उत्परिवर्ती केआरएएस (जी12सी) 3डी फेफड़े के कैंसर स्फेरोइड्स में ट्रांसपोज़ेबल एलिमेंट आरएनए डिसरेग्यूलेशन

अमूर्त

उत्परिवर्ती केआरएएस ट्रांसपोज़ेबल तत्व (टीई) आरएनए और इंटरफेरॉन-उत्तेजित जीन (आईएसजी) अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है, लेकिन यह स्पष्ट नहीं है कि केआरएएस में विविध उत्परिवर्तन पूरे जीनोम में विभिन्न टीई आरएनए को प्रभावित करते हैं या नहीं। हमने उत्परिवर्ती केआरएएस (जी12सी) द्वारा विनियमित टीई आरएनए के परिदृश्य को निर्धारित करने के लिए केआरएएस (जी12सी) उत्परिवर्तन को धारण करने वाले 3डी मानव फेफड़ों के कैंसर स्फेरोइड के ट्रांसक्रिप्टोम का विश्लेषण किया। हमने पाया कि LINE- और LTR-व्युत्पन्न TE RNA की अभिव्यक्ति के लिए KRAS (G12C) सिग्नलिंग आवश्यक है जो TE RNA से अलग हैं जिन्हें पहले उत्परिवर्ती KRAS (G12D) या KRAS (G12V) द्वारा विनियमित दिखाया गया है। इसके अलावा, KRAS (G12C) निषेध विशेष रूप से सबसे कम उम्र के Alu उपपरिवार AluY से SINE-व्युत्पन्न TE RNA को अपग्रेड करता है। हमारे परिणामों से पता चलता है कि केआरएएस संचालित फेफड़ों के कैंसर कोशिकाओं में टीई आरएनए डिसरेग्यूलेशन उत्परिवर्तन-निर्भर है, साथ ही युवा, अलु-व्युत्पन्न टीई आरएनए के एक उपसमूह को भी उजागर करता है जो केआरएएस (जी 12 सी) निषेध पर जन्मजात प्रतिरक्षा जीन के साथ समन्वित रूप से सक्रिय होते हैं।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-एंटीट्यूमर के लाभ

परिचय

कैंसर के संदर्भ में ट्रांसपोज़ेबल एलिमेंट (टीई) आरएनए को बार-बार अनियमित किया जाता है। उत्परिवर्ती केआरएएस फेफड़ों के कैंसर कोशिकाओं में, केआरएबी जिंक-फिंगर (केजेडएनएफ) जीन को मोटे तौर पर डाउनग्रेड किया जाता है, जिससे लाइन, साइन और से प्राप्त टीई आरएनए का अनियमित अपग्रेडेशन होता है। एलटीआर तत्व 2,3. टीई आरएनए के अलावा, लंबे नॉनकोडिंग आरएनए (एलएनसीआरएनए) को भी आरएएस सिग्नलिंग जीन 4 के साथ समन्वित रूप से विनियमित किया जाता है, और उनके अभिव्यक्ति पैटर्न को कई कैंसर 5-8 में समान रूप से बदल दिया जाता है। टीई आरएनए के लिए, कैंसर में उनका अपग्रेडेशन वायरल मिमिक्री की स्थिति को प्रेरित करता है, जिससे इंटरफेरॉन-उत्तेजित जीन (आईएसजी) 3,9,10 जैसे जन्मजात प्रतिरक्षा जीन की आंतरिक सक्रियता होती है। विशेष रूप से, SINEs का अलु परिवार इम्युनोजेनिक TE RNAs 11 का एक प्रमुख स्रोत है, जो डीएनए मिथाइलट्रांसफेरेज़ इनहिबिटर (DNMTi) या उत्परिवर्ती KRAS-मध्यस्थता KZNF निषेध 3,9,10 के कारण होने वाले एपिजेनेटिक परिवर्तनों से प्रेरित होता है।

यह जांचने के लिए कि केआरएएस में एक सामान्य उत्परिवर्तन फेफड़ों के कैंसर कोशिकाओं में टीई आरएनए परिदृश्य को कैसे प्रभावित करता है, हमने 3डी फेफड़े के कैंसर स्फेरोइड के ट्रांसक्रिप्टोम की विशेषता बताई है जो उत्परिवर्ती केआरएएस (जी12सी) अवरोधक 12 की उपस्थिति या अनुपस्थिति में केआरएएस (जी12सी) उत्परिवर्तन को बरकरार रखते हैं। हम दिखाते हैं कि KRAS (G12C) सिग्नलिंग LINE और LTR-व्युत्पन्न TE RNA की अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक है, जबकि KRAS (G12C) निषेध विशेष रूप से SINE-व्युत्पन्न TE RNA और इंटरफेरॉन (IFN)-संबंधित जीन के एक उपसमूह को अपग्रेड करता है। हमारे निष्कर्षों से फेफड़ों के कैंसर कोशिकाओं में उत्परिवर्ती केआरएएस सिग्नलिंग और टीई डिसरेग्यूलेशन के बीच जटिल परस्पर क्रिया का पता चलता है, जहां युवा अलुवाई तत्वों का एक परिभाषित सेट उत्परिवर्तन-निर्भर तरीके से अपग्रेड किया जाता है।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-एंटीट्यूमर के लाभ

परिणाम

केआरएएस (जी12सी) निषेध कोडिंग और नॉनकोडिंग ट्रांस्क्रिप्टोम को बदल देता है

यह निर्धारित करने के लिए कि ऑन्कोजेनिक केआरएएस (जी12सी) सिग्नलिंग कोडिंग और नॉनकोडिंग ट्रांस्क्रिप्टोम को कैसे नियंत्रित करती है, हमने 3डी उत्परिवर्ती केआरएएस (जी12सी) फेफड़ों के कैंसर स्फेरोइड पर आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सीक्यू) का प्रदर्शन किया। आरएनए-सीक के लिए, हमने पीसीआर प्रवर्धन पूर्वाग्रह 13 (चित्रा 1 ए) को कम करते हुए सटीक आरएनए गिनती को सक्षम करने के लिए 5' अद्वितीय आणविक पहचानकर्ताओं (यूएमआई) के साथ एक पूर्ण-लंबाई प्रोटोकॉल का उपयोग किया। हमने स्फेरोइड्स (डीएमएसओ-उपचारित) (चित्रा एस1ए) को नियंत्रित करने के लिए केआरएएस (जी12सी) अवरोधक एआरएस {{11 }} (एआरएस) के साथ इलाज किए गए एच358 फेफड़े के कैंसर स्फेरोइड्स के ट्रांस्क्रिप्टोम की तुलना की और देखा कि एआरएस उपचार ने फॉस्फोराइलेटेड ईआरके के स्तर को काफी हद तक कम कर दिया है। (पी-ईआरके) (चित्रा एस1बी), यह दर्शाता है कि एआरएस उपचार डाउनस्ट्रीम केआरएएस (जी12सी) सिग्नलिंग को बाधित कर रहा था। एआरएस उपचार द्वारा केआरएएस (जी12सी) सिग्नलिंग का दमन भी गोलाकार आकार और सेल व्यवहार्यता (चित्रा एस1सी और एस1डी) में कमी से प्रमाणित हुआ था।

आरएनए स्तर पर, हमने एआरएस- या डीएमएसओ-उपचारित 3डी फेफड़े के कैंसर स्फेरोइड्स में विभिन्न बायोटाइप और टीई सुपरफैमिली के सापेक्ष प्रचुरता का आकलन किया, जिससे केआरएएस (जी 12 सी) निषेध (चित्रा 1 बी) पर टीई आरएनए संरचना में गतिशील परिवर्तन का पता चला। जबकि हमने केवल 32% GENCODE-एनोटेटेड प्रोटीन-कोडिंग जीन और 15% lncRNA जीन का पता लगाया, हमारे UMI-टैग में TE सुपरफैमिली के 92-96% (92% LTR, 95% SINE, 96% LINE) का प्रतिनिधित्व किया गया था। आरएनए-सीक्यू डेटा, केआरएएस (जी12सी)-संचालित ट्रांस्क्रिप्टोम में टीई आरएनए के व्यापक विनियमन का खुलासा करता है। एआरएस-उपचारित फेफड़ों के कैंसर स्पेरोइड्स में पाए गए सभी आरएनए अणुओं के एक चौथाई तक टीईएस से प्राप्त किए गए थे, जो दर्शाता है कि टीई आरएनए उत्परिवर्ती केआरएएस (जी 12 सी) फेफड़ों के कैंसर कोशिकाओं के ट्रांसक्रिप्शनल आउटपुट के एक बड़े हिस्से का प्रतिनिधित्व करते हैं।

पुरुषों के लिए सिस्टैंच के फायदे - प्रतिरक्षा प्रणाली को मजबूत करें

सिस्टैंच एन्हांस इम्युनिटी उत्पादों को देखने के लिए यहां क्लिक करें

【अधिक के लिए पूछें】 ईमेल:cindy.xue@wecistanche.com / व्हाट्स ऐप: 0086 18599088692 / वीचैट: 18599088692

इसके बाद हमने जैविक प्रक्रियाओं की पहचान करने के लिए एआरएस- और डीएमएसओ-उपचारित 3डी फेफड़े के कैंसर स्फेरोइड के बीच महत्वपूर्ण रूप से भिन्न रूप से व्यक्त जीन का निर्धारण किया, जो ऑन्कोजेनिक केआरएएस (जी12सी) सिग्नलिंग द्वारा विनियमित थे। अक्षुण्ण KRAS (G12C) सिग्नलिंग के साथ फेफड़े के कैंसर के गोलाकार को G2M चेकपॉइंट, E2F लक्ष्य, MYC लक्ष्य और माइटोटिक स्पिंडल (चित्र 1C) में शामिल जीनों के लिए काफी समृद्ध किया गया था। हालांकि, केआरएएस (जी12सी) निषेध पर, फेफड़े के कैंसर स्फेरॉइड्स ने ऑक्सीकरण फास्फारिलीकरण, पूरक और आईएफएन अल्फा और गामा प्रतिक्रियाओं (चित्र 1सी) में शामिल जीनों के उच्च स्तर को व्यक्त किया, जो विनियमन में केआरएएस सिग्नलिंग की भागीदारी के लिए और अधिक सहायक साक्ष्य प्रदान करता है। आईएफएन-संबंधित जीन 2,3।

KRAS(G12C) निषेध समन्वित रूप से ISGs और युवा AluY तत्वों को प्रेरित करता है

केआरएएस (जी12सी) निषेध पर आईएसजी के आंतरिक अपग्रेडेशन को और अधिक स्पष्ट करने के लिए, हमने पहचान की कि कौन से जीन और टीई क्रमशः प्रत्येक जीन सेट और टीई सुपरफैमिली में महत्वपूर्ण रूप से भिन्न रूप से व्यक्त किए गए थे। आईएफएन अल्फा और आईएफएन गामा प्रतिक्रिया जीन दोनों में, फेफड़ों के कैंसर स्फेरोइड्स में केआरएएस (जी 12 सी) निषेध पर सबसे दृढ़ता से प्रेरित जीन आरटीपी 4 (चित्र 2 ए) था, एक रिसेप्टर ट्रांसपोर्टर प्रोटीन जो टीबीके 1 सिग्नलिंग 14 को नकारात्मक रूप से नियंत्रित करता है। इसके अतिरिक्त, एमएचसी वर्ग I कॉम्प्लेक्स जीन बीटा -2-माइक्रोग्लोबुलिन (बी2एम), जो फेफड़ों के कैंसर 15 में बार-बार निष्क्रिय होता है, एआरएस-उपचारित फेफड़ों के कैंसर स्फेरोइड्स (चित्रा 2ए) में दोनों आईएफएन-संबंधित जीन सेटों में भी काफी हद तक अपग्रेड किया गया था।

टीई आरएनए विनियमन 3 में ऑन्कोजेनिक केआरएएस सिग्नलिंग की प्रत्यक्ष भूमिका को देखते हुए, हमने जांच की कि टीई आरएनए की कौन सी उपफैमिलियां उत्परिवर्ती केआरएएस (जी12सी) पर निर्भर थीं। अक्षुण्ण KRAS (G12C) सिग्नलिंग के साथ फेफड़े के कैंसर स्फेरोइड्स में, हमने पाया कि LINE उपपरिवार L1M6B और L1PA12 अत्यधिक व्यक्त किए गए थे और KRAS (G12C) पर निर्भर थे, जैसा कि ARS (चित्रा 2 बी) के साथ इलाज किए गए फेफड़ों के कैंसर स्फेरोइड्स में उनके डाउनरेगुलेशन से प्रमाणित है। इसके अलावा, जबकि केवल एक डीएनए उपपरिवार MER44D KRAS(G12C) सिग्नलिंग पर निर्भर था, एक दर्जन से अधिक LTR उपपरिवारों को उत्परिवर्ती KRAS(G12C) द्वारा विनियमित किया गया था, जिसमें MLT1A{{13}int, LTR51, MER5{17}}B भी शामिल था। , और LTR1B0 (चित्रा 2बी)। इसके विपरीत, SINE उपपरिवारों को KRAS (G12C) निषेध पर महत्वपूर्ण रूप से अपग्रेड किया गया था और फेफड़ों के कैंसर स्फेरॉइड में विशिष्ट ISG जीन (चित्र 2A) के साथ समन्वयित रूप से प्रेरित किया गया था। ये SINE TE RNA सभी AluY उपपरिवार (चित्र 2B) से प्राप्त हुए थे, जो दर्शाता है कि KRAS (G12C) निषेध युवा AluY तत्वों के एक विशिष्ट उपसमूह को ख़राब कर देता है।

केआरएएस (जी12सी) निषेध लंबे नॉनकोडिंग आरएनए को डाउनरेगुलेट करता है

ट्रांस्क्रिप्टोम पर केआरएएस (जी12सी) निषेध के प्रभावों को और अधिक स्पष्ट करने के लिए, हमने एआरएस या डीएमएसओ नियंत्रण के साथ इलाज किए गए फेफड़ों के कैंसर स्फेरोइड्स में सभी महत्वपूर्ण रूप से भिन्न रूप से व्यक्त एलएनसीआरएनए की जांच की। हमने पाया कि बड़ी संख्या में lncRNAs अपनी अभिव्यक्ति के लिए KRAS (G12C) सिग्नलिंग पर निर्भर थे, क्योंकि इनमें से कई lncRNAs को KRAS (G12C) निषेध (चित्र 3A) पर काफी कम कर दिया गया था। इनमें से तीन डाउनरेगुलेटेड lncRNAs, AC114546.3, NCMAP-DT, और AC073575.2 का कोई ज्ञात कार्य नहीं है, लेकिन क्रमशः कोडिंग जीन ZNF770, RCAN3 और ERP29 के लिए एंटीसेंस ओरिएंटेशन में ओवरलैप होते हैं। नॉनकोडिंग आरएनए के एक वर्ग के रूप में, हमने फेफड़ों के कैंसर स्फेरोइड्स (चित्रा 3बी) में एआरएस उपचार पर एलएनसीआरएनए के व्यापक डाउनरेगुलेशन को देखा, यह दर्शाता है कि कई एलएनसीआरएनए अपनी अभिव्यक्ति के लिए केआरएएस (जी12सी) सिग्नलिंग पर निर्भर हैं।

पुरुषों के लिए सिस्टैंच के फायदे - प्रतिरक्षा प्रणाली को मजबूत करें

बहस

यहां हम दिखाते हैं कि विशिष्ट TE सुपरफैमिली, अर्थात् LINE और LTR तत्वों, साथ ही lncRNAs के एक उपसमूह की अभिव्यक्ति के लिए ऑन्कोजेनिक KRAS (G12C) सिग्नलिंग की आवश्यकता होती है, जो आगे दर्शाता है कि RAS सिग्नलिंग नॉनकोडिंग ट्रांसक्रिप्टोम 2-4 को कैसे नियंत्रित करता है। हमने अपने केआरएएस (जी12सी) अवरोधक प्रयोगों के लिए एक 3डी फेफड़े के कैंसर गोलाकार मॉडल का भी उपयोग किया है क्योंकि 2डी कल्चर मॉडल 16 की तुलना में 3डी मॉडल को विवो दवा प्रतिक्रिया को अधिक ईमानदारी से दोहराने के लिए दिखाया गया है। इसके अलावा, यूएमआई-आधारित पूर्ण का हमारा अनुप्रयोग -लंबाई आरएनए-सीक्यू तकनीक 13 ने हमें हमारे आरएनए-सीक्यू डेटा में पीसीआर डुप्लिकेट को हटाकर हमारे फेफड़ों के कैंसर स्फेरोइड में टीई आरएनए संरचना और गतिशीलता को अधिक सटीक रूप से पकड़ने की अनुमति दी।

हमारे निष्कर्ष केआरएएस (जी12सी) निषेध के पिछले अध्ययनों के अनुरूप हैं, जहां आईएफएन अल्फा और गामा प्रतिक्रिया जीन को एआरएस-उपचारित एच358 फेफड़ों के कैंसर कोशिकाओं 17 में अपग्रेड किया गया था। अलु-व्युत्पन्न आरएनए 11 के ज्ञात इम्युनोजेनिक गुणों के आधार पर, हमारे परिणाम बताते हैं कि केआरएएस (जी12सी) निषेध पर युवा अलुय तत्वों का विशिष्ट अपनियमन कम से कम आंशिक रूप से एआरएस-उपचारित फेफड़ों के कैंसर स्फेरोइड में आईएसजी के मजबूत अपनियमन के लिए जिम्मेदार है। विशेष रूप से, केआरएएस (जी12सी) अवरोधक उपचार के जवाब में आईएफएन-संबंधित जीन के महत्वपूर्ण संवर्धन में आरएनए सेंसर आईएसजी जैसे एमडीए, आरआईजी-आई, या पीकेआर का आगे का अपग्रेडेशन शामिल नहीं है, जो शुरू में अपग्रेड हो जाते हैं। ऑन्कोजेनिक केआरएएस सिग्नलिंग 2,3 के जवाब में फेफड़े की कोशिकाएं।

हमने पहले दिखाया है कि अकेले उत्परिवर्ती केआरएएस सिग्नलिंग मानव फेफड़ों की कोशिकाओं में टीई आरएनए अपग्रेडेशन को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है जो इन विट्रो 2,3 में परिवर्तित हो गए हैं, और यहां वर्णित हमारे परिणाम इन अवलोकनों को एक अलग सक्रिय केआरएएस उत्परिवर्तन के साथ फेफड़ों के कैंसर कोशिकाओं तक विस्तारित करते हैं। केआरएएस (जी12डी) या केआरएएस (जी12वी) उत्परिवर्तन दोनों रूपांतरित फेफड़ों की कोशिकाओं 3 में एलटीआर12सी उपपरिवार के महत्वपूर्ण अपनियमन को प्रेरित करते हैं, लेकिन हमने अपने केआरएएस (जी12सी) फेफड़ों के कैंसर स्फेरोइड्स में एलटीआर12सी-व्युत्पन्न टीई आरएनए का महत्वपूर्ण संवर्धन नहीं देखा। इसके बजाय, हमने LTR51, LTR1B0, LTR14B, और LTR28B का अपग्रेडेशन देखा, जो सुझाव देता है कि KRAS में विविध लाभ-कार्य उत्परिवर्तन TE RNA प्रतिलेख के विभिन्न पहलुओं को नियंत्रित करते हैं।

हमारा काम इस बात का व्यापक मूल्यांकन प्रदान करता है कि नॉनकोडिंग/टीई आरएनए ट्रांस्क्रिप्टोम गतिशील रूप से केआरएएस (जी12सी) निषेध पर कैसे प्रतिक्रिया करता है। भविष्य के अध्ययन केआरएएस (जी12सी) अवरोधक प्रतिरोध के तंत्र में नॉनकोडिंग/टीई आरएनए की संभावित भूमिकाओं में नई अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। इसके अलावा, टीई आरएनए जो केआरएएस अवरोध पर कैंसर कोशिकाओं से स्रावित होते हैं, केआरएएस अवरोधक उपचारों 20 की प्रतिक्रिया और/या प्रतिरोध के बाह्य कोशिकीय आरएनए बायोमार्कर 2,3,5,18,19 के रूप में काम कर सकते हैं।

सामग्री और तरीके

सेल लाइनों

KRAS (G12C) उत्परिवर्तन वाले H358 फेफड़े के कैंसर सेल लाइनों को RPMI 1640 माध्यम (इन्विट्रोजन) में 37 डिग्री पर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (सिग्मा), 5% CO2 के साथ एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में संवर्धित किया गया था। सभी कोशिका रेखाओं का माइकोप्लाज्मा के लिए नकारात्मक परीक्षण किया गया। सेल लाइनें अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (एटीसीसी) से खरीदी गईं।

सेल व्यवहार्यता परख

गोलाकार व्यवहार्यता परख के लिए, 10, 000 कोशिकाओं/कुओं को कम आसंजन वाली गोल तली 96- वेल प्लेटों में डाला गया और 24 घंटों के लिए 37 डिग्री, 5% CO2 पर इनक्यूबेट किया गया। फिर क्रमिक रूप से पतला एआरएस या डीएमएसओ को कोशिकाओं में जोड़ा गया, और प्लेटों को 72 घंटों के लिए मानक संस्कृति स्थितियों में ऊष्मायन किया गया, जिसमें ताजा एआरएस और डीएमएसओ मीडिया को दैनिक रूप से प्रतिस्थापित किया गया। सेल व्यवहार्यता को निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार सेल टिटर-ग्लो® ल्यूमिनसेंट सेल व्यवहार्यता परख किट (पेमरेगा) का उपयोग करके मापा गया था। एआरएस उपचारित नमूनों के ल्यूमिनसेंस सिग्नल को डीएमएसओ नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत किया गया था। ल्यूमिनसेंस को स्पेक्ट्रामैक्स iD3 आणविक उपकरण पर मापा गया था।

आरएनए अलगाव

निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार क्विक-आरएनए मिनी-प्रेप किट (ज़ाइमोजेन) का उपयोग करके कुल थोक आरएनए को लगभग 100 एच358 स्फेरोइड (प्रति स्थिति) से अलग किया गया था। आरएनए को नैनोड्रॉप-8000 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के माध्यम से निर्धारित किया गया था।

आरएनए-सीक्यू लाइब्रेरी तैयारी

पूर्ण-लंबाई वाले आरएनए अणुओं की गिनती और आकलन करने के लिए कुल आरएनए से आरएनए-सीक लाइब्रेरी उत्पन्न करने के लिए एक अनुकूलित स्मार्ट-सीक3 प्रोटोकॉल 13 का उपयोग किया गया था। संक्षेप में, कुल आरएनए का 1 0एनजी एक बारकोडेड ऑलिगोडीटी प्राइमर (125एनएम) का उपयोग करके रिवर्स ट्रांसक्राइब किया गया था, इसके बाद बारकोडेड टेम्पलेट स्विच ऑलिगो (125एनएम) के साथ टेम्पलेट स्विचिंग किया गया था। ये ऑलिगो अनुक्रम पीसीआर प्रवर्धन के लिए प्राइमर के रूप में कार्य करते हैं। नेक्सटेरा एचटी किट (इलुमिना) का उपयोग स्मार्ट-सीक्यू3 प्रोटोकॉल में वर्णित आणविक बारकोड वाले सीडीएनए सिरों को बढ़ाने के लिए यूएमआई-विशिष्ट प्राइमर के साथ सीडीएनए पुस्तकालयों को अनुक्रमण पुस्तकालयों में परिवर्तित करने के लिए किया गया था। सीडीएनए और लाइब्रेरी की गुणवत्ता का मूल्यांकन एगिलेंट बायोएनालाइज़र डीएनए उच्च संवेदनशीलता चिप का उपयोग करके किया गया था और क्यूबिट 3.0 पर उच्च संवेदनशीलता डीएनए परख का उपयोग करके मात्रा निर्धारित की गई थी।

पश्चिमी ब्लॉट

एआरएस या डीएमएसओ उपचार के बाद लगभग 100 एच358 गोलाकार (प्रति स्थिति) अलग किए गए थे। इसके बाद गोलाकार को 15 मिनट के लिए प्रोटीज़ अवरोधक के साथ पूरक करके आरआईपीए बफर में बर्फ पर रखा गया। फिर लाइसेट्स को 10 मिनट के लिए 10, आरसीएफ पर घुमाया गया। इसके बाद सतह पर तैरनेवाला को लेम्मली बफर में एसडीएस-पेज नमूना तैयार करने के लिए एक नई ट्यूब में स्थानांतरित किया गया, 1 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम सांद्रता के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट तक उबाला गया। आकार के अनुसार प्रोटीन को अलग करने के लिए एसडीएस पेज का प्रदर्शन किया गया और उसके बाद इसे पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित किया गया। झिल्लियों को प्राथमिक पी-ईआरके (सीएसटी) और एचएसपी90 (सीएसटी) एंटीबॉडी के साथ रात भर 4 सी पर इनक्यूबेट किया गया। सेकेंडरी एंटीबॉडीज (एबीकैम) को बाद की इमेजिंग के लिए ब्लॉकिंग बफर में 3 बार टीबीएसटी धोए गए झिल्लियों पर इनक्यूबेट किया गया।

पुरुषों के लिए सिस्टैंच के फायदे - प्रतिरक्षा प्रणाली को मजबूत करें

यूएमआई डिडुप्लीकेशन

युग्मित अंत इलुमिना रीड्स को डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स के साथ फास्टपी 21 का उपयोग करके एडाप्टर ट्रिम किया गया था। यूएमआई को रीड से निकाला गया और यूएमआई-टूल्स पैकेज 22 से यूएमआई-टूल्स पैकेज 22 के एक्सट्रैक्ट का उपयोग करके रीडनेम में ले जाया गया, जिसमें बारकोड पैटर्न "एनएनएनएनएनएनएनएन" पर सेट था। UMI हटाए गए रीड्स को GENCODE v38 एनोटेशन सेट के साथ STAR एलाइनर का उपयोग करके HG38 के विरुद्ध संरेखित किया गया था। संरेखित रीड्स को डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स के साथ "यूएमआई-टूल्स डिडअप" का उपयोग करके डुप्लिकेट किया गया था।

आरएनए-सीक्यू विश्लेषण

सभी फास्टक्यू फाइलों को ट्रिमोमैटिक 2 (0.38) 23 के साथ ट्रिम किया गया था और परिणामी ट्रिम की गई फाइलों का फास्टक्यूसी 24 के साथ मूल्यांकन किया गया था और फिर निम्नलिखित विश्लेषणात्मक पाइपलाइन के साथ संसाधित किया गया था: सैल्मन (1.3.0): आरएनए का छद्म संरेखण -seq रीडिंग निम्नलिखित तर्कों का उपयोग करके सैल्मन 25 के साथ निष्पादित की जाती है: {{1{{20}}}}validateMappings –gcBias --seqBias --recoverOrphons --rangeFactorizationBins 4 का उपयोग करके चयनात्मक संरेखण को सक्षम करने के लिए डिकॉय अनुक्रमों का उपयोग करके GENCODE संस्करण 35 ट्रांसक्रिप्टोम फास्टा फ़ाइल से बनाया गया एक सूचकांक। एक अतिरिक्त, टीई-अवेयर इंडेक्स इसी तरह से बनाया गया था लेकिन यूसीएससी रिपीट मास्कर ट्रैक से उत्पन्न अनुक्रमों के साथ पूरक किया गया था। DESeq2 (1.32.0): सैल्मन आउटपुट को tximport 26 का उपयोग करके DESeq ऑब्जेक्ट में आयात किया गया था और मानक तर्क 27 के साथ अंतर अभिव्यक्ति विश्लेषण किया गया था। सभी परिणामों को पैडज <0.05 के लिए फ़िल्टर किया गया था। जहां गणना डेटा का उपयोग किया गया था, उसे DESeq का उपयोग करके नमूनों में सामान्यीकृत किया गया था।

जीन सेट संवर्धन विश्लेषण

विभेदित रूप से व्यक्त जीन को DESeq2 द्वारा उत्पन्न सिकुड़े हुए log2FoldChange मानों द्वारा रैंक किया गया था। जीन सेट आर पैकेज msigdbr (7.4.1) का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे और केवल 'हॉलमार्क' स्थिति वाले जीन सेट शामिल करने के लिए फ़िल्टर किए गए थे। R पैकेज fgsea (1.18.0) का उपयोग जीन सेट संवर्धन अनुमान उत्पन्न करने के लिए किया गया था, जिन्हें समायोजित pvalues ​​​​के साथ परिणामों के लिए फ़िल्टर किया गया था <{8}}.05।

प्रतिक्रिया दें संदर्भ

1. बर्न्स, केएच (2017)। कैंसर में ट्रांसपोज़ेबल तत्व। नेट रेव कैंसर 17, 415-424. 10.1038/एनआरसी.2017.35.

2. रेगिआर्डो, आरई, मारोली, एसवी, हलास्ज़, एच., ओज़ेन, एम., कैरिलो, डी., लामोंटेन, ई., व्हाइटहेड, एल., किम, ई., मलिक, एस., फर्नांडीस, जे., और अन्य। (2020)। उत्परिवर्ती केआरएएस द्वारा दोहराए जाने वाले गैर-कोडिंग आरएनए और आईएफएन-उत्तेजित जीन की एपिजेनोमिक रिप्रोग्रामिंग। बायोरेक्सिव, 2020.2011.2004.367771। 10.1101/2020.11.04.367771.

3. रेगिआर्डो, आरई, मारोली, एसवी, हलास्ज़, एच., ओज़ेन, एम., ह्राबेटा-रॉबिन्सन, ई., बेहेरा, ए., पेड्डू, वी., कैरिलो, डी., लामोंटेग्ने, ई., व्हाइटहेड, एल. ।, और अन्य। (2022)। उत्परिवर्ती केआरएएस, केआरएबी जिंक-फिंगर जीन के माध्यम से ट्रांसपोज़ेबल तत्व आरएनए और जन्मजात प्रतिरक्षा को नियंत्रित करता है। सेल रिपोर्ट 40. 10.1016/जे.सेलरेप.2022.111104।

4. किम, डीएच, मारिनोव, जीके, पेपके, एस., सिंगर, जेडएस, हे, पी., विलियम्स, बी., श्रोथ, जीपी, एलोविट्ज़, एमबी, और वोल्ड, बीजे (2015)। एकल-कोशिका ट्रांस्क्रिप्टोम विश्लेषण से रीप्रोग्रामिंग के दौरान एलएनसीआरएनए अभिव्यक्ति में गतिशील परिवर्तनों का पता चलता है। सेल स्टेम सेल 16, 88-101. 10.1016/j.stem.2014.11.005.

5. रेगिआर्डो, आरई, मारोली, एसवी, और किम, डीएच (2022)। सूजन और कैंसर के एलएनसीआरएनए बायोमार्कर। एड एक्सप मेड बायोल 1363, 121-145। 10.1007/978-3-030-92034-0_7.

6. श्मिट, एएम, और चांग, ​​एचवाई (2016)। कैंसर मार्गों में लंबे नॉनकोडिंग आरएनए। कैंसर कोशिका 29, 452-463. 10.1016/जे.सीसेल.2016.03.010.

7. रिन, जेएल, और चांग, ​​एचवाई (2020)। लंबे नॉनकोडिंग आरएनए: जीव संबंधी कार्यों के लिए आणविक तौर-तरीके। अन्नू रेव बायोकेम 89, 283-308। 10.1146/एनुरेव-बायोकेम- 062917-012708।

8. स्लैक, एफजे, और चिन्नैयन, एएम (2019)। ऑन्कोलॉजी में गैर-कोडिंग आरएनए की भूमिका। सेल 179, 1033-1055. 10.1016/जे.सेल.2019.10.017.

9. चियापिनेली, कैथरीन बी., स्ट्रिसेल, पामेला एल., डेसरिचर्ड, ए., ली, एच., हेन्के, सी., अकमन, बी., हेन, ए., रोटे, नील एस., कोप, लेस्ली एम. , स्नाइडर, ए., एट अल. (2015)। डीएनए मिथाइलेशन को बाधित करने से अंतर्जात रेट्रोवायरस सहित डीएसआरएनए के माध्यम से कैंसर में इंटरफेरॉन प्रतिक्रिया होती है। सेल 162, 974-986। 10.1016/जे.सेल.2015.07.011.

10. रूलोइस, डी., लू याउ, एच., सिंघानिया, आर., वांग, वाई., दानेश, ए., शेन, शू वाई., हान, एच., लियांग, जी., जोन्स, पीटर ए., पुघ, ट्रेवर जे., एट अल। (2015)। डीएनए-डीमिथाइलेटिंग एजेंट अंतर्जात प्रतिलेखों द्वारा वायरल मिमिक्री को प्रेरित करके कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं को लक्षित करते हैं। सेल 162, 961-973. 10.1016/जे.सेल.2015.07.056.

11. मेहदीपुर, पी., मैरहोन, एसए, एट्टायेबी, आई., चक्रवर्ती, ए., होसेनी, ए., वांग, वाई., डी कास्त्रो, एफए, लू याउ, एच., इशाक, सी., एबेल्सन, एस. ।, और अन्य। (2020)। एपिजेनेटिक थेरेपी उल्टे SINEs और ADAR1 निर्भरता के प्रतिलेखन को प्रेरित करती है। प्रकृति 588, 169-173. 10.1038/सेकेंड41586-020-2844-1.

12. ओस्ट्रम, जेएम, पीटर्स, यू., एसओएस, एमएल, वेल्स, जेए, और शौकत, केएम (2013)। K-Ras(G12C) अवरोधक जीटीपी आत्मीयता और प्रभावकारी अंतःक्रियाओं को सर्वव्यापी रूप से नियंत्रित करते हैं। प्रकृति 503, 548- 551. 10.1038/प्रकृति12796.

13. हेजमैन-जेन्सेन, एम., ज़िगेनहैन, सी., चेन, पी., रामस्कोल्ड, डी., हेंड्रिक्स, जीजे, लार्सन, एजेएम, फरीदानी, ओआर, और सैंडबर्ग, आर. (2020)। स्मार्ट-सीक्यू3 का उपयोग करके एलील और आइसोफॉर्म रिज़ॉल्यूशन पर एकल-कोशिका आरएनए की गिनती। नेट बायोटेक्नोल 38, 708-714। 10.1038/सेकेंड41587-020- 0497-0.

14. हे, एक्स., एशब्रुक, एडब्ल्यू, डू, वाई., वू, जे., हॉफमैन, एचएच, झांग, सी., ज़िया, एल., पेंग, वाईसी, तुमास, केसी, सिंह, बीके, एट अल। (2020)। RTP4 IFN-I प्रतिक्रिया को रोकता है और प्रायोगिक सेरेब्रल मलेरिया और न्यूरोपैथोलॉजी को बढ़ाता है। प्रोक नेटल एकेड साइंस यूएसए 117, 19465- 19474। 10.1073/पीएनएएस.2006492117.

15. परेरा, सी., जिमेनेज-जेवियर, पी., प्रोस, ई., पजारेस, एमजे, मोरो, एम., गोमेज़, ए., नवारो, ए., कंडोम, ई., मोरन, एस., गोमेज़- लोपेज़, जी., एट अल. (2017)। फेफड़ों के कैंसर के लिए रोगी व्युत्पन्न ज़ेनोग्राफ़्ट की जीनोमिक प्रोफाइलिंग, प्रतिरक्षा पहचान को ख़राब करने वाले बी2एम निष्क्रियता की पहचान करती है। क्लिन कैंसर रेस 23, 3203-3213। 10.1158/1078-0432.सीसीआर-16-1946.

16. सेन, सी., फ्रायंड, डी., और गोम्पर्ट्स, बीएन (2022)। फेफड़े के त्रि-आयामी मॉडल: अतीत, वर्तमान और भविष्य: एक लघु समीक्षा। बायोकेम सोक ट्रांस 50, 1045-1056। 10.1042/बीएसटी20190569। 17. मुगर्ज़ा, ई., वैन मालडेगेम, एफ., बौमेल्हा, जे., मूर, सी., राणा, एस., लोरियन सोपेना, एम., ईस्ट, पी., एंबलर, आर., अनास्तासियोउ, पी., रोमेरो -क्लैविजो, पी., एट अल. (2022)। चिकित्सीय केआरएएस (जी12सी) निषेध इम्युनोजेनिक फेफड़ों के कैंसर में प्रभावी इंटरफेरॉन-मध्यस्थता एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा को संचालित करता है। विज्ञान सलाह 8, eabm8780। 10.1126/sciadv.abm8780.

18. खोजा, आर., रेगिआर्डो, आरई, ओज़ेन, एम., मारोली, एसवी, कैरिलो, डी., डेमिरसी, यू., और किम, डीएच (2022)। उत्परिवर्ती केआरएएस (जी12सी) फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा कोशिकाओं के बाह्यकोशिकीय आरएनए हस्ताक्षर। बायोरेक्सिव, 2022.2002.2023.481574। 10.1101/2022.02.23.481574.

19. वांग, जे., मा, पी., किम, डीएच, लियू, बीएफ, और डेमिरसी, यू. (2021)। ट्यूमर थेरेपी के लिए माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित एक्सोसोम अलगाव और जांच की ओर। नैनो टुडे 37. 10.1016/j.nantod.2020.101066.

20. मूर, एआर, रोसेनबर्ग, एससी, मैककॉर्मिक, एफ., और मालेक, एस. (2021)। आरएएस-लक्षित उपचार। नेट रेव ड्रग डिस्कोव। 10.1038/सेकेंड41573-021-00220-6.

21. चेन, एस., झोउ, वाई., चेन, वाई., और गु, जे. (2018)। fastp: एक अल्ट्रा-फास्ट ऑल-इन-वन FASTQ प्रीप्रोसेसर। जैव सूचना विज्ञान 34, i884-i890। 10.1093/जैवसूचना विज्ञान/बीटीवाई560।

22. स्मिथ, टी., हेगर, ए., और सडबेरी, आई. (2017)। यूएमआई-उपकरण: परिमाणीकरण सटीकता में सुधार के लिए अद्वितीय आणविक पहचानकर्ताओं में मॉडलिंग अनुक्रमण त्रुटियां। जीनोम रेस 27, 491- 499। 10.1101/जीआर.209601.116.

23. बोल्गर, एएम, लोहसे, एम., और यूसाडेल, बी. (2014)। ट्रिमोमैटिक: इलुमिना अनुक्रम डेटा के लिए एक लचीला ट्रिमर। जैवसूचना विज्ञान 30, 2114-2120. 10.1093/जैव सूचना विज्ञान/बीटीयू170।

24. ब्राउन, जे., पिरुंग, एम., और मैक्यू, एलए (2017)। एफक्यूसी डैशबोर्ड: फास्टक्यूसी परिणामों को एक वेब-आधारित, इंटरैक्टिव और एक्स्टेंसिबल फास्टक्यू गुणवत्ता नियंत्रण उपकरण में एकीकृत करता है। जैव सूचना विज्ञान। 10.1093/जैवसूचना विज्ञान/btx373.

25. पेट्रो, आर., दुग्गल, जी., लव, एमआई, इरिज़ारी, आरए, और किंग्सफोर्ड, सी. (2017)। सैल्मन प्रतिलेख अभिव्यक्ति की तेज़ और पूर्वाग्रह-जागरूक मात्रा का ठहराव प्रदान करता है। नेट विधियाँ 14, 417-419। 10.1038/एनमेथ.4197.

26. सोनेसन, सी., लव, एमआई, और रॉबिन्सन, एमडी (2015)। आरएनए-सीक्यू के लिए विभेदक विश्लेषण: प्रतिलेख-स्तर के अनुमान जीन-स्तर के अनुमानों में सुधार करते हैं। F1000Res 4, 1521. 10.12688/f1000research.7563.2.

27. लव, एमआई, ह्यूबर, डब्लू., और एंडर्स, एस. (2014)। DESeq2 के साथ RNA-seq डेटा के लिए गुना परिवर्तन और फैलाव का नियंत्रित अनुमान। जीनोम बायोल 15, 550. 10.1186/सेकेंड13059-014- 0550-8।

आभार

हम उपयोगी चर्चा के लिए किम लैब के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। इस कार्य को बास्किन स्कूल ऑफ इंजीनियरिंग (डीएचके को) के फंड द्वारा समर्थित किया गया था। डीसी को तम्बाकू-संबंधित रोग अनुसंधान कार्यक्रम (T30DT0997) से प्रीडॉक्टोरल फ़ेलोशिप पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था, RER को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (1F99DK) से F99/K 00 NIDDK KUH प्रीडॉक्टोरल से पोस्टडॉक्टरल फ़ेलो ट्रांज़िशन अवार्ड द्वारा समर्थित किया गया था। {7}}), और वीपी को तंबाकू-संबंधित रोग अनुसंधान कार्यक्रम (टी32डीटी4904) से प्रीडॉक्टोरल फ़ेलोशिप पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था।

लेखक का योगदान

डीएचके ने अनुसंधान की संकल्पना की, डीसी और डीएचके ने अनुसंधान डिजाइन किया, डीसी, जेएल और जीएम ने प्रयोग किए, आरईआर और वीपी ने डेटा का विश्लेषण किया, और डीसी और डीएचके ने लेखकों से इनपुट के साथ पेपर लिखा।

आंकड़ों

चित्र 1. केआरएएस (जी12सी) निषेध कोडिंग और नॉनकोडिंग ट्रांस्क्रिप्टोम ए को बदल देता है। प्रायोगिक योजनाबद्ध। बी. एआरएस-उपचारित (एआरएस) या डीएमएसओ-उपचारित (डीएमएसओ) फेफड़ों के कैंसर गोलाकार आरएनए-सीक्यू पुस्तकालयों में जेनकोड कोडिंग, एलएनसीआरएनए, और टीई/रिपीट सुपरफैमिली को सौंपी गई गणनाओं का वितरण, जहां प्रत्येक कॉलम एक जैविक प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करता है। सी. सामान्यीकृत संवर्धन स्कोर (एनईएस) द्वारा रैंक किए गए विभेदित रूप से व्यक्त जीन का उपयोग करके डीएमएसओ-उपचारित (दाएं, सकारात्मक एनईएस) या एआरएस-उपचारित (बाएं, नकारात्मक एनईएस) फेफड़ों के कैंसर स्फेरोइड में महत्वपूर्ण जीन सेट संवर्धन विश्लेषण परिणाम देखे गए।

चित्र 2. KRAS(G12C) अवरोधन ISGs और युवा AluY तत्वों को समन्वित रूप से प्रेरित करता है

ए. ज्वालामुखी भूखंड डीएमएसओ-उपचारित (दाएं, सकारात्मक गुना-परिवर्तन) या एआरएस-उपचारित (बाएं, नकारात्मक गुना परिवर्तन) फेफड़ों के कैंसर स्फेरोइड के बीच प्रमुख जीन सेटों में देखे गए महत्वपूर्ण अंतर अभिव्यक्ति को दर्शाते हैं। डीएमएसओ-उपचारित (दाएं, सकारात्मक गुना परिवर्तन) या एआरएस-उपचारित (बाएं, नकारात्मक गुना-परिवर्तन) फेफड़ों के कैंसर स्फेरोइड के बीच टीई सुपरफैमिली में देखे गए महत्वपूर्ण अंतर अभिव्यक्ति को दर्शाने वाले ज्वालामुखी भूखंड।

चित्र 3. केआरएएस (जी12सी) निषेध लंबे नॉनकोडिंग आरएनए को डाउनरेगुलेट करता है

ए. डीएमएसओ-उपचारित (दाएं, सकारात्मक गुना-परिवर्तन) या एआरएस-उपचारित (बाएं, नकारात्मक गुना-परिवर्तन) फेफड़ों के कैंसर गोलाकार के बीच जेनकोड प्रोटीन-कोडिंग आरएनए और एलएनसीआरएनए की महत्वपूर्ण अंतर अभिव्यक्ति का ज्वालामुखी प्लॉट। बी. डीएमएसओ-उपचारित (शीर्ष, सकारात्मक गुना-परिवर्तन) या एआरएस-उपचारित (निचला, नकारात्मक गुना-परिवर्तन) फेफड़ों के कैंसर स्फेरोइड्स (विलकॉक्सन) के बीच जेनकोड प्रोटीन-कोडिंग आरएनए और एलएनसीआरएनए की महत्वपूर्ण अंतर अभिव्यक्ति का बॉक्स प्लॉट।

पूरक चित्र

चित्र S1.

ए. एच358 3डी फेफड़े के कैंसर स्फेरॉइड का इलाज एआरएस या डीएमएसओ से किया जाता है। बी. पी-ईआरके और एचएसपी90 के लिए वेस्टर्न ब्लॉट, जिसमें एआरएस या डीएमएसओ से इलाज किए गए एच358 3डी फेफड़ों के कैंसर स्फेरोइड का उपयोग किया जाता है। सी. व्यास माप (माइक्रोमीटर में) (बाएं प्लॉट) और सेल व्यवहार्यता (सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयों में सेल टिटर-ग्लो® ल्यूमिनसेंट सेल व्यवहार्यता) (दायां प्लॉट) एच 358 3 डी फेफड़ों के कैंसर स्फेरॉइड का इलाज एआरएस या डीएमएसओ के साथ किया जाता है उपचार के 3 या 5 दिन (500 एनएम एआरएस-1620 या डीएमएसओ)। डी. एच358 3डी फेफड़े के कैंसर स्फेरोइड का व्यास माप (माइक्रोमीटर में) 7 दिनों के लिए एआरएस-1620 (एनएम) की विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया।