन को प्रभावित कर सकते हैं। दिलचस्प बात यह है कि हमने देखा कि नेफ्रॉन विशिष्ट विमानों में झूठ बोलते हैं। अप्रत्याशित रूप से, जब हमने इस तकनीक को jckmice पर लागू किया, तो हमने देखा कि सिस्ट केवल विशिष्ट नेफ्रॉन खंडों में विकसित होते हैं, जिसमें फ्यूसीफॉर्म सिस्ट होते हैं जो सामान्य नलिकाओं के साथ परस्पर जुड़े होते हैं।

करने के लिए क्लिक करेसिस्टांचेदुष्प्रभावगुर्दे की बीमारी के लिए

परिणाम

प्रयोगिक व्यवस्था

संपूर्ण के आकार का अध्ययन करने के लिएनेफ्रॉनउनके पर्यावरण के संबंध में, हमने ऑप्टिकल क्लियरिंग और मल्टीफ़ोटो माइक्रोस्कोपी (सप्लीमेंट्रीफिगर S1A) पर आधारित एक तकनीक को अपनाया। विभिन्न ऑप्टिकल समाशोधन प्रोटोकॉल की तुलना करके, हमने निर्धारित किया किगुर्दा, बेंज़िल अल्कोहल / बेंज़िल बेंजोएट (BABB) प्रभावकारिता के मामले में सबसे उपयुक्त था (पूरक चित्रा S1B और C और पूरक तालिका S1)।

3D (तीन आयामी) पुनर्निर्माण और डिजिटल ट्रेसिंग के लिए उच्च रिज़ॉल्यूशन वाली उच्च-गुणवत्ता वाली छवियों और उच्च सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात की आवश्यकता होती है। हमने देखा कि नेटिवफ्लोरेसेंस द्वारा प्रदान किया गया ऑप्टिकल सिग्नल किडनी सेक्शन पर एक समान नहीं था। विशेष रूप से, मज्जा से छवियों को कम सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात (सप्लीमेंट्री फिगर S2) के साथ खराब रूप से विपरीत किया गया था। सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात में सुधार करने के लिए, आवधिक एसिड-शिफ (सप्लीमेंट्रीफिगर S1D) के साथ वेस्टस्टेड सेक्शन, क्योंकि हमने अनुभवजन्य रूप से नोट किया कि यह धुंधला 2-फोटॉनफ्लोरेसेंस के दौरान पतले वर्गों में उच्च विपरीतता को जन्म देता है। हालांकि, संकेत मोटी आवधिक एसिड-शिफ-दाग में एक समान नहीं थागुर्दाअनुभाग (पूरक चित्रा S1E)। इसलिए, हमने फ़्लोरोक्रोम-युग्मित लेक्टिन के साथ गुर्दे के वर्गों को दाग दिया: मूंगफली एग्लूटीनिन और गेहूं के रोगाणु एग्लूटीनिन, जो ग्लोमेरुली और नलिकाओं को दागते हैं, और ग्रिफ़ोनिया सादगी I फोलिया एग्लूटीनिन, जो रक्त वाहिकाओं को चिह्नित करता है। 30 उल्लेखनीय रूप से, चयनकर्ताओं के संयोजन के साथ, सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात XY विमान और z- अक्ष (सप्लीमेंट्री फिगर S1E और सप्लीमेंट्री मूवी S1) दोनों में महत्वपूर्ण सुधार के साथ, पूरे किडनी वर्गों में नाटकीय रूप से वृद्धि हुई थी।

3डी नेफ्रॉन खंड विज़ुअलाइज़ेशन

पूरे के आकार की कल्पना करने के लिएनेफ्रॉन, हमने उनके पथ का पता लगाया, ग्लोमेरुलस के मूत्र ध्रुव से शुरू होकर सीडी जंक्शन पर समाप्त होता है (पूरक मूवी S2)। इस तथ्य के बावजूद कि विश्व स्तर पर उपयोग किए जाने वाले व्याख्यान सभी नेफ्रोनसेगमेंट को बांधते हैं, हमने देखा कि जब सावधानीपूर्वक निरीक्षण किया गया था, तो चयनकर्ताओं को एक विशिष्ट पैटर्न की विशेषता थी, जिस तरह से उन्होंने विभिन्न नेफ्रोनसेगमेंट में बेसल या ल्यूमिनल झिल्ली को दाग दिया था। दूसरे शब्दों में, हमने विभिन्न नेफ्रॉन खंडों की पहचान करने के लिए लेक्टिन धुंधला के रूढ़िवादी पैटर्न का लाभ उठाया। इस तरह, हम आसानी से 6 संस्थाओं की पहचान कर सकते हैं: समीपस्थ नलिका (पीटी), हेनलेलूप (एचएल) का पतला अंग (टीएल), एचएल का मोटा आरोही अंग (टीएएल), डिस्टल कन्फ्यूज्ड ट्यूब्यूल (डीसीटी), कनेक्टिंग ट्यूबल (सीएनटी), और सीडी। पीटी और टीएल के बीच संक्रमण को विशिष्ट पीटी ब्रश बॉर्डर सिग्नल के अचानक नुकसान और लुमेन की चौड़ाई में कमी की विशेषता थी, जो टीएल (चित्रा 1 ए) में लगभग अनुपस्थित था। इसके विपरीत, टीएल और टीएएल के बीच संक्रमण को बाहरी ट्यूबलर व्यास और अपेक्षाकृत स्थिर लुमेन चौड़ाई (चित्रा 1 बी) में उल्लेखनीय वृद्धि की विशेषता थी। सभी नेफ्रॉन में, टीएएल से डीसीटी का संक्रमण ग्लोमेरुलस के संवहनी ध्रुव पर व्यवस्थित रूप से पाया गया था। इस संक्रमण को बाहरी ट्यूबलर व्यास के अचानक बढ़ने की विशेषता थी जो मुख्य रूप से लुमेन व्यास (चित्रा 1 सी) में उल्लेखनीय वृद्धि के कारण था। डीसीटी और सीएनटी के बीच संक्रमण को ट्यूबलर व्यास और लुमेन (चित्रा 1 डी) दोनों में कमी की विशेषता थी। अंत में, सीएनटी और कॉर्टिकल सीडी के बीच संबंध को ट्यूबलर व्यास और लुमेन (चित्रा 1e) दोनों में अचानक वृद्धि की विशेषता थी। इन रूपात्मक संक्रमणों की मात्रा का ठहराव सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था (चित्र 1f), और इसकी प्रासंगिकता को विशिष्ट ट्यूबलर मार्करों (सप्लीमेंट्री फिगर्स S3-S5 और सप्लीमेंट्री मूवी S3-S5) के साथ धुंधला करके सत्यापित किया गया था।

पीटी का आकार और आकार उनकी गहराई के अनुसार भिन्न होता है

मोटी का धुंधलापनगुर्दाअनुभागों ने हमें संपूर्ण पीटी खंडों के स्थानिक विकास के निर्देशांक का पता लगाने की अनुमति दी। दिलचस्प बात यह है कि हमने पाया कि उनका आकार अत्यंत परिवर्तनशील था और प्रांतस्था में उनके ग्लोमेरुली की स्थिति से निर्धारित होता था। विश्व स्तर पर, हमने 3 पैटर्न की पहचान की। पहला सबसे सतही से मेल खाता हैनेफ्रॉन(एसएन) (चित्रा 2 ए; अनुपूरक मूवी एस 6), जो प्रांतस्था के सबसे बाहरी हिस्से पर कब्जा कर लिया (सबसे बाहरी 30 प्रतिशत रीनलकैप्सूल के करीब)। उनके जटिल भागों ने अपने स्वयं के ग्लोमेरुलस के चारों ओर केवल 6 से 7 कनवल्शन के साथ कॉम्पैक्ट संरचनाएं बनाईं, जो बहुत छोटे और कसकर भरे हुए स्थानों पर कब्जा कर रहे थे। इन एसएन का कनवल्शन लंबे और सीधे पार्स रेक्टा में समाप्त हुआ जो मज्जा में उतर गया। इस स्पेक्ट्रम के विपरीत छोर पर, हमने कॉर्टेक्स के सबसे गहरे हिस्से (40 प्रतिशत अधिक आंतरिक गहराई) में स्थित नेफ्रॉन का दूसरा पैटर्न देखा, जो मज्जा (जुक्सटेमेडुलरी नेफ्रॉन [जेएन]) (चित्रा 2 ए; पूरक चित्रा एस 6 और अनुपूरक मूवी) के बगल में स्थित है। एस6)। उनके पीटी को एक प्रारंभिक शॉर्टलूप की विशेषता थी जो व्यवस्थित रूप से पैपिला की ओर उतरा और फिर यू वृक्क कैप्सूल की ओर चढ़ गया। एसएन के विपरीत, जेएन समीपस्थ घुमावदार नलिकाओं को बड़े कॉइल की विशेषता थी जो अपने स्वयं के ग्लोमेरुलस के आसपास विकसित हुए और जुक्सटेमेडुलरी कॉर्टेक्स में बड़े, शिथिल पैक वाले डोमेन पर कब्जा कर लिया। जेएन के पीटी के जटिल हिस्से में बड़े डोमेन बनाने वाले 10 से 15 संकल्प थे। अंत में, तीसरे पैटर्न में कोर्टेक्स के मध्य भाग में स्थित नेफ्रॉन (मध्य नेफ्रॉन [एमएन]) (चित्र 2a; पूरक मूवी S6) शामिल थे। दिलचस्प बात यह है कि इन नलिकाओं में आकार और स्थानिक अभिविन्यास था जो एसएन और जेएन के बीच एक संक्रमण का प्रतिनिधित्व करता था। वास्तव में, उनमें कॉइल के साथ 8 से 9 कनवल्शन थे जो एसएन से बड़े थे, लेकिन जेएन से छोटे थे। इसके अलावा, एमएन के पास जेएन की तुलना में लंबे समय तक पार्स रेक्टा था। दिलचस्प बात यह है कि पीटी के आकार की वैश्विक तुलना से पता चला है कि एसएन और एमएन में एक सजातीय पैटर्न था जबकि जेएन बेहद विषम थे (पूरक चित्रा एस 6)। इसके अलावा, कई . के स्थानिक पुनर्निर्माणनेफ्रॉन पता चला कि पीटी कभी भी आपस में नहीं मिलते (सप्लीमेंट्रीमूवी S6), यह दर्शाता है कि प्रत्येक नेफ्रॉन प्रांतस्था में अपने स्वयं के व्यक्तिगत स्थान पर कब्जा कर लेता है।

मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण ने एमएन के लिए एक मध्यवर्ती पहलू के साथ एसएन और जेएन के आकार और आकार में बड़े अंतर की पुष्टि की। जेएन का पीटी एसएन के पीटी से 2-गुना लंबा था (चित्र 2बी); हालांकि, जेएन (चित्रा 2 सी) की तुलना में एसएन में सीधापन अधिक था, इस अवलोकन के अनुरूप कि जेएन नलिकाएं बहुत अधिक कष्टप्रद थीं (चित्रा 2 ए; पूरक चित्रा एस 6)।

चित्र 1|नेफ्रॉन खंडों की पहचान करने के लिए उपयोग किए जाने वाले रूपात्मक मानदंड। (ए-ई) नेफ्रॉन अनियंत्रित चूहों के विभिन्न खंडों की आकृति विज्ञान।नेफ्रॉनग्लोमेरुलस के मूत्र ध्रुव से एकत्रित वाहिनी (समीपस्थ नलिका [पीटी]: फ़िरोज़ा; हेनले लूप का पतला अंग [टीएल] तक का पता लगाया गया: हल्का भूरा; हेनले लूप का मोटा आरोही अंग [टीएएल]: गहरा भूरा; बाहर का घुमावदार नलिका [डीसीटी]: गुलाबी; कनेक्टिंगट्यूब्यूल [सीएनटी]: पीला; कॉर्टिकल कलेक्टिंग डक्ट [सीसीडी]: नारंगी)। तीर विभिन्न नेफ्रॉन खंडों के व्यास को इंगित करते हैं। (जारी)

चित्र 1|(जारी) (च) विभिन्न नेफ्रॉन खंडों के बाहरी ट्यूबलर व्यास का परिमाणीकरण। डेटा को माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है±SEM. तुकी-क्रेमर परीक्षण के बाद विचरण का विश्लेषण: **P < 0.01, ***P <0.001।

चित्र 2 |तीन आयामी(3डी) समीपस्थ नलिका पुनर्निर्माण से 3 विभिन्न आकृतियों और संगठनों का पता चलता है। (ए) पूरे रीनल कॉर्टेक्स के माध्यम से समीपस्थ नलिकाओं की प्रतिनिधि 3डी-पुनर्निर्माण छवियां, समीपस्थ नलिकाओं (पीटी) के आकार के अनुसार 3 स्तरों (सफेद रेखाओं) में विभाजित होती हैं: सतही (नीला), मध्य (हरा), और जुक्सटेमेडुलरी (लाल) प्रांतस्था, क्रमशः बाहरी 30 प्रतिशत, मध्य 30 प्रतिशत, और आंतरिक 40 प्रतिशत प्रांतस्था के अनुरूप। 3 प्रकार के विभिन्न आकृतियों पर ध्यान देंनेफ्रॉनऔर विशेष रूप से जुक्सटेमेडुलरी नलिकाओं की लंबाई और यातना। बार{0}} मिमी। (बी, सी) (बी) लंबाई की मात्रा और (सी) समीपस्थ नलिकाओं के 3 प्रकार के सीधेपन। (डी) प्रत्येक प्रांतस्था क्षेत्र से ग्लोमेरुली की मात्रा की मात्रा। डेटा को माध्य SEM के रूप में व्यक्त किया जाता है। तुकी-क्रेमर परीक्षण के बाद विचरण का विश्लेषण: जुक्सटेमेडुलरी पीटी बनाम सतही पीटी: ### पी < 0।="" 001;="" juxtamedullary="" पीटी="" बनाम="" मध्य="" पीटी:="" ***पी=""><0.001; सतही="" पीटी="" बनाम="" मध्य="" पीटी:="" $$$="" पी=""><>

चित्र 3 |तीन आयामी(3डी) नेफ्रॉन के पुनर्निर्माण से 3 अलग-अलग प्रकार के नेफ्रॉन का पता चलता है। (ए) नियंत्रण चूहों में सतही प्रांतस्था (नीला), मध्य प्रांतस्था (हरा), और juxtamedullary क्षेत्र (लाल) में नलिका एकत्र करने के लिए ग्लोमेरुली से पूरे नेफ्रॉन (बाएं पैनल) की प्रतिनिधि 3डी छवियां। 3 विभिन्न प्रकार के नेफ्रॉन के लिए नेफ्रॉन विभाजन (दाएं पैनल)। बार=150 मिमी। (बी) 3 प्रकार के नेफ्रॉन के लिए हेनले लूप के 2 अंगों के बीच की आंतरिक दूरी की मात्रा। (सी) (जारी) के लिए नेफ्रॉन लंबाई की मात्रा का ठहराव

चित्र 3|(जारी) 3 प्रकार केनेफ्रॉन. (डी) नेफ्रॉन के प्रकार के अनुसार नेफ्रॉन के विभिन्न खंडों की लंबाई का परिमाणीकरण। डेटा को माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है±एसईएम। टकी-क्रेमर परीक्षण के बाद विचरण का विश्लेषण: जुक्सटेमेडुलरी नेफ्रॉन (जेएन) बनाम सतही नेफ्रॉन (एसएन): ###P < 0।001;="" जेएन="" बनाम="" मध्य="" नेफ्रॉन="" (एमएन):="" *पी="">< 0.05,="" **पी=""><0.01, ***पी=""><0.001। सीएनटी,="" कनेक्टिंग="" ट्यूबल;="" डीसीटी,="" डिस्टलकन्व्यूटेड="" ट्यूब्यूल;="" पीटी,="" समीपस्थ="" नलिका;="" टीएएल,="" हेनले="" लूप="" का="" मोटा="" आरोही="" अंग;="" टीएल,="" हेनले="" लूप="" का="" पतला="">

ग्लोमेरुलर आकार गहराई के साथ बदलता रहता है

फिर हमने 3 क्षेत्रों में से प्रत्येक से यादृच्छिक रूप से चयनित ग्लोमेरुली की गहराई और व्यास का विश्लेषण किया। मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण से पता चला कि ग्लोमेरुली क्रमशः जेएन और एसएन में वृक्क कैप्सूल से औसतन 783 और 355 मिमी स्थित थे। जैसा कि पहले बताया गया था, हमने देखा कि ग्लोमेरुली का आकार उनकी गहराई के अनुसार भिन्न होता है। विशेष रूप से, जेएन का ग्लोमेरुलर आयतन एसएन और एमएन (चित्रा 2डी) की तुलना में 3 गुना अधिक था।

3डी नेफ्रॉन पुनर्निर्माण

हमने तब संपूर्ण के स्थानिक विकास का पता लगायानेफ्रॉनपीटी से सीएनटी तक। उनके 3D का वैश्विक दृष्टिकोण (तीन आयामी) पुनर्निर्माण ने पुष्टि की कि नेफ्रॉन का आकार एसएन, एमएन और जेएन (चित्रा 3 ए; अनुपूरक मूवी एस 7) के बीच भिन्न था। यह अंतर मुख्य रूप से पीटी की संरचना के कारण था। इसके अलावा, हमने देखा कि HL का एक अलग 3D स्थानिक संगठन था। विशेष रूप से, टीएल और टीएएल एसएन और एमएन (चित्रा 3 बी) में जेएनस्थान में अधिक दूर से अलग हो गए थे। मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषणों से पता चला है कि जेएन विश्व स्तर पर 2-एसएन (चित्रा 3सी) की तुलना में अधिक लंबे थे। बढ़ी हुई लंबाई को टीएएल और डीसीटी को छोड़कर, सभी खंडों में आनुपातिक रूप से वितरित किया गया था, जो सभी नेफ्रॉन प्रकारों (चित्रा 3 डी) में समान पूर्ण लंबाई वाले थे। इसने सुझाव दिया कि नेफ्रॉन बढ़ाव आश्चर्यजनक रूप से समरूप रूप से प्रतिरूपित प्रक्रिया है।

आर्कुएट वेसल्स जूसटैमेडुलरी पीटी कनवल्शन को प्रभावित करते हैं

का अधिक व्यापक परिप्रेक्ष्य प्राप्त करने के लिएगुर्दासंरचना, हमने ग्रिफ़ोनिया सिंपिसिफोलियाएग्लगुटिनिन धुंधला का लाभ उठाया, जिसने हमें आर्कुएटवेसल्स और उनकी शाखाओं को कॉर्टिकल विकिरण वाहिकाओं (चित्रा 4 ए; पूरक मूवी एस 8) में ट्रेस करने की अनुमति दी। दिलचस्प बात यह है कि सहवर्ती 3डी (तीन आयामी) नेफ्रॉन और वाहिकाओं के पुनर्निर्माण से पता चला है कि चापाकार वाहिकाएं आस-पास के नलिकाओं के साथ एक आश्चर्यजनक समानांतर स्थानिक संगठन में होती हैं। विशेष रूप से, हमने देखा कि विशिष्ट जेएन (विवश जेएन) द्वारा अनुसरण किया जाने वाला मार्ग पास के पोत (चित्रा 4 बी; अनुपूरक मूवी एस 9) के मार्ग का अनुसरण करता है। उल्लेखनीय रूप से, यह पूर्वाग्रह (केवल JN . के सबसेट में देखा गया है)नेफ्रॉन) पीटी (सप्लीमेंट्रीफिगर S6) के आकार में बड़ी विविधता के लिए जिम्मेदार है। मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषणों से पता चला है कि "विवश" पीटी "गैर-विवश" वाले (चित्रा 4 सी और डी) की तुलना में काफी लंबे और अधिक यातनापूर्ण (कम सीधे) थे। यह ध्यान देने योग्य है कि एसएन और एमएन दोनों के जटिल हिस्से आर्कुएट वेसल्स के ऊपर स्थित थे और विवश नहीं थे।

सिस्टांचे-क्रोनिक किडनी डिजीज

नलिकाएं विमानों में झूठ बोलती हैं

दिलचस्प बात यह है कि 3डी (तीन आयामी) के आकारनेफ्रॉनसंकेत दिया कि वे विमानों में झूठ बोलते हैं (चित्र 5a; पूरक मूवीS1 0)। इस पैरामीटर की मात्रा निर्धारित करने के लिए और इस रचना के संभावित सांख्यिकीय पूर्वाग्रह का आकलन करने के लिए, हमने नलिकाओं की सामान्य प्रवृत्ति को उनके लूप द्वारा परिभाषित विमान से बाहर मोड़ने के लिए मापा। हमारे मापों से पता चला है कि लगातार मापा कोणों के एक ही सेट और लगातार बिंदुओं (चित्रा 5 बी) के बीच लंबाई के साथ उत्पन्न यादृच्छिक चलने के एक नकली मॉडल की तुलना में, नलिकाएं एक विमान (चित्रा 5 सी) से एक छोटे विचलन के साथ विकसित होती हैं। इससे संकेत मिलता है कि नलिकाएं एक विमान के साथ अपने पथ को प्रतिबंधित करती हैं। देखे गए अंतर अत्यधिक सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण थे (पी <>

3डी नेफ्रॉन पुनर्निर्माण से पुटी विकास के लिए एक विशिष्ट पैटर्न का पता चलता है

यह निर्धारित करने के लिए कि क्या हमारा प्रोटोकॉल अव्यवस्थित पैथोलॉजिकल ऊतकों में नेफ्रॉन का पता लगाने की अनुमति देता है, हमने जैक चूहों में सिस्ट के आकार और स्थानिक वितरण की विशेषता बताई, जो एनपीएचपी और सिस्टिक रोग का एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला मॉडल है। 31-33 3डी छवियों ने दिखाया कि इसके बावजूद प्रमुख सिस्ट की उपस्थिति, सामान्य 3डी (तीन आयामी) नेफ्रॉन का पाठ्यक्रम नियंत्रण चूहों (सप्लीमेंट्री मूवी S11) से महत्वपूर्ण रूप से भिन्न नहीं था। इसी तरह, मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषणों ने पुष्टि की कि की वैश्विक लंबाईनेफ्रॉन, ग्लोमेरुलर आयतन, और प्रत्येकनेफ्रॉन खंड की लंबाई नियंत्रण चूहों (पूरक चित्रा S7) के साथ तुलनीय थी। ध्यान दें, पुटी के विकास के कारण, हम एचएल में टीएल से टीएल को अलग करने में असमर्थ थे। सभी नेफ्रॉन ने फ्यूसीफॉर्म सिस्ट (सप्लीमेंट्रीमूवीज एस 11 और एस 12) विकसित किए। सबसे महत्वपूर्ण विशेषताओं में से एक यह अवलोकन था कि एक ही नेफ्रॉन खंड (सप्लीमेंट्री मूवीज़ S12 और S13) के साथ कई स्थानों पर फ्यूसीफॉर्म सिस्टिक फैलाव हुआ। आश्चर्यजनक रूप से, हमने देखा कि पीटी और एचएल अवरोही अंगों (चित्रा 6 ए; अनुपूरक मूवी एस 12) में अल्सर कभी विकसित नहीं हुए। इसके विपरीत, वे मुख्य रूप से एचएल आरोही अंग, डीसीटी, सीएनटी, और सीडी के ऊपरी भाग में सीएनटी (चित्रा 6 ए; पूरक मूवी एस 12) के साथ निरंतरता में पाए गए थे। विशेष रूप से, हमने देखा कि डीसीटी, साथ ही सीएनटी खंडों में, उनके संबंधित अधिक दूरस्थ भागों (चित्रा 6 बी) में सिस्ट विकसित होने की एक अजीबोगरीब संभावना थी। 3डी पुनर्निर्माण छवियों के मात्रात्मक रूपमितीय विश्लेषण से पता चला है कि प्रति नेफ्रॉन में पुटी की कुल मात्रा विशेष रूप से सीएनटी (चित्रा 7 ए) में उच्च थी। इसके अलावा, हमने देखा कि एचएल और डीसीटी में सिस्ट इज़ाफ़ा एसएन और एमएन (चित्रा 7 ए; अनुपूरक मूवी एस 12) की तुलना में जेएन में अधिक थे। इसके अलावा, अन्य प्रकार की तुलना में जेएन में पुटी की घटना काफी अधिक थीनेफ्रॉन(चित्र 7ख)। हमने यह भी देखा कि औसत ग्लोमेरुलर अंतर दूरी (निकटतम 5 ग्लोमेरुली पर गणना) विशेष रूप से अधिक सतही प्रांतस्था (सप्लीमेंट्री फिगर S8) में विशेष रूप से बढ़े हुए इंसिस्टिक चूहों की प्रवृत्ति है।

चित्र 4|वेसल्स नेफ्रॉन के आकार को निर्धारित करते हैं। (एक)तीन आयामीचापाकार वाहिकाओं से कॉर्टिकल विकीर्ण वाहिकाओं तक पोत वास्तुकला का पुनर्निर्माण। बार 200 मिमी। (बी) "गैर-प्रतिबंधित" (ऊपरी पैनल) और "विवश" (निचला पैनल) के प्रतिनिधि चित्र जक्सटेमेडुलरी समीपस्थ नलिकाएं। बार 100 मिमी। (सी, डी) (सी) लंबाई की मात्रा और (डी) "गैर-विवश" और "बाधित" जुक्समेडुलरी समीपस्थ नलिकाओं की सीधीता। डेटा को माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है±एसईएम। मान-व्हिटनी परीक्षण: "विवश" बनाम "अप्रतिबंधित":*P < 0.05,="" ***p=""><>

3D (तीन आयामी) कई अल्सर के पुनर्निर्माण से पता चला कि वे आकार और आयतन में अत्यंत परिवर्तनशील थे (चित्र 6c; पूरक फिल्में S11 और S13)। एचएल आरोही अंग में, अल्सर का एक छोटे व्यास के साथ एक फ्यूसीफॉर्म आकार होता था। डीसीटी में, सिस्ट का आकार गोलाकार और बड़ा होता था और वे नॉनडिलेटेटेड नलिकाओं के बीच में होते थे। दिलचस्प बात यह है कि डीसीटी और सीएनटी के बीच संक्रमण को व्यवस्थित रूप से एक सामान्य गैर-विस्तारित संरचना की विशेषता थी। इसके विपरीत, सीएनटी में, हमने व्यवस्थित रूप से सीडी के संपर्क में एक सन्निहित पतला सिस्टिक संरचना का अवलोकन किया। दिलचस्प बात यह है कि सीडी में, यह संरचना उत्तरोत्तर एक सामान्य नलिका के आकार में सिकुड़ जाती है। मोटे तौर पर, सीडी के सन्निहित हिस्से में आगे के सिस्ट का पता नहीं लगाया जा सका। एक और सुसंगत विशेषता एचएल आरोही अंग में अल्सर का अजीबोगरीब स्थानिक संगठन था। वास्तव में, हालांकि सिस्ट एसएन में अधिक गहरे और लूप के करीब थे, वे जेएन (चित्रा 6 सी) में अधिक सतही और डीसीटी के करीब थे। फिर से, अल्सर ने एमएन (चित्रा 6 सी) में एक मध्यवर्ती स्थिति पर कब्जा कर लिया।

चित्र 5|नेफ्रॉन नलिकाएं एक सपाट संरचना के रूप में विकसित होती हैं। (ए) नेफ्रॉन समीपस्थ नलिका का एक विशिष्ट पथ। यह पथ एक समतल में लेटने की उसकी प्रवृत्ति को दर्शाता है। पथ के विकास की योजना को बेहतर ढंग से देखा जा सकता है जब ठीक से घुमाया जाता है और पर्यवेक्षक के दृष्टिकोण के साथ गठबंधन किया जाता है (उसी ट्यूबलर खंड के दाहिने हाथ का प्रतिनिधित्व देखें, जो बाईं ओर, एक अलग कोण पर दर्शाया जाता है) . (बी) 4 खंडों से बना एक ट्यूबलर पथ का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व (उदाहरण के रूप में दिखाए गए ट्यूबलर पथ को परिभाषित करने वाले 5 बिंदुओं के बीच)। जिस डिग्री तक पथ "उनके विमान से बाहर" जाते हैं, उन्हें यहां "बीटा" के रूप में इंगित कोण द्वारा दर्शाया जा सकता है। (जारी)

चित्र 5|(जारी) इस कोण को समतल के सापेक्ष खंड p3-p4 के बीच मापा जाता है (तुरंत पूर्ववर्ती बिंदुओं p3, p2, और p1 द्वारा परिभाषित) और योजना में एक गहरे भूरे रंग के आयत द्वारा दर्शाया गया है। बीटा कोणों की गणना तब एक ट्यूबलर पथ में बिंदुओं के सेट के साथ-साथ पुनरावर्ती रूप से गणना की गई थी। इन बीटा कोणों के पूर्वाग्रह की सीमा का मूल्यांकन करने के लिए, हमने प्रत्येक ट्यूबलर पथ के लगातार अल्फा कोणों के एक ही सेट (सभी लगातार खंडों के बीच मापा) का उपयोग करके एक यादृच्छिक चलने (मोंटे कार्लोसिम्यूलेशन [एमसी]) का अनुकरण किया। इस यादृच्छिक चलने ने अल्फा कोणों और यादृच्छिक बीटा कोणों के समान सेट के साथ एक पथ उत्पन्न किया। (सी) बीटा कोणों के वैश्विक वितरण के वायलिन प्लॉट और समीपस्थ नलिका (पीटी) में एमसी के परिणाम, हेनले लूप के पतले अंग (टीएल), हेनले लूप के मोटे आरोही अंग (टीएएल), डिस्टल कन्फ्यूज्ड ट्यूब्यूल (डीसीटी) ), और संयोजी नलिका (CNT)। एमसी, पी <>

बहस

पारंपरिक हिस्टोलॉजिकल तरीके के वैश्विक आकार को प्रभावित करने वाले पैथोलॉजिकल परिवर्तनों का पता लगाने की उनकी क्षमता में सीमित हैंनेफ्रॉन. यहां, हम ऊतक समाशोधन पर आधारित एक शक्तिशाली दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं जिसमें महत्वपूर्ण प्रश्नों को संबोधित करने की क्षमता हैगुर्दासामान्य और रोग स्थितियों के तहत अभूतपूर्व स्थानिक विवरण के साथ वास्तुकला। हमारे परिणामों ने 3 प्रकार के नेफ्रॉन के अस्तित्व की पुष्टि की, जो उनकी कार्यात्मक विशिष्टताओं के अनुरूप उनके स्थान, आकार और आकार में भिन्न होते हैं। इसके अलावा, हमने यह प्रदर्शित किया कि नेफ्रोनस्टेंड विमानों में लेटने और पोत के स्थानिक संगठन के अनुकूल होने के लिए है। दिलचस्प बात यह है कि जब हमने इस तकनीक को सिस्टिक किडनी रोग के मॉडल पर लागू किया, तो हमने देखा कि सिस्ट सभी नेफ्रॉन में विकसित होते हैं, लेकिन केवल विशिष्ट खंडों में। दिलचस्प बात यह है कि हमने दिखाया कि पुटी का आकार नेफ्रोनसेगमेंट के अनुसार बदलता रहता है और उसी नेफ्रॉन के साथ, सिस्ट सामान्य नॉनडिलेटेड नलिकाओं के साथ जुड़ते हैं। कुल मिलाकर, ये परिणाम पहले 3D . प्रदान करते हैं (तीन आयामी) की स्थानिक व्यवस्था का लक्षण वर्णननेफ्रॉनऔर वाहिकाओं और महत्वपूर्ण रूप से एक रोग प्रक्रिया को समझने के लिए आधार प्रदान करते हैं, जैसे कि सिस्टोजेनेसिस।

ऑटोफ्लोरेसेंस और सेल घनत्व के उच्च स्तर के कारण किडनी ऑप्टिकल क्लियरिंग चुनौतीपूर्ण है। विभिन्न समाशोधन प्रोटोकॉल की तुलना करके, हमने BABB में सबसे गहरे हिस्से में स्थित संरचनाओं के विज़ुअलाइज़ेशन और पुनर्निर्माण को लागू करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक की पहचान की।गुर्दा, यानी मज्जा। इसके अलावा, BABB तेजी से और स्केलेबल है और, एक बार साफ हो जाने पर, नमूने छवि अधिग्रहण से पहले महीनों तक संग्रहीत किए जा सकते हैं। इस तकनीक का एक अन्य मुख्य लाभ इसकी कम लागत है। समाशोधन एजेंटों के परिणामस्वरूप संरचनाओं का सिकुड़ना या विस्तार हो सकता है। 9–17 हालांकि, गुर्दे के आकार के ये संशोधन आइसोट्रोपिक हैं, इसलिए सापेक्ष माप प्रभावित होने या उनकी व्याख्या को पूर्वाग्रहित करने की उम्मीद नहीं है। सबसे महत्वपूर्ण सीमाओं में से एक संरचना की व्याख्या है जो अत्यधिक समय लेने वाली है। फिर भी, गहन शिक्षण पर आधारित तकनीकों की संख्या बढ़ रही है जो इस सीमा को तेजी से पार कर सकती हैं।

शास्त्रीय तकनीकों द्वारा प्राप्त परिणामों के अनुरूप, हमारे अध्ययन से पता चला है कि नेफ्रॉन अपनी स्थिति के अनुसार आकार और लंबाई में भिन्न होते हैं। विशेष रूप से, हमने देखा कि जेएन में अधिक विकसित जटिल पीटी और बड़े ग्लोमेरुली हैं और एसएन की तुलना में 2 गुना अधिक हैं। बढ़ी हुई लंबाई एक सामंजस्यपूर्ण प्रक्रिया का परिणाम है क्योंकि लंबा होना नेफ्रॉन के सभी खंडों को आनुपातिक रूप से प्रभावित करता है। हमने यह भी देखा कि जेएन का एचएल बड़ा है। कुल मिलाकर, ये डेटा स्पष्ट रूप से दिखाते हैं कि एसएन और जेएन की माइक्रोएनाटॉमी काफी भिन्न है और एमएन मध्यवर्ती विशेषताएं प्रदर्शित करते हैं। दिलचस्प है, शारीरिक अध्ययनों से पता चला है किनेफ्रॉनकार्यात्मक रूप से भी भिन्न हैं। 2 इन अंतरों को रेखांकित करने वाली मॉर्फोजेनेटिक घटनाएं अभी तक ज्ञात नहीं हैं। इस प्रकार यह अनुमान लगाना आकर्षक है कि जेएन की विशेष संरचना उनके कार्यों की विशिष्टता के लिए जिम्मेदार हो सकती है।

दिलचस्प है, पहली बार 3D . प्रदान करके (तीन आयामी) का पुनर्निर्माणनेफ्रॉनऔर उनके आस-पास के जहाजों ने, हमने आर्कुएट जहाजों और नेफ्रॉन के उपसमूह के बीच एक स्थानिक बाधा की खोज की। इस प्रकार, यह सोचना संभव है कि विकास के दौरान नेफ्रॉन को लंबा करने के तरीके को जहाज निर्देशित कर सकते हैं। 34,35 कम्प्यूटेशनल सिमुलेशन के साथ संयुक्त नेफ्रॉन के 3 डी आकार के निरीक्षण से यह भी पता चला है कि नेफ्रॉन कभी आपस में नहीं मिलते हैं और प्रत्येक नेफ्रॉन एक विमान में झूठ बोलते हैं। इस अवलोकन के कार्यात्मक महत्व को स्पष्ट किया जाना बाकी है।

पॉलीसिस्टिक के दौरान पुटी का विकासगुर्दारोग अभी भी एक पेचीदा प्रक्रिया है। एनपीएचपी, सिस्ट के विकास की विशेषता वाली एक रोग संबंधी स्थिति, बच्चों और किशोरों में सबसे आम आनुवंशिक रोग है, जिसके कारण अंतिम चरण में गुर्दे की बीमारी होती है। अब तक बीस एनपीएचपी जीनों की पहचान की जा चुकी है। उनमें से, एनईके8 नेवर इनमिटोसिस ए-संबंधित किनेज परिवार के एक सदस्य को एनकोड करता है, जो सिलिया फंक्शन और सेल चक्र प्रगति में एक भूमिका निभाता है। 37 नेक 8 को मूल रूप से जेके चूहों में उत्परिवर्तित जीन के रूप में चित्रित किया गया था। 32 विशेष रूप से, एक ही प्रोटीन डोमेन में उत्परिवर्तन को मनुष्यों में एनपीएचपी9 की ओर ले जाने के लिए दिखाया गया है। 38 2डी अध्ययनों ने सुझाव दिया है कि सिस्ट विकास पॉलीसिस्टिक किडनी रोग के विभिन्न रूपों में नाटकीय रूप से भिन्न होता है। विशेष रूप से, एनपीएचपी में, सिस्टस व्युत्पन्न प्रतीत होता है। विशेष रूप से सीडी और डीसीटी से।31 हालांकि सूचनात्मक, ये इम्यूनोहिस्टोकेमिकल अध्ययन इस संभावना के खिलाफ बहस नहीं कर सकते हैं कि विशिष्ट ट्यूबलर मार्करों का नुकसान इस अवलोकन के लिए कृत्रिम रूप से खाता है। इस प्रकार, हमारा3डी (तीन आयामी) अध्ययन पहला स्पष्ट प्रमाण प्रदान करता है कि पुटी विकास एक ऐसी प्रक्रिया है जिसमें केवल विशिष्ट नेफ्रोनसेगमेंट शामिल हो सकते हैं। दिलचस्प बात यह है कि हालांकि NIMA (नेवर इन माइटोसिसजीन ए) -रिलेटेड किनसे 8 (NEK8) को सभी नेफ्रॉन सेगमेंट के साइटोप्लाज्म में व्यक्त किया जाता है, सिलिया में इसकी अभिव्यक्ति डीसीटी और सीडी तक सीमित है। क्योंकि केवल इन खंडों में सिस्ट विकसित होने की संभावना होती है, 31 हम यह मान सकते हैं कि NEK8 सिलिअरी फ़ंक्शन का विघटन पुटी के गठन के लिए महत्वपूर्ण घटना है। दिलचस्प बात यह है कि हमने यह भी देखा है कि फ्यूसीफॉर्म सिस्ट सामान्य नॉनडिलेटेड नलिकाओं के साथ निरंतरता में होते हैं। तथ्य यह है कि एक पुनरावर्ती रोगाणु उत्परिवर्तन केवल कोशिकाओं के एक सबसेट में एक पैथोलॉजिकल फेनोटाइप की ओर जाता है, यह बताता है कि एक दूसरी घटना इन कोशिकाओं में पुटी के विकास को ट्रिगर कर सकती है, जैसा कि ऑटोसोमल प्रमुख पॉलीसिस्टिक के लिए सुझाव दिया गया है।गुर्दारोग.40,41

चित्र 6 |तीन आयामी(3डी) नेफ्रॉन पुनर्निर्माण से पता चलता है कि सिस्ट केवल विशिष्ट नेफ्रॉन खंडों में विकसित होते हैं। (ए) ग्लोमेरुली से पूरे नेफ्रॉन (बाएं पैनल) के सिस्ट वॉल्यूम रेंडरिंग के साथ प्रतिनिधि 3 डी छवियां, जैक चूहों में सुपरफिशियलकोर्टेक्स (नीला), मध्य प्रांतस्था (हरा), और जुक्सटेमेडुलरी क्षेत्र (लाल) में डक्ट इकट्ठा करने के लिए। 3 अलग-अलग प्रकारों के लिए नेफ्रॉन विभाजन (दायां पैनल)नेफ्रॉन. बार=150 मिमी. (बी) जैक चूहों में विभिन्न नेफ्रॉन खंडों में सिस्ट विकसित होने की संभावना। (जारी)

चित्र 6|(जारी) क्षैतिज अक्ष 50 डिब्बे (समीपस्थ नलिका [पीटी], फ़िरोज़ा; हेनलेलूप [एचएल], सफ़ेद; डिस्टल कनवल्यूटेड ट्यूब्यूल [डीसीटी], गुलाबी; कनेक्टिंग ट्यूब्यूल [सीएनटी], पीला) के अनुरूप नेफ्रॉन की एक सामान्यीकृत लंबाई है। (सी) सतही (ऊपरी पैनल), मध्य (मध्य पैनल) में एचएल (बाएं पैनल), डीसीटी (मध्य पैनल), और सीएनटी और कॉर्टिकल एकत्रित नलिकाओं (सीसीडी) (दाएं पैनल) के आरोही अंग के सिस्ट वॉल्यूम प्रतिपादन के साथ प्रतिनिधि 3 डी सिस्ट पुनर्निर्माण छवियां पैनल), और जैक चूहों में juxtamedullary (निचले पैनल) नेफ्रॉन। बार= 50 मिमी।

चित्र 7|नेफ्रॉन भर में पुटी वितरण और मात्रा की विशेषता। (ए) प्रत्येक नेफ्रॉन खंड (हेनले लूप [एचएल], सफेद; डिस्टल कनवॉल्यूटेड ट्यूब्यूल [डीसीटी], गुलाबी; कनेक्टिंग ट्यूब्यूल [सीएनटी], पीला) और (बी) के लिए कुल सिस्ट वॉल्यूम (नेफ्रॉन प्रति सिस्ट का योग) की मात्रा। जैकमिस में प्रत्येक प्रकार के नेफ्रॉन (सतही: नीला; मध्य: हरा; जुक्सटेमेडुलरी: लाल) के लिए सिस्ट द्वारा कब्जा कर लिया गया ट्यूबल की लंबाई। डेटा को माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है±एसईएम। टकी-क्रेमर परीक्षण के बाद विचरण का विश्लेषण: जुक्सटेमेडुलरी नेफ्रॉन [जेएन] बनाम सतही नेफ्रॉन [एसएन]: #P < 0।05;="" जेएन="" बनाम="" मध्य="" नेफ्रॉन="" [एमएन]:="" *पी="">< 0.05,="" **पी=""><>

हमने यह भी देखा कि एसएन की तुलना में जेएन में सिस्ट इज़ाफ़ा अधिक प्रमुख है, कम से कम पीटी और सीएनटी के बीच स्थित सिस्ट को देखते हुए। लगातार, यह बताया गया है कि ग्लोमेरुलोस्केलेरोसिस के संदर्भ में, ग्लोमेरुलर घाव जेएन में एसएन की तुलना में अधिक बार पाए जाते हैं। 1,21,42 क्या एकल नेफ्रॉन ग्लोमेरुलर निस्पंदन दर और परिवहन / एंजाइमेटिक गतिविधियों में वृद्धि के कारण अधिक काम जेएन की संवेदनशीलता में वृद्धि के लिए जिम्मेदार है। बिगड़ना एक दिलचस्प परिकल्पना है जो आगे की जांच के योग्य है।

संक्षेप में, हम छवि के लिए एक नई तकनीक का वर्णन करते हैंगुर्दे3डी . में (तीन आयामी) विशेष रूप से लेबल की गई आंतरिक संरचनाओं के स्थानिक और मात्रात्मक वितरण को सीधे रिकॉर्ड करने के लिए पर्याप्त आणविक विशिष्टता और संकल्प के साथ (नेफ्रॉन, वाहिकाओं, और अल्सर)। प्रत्यक्ष परिमाणीकरण की सुविधा, गति और क्षमता को देखते हुए, हम अनुमान लगाते हैं कि यह तकनीक किडनी रोगविज्ञान को समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन जाएगी।

विधि

जानवरों

सभी पशु प्रक्रियाओं को "सर्विसेज वेटेरिनारेसडे ला प्रीफेक्चर डी पुलिस डे पेरिस" और यूनिवर्सिटी पेरिस डेसकार्टेस की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। दो महीने पुराने FVB/N चूहों (n=20) का उपयोग के लिए प्रायोगिक स्थिति को स्थापित करने के लिए किया गया थागुर्दासमाशोधन। अध्ययन तब 2-सप्ताह के पुराने जैक नर चूहों (n=4) और नियंत्रण लिटरमेट्स (n=3) में किया गया था।

गुर्दे के ऊतकों की तैयारी

मारने से पहले, चूहों को इंट्राकार्डियक कैथीटेराइजेशन के माध्यम से, 25 मिलीलीटर हेपरिनिज्ड खारा (1000 आईयू / एल) के साथ फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड के 75 मिलीलीटर के साथ सुगंधित किया गया था। प्रयोग xylazine (Rompun 2 प्रतिशत, बायर, लीवरकुसेन, जर्मनी, शरीर के वजन का 6 mg/g) और ketamine (Clorketam 1000, Vetoquinol SA, Lure, France, 120 mg/g of body weight) संज्ञाहरण के तहत किए गए।

पढ़ाई क्लियर करने के लिए,गुर्दे4 घंटे के लिए 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड में तय किया गया था और 4 प्रतिशत agarose में एम्बेडेड था और 1. 5- वृक्क हिलम के आसपास के मिमी-मोटी वर्गों को पीबीएस में 4 घंटे में काटा और संग्रहीत किया गया था।डिग्री. गुर्दे के वर्गों को पहले दाग दिया गया और फिर साफ किया गया।

पतले वर्गों पर इम्यूनोहिस्टोकेमिकल अध्ययन के लिए, गुर्दे को रातोंरात 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड में तय किया गया था और पैराफिन-एम्बेडेड और 4- मिमी वर्गों को काट दिया गया था।

धुंधला हो जाना

आवधिक एसिड-शिफ धुंधला हो जाना। 1.5-मिमीगुर्दावर्गों को शुद्ध या 1:100 पीबीएस-पतला आवधिक एसिड-शिफ में समाशोधन से पहले कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया था।

पतली पैराफिन-एम्बेडेड वर्गों पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री। पैराफिन-एम्बेडेड किडनी के चार-माइक्रोमीटर वर्गों को एंटीजन पुनर्प्राप्ति के लिए गर्म किया गया और 4 बजे रात भर इनक्यूबेट किया गया।4 डिग्रीफ्लुफ्लोरोक्रोम-युग्मित लेक्टिन के साथ नलिकाओं का पता लगाने के लिए (रोडामाइन मूंगफली एग्लूटीनिन [आरएल -1072-5] और रोडामाइन गेहूं रोगाणु एग्लूटीनिन [आरएल -1022-5], वेक्टर लेबोरेटरीज, बर्लिंगम, सीए, 1:200 पर पतला) और खंड- विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी विशिष्ट ट्यूबलर खंडों को चित्रित करने के लिए (बायोटिनाइलेटेड लोटस टेट्रागोनोलोबस लेक्टिन [बी -1325], वेक्टर प्रयोगशालाएं, 1: 100 पर पतला; माउस एंटी-कैलबिंडिन डी 28 के [डी -4], सांता क्रूज़, हीडलबर्ग, जर्मनी, 1:200 पर पतला; बकरी विरोधी AQP2 [C-17], सांता क्रूज़, 1:200 पर पतला)। अगले दिन, वर्गों को कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ जोड़ा गया (एलेक्सा फ्लोर 488 संयुग्म [एस 32354], इंविट्रोजन; बकरी विरोधी एलेक्सा फ्लोर 488 [ए -11055], इंविट्रोजन; माउस विरोधी एलेक्साफ्लूर 488 [ए-21202], इंविट्रोजन, कार्ल्सबैड, सीए; सभी 1:500 पर पतला) 40, 6-डायमिडीनो-2-फेनिलइंडोल के साथ रंगीन होने से पहले। सभी छवियों को निकॉन एक्लिप्स E800 माइक्रोस्कोप (चैंपिग्नेसुर मार्ने, फ्रांस) के साथ हासिल किया गया था और फिजी सॉफ्टवेयर (संस्करण 1.50) का उपयोग करके तैयार किया गया था। मोटे वर्गों पर लेक्टिन धुंधला हो जाना। 1.5-मिमी-मोटीगुर्दावर्गों को 4 . पर ऊष्मायन किया गया था4 डिग्रीटेक्सास रेड या फ्लुफ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट युग्मित लेक्टिन में 1 महीने के लिए: मूंगफली एग्लूटीनिन (आरएल-1072-5) और गेहूं रोगाणु एग्लूटीनिन (आरएल-1022-5), 1:100 पर पतला 0.1 प्रतिशत पीबीएस एज़ाइड और 0.1 प्रतिशत ट्राइटन-एक्स में। समाशोधन से पहले पीबीएस के साथ 2 सप्ताह के लिए हर दिन वर्गों को धोया जाता था।

सिस्टैंच-किडनी फंक्शन

ऑप्टिकल समाशोधन

स्केल समाशोधन के लिए, 1.5-मिमीगुर्दास्केलए2 (4 एम यूरिया, 0.1 प्रतिशत ट्राइटन एक्स-100, 10 प्रतिशत ग्लिसरॉल) या स्केलबी4 (8 मुरिया, 0.1 प्रतिशत ट्राइटन एक्स-100 में वर्गों को इनक्यूबेट किया गया था। ) 2 सप्ताह के लिए, 1 वर्ष तक, 4डिग्री.

BABB समाशोधन के लिए, 1.5-mm गुर्दा वर्गों को कमरे के तापमान पर इथेनॉल के अनुक्रमिक रिन्स में निर्जलित किया गया था। नमूनों को तब BABB (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, MO) में 1: 2 के अनुपात में कम से कम 2 दिनों के लिए 4 डिग्री पर ऊष्मायन किया गया था।

दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी छवि अधिग्रहण

माई ताई एचपी टाइटेनियम-नीलम लेजर (स्पेक्ट्रा-भौतिकी, सांता क्लारा, सीए) (सप्लीमेंट्रीफिगर S1A) से लैस एक उल्टे मल्टीफोटोनमाइक्रोस्कोप (LaVision BioTec) पर जलीय जेल के साथ ऊतकों की नकल की गई थी। 8 प्रतिशत शक्ति पर उत्तेजना तरंगदैर्घ्य 815 एनएम था। हमने 20 . का इस्तेमाल कियाXजल विसर्जन उद्देश्य (XLUMPLFL20XW, ओलिंप [टोक्यो, जापान]; संख्यात्मक एपर्चर, 0.95; कार्य दूरी, 2.0 मिमी)। प्रतिदीप्ति अधिग्रहण के लिए, हमने 593/40 एनएम के बैंडपास फिल्टर के साथ 80 प्रतिशत पर एक गैर-अवरोही डिटेक्टर का उपयोग किया।

सबसे प्रासंगिक केंद्रीय क्षेत्रों के चयन का मार्गदर्शन करने के लिए पहले चरण में उप-इष्टतम अधिग्रहण मापदंडों (400 मिमी X400 मिमी और 1011X1011 पिक्सल, 10 प्रतिशत ओवरलैप और 2 पर एक रेखीय औसत के साथ) का उपयोग करके थीम्ड जेड स्टैक पर 2डी मोज़ेक छवि अधिग्रहण शामिल था (पूरक चित्रा S9A) ) एक बार XY ग्रिड और z फ़ील्ड ऑफ़ इंटरेस्ट को परिभाषित करने के बाद, उच्च-गुणवत्ता वाली छवियों को प्राप्त करने के लिए मापदंडों को समायोजित किया गया। इस तरह के दृष्टिकोण ने रुचि के क्षेत्र को घटाकर 5 . कर दियाX12 फ़ील्ड प्रति z स्टैक। फिर, हमने 850 z स्टैक्स/ऑप्टिकल स्लाइस (1-मिमी स्टेप साइज) का अधिग्रहण किया, जो मध्य भाग में वृक्क हिलम के आसपास है।गुर्दाखंड।

इमेज स्टिचिंग, प्रोसेसिंग और ट्रेसिंग प्रत्येक स्टैक को प्रीबिस्केट अल द्वारा विकसित विधि के अनुसार टाइल किया गया था। 43 जो फिजी सॉफ्टवेयर के "ग्रिड/कलेक्शन स्टिचिंग" प्लगइन का उपयोग करके छवियों के एक बड़े संग्रह की सिलाई की अनुमति देता है (HTTP: // फिजी। एससी/फिजी)। चूंकि हमने सिलाई के बाद 2 आसन्न छवियों के बीच एक महत्वपूर्ण बदलाव देखा, इसलिए हमने पायथन में एक कस्टम-मिलान कार्यक्रम लिखा। यह प्रोग्राम इमेज शिफ्ट के लिए क्षतिपूर्ति करता है, जिससे हमें छवियों को सही ढंग से संरेखित करने की अनुमति मिलती है (सप्लीमेंट्री फिगर S9B)। इमारिस संस्करण 8.4.2 (बिटप्लेन, ज्यूरिख, स्विट्जरलैंड) का उपयोग करके सिले-सुधारित छवियों का विश्लेषण किया गया था। इमारिस के फिलामेंट ट्रेसर पैकेज मैनुअल मोड का उपयोग करके नलिकाओं और जहाजों का पता लगाया गया था और एक इमरिस एक्सटेंशन से जुड़ गया था जिसे हमने MATLAB के साथ विकसित किया था (//www.dropbox.com/s/sm9u5em3orjrpmc/Standalone_शामिल हों_ फिलामेंट_Tool.zip?dl=0) (सप्लीमेंट्री फिगर S9C)। इमारिस के सतह पैकेज के मैनुअल मोड का उपयोग करके ग्लोमेरुलिआंड सिस्ट को 3डी पुनर्निर्माण किया गया था। 3डी (तीन आयामी) इमारिस के स्पॉट पैकेज के मैनुअल मोड का उपयोग करके ग्लोमेरुली स्थानिक संगठन प्रदर्शित किया गया था।

मोर्फोमेट्री

इमारिस के फिलामेंट ट्रेसर पैकेज का उपयोग करके ट्यूबलर खंड की लंबाई, नेफ्रॉन की लंबाई और सीधापन निर्धारित किया गया था। इमरिस सॉफ्टवेयर के अनुसार, सीधापन 2 बिंदुओं के बीच की दूरी और नेफ्रॉन खंडपथ की लंबाई के बीच के अनुपात के रूप में निर्धारित किया गया था। इकतीस पीटी और 12 पूरेनेफ्रॉन3 जंगली प्रकार के चूहों में खंगाला और मापा गया, जबकि 37 पीटी और 17 होलनेफ्रॉन का पुनर्निर्माण किया गया और 4 जैक चूहों में मापा गया। सिस्ट और ग्लोमेरुलर वॉल्यूम इमरिस के "सतह पैकेज" का उपयोग करके निर्धारित किए गए थे। इकतीस और 34 ग्लोमेरुली को क्रमशः जंगली-प्रकार और जैक चूहों में मापा गया। कुल चौहत्तर अल्सर को मापा गया।

ट्यूबलर घुमावों के "विमान से बाहर" कोण ("बीटा" के रूप में इंगित) को विमान (3 लगातार बिंदुओं द्वारा परिभाषित) और अगले लगातार चौथे बिंदु अंतरिक्ष (चित्रा 5 बी) के साथ दिशा के बीच मापा गया था। देखे गए पूर्वाग्रह के सांख्यिकीय महत्व का मूल्यांकन करने के लिए, हमने बीटा कोणों के वितरण को बीटा कोणों (मोंटे कार्लो सिमुलेशन) के यादृच्छिक रोटेशन के साथ संरचनाओं में सिम्युलेटेड किया, जो समान खंडों से बने थे, जो अल्फा कोणों के समान सेट के साथ थे।

नेफ्रॉन खंडों के साथ एक सिस्टिक घाव विकसित होने की संभावना की गणना के लिए, हमने अंतरिक्ष में बिंदुओं के एक सेट द्वारा प्रत्येक नेफ्रॉन का प्रतिनिधित्व किया। प्रत्येक बिंदु को पुटी बनाम सामान्य संरचना और खंड के प्रकार की उपस्थिति के संबंध में व्याख्या की गई थी। प्रत्येक मानकीकृत लंबाई (50 डिब्बे पर सेट) पर संभाव्यता की गणना सिस्टिक एनोटेशन के साथ अंकों की संख्या और बिन में अंकों की कुल संख्या के बीच के अनुपात के रूप में की गई थी।

औसत ग्लोमेरुलर अंतर दूरी की गणना के लिए, हमने प्रत्येक ग्लोमेरुलस के लिए निकटतम 5 ग्लोमेरुली पर गणना की गई औसत ग्लोमेरुलर इंटरडिस्टेंस पर विचार किया।

डेटा विश्लेषण और सांख्यिकी

डेटा को माध्य ± SEM के रूप में व्यक्त किया जाता है। प्रायोगिक समूहों के बीच अंतर का मूल्यांकन विचरण के विश्लेषण का उपयोग करके किया गया था, जब महत्वपूर्ण (P <{0}}.05), tukey-kramer="" परीक्षण="" द्वारा="" किया="" गया="" था।="" जब="" केवल="" 2="" समूहों="" की="" तुलना="" की="" गई,="" तो="" मान-व्हिटनी="" परीक्षण="" का="" उपयोग="" किया="" गया।="" ग्राफ="" प्रिज्म="" सॉफ्टवेयर="" (सैनडिगो,="" सीए,="" संस्करण="" 9.0.0)="" का="" उपयोग="" करके="" सांख्यिकीय="" विश्लेषण="" किए="" गए="">

खुलासा

सभी लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी हित घोषित नहीं किया।

आभार

हम तकनीकी सहायता के लिए लेबरटोएयर एक्सपेरिमेंटेशन एनिमेल एट ट्रांसजेनीज (एलईएटी), हिस्टोलॉजी और इमेजिंग प्लेटफॉर्म ऑफ स्ट्रक्चर फेडेरेटिव डेरेचेर्चे नेकर को धन्यवाद देते हैं। हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए पियरे इस्नार्ड, मैरी-क्लेयर गबलर और निकोलस कुपरवासर को धन्यवाद देते हैं। इस काम को इंस्टिट्यूट नेशनल डे लासेंटे एट डे ला रेचेर्चे मेडिकल, यूनिवर्सिटी पेरिस डेसकार्टेस, असिस्टेंस पब्लिक - होपिटॉक्स डी पेरिस, एजेंस नेशनेल डे लारेचेर्चे, व्हूमी लेबोरेटोएरे डी'एक्सीलेंस हू एम, रोशफार्मा रिसर्च एंड अर्ली डेवलपमेंट (बेसल, स्विट्जरलैंड) द्वारा समर्थित किया गया था। , और इंस्टिट्यूट रोश डे रेकेर्चे और मेडेसीन ट्रांसलेशननेल (पेरिस, फ्रांस)।

लेखक का योगदान

टीबी, एनजी, और एमजेड ने प्रयोगों को डिजाइन और निष्पादित किया और डेटा का विश्लेषण किया। FB, LT, MGT, और SG ने भी कुछ प्रयोग किए और डेटा का विश्लेषण किया। एमबी और सीएन ने माउस प्रयोग किए। टीबी और एमजेड ने भी पांडुलिपि लिखने में योगदान दिया। जीएफ ने पांडुलिपि को संशोधित किया। एफटी और एमपी ने वैचारिक ढांचा प्रदान किया और अध्ययन को डिजाइन किया, परियोजना की देखरेख की और पेपर लिखा।

सिस्टैंच-नेफ्रॉन किडनी की त्रि-आयामी वास्तुकला

पूरक सामग्री

अनुपूरक फ़ाइल (पीडीएफ)

चित्रा S1। प्रायोगिक सेटअप, अधिग्रहण प्रक्रिया, और इमेजप्रोसेसिंग।

चित्रा S2। XY और z रिज़ॉल्यूशन में ऑटोफ्लोरेसेंस सिग्नल की सीमाएं।

चित्रा S3। 4-मिमी पैराफिन-एम्बेडेड . पर पीटी और टीएल के बीच संक्रमण की एक द्वि-आयामी छविगुर्दाखंड।

चित्रा S4। 4-मिमी पैराफिन-एम्बेडेड किडनी सेक्शन पर टीएएल और डीसीटी के बीच संक्रमण की द्वि-आयामी छवि।

चित्रा S5। 4-मिमी पैराफिन-एम्बेडेड किडनी सेक्शन पर डीसीटी और सीएनटी के बीच संक्रमण की एक द्वि-आयामी छवि।

चित्रा S6। त्रि-आयामी पुनर्निर्माण से समीपस्थ नलिकाओं के 3 अलग-अलग आकार का पता चलता है।

चित्र S7.तीन आयामीपुनर्निर्माण से पता चलता है कि की लंबाई और विभाजननेफ्रॉनसिस्ट से प्रभावित नहीं होते हैं।

चित्रा S8। नियंत्रण और सिस्टिक में ग्लोमेरुली का घनत्वगुर्दे.

चित्र S9. अधिग्रहण प्रक्रिया और पोस्टट्रीटमेंट इमेजप्रोसेसिंग। टेबल S1। समाशोधन विधियों की तुलना। अनुपूरक फ़ाइल (फिल्में)

मूवी S1. लेक्टिन धुंधलापन स्पष्ट रूप से रिज़ॉल्यूशन और सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात में सुधार करता है।

मूवी S2. एक नलिका के पथ का अनुरेखण।

मूवी S3. समीपस्थ नलिका और हेनले लूप के पतले अंग के बीच के जंक्शन को दर्शाने वाले एक साफ गुर्दे का त्रि-आयामी पुनर्निर्माण।

मूवी S4. हेनलेलूप के मोटे आरोही अंग और बाहर की घुमावदार नलिका के बीच के जंक्शन को दर्शाने वाले एक साफ गुर्दे का त्रि-आयामी पुनर्निर्माण।

मूवी S5.तीन आयामीएक मंजूरी का पुनर्निर्माणगुर्दाडिस्टल कनवल्यूटेड ट्यूब्यूल और कनेक्टिंग ट्यूब्यूल के बीच के जंक्शन को दर्शाता है।

मूवी S6. समीपस्थ नलिकाओं का आकार और आकार उनकी गहराई के अनुसार भिन्न होता है।

मूवी S7. नियंत्रण चूहों में त्रि-आयामी नेफ्रॉन पुनर्निर्माण।

मूवी S8. एक धनुषाकार पोत से एकोर्टिकल विकीर्ण पोत तक एक पोत के पथ का अनुरेखण।

मूवी S9. धनुषाकार वाहिकाएं जक्सटेमेडुलरीप्रोक्सिमल नलिकाओं के आकार का मॉडल बनाती हैं।

मूवी S10.नेफ्रॉनविमान में लेटने की प्रवृत्ति।

मूवी S11. त्रि-आयामी नेफ्रॉन पुनर्निर्माण पुटी के विकास के लिए विशिष्ट पैटर्न को दर्शाता है।

मूवी S12.तीन आयामीनेफ्रॉन विभाजन से पता चलता है कि विशिष्ट नेफ्रॉन खंडों में सिस्ट विकसित होते हैं।

मूवी S13. की स्थानिक व्यवस्था और अंतर्संबंधनेफ्रॉनऔर एक पॉलीसिस्टिक में वाहिकाओंगुर्दा.

प्रतिक्रिया दें संदर्भ

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