वैरीसेला-ज़ोस्टर वायरस का छोटा ग्लाइकोप्रोटीन ई एस्चेरिचिया कोली-आधारित वैक्सीन डिजाइन के लिए एक आदर्श इम्यूनोजेन है

वैरिसेला-ज़ोस्टर वायरस (वीजेडवी) एक अत्यधिक संक्रामक एजेंट है जो वैरिसेला और हर्पीस ज़ोस्टर रोग दोनों के लिए जिम्मेदार है। उच्च प्रभावकारिता के बावजूद, लाइसेंस प्राप्त टीकों के साथ सुरक्षा और पहुंच संबंधी चिंताएँ बनी हुई हैं। यहां, हमने ई. कोली अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करके वीजेडवी जीई इम्युनोजेन का उत्पादन करने की मांग की। हमने पाया कि जीई प्रोटीन की घुलनशील अभिव्यक्ति और उपज को प्रोटीन में सी-टर्मिनल ट्रंकेशन के माध्यम से बढ़ाया जा सकता है, जिससे वैक्सीन निर्माण के लिए एक मजबूत और स्केलेबल शुद्धिकरण प्रक्रिया की सुविधा मिल सके। लेड ट्रंकेटेड जीई (एए 31-358), जिसे इसके बाद टीजीई के रूप में जाना जाता है, समाधान में एक समरूप मोनोमर था और उत्कृष्ट एंटीजेनेसिटी दिखाता था। अंत में, हमने वाणिज्यिक वोदका एलएवी और शिंग्रिक्स वैक्सीन के साथ टीजीई की इम्युनोजेनेसिटी का आकलन और तुलना की। हमने पाया कि एल्युमीनियम-सहायक टीजीई वोदका एलएवी की तुलना में इम्युनोजेनिक था। जब AS01B के साथ जोड़ा गया, तो tgE की दो-खुराक टीकाकरण ने उसी खुराक पर शिंग्रिक्स वैक्सीन के साथ एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं और सेल-मध्यस्थ प्रतिरक्षा में तुलनीय या बेहतर क्षमता दिखाई, विशेष रूप से IFN के अनुपात के संदर्भ में - - व्यक्त करना सीडी4+ टी कोशिकाएँ। अंत में, ई. कोली-मध्यस्थ टीजीई अभिव्यक्ति की यह विधि वैरिसेला और ज़ोस्टर टीकों दोनों के विकास के लिए एक आदर्श वीजेडवी जीई इम्युनोजेन उत्पन्न करने के लिए एक लागत प्रभावी और स्केलेबल रणनीति प्रदान करती है।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

वैरिसेला-ज़ोस्टर वायरस, ग्लाइकोप्रोटीन ई, एस्चेरिचिया कोलाई, वैक्सीन

परिचय

वैरीसेला-ज़ोस्टर वायरस (वीजेडवी) एक रोगजनक, मानव अल्फा हर्पीसवायरस है जो रोग की दो मुख्य श्रेणियों को प्रेरित करता है: वैरीसेला के साथ प्राथमिक संक्रमण, एक अत्यधिक संक्रामक रोग जिसमें त्वचा पर छाले जैसे दाने और बुखार और अस्वस्थता जैसे हल्के प्रणालीगत लक्षण होते हैं। मुख्यतः बच्चों में; और हर्पीस ज़ोस्टर (एचजेड), उम्र बढ़ने के कारण कमजोर सेलुलर प्रतिरक्षा प्रणाली के जवाब में वायरस का अव्यक्त पुनर्सक्रियन होता है जो कई अन्य जटिलताओं के साथ या उसके बिना एक दर्दनाक, स्थानीयकृत वेसिकुलर दाने (एचजेड) का कारण बनता है (कोहेन, 2013; हेनिंगर और सीवार्ड, 2006; ज़ेरबोनी एट अल., 2014)। वैरीसेला और एचजेड दोनों को लाइव-एटेन्यूएटेड वायरस टीके (एलएवी) द्वारा रोका जा सकता है। वैरिसेला की रोकथाम के लिए पहला एलएवी ताकाहाशी एट अल द्वारा विकसित किया गया था। (1974) वोका वायरस स्ट्रेन पर आधारित था और बाद में इसे संयुक्त राज्य अमेरिका में नियमित उपयोग के लिए वेरिवैक्स के रूप में लाइसेंस दिया गया था। इसके बाद एचजेड की रोकथाम के लिए ज़ोस्टावैक्स का विकास और लाइसेंसिंग की गई (त्सेंग एट अल., 2011)। दुर्भाग्य से, वैरिवेक्स के साथ टीकाकरण शुरू होने के बाद से 10 वर्षों में, एचजेड के लगभग 1/3 मामलों की पुष्टि वोका स्ट्रेन (गैलिया एट अल., 2008) से होने की पुष्टि की गई है, जिससे पता चलता है कि वीओका संक्रमित हो सकता है और जंगली की तरह विलंबता स्थापित कर सकता है। -प्रकार का वायरस, और फिर HZ पैदा करने के लिए पुनः सक्रिय होता है। इसके अलावा, ज़ोस्टावैक्स की प्रभावकारिता प्रशासन के समय रोगी की उम्र के विपरीत आनुपातिक है, बढ़ती उम्र के साथ कम प्रभावकारिता जुड़ी हुई है (ऑक्समैन एट अल।, 2005)। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि वीजेडवी ग्लाइकोप्रोटीन ई (जीई) विषाणु आवरण और संक्रमित कोशिका सतह पर सबसे प्रचुर मात्रा में वायरल ग्लाइकोप्रोटीन है। जीई भी सबसे महत्वपूर्ण वीजेडवी सुरक्षात्मक एंटीजन में से एक है जो प्राकृतिक वैरीसेला संक्रमण के साथ-साथ वीओका टीकाकरण (अरविन, 1992; ओलिवर एट अल।, 2016) के दौरान सेलुलर और ह्यूमरल प्रतिरक्षा को प्रेरित करने में सक्षम है। हाल ही में, एक पुनः संयोजक एचजेड सबयूनिट वैक्सीन, शिंग्रिक्स (एचजेड/एसयू), को 50 वर्ष से अधिक या उसके बराबर आयु वर्ग के वयस्कों में एचजेड और संबंधित पोस्टहर्पेटिक न्यूराल्जिया (पीएचएन) की रोकथाम के लिए अनुमोदित किया गया था (शाह एट अल।, 2019; सैयद, 2018). नैदानिक ​​​​परीक्षणों में, शिंग्रिक्स ने एक कुशल, वीजेडवी-विशिष्ट, सेल-मध्यस्थ प्रतिरक्षा (सीएमआई) को प्रेरित किया, जिसमें 50 वर्ष से अधिक या उसके बराबर प्रतिभागियों के बीच 97.2% की समग्र टीका प्रभावकारिता और उससे अधिक या उसके बराबर प्रतिभागियों में 91.3% सुरक्षा दर थी। 70 वर्ष तक. ये निष्कर्ष सामूहिक रूप से उम्र से स्वतंत्र टीकाकरण वाले व्यक्तियों में एचजेड के काफी कम जोखिम का संकेत देते हैं, और इस प्रकार ज़ोस्टावैक्स (लाल एट अल।, 2015; शाह एट अल।, 2019) की तुलना में अधिक शक्तिशाली टीका विकल्प है।

सिस्टैंच पौधा-बढ़ाने वाली प्रतिरक्षा प्रणाली

शिंग्रिक्स को चीनी हैम्स्टर अंडाशय (सीएचओ) कोशिकाओं और एक लिपोसोम-आधारित सहायक प्रणाली (एएस01बी) में व्यक्त एक पुनः संयोजक जीई एंटीजन से डिज़ाइन किया गया है जिसमें 3-ओडेसैसिल-4′-मोनोफॉस्फोरिल लिपिड ए (एमपीएल) और क्विलाजा सैपोनारिया शामिल हैं। मोलिना, अंश 21 (क्यूएस21) (डेन्डौगा एट अल., 2012)। हालाँकि, पुनः संयोजक सीएचओ कोशिकाओं को एक लंबे उत्पादन चक्र की आवश्यकता होती है और वे एक जटिल शुद्धिकरण प्रक्रिया से जुड़े होते हैं जिसके परिणामस्वरूप उच्च विनिर्माण लागत और सीमित आपूर्ति होती है। इस प्रकार, शिंग्रिक्स व्यापक उपयोग के लिए एक आदर्श टीकाकरण समाधान नहीं है, खासकर विकासशील देशों में (किम एट अल., 2012)। माइक्रोबियल अभिव्यक्ति प्रणालियाँ स्तनधारी अभिव्यक्ति प्रणालियों की तुलना में कई लाभ प्रदान करती हैं, जिनमें तेजी से विकास, संस्कृति में आसानी और कम उत्पादन लागत (ओवरटन, 2014) शामिल हैं, और इस प्रकार कई बायोफार्मास्यूटिकल्स (एडकिंस और वागस्टाफ, 1998; मोनी) की अभिव्यक्ति और उत्पादन में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। एट अल., 2008; वू एट अल., 2012). हालाँकि, प्रोकैरियोटिक प्रणालियों में पुनः संयोजक यूकेरियोटिक प्रोटीन की सफल अभिव्यक्ति के लिए उत्पादन के दौरान कई कठिनाइयों को दूर करने की आवश्यकता है, जैसे कि गलत तह और पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन की कमी (सिंह और पांडा, 2005)। इन कठिनाइयों के बावजूद, माइक्रोबियल अभिव्यक्ति प्रणाली व्यापक, लागत प्रभावी वैक्सीन निर्माण के लिए एक आदर्श प्रणाली की पेशकश कर सकती है, और इसलिए, वीजेडवी वैक्सीन डिजाइन के लिए ई. कोली अभिव्यक्ति प्रणाली से एंटीजन की जांच की आवश्यकता होती है। पिछले काम में, हमने कीट कोशिकाओं में एक पुनः संयोजक जीई (आरजीई) प्रोटीन की सफल अभिव्यक्ति दिखाई और माउस टीकाकरण और एमएबी उत्पादन के लिए शुद्ध प्रोटीन प्राप्त किया (लियू एट अल।, 2015)। इस कार्य के आधार पर, यहां हम जांच करते हैं कि क्या जीई प्रोटीन को ई. कोलाई में व्यक्त किया जा सकता है। हमने ई. कोली में सी-टर्मिनल ट्रंकेशन (इसके बाद ट्रंकेटेड जीई (टीजीई) या टीजीई के रूप में संदर्भित) के साथ जीई उम्मीदवार एंटीजन की गैर-संलयन घुलनशील अभिव्यक्ति का पता लगाया और शुद्ध टीजीई प्रोटीन की विशेषता बताई। हम दिखाते हैं कि शुद्ध किया गया टीजीई देशी जीई के समान एंटीजेनिक है, और चूहों में वीओका-निष्क्रिय गतिविधि के साथ उच्च एंटीबॉडी टाइटर्स को प्रेरित करने में सक्षम है। एलएवी और शिंग्रिक्स के साथ हमारे अध्ययन में उत्पन्न टीजीई एंटीजन की इम्युनोजेनेसिटी की तुलना करने पर, हम पाते हैं कि हमारा एंटीजन न केवल एक कुशल हास्य प्रतिक्रिया प्रदर्शित करता है बल्कि एक एंटीजन-विशिष्ट सीएमआई भी प्रेरित करता है। कुल मिलाकर, टीजीई प्रोटीन के उत्पादन के लिए हमारी ई. कोलाई रणनीति वैरिसेला और एचजेड टीकाकरण दोनों के लिए वैकल्पिक औद्योगिक रूप से उत्पादित इम्यूनोजेन का मार्ग प्रशस्त कर सकती है।

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परिणाम

ई. कोलाई में पुनः संयोजक टीजीई की अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण

वीजेडवी जीई बाह्यकोशिकीय डोमेन के लिए डीएनए अनुक्रम एन्कोडिंग को विभिन्न एन- या सी-टर्मिनल ट्रंकेशन के साथ निर्माण के रूप में तैयार किया गया था, और ई. कोलाई में प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए पीटीओ-टी 7 वेक्टर में क्लोन किया गया था। जीई का पूर्ण लंबाई वाला बाह्यकोशिकीय डोमेन अभिव्यक्ति के दौरान ई. कोली में समावेशन निकायों का निर्माण करता है, और इसे सी-टर्मिनल ट्रंकेशन के साथ बेहतर बनाया जा सकता है। विभिन्न काटे गए प्रोटीनों में से, सर्वोत्तम घुलनशीलता जीई (एए 31-358) निर्माण (चित्र 1ए) के साथ प्राप्त की गई थी, जिसे इसके बाद काटे गए जीई या टीजीई के रूप में जाना जाता है। उम्मीदवार टीजीई को घुलनशील पुनः संयोजक प्रोटीन के रूप में सफलतापूर्वक व्यक्त किया गया था और संभावित टीके के रूप में आगे के मूल्यांकन और विकास के लिए प्रयोगशाला पैमाने पर तीन-चरण क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके बैक्टीरिया लाइसेट्स के सतह पर तैरनेवाला से शुद्ध किया गया था। कैप्चर के लिए मजबूत अनियोनिक एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी का उपयोग किया गया, जिसके बाद सिरेमिक हाइड्रॉक्सीपैटाइट और हाइड्रोफोबिक क्रोमैटोग्राफी चरण (चित्रा 1 बी) किए गए। शुद्धिकरण प्रक्रिया के क्रमिक चरणों में एसडीएस-पेज पर टीजीई की शुद्धता में वृद्धि देखी गई (चित्र 1सी)। टीजीई लगभग 40 केडी बैंड के रूप में स्थानांतरित हुआ और विशिष्ट एंटीबॉडी 1बी11 (चित्रा 1डी) के साथ अच्छी प्रतिक्रिया दिखाई। प्रति ग्राम बैक्टीरिया की कुल उपज लगभग 500 ग्राम शुद्ध टीजीई थी।

काटे गए जीई की विशेषता

शुद्ध प्रोटीन की समरूपता और अवसादन गुणांक का विश्लेषण करने के लिए उच्च-प्रदर्शन आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एचपीएसईसी) और विश्लेषणात्मक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन (एयूसी) का उपयोग किया गया था। कीट कोशिका प्रणाली से शुद्ध आरजीई प्रोटीन (लियू एट अल., 2015) का उपयोग नियंत्रण के रूप में किया गया था। एचपीएसईसी में, टीजीई 16.1 मिनट (चित्र 2ए) के प्रमुख अवधारण समय पर एक तीव्र शिखर दिखाई दिया, जो शुद्ध टीजीई प्रोटीन के लिए उच्च समरूपता को दर्शाता है। एयूसी प्रयोगों में, एक प्रमुख अवसादन शिखर ~2.3 एस (चित्र 2बी) पर देखा गया, जो ~39.4 केडी के बराबर है, यह दर्शाता है कि टीजीई समाधान में एक मोनोमर के रूप में प्रस्तुत होता है। थर्मल अनफोल्डिंग प्रक्रिया के दौरान ताप क्षमता की निगरानी करके टीजीई प्रोटीन की थर्मल स्थिरता का परीक्षण करने के लिए डिफरेंशियल स्कैनिंग कैलोरीमेट्री (डीएससी) का उपयोग किया गया था। डीएससी प्रोफाइल ने टीजीई के लिए 63.80 डिग्री के संक्रमण तापमान (टीएम) मान पर प्रोटीन के प्रकट होने के दौरान केवल एक थर्मल संक्रमण दिखाया, जो आरजीई (63.64 डिग्री) (चित्र 2सी) के बराबर है। शुद्ध टीजीई प्रोटीन की गठनात्मक अखंडता की जांच करने के लिए, हमने एलिसा परख का उपयोग करके टीजीई की एंटीजेनेसिटी का विश्लेषण किया, जिसमें नियंत्रण के रूप में काम करने वाले कीट कोशिकाओं में व्यक्त शुद्ध आरजीई प्रोटीन शामिल थे। एलिसा परीक्षण (चित्रा 3) में नौ एमएबीएस का उपयोग किया गया था जो गठनात्मक एपिटोप्स (एमएबी 1बी11, 4जी4, 14जी1) या रैखिक एपिटोप्स (4ए2, 11बी11, 11बी12, 6एच6, 10एच6, 11ई3) को पहचान सकते थे। हमने 1B11 को छोड़कर अधिकांश एंटीबॉडी के लिए tgE और rgE प्रोटीन के लिए समान औसत प्रभावी एकाग्रता (EC50, ng mL−1) मान पाया, जिसमें लगभग {{39%)गुना कम प्रतिक्रियाशीलता थी, जो उनकी समान एंटीजेनेसिटी का सुझाव देता है। इन परिणामों से पता चलता है कि आरजीई पर प्रमुख एपिटोप्स टीजीई प्रोटीन में अच्छी तरह से संरक्षित हैं।

चित्र 1 (रंग ऑनलाइन) प्रोटीन की अभिव्यक्ति और शुद्धि। टीजीई निर्माण डिजाइन का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। ई. कोली कोशिकाओं को जीई (एए 31-358) काटे गए जीन को ले जाने वाले पुनः संयोजक प्लास्मिड के साथ बदल दिया गया था। बी, टीजीई शुद्धि प्रक्रिया का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। टीजीई को तीन-चरण क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके लाइस्ड सतह पर तैरनेवाला से शुद्ध किया गया था। शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान टीजीई की सी, एसडीएस-पेज प्रोफ़ाइल। टीजीई का आणविक भार लगभग 40 kD है। एम: आणविक भार मार्कर। लेन 1: सतह पर तैरनेवाला सेल लाइसेट से अलग हो गया; लेन 2: क्यू-एफएफ क्रोमैटोग्राफ से टीजीई युक्त अंश; लेन 3: सीएचटी क्रोमैटोग्राफ से टीजीई युक्त अंश; लेन 4: ब्यूटाइल क्रोमैटोग्राफ से अंश, जिसमें उच्च शुद्धता वाला टीजीई प्रोटीन होता है। डी, शुद्ध टीजीई का इम्यूनोब्लॉटिंग।

चूहों में टीजीई द्वारा प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण

आरजीई के साथ टीजीई की इम्युनोजेनेसिटी की तुलना करने के लिए, हमने आमतौर पर शोध कार्य के लिए उपयोग किए जाने वाले दो सहायक पदार्थों के साथ प्रोटीन तैयार किया: एल्युमीनियम-आधारित सहायक अल -001 और फ्रायंड का सहायक। चूहों को सहायक टीजीई और आरजीई दोनों के लिए 1 यूजी की खुराक के साथ सप्ताह 0, 2, और 4 में तीन बार प्रतिरक्षित किया गया। पहले टीकाकरण के बाद 5वें सप्ताह में जीई-विशिष्ट एंटीबॉडी टाइटर्स और टी-सेल प्रतिक्रियाओं का उपयोग विभिन्न सहायक फॉर्मूलेशन की इम्युनोजेनेसिटी निर्धारित करने के लिए किया गया था। अल -001 के साथ तैयार किए गए टीजीई टीके से प्रतिरक्षित चूहों ने आरजीई समूह में चूहों के समान एंटीबॉडी प्रोफाइल दिखाया, और आरजीई की तुलना में टीजीई के साथ तैयार किए जाने पर फ्रायंड के सहायक ने बेहतर उत्तेजना प्रभाव दिखाया (चित्र 4ए)। न्यूट्रलाइज़ेशन टाइटर्स ने टीजीई या आरजीई वैक्सीन से प्रतिरक्षित चूहों में कोई अंतर नहीं दिखाया, टीजीई के लिए ~103 के न्यूट्रलाइज़ेशन टाइटर्स को अलग-अलग सहायक पदार्थों के साथ तैयार किया गया (चित्रा 4बी)। हालाँकि, इंट्रासेल्युलर साइटोकिन स्टेनिंग (आईसीएस) द्वारा स्प्लेनोसाइट्स से सीडी 4+ टी कोशिकाओं के विश्लेषण में, टीजीई और आरजीई दोनों टीकों ने सेलाइन समूह की तुलना में जीई-विशिष्ट आईएफएन के समान स्तर प्राप्त किए (चित्र 4सी, ~{ {22}}.1% या तो टीके समूहों या खारा समूह के लिए), और केवल जीई-विशिष्ट आईएल का एक मध्यम सिमुलेशन {{2{{24 }}}} (चित्र 4डी, टीके समूहों के लिए ~0.2% बनाम ~0.1) खारा समूह के लिए %). एक साथ लेने पर, इन परिणामों से पता चलता है कि tgE/Al-001 और tgE/Freund के सहायक जीई-विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएँ उत्पन्न करते हैं, जो कि विशेष रूप से मजबूत हास्य प्रतिक्रिया के साथ, rgE द्वारा प्राप्त प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के बराबर होती हैं।

एलएवी की तुलना में टीजीई वैरीसेला वैक्सीन उम्मीदवार का मूल्यांकन

हमने इसके बाद BALB/c चूहों में एंटीबॉडी उत्पादन और एल्यूमीनियम-सहायक टीजीई प्रोटीन की दृढ़ता का मूल्यांकन किया। चूहों के दो समूहों (n=5 प्रति समूह) को सप्ताह 0, 2, और 4 में तीन बार 0.5 ug और 5 ug tgE/Al{{ की अलग-अलग खुराक के साथ प्रतिरक्षित किया गया। 8}} (चित्र 5ए और बी)। एंटीबॉडी प्रतिक्रिया प्रोफाइल से पता चला कि टीजीई प्रोटीन के प्राथमिक टीकाकरण से उच्च एंटीबॉडी टाइटर्स प्राप्त हुए, सप्ताह 2 और 4 में दो बूस्टर टीकाकरण के बाद निरंतर वृद्धि हुई, और धीरे-धीरे 1 से अधिक तक गिरने से पहले सप्ताह 6 में अधिकतम स्तर तक पहुंच गया। निगरानी अवधि में 20}}4। विभिन्न खुराक समूहों ने निगरानी अवधि के दौरान समान एंटीबॉडी टिटर प्रोफाइल साझा किए, सप्ताह 6 में समान उच्च न्यूट्रलाइजिंग टिटर के साथ। टीजीई की इम्युनोजेनेसिटी का मूल्यांकन किया गया और वोदका के साथ तुलना की गई। चूहों में आधी-प्रभावी खुराक (ED50) का उपयोग सेरोकनवर्जन के माप के रूप में किया गया था, कम ED50 बेहतर इम्युनोजेनेसिटी का संकेत था। बाल्ब/सी चूहों को समूहों में अलग किया गया और एल्युमीनियम-सहायक टीजीई (1, 0.5, 0.25, {{50}}.125, {{) के साथ इंट्रापेरिटोनियल रूप से प्रतिरक्षित किया गया। 54}}। 500, 250, 125, या 62.5 पीएफयू; एन=6) क्रमिक तनुकरण में। सीरा को 4 सप्ताह के बाद एकत्र किया गया और एलिसा का उपयोग करके परीक्षण किया गया। सेरोकनवर्जन का विश्लेषण रीड और मुएंच विधि (चित्रा 5सी) के अनुसार किया गया था। आयु समूहों में, चूहों में 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, और 0.03125 कुरूप खुराक के लिए क्रमशः 83%, 100%, 100%, 100%, 50% और 17% की सीरोरूपांतरण दर थी। वोदका समूहों में, चूहों में क्रमशः 67%, 50%, 33%, 17%, और 1,{64}}, 500, 250, 125, या 62.5 पीएफयू खुराक के लिए 0% की सीरोरूपांतरण दर कम थी। ED50 मान tgE के लिए 0.063 ug और vOka के लिए 449.425 pfu थे, जो दर्शाता है कि 0.3 ug की कम खुराक पर tgE की इम्युनोजेनेसिटी vOka युक्त वैरिसेला वैक्सीन की एक खुराक के साथ हासिल की गई प्रतिरक्षा के बराबर थी (आमतौर पर 2 से अधिक, {{78} } पीएफयू प्रति खुराक)।

चित्र 2 टीजीई और आरजीई प्रोटीन की विशेषता। ए, शुद्ध टीजीई की एचपीएसईसी प्रोफाइल। जीई का अवधारण समय दर्शाया गया है। बी, शुद्ध टीजीई प्रोटीन का अवसादन वेग विश्लेषण। टीजीई का अवसादन गुणांक और आणविक भार स्वतंत्र रूप से सी(एस) और सी(एम) विधियों द्वारा निर्धारित किया गया था। (ए) और (बी) में, टीजीई को काले रंग में और लाल को नीले रंग में दिखाया गया है। सी, शुद्ध टीजीई और आरजीई प्रोटीन की विभेदक स्कैनिंग कैलोरीमेट्री प्रोफाइल।

चित्र 3 mAbs के साथ tgE और rgE की प्रतिक्रियाएँ। mAbs को क्रमिक रूप से पतला किया गया और एलिसा परख में लेपित tgE या rgE प्रोटीन के साथ प्रतिक्रिया की गई। एचआरपी-लेबल एंटी-माउस एंटीबॉडी का उपयोग करके प्रतिक्रियाओं का पता लगाया गया। प्रत्येक तनुकरण के लिए डुप्लिकेट कुओं को एक ही प्लेट पर मापा गया। EC50 मानों की गणना ग्राफपैड प्रिज्म सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके सिग्मॉइड ट्रेंड फिटिंग द्वारा की गई थी।

चित्र 4 तीन-खुराक टीकाकरण के 1 सप्ताह बाद BALB/c चूहों में tgE और rgE की प्रतिरक्षण क्षमता का परीक्षण किया गया। ए, टीजीई और आरजीई के लिए चूहों में एंटीबॉडी का उत्पादन विभिन्न सहायक पदार्थों के साथ तैयार किया गया। बी, टीजीई और आरजीई के लिए चूहों में एंटीबॉडी टाइटर्स को निष्क्रिय करना विभिन्न सहायक पदार्थों के साथ तैयार किया गया। सी और डी, टीजीई या आरजीई टीकों से प्रेरित जीई विशिष्ट आईएफएन- और आईएल -2 प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन।

चित्र 5 BALB/c चूहों में एल्यूमीनियम-निर्मित टीजीई वैक्सीन के इम्यूनोजेनेसिटी परीक्षण। ए और बी, एंटीबॉडी दृढ़ता और tgE/Al की निष्क्रिय एंटीबॉडी प्रतिक्रिया-001। टाइटर्स की 16 सप्ताह तक निगरानी की गई। एल्यूमीनियम-निर्मित टीजीई और वोदका के लिए चूहों में सी, ईडी50।

शिंग्रिक्स की तुलना में टीजीई ज़ोस्टर वैक्सीन उम्मीदवार का मूल्यांकन

शिंग्रिक्स के साथ हमारे टीजीई वैक्सीन की इम्युनोजेनेसिटी की तुलना करने के लिए, लियोफिलाइज्ड टीजीई प्रोटीन को शिंग्रिक्स एडजुवेंट, एएस 01बी के साथ तैयार किया गया था। C57BL/6 चूहों को 0 और 4 सप्ताह में टिबिअलिस मांसपेशी में tgE/AS01B या शिंग्रिक्स की दो खुराक से इंट्रामस्क्युलर रूप से प्रतिरक्षित किया गया। पहले टीकाकरण के बाद एंटीबॉडी के स्तर ने सुझाव दिया कि शिंग्रिक्स के साथ टीकाकरण उच्च स्तर के एंटी-जीई एंटीबॉडी को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त था। टीजीई/एएस01बी द्वारा उत्पादित की तुलना में काफी अधिक; हालाँकि, दूसरे टीकाकरण के बाद, दोनों समूहों के बीच एंटीबॉडी उत्पादन में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था (चित्र 6ए)। जहां तक ​​न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी स्तरों का सवाल है, टीजीई/एएस01बी की एकल-खुराक टीकाकरण से न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी की नगण्य मात्रा का उत्पादन हुआ, जो शिंग्रिक्स द्वारा उत्पादित की तुलना में काफी कम है। हालाँकि, फिर से, बूस्टर टीकाकरण के बाद, हम दोनों समूहों के बीच एंटीबॉडी उत्पादन को निष्क्रिय करने के मामले में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देख सके (चित्रा 6बी)। यह सत्यापित करने के लिए कि टीकाकरण सीएमआई को कैसे प्रभावित करता है, एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट स्पॉट (ELISPOT) परख और इंट्रासेल्युलर साइटोकिन स्टेनिंग का उपयोग करके पहले और दूसरे टीकाकरण के बाद जीई-विशिष्ट आईएफएन- और आईएल -2 स्तर का पता लगाया गया था। टीजीई/एएस01बी टीकाकरण ने शिंग्रिक्स की एक खुराक की तुलना में खराब हास्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित किया, लेकिन आईएफएन - - और आईएल {{18} को प्रेरित करने के साथ स्प्लेनोसाइट्स (चित्रा 6 सी) उत्पन्न करने के मामले में तुलनीय क्षमता दिखाई। दरअसल, दूसरे टीकाकरण के बाद, खारा नियंत्रण समूह की तुलना में tgE/AS01B समूह में जीई-विशिष्ट साइटोकिन-उत्पादक कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या का पता लगाया गया था, जो शिंग्रिक्स समूह (चित्र 6D) के बराबर या उससे बेहतर थे। ). प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण में इसी तरह के परिणाम देखे गए, IFN - - व्यक्त सीडी 4+ टी कोशिकाओं (चित्रा 6 ई), आईएल -2- व्यक्त सीडी 4+ टी के समान अनुपात के अवलोकन के साथ। एकल या बूस्ट-खुराक टीकाकरण की परवाह किए बिना, tgE/AS01B- और शिंग्रिक्सिम्युनाइज्ड चूहों के बीच कोशिकाएं (चित्र 6F), और IFN - - CD 8+ T कोशिकाएं (चित्र 6G)। इन परिणामों से पता चलता है कि बैक्टीरियल अभिव्यक्ति प्रणाली से प्राप्त टीजीई प्रोटीन उचित सहायक के साथ तैयार होने पर हास्य और सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं दोनों को प्रेरित कर सकता है, और इस प्रकार वीजेडवी के खिलाफ टीका की पीढ़ी के लिए उम्मीदवार एंटीजन के रूप में माना जा सकता है।

चित्र 6 C57BL/6 चूहों में tgE की प्रतिरक्षण क्षमता। 5 0 μL AS01B सहायक के साथ तैयार की गई 5 ug tgE की खुराक दी गई। यह शिंग्रिक्स वैक्सीन की खुराक का 1/10 हिस्सा था। टीकाकरण 0 और 4 सप्ताह में किया गया था। ए, शिंग्रिक्स की तुलना में टीजीई/एएस01बी वैक्सीन से प्रेरित एंटीबॉडी उत्पादन की तुलना। आरजीई-लेपित प्लेटों का उपयोग करके एलिसा परख द्वारा सीरम टाइटर्स निर्धारित किए गए थे। बी, tgE/AS01B वैक्सीन या शिंग्रिक्स के साथ टीकाकरण के बाद vOka के प्रति तटस्थ एंटीबॉडी प्रतिक्रिया की तुलना। सप्ताह 2 (बाएं पैनल) और सप्ताह 6 (दाएं पैनल) पर एंटीसीरम के न्यूट्रलाइजेशन टाइटर्स को सीरम कमजोर पड़ने के पारस्परिक के रूप में व्यक्त किया जाता है जिसके परिणामस्वरूप 50% अवरोध होता है। सी, सप्ताह 2 में टीजीई/एएस01बी वैक्सीन या शिंग्रिक्स से प्रेरित जीई-विशिष्ट आईएफएन- और आईएल -2 प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन। स्प्लेनोसाइट्स का उत्पादन करने वाले आईएफएन - - और आईएल -2- की संख्या की गणना की गई। जीई पेप्टाइड्स के एक पूल के साथ पुनः उत्तेजना के बाद एलिसपोट परख। डी, सप्ताह 8 में टीजीई/एएस01बी वैक्सीन या शिंग्रिक्स से प्रेरित जीई-विशिष्ट आईएफएन- और आईएल -2 प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन। स्प्लेनोसाइट्स का उत्पादन करने वाले आईएफएन - - और आईएल -2- की संख्या की गणना की गई। जीई पेप्टाइड्स के एक पूल के साथ पुनः उत्तेजना के बाद एलिसपोट परख। ई-जी, जीई-विशिष्ट साइटोकिन-व्यक्त करने वाली सीडी4+ और सीडी{33}} कोशिकाओं के लिए फ्लो साइटोमेट्री परख। आईएफएन{{34}सीडी{35}} टी कोशिकाओं का उत्पादन करने वाले, आईएल{{36}सीडी{37}} टी कोशिकाओं का उत्पादन करने वाले और आईएफएन{38}सीडी उत्पन्न करने वाले 8+ टी कोशिकाओं का अनुपात स्प्लेनोसाइट्स के बीच कोशिकाओं का निर्धारण किया गया था।

बहस

वीजेडवी जीई प्राकृतिक वैरीसेला संक्रमण के दौरान और वीजेडवी ओका टीकाकरण के बाद हास्य और कोशिका-मध्यस्थ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का एक प्रमुख लक्ष्य है। शिंग्रिक्स (जीएसके) एक पुनः संयोजक सबयूनिट वैक्सीन है जिसमें सीएचओ कोशिकाओं में व्यक्त वीजेडवी जीई और लिपोसोम-आधारित सहायक एएस01बी शामिल है। अन्य कार्यों में सीएचओ से उत्पन्न जीई प्रोटीन या उपन्यास सहायक (काओ एट अल., 2021; ली एट अल., 2020; लुआन एट अल., 2022ए, लुआन एट अल.) से तैयार कीट कोशिकाओं का उपयोग करके एचजेड के खिलाफ सबयूनिट टीकों की जांच करने की मांग की गई है। 2022बी; वांग एट अल., 2021; वुई एट अल., 2019; वुई एट अल., 2021)। यहां, हमने जांच की और दिखाया कि जीई प्रोटीन को ई. कोली से घुलनशील रूप से व्यक्त और शुद्ध किया जा सकता है, और फिर एक उपयुक्त सहायक के साथ एक सबयूनिट वैक्सीन उम्मीदवार के रूप में तैयार किया जा सकता है जो न केवल एक मजबूत न्यूट्रलाइजिंग टिटर बल्कि एक मजबूत सीएमआई प्रतिक्रिया भी प्राप्त करता है।

सिस्टैंच पौधा-बढ़ाने वाली प्रतिरक्षा प्रणाली

एक अभिव्यक्ति प्रणाली के रूप में ई. कोलाई कई लाभ प्रदान करता है: तीव्र कोशिका वृद्धि दर, सस्ती संस्कृति स्थितियां, और पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक कुशल और बहुमुखी उपकरण। ई. कोली-आधारित अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करके हर्पीस वायरस से जुड़े एंटीजन अनुसंधान में कई सफलताएँ मिली हैं। एक न्यूट्रलाइजिंग लीनियर एपिटोप जीई (एए 121-135) को काइमेरिक वीएलपी का उत्पादन करने के लिए हेपेटाइटिस बी वायरस कोर (एचबीसी) प्रोटीन के 149 एए के साथ जोड़ा गया है जो चूहों में वीजेडवी-विशिष्ट न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी को प्रेरित कर सकता है (झू एट अल।, 2016)। एक अन्य अध्ययन में, जीई एंटीसेरम (ग्रे एट अल।, 2001) उत्पन्न करने के लिए जीएसटी फ्यूजन टैग का उपयोग करके ई. कोली में सिमियन वैरीसेला वायरस (एसवीवी) से एक समरूप जीई प्रोटीन व्यक्त किया गया था। अभी तक, वैक्सीन उम्मीदवार के रूप में ई. कोली से शुद्ध किए गए फ्यूजन टैग के बिना वीजेडवी जीई प्रोटीन की कोई रिपोर्ट नहीं आई है।

जीई में तीन क्षेत्र होते हैं: एक सिग्नल पेप्टाइड (एए 1-30) के साथ एक 544-एए हाइड्रोफिलिक एक्टोडोमैन, एक 17-एए हाइड्रोफोबिक ट्रांसमेम्ब्रेन क्षेत्र, और एक 62-एए साइटोप्लास्मिक टेल क्षेत्र। हमने जीई एक्टोडोमैन के एन- या सी-टर्मिनल क्षेत्रों में अलग-अलग ट्रंकेशन के साथ कई उम्मीदवार अणुओं की जांच की और पाया कि ई. कोली में इन प्रोटीनों की बहिर्जात अभिव्यक्ति कटे हुए हिस्से (डेटा नहीं दिखाया गया) का उपयोग करके सबसे अच्छी थी। फ़्यूज़न टैग के बिना एक अक्षुण्ण जीई एक्टोडोमैन ई. कोली द्वारा व्यक्त किए जाने पर समावेशन निकाय बनाता है और इसे शुद्ध करना मुश्किल होता है। परीक्षण किए गए ट्रंकेशन उम्मीदवारों में, जीई (एए 31-358) प्रोटीन ने अपने शुद्धिकरण में न्यूनतम कठिनाइयों के साथ-साथ उच्च शुद्धता और उच्च समरूपता (चित्रा 1) के साथ उच्च घुलनशील अभिव्यक्ति दिखाई, इस प्रकार, इस ट्रंकेशन निर्माण को एक आदर्श उम्मीदवार टीका माना गया था प्रतिजन. इस काट-छाँट रणनीति का प्रोटीन के गुणों, विशेष रूप से इसकी प्रतिजनता पर संभावित प्रभाव पड़ सकता था। हमने पहले कीट कोशिकाओं में पुनः संयोजक जीई व्यक्त किया था और एपिटोप विश्लेषण के लिए 70 जीई मोनोक्लोनल एंटीबॉडी प्राप्त करते हुए, बीएएलबी/सी चूहों को प्रतिरक्षित करने के लिए इस निर्माण को शुद्ध किया था (लियू एट अल।, 2015)। हमारे विश्लेषण के माध्यम से, हमने एए 1-194 को इम्यूनोडोमिनेंट क्षेत्र (डेटा नहीं दिखाया गया) के रूप में पहचाना। इसी तरह के परिणाम अन्यत्र प्राप्त किए गए थे, जिसमें जीई-विशिष्ट एमएबीएस ने एए 109-123 और 160-316 क्षेत्रों की ओर इशारा किया था, जो वैरिएंट आइसोलेट्स के बीच एंटीबॉडी के स्थिर एंटीबॉडी बाइंडिंग के लिए जिम्मेदार क्षेत्र थे (वाफाई, 1994)। एक अन्य अध्ययन में, पुनः संयोजक हाइब्रिड जीई टुकड़ा-वीएलपी का उपयोग करते हुए, लेखकों ने अवशेषों 1-134 को जीई प्रोटीन के सबसे एंटीजेनिक क्षेत्र के रूप में पहचाना और दिखाया कि जीई का सी-टर्मिनल (अवशेष 303-623) जिसमें कई सिस्टीन अवशेष शामिल हैं, कणों का उत्पादन करने में विफल रहे। यीस्ट में (फाउलर एट अल., 1995), यह सुझाव देते हुए कि जीई की विषम अभिव्यक्ति को न केवल प्रतिजनता बल्कि अभिव्यक्ति की आसानी पर भी विचार करना चाहिए। यहां, हमने एंटीजेनेसिटी में न्यूनतम कटौती के साथ इसकी कुशल घुलनशील अभिव्यक्ति के लिए जीई प्रोटीन की लंबाई को अनुकूलित किया है। टीजीई ने चित्र 3 में अधिकांश एंटीबॉडी के समान प्रतिक्रियाशीलता दिखाई, जैसा कि कीट कोशिकाओं में उत्पन्न आरजीई ने किया था, जिससे पता चलता है कि ई. कोली से शुद्ध किए गए टीजीई प्रोटीन में प्रमुख एपिटोप्स अच्छी तरह से संरक्षित हैं। हालाँकि, एक अध्ययन से पता चला है कि शिंग्रिक्स वैक्सीन दाताओं द्वारा मान्यता प्राप्त इम्युनोडोमिनेंट सीडी 4+ टी सेल एपिटोप्स पूरे जीई प्रोटीन (वॉयक एट अल।, 2020) में फैले हुए थे। हमारे अध्ययन में टीजीई की इम्युनोजेनेसिटी शिंग्रिक्स में सीएचओ कोशिकाओं से प्राप्त जीई के समान थी, जब एंटीजन को एएस01बी सहायक के साथ जोड़ा गया था, समान रूप से कुशल हास्य प्रतिक्रियाओं और सीएमआई प्रतिक्रियाओं के साथ, जैसा कि चित्र 5 में दिखाया गया है। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि काटे गए जीई प्रोकैरियोटिक प्रणाली से प्राप्त एंटीजेनेसिटी के मामले में यूकेरियोटिक प्रणाली से प्राप्त अक्षुण्ण जीई एक्टोडोमैन जितना ही अच्छा था।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

विभिन्न अभिव्यक्ति प्रणालियों से प्राप्त जीई प्रोटीन के बीच काफी अंतर हैं। सबसे प्रमुख अंतर पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों, विशेष रूप से ग्लाइकोसिलेशन के साथ नोट किए जाते हैं। झिल्ली ग्लाइकोप्रोटीन से ओ-लिंक्ड ग्लाइकेन टी-सेल और वायरल ग्लाइकोपेप्टाइड एपिटोप्स की एंटीबॉडी पहचान के संदर्भ में प्रासंगिक है, और यह मान्यता सबयूनिट टीकों का उपयोग करके वायरस के खिलाफ प्रतिरक्षा सुरक्षा में मध्यस्थता करने के हमारे प्रयासों में उच्च जैव चिकित्सा महत्व की क्षमता रखती है। CHO-K1 कोशिकाओं में उत्पादित जीई में ग्लाइकन्स को हटाने से वीजेडवी-पॉजिटिव सीरा के साथ प्रतिक्रियाशीलता में 17% की कमी आई। इसके विपरीत, ओ-ग्लाइकोसिलेशन बी सेल एपिटोप्स की प्रतिरक्षा-सक्रियता में हस्तक्षेप कर सकता है: कुछ महत्वपूर्ण एपिटोप्स अतिरिक्त ओ-लिंक्ड ग्लाइकन्स (नॉर्डेन एट अल।, 2019) द्वारा अवरुद्ध होते हैं। हमारे अध्ययन में, ई. कोलाई से उत्पन्न टीजीई अपनी प्रतिरक्षा सक्रियता और इम्यूनोजेनेसिटी के संदर्भ में कीट कोशिका-व्युत्पन्न आरजीई के समान ही व्यवहार करता है, जिससे पता चलता है कि "नग्न" टीजीई प्रोटीन एक वैक्सीन उम्मीदवार के रूप में आशाजनक है। एंटीजन के रूप में टीजीई वाले टीके न केवल उच्च आईजीजी टाइटर्स को प्रेरित कर सकते हैं, जो वायरस विलंबता के संभावित जोखिम के बिना सबयूनिट वैरिसेला वैक्सीन के रूप में इसकी क्षमता का संकेत है, बल्कि उच्च सीएमआई भी है, जो ज़ोस्टर वैक्सीन के रूप में भी इसकी क्षमता का संकेत देता है। कुल मिलाकर, इस अध्ययन में जीवाणु अभिव्यक्ति प्रणाली से प्राप्त जीई एंटीजन वीजेडवी टीकों के विकास के लिए बहुत अधिक किफायती रणनीति प्रदान करता है।

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