अमाना एडुलिस के बल्ब से ट्यूलिपोसाइड्स एच-जे और बायोएक्टिव घटक

अमूर्त:

पहली बार अमाना एडुलिस के बल्बों के मेथनॉलिक अर्क से तीन नए ट्यूलिप पक्ष एच-जे (1-3) और 11 ज्ञात यौगिक प्राप्त किए गए थे। उनकी संरचनाओं को एनएमआर, एमएस और आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपिक डेटा, ऑप्टिकल रोटेशन और मोशेर की विधि द्वारा स्पष्ट किया गया था। बी16 मेलेनोमा कोशिकाओं में सभी आइसोलेट्स के मेलानोजेनेसिस गुणों का मूल्यांकन किया गया था। नतीजतन, ट्रिब्यूटाइल साइट्रेट (9) में मेलानोजेनेसिस विरोधी गतिविधि थी लेकिन बी16 की ओर साइटोटॉक्सिक था। (प्लस)-पायरोग्लूटामिक एसिड (4), (प्लस)-ब्यूटाइल 5-ऑक्सो पायरोलिडीन-2-कार्बोक्सिलेट (6), (-)-3-हाइड्रॉक्सी-2-मिथाइलब्यूटिरोलैक्टोन (10) ), और 5- (हाइड्रोक्सीमिथाइल)फुरफुरल (12) ने मेलेनिन उत्पादन और टायरोसिनेस गतिविधियों में वृद्धि की थी। त्वचा रोगों या बालों के सफेदी/हाइपोपिगमेंटेशन के लिए मेलेनोमा और विटिलिगो के खिलाफ उम्मीदवारों के रूप में उन सक्रिय घटकों का आगे अध्ययन किया जा सकता है।

व्हाइटनिंग रिसर्च में हमने पाया कि सिस्टैंच का भी व्हाइटनिंग इफेक्ट होता है

सबसे पहले, Cistanche पॉलीसेकेराइड और फ्लेवोनोइड्स में समृद्ध है। ये यौगिक एंटीऑक्सिडेंट के रूप में कार्य करते हैं और शरीर को मुक्त कणों को नष्ट करने में मदद कर सकते हैं, त्वचा की उम्र बढ़ने को धीमा कर सकते हैं और इस प्रकार रंग में सुधार कर सकते हैं।

दूसरे, Cistanche में विभिन्न प्रकार के अमीनो एसिड, खनिज और विटामिन भी होते हैं, जो त्वचा की मरम्मत और पुनर्जनन के लिए बहुत फायदेमंद होते हैं। Cistanche त्वचा कोशिकाओं के चयापचय को बढ़ावा दे सकता है, त्वचा की आत्म-मरम्मत क्षमता को बढ़ा सकता है और त्वचा को स्वस्थ रंग में बहाल कर सकता है।

अंत में, Cistanche में कुछ कार्बनिक अम्ल और क्षारीय पदार्थ भी होते हैं, और इन अवयवों का त्वचा के क्यूटिकल्स की कंडीशनिंग और चयापचय पर भी एक निश्चित प्रभाव पड़ता है। ये पदार्थ त्वचा के पीएच मान को प्रभावी ढंग से संतुलित कर सकते हैं, स्ट्रेटम कॉर्नियम की मोटाई में सुधार कर सकते हैं और त्वचा को अधिक पारदर्शी और नाजुक बना सकते हैं।

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1 परिचय

अमाना एडुलिस (ए। एडुलिस; मिक।) होंडा, सिन। ट्यूलिपा एडुलिस (मिक।) बेकर लिलियासी परिवार से संबंधित है और कैंसर रोगों के इलाज के लिए इस्तेमाल किया जाने वाला एक लोक औषधीय पौधा है [1,2]। हालांकि, आज तक रिपोर्ट की गई इस प्रजाति के कुछ फाइटोकेमिकल और जैविक अध्ययन हुए हैं।

उदाहरण के लिए, 95 प्रतिशत और 50 प्रतिशत EtOH निष्कर्ष मानव गैस्ट्रिक (SGC7901) [1] और हेपेटोमा (BEL7404, HepG2, और Huh7) [2] कार्सिनोमा कोशिकाओं में क्रमशः एपोप्टोसिस को प्रेरित कर सकते हैं। ए. एडुलिस से तैयार किए गए पॉलीसेकेराइड में एंटी-ऑक्सीडेंट गुण होते हैं, जिनमें डीपीपीएच, ओएच- और एबीटीएस प्लस मैला ढोने की गतिविधियां शामिल हैं [3-5]। त्वचा विकारों के लिए प्राकृतिक उत्पादों से नए एजेंटों के शोध में, हमने पाया कि ए। एडुलिस के बल्बों के मेओएच निष्कर्ष संभावित मेलानोजेनेसिस विनियमन दिखाते हैं जिस पर अभी तक शोध नहीं किया गया है। सौर प्रकाश या हानिकारक रसायनों और रोगजनक कारकों के पराबैंगनी विकिरण के संपर्क में आने पर, मध्यम मेलानोजेनेसिस हमारी त्वचा को केराटिनोसाइट्स और मेलानोसाइट्स [6] में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन से बचा सकता है। टाइरोसिनेज मेलानोजेनेसिस में एक महत्वपूर्ण एंजाइम है जो हमें उपरोक्त खतरनाक परिस्थितियों से बचाव के लिए अधिक मेलेनिन पैदा करता है [7]।

इसलिए, ए एडुलिस के सक्रिय घटक आगे के चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए साफ किए जाने योग्य हैं। इस जांच में, तीन नए ट्यूलिप पक्ष एच-जे (1-3) और 11 ज्ञात यौगिक (4-14) (चित्र 1) को ए. एडुलिस से अलग किया गया और एनएमआर, एमएस, और आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपिक डेटा, ऑप्टिकल रोटेशन द्वारा संरचनात्मक रूप से पहचाना गया। , या मोशर एस्टर प्रतिक्रिया। यौगिक 9 मेलेनिन सामग्री को कम कर सकता है लेकिन B16 मेलेनोमा कोशिकाओं की ओर साइटोटॉक्सिक हो सकता है। यौगिकों 4, 6, 10 और 12 ने मेलेनिन उत्पादन और टायरोसिनेस गतिविधियों में वृद्धि की थी। कुल मिलाकर, इस कार्य ने साबित कर दिया कि ए. एडुलिस और इसके सक्रिय घटक मेलेनिन से संबंधित बीमारियों के लिए नए एजेंट हो सकते हैं, जैसे मेलेनोमा और हाइपोपिगमेंटेशन (स्किन विटिलिगो या बालों का सफेद होना)।

2. परिणाम और चर्चा

2.1। आइसोलेट्स की संरचना व्याख्या 1-3

A. edulis के बल्बों के MeOH एक्सट्रैक्ट (TEM) को अलग-अलग EtOAc-घुलनशील (TEE), n-BuOH-घुलनशील (TEB), और HO-घुलनशील (TEW) अंशों में विभाजित किया गया था। अंश। टीईई और टीईबी अर्क की कार्रवाई ने नए आइसोप्रेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स 1-3 और ज्ञात यौगिकों 4-14 (चित्र 1) को वहन किया। इसके अतिरिक्त, टीईडब्ल्यू निकालने के प्रमुख घटक कार्बोहाइड्रेट थे।

1 के HRESIMS (उच्च-रिज़ॉल्यूशन इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री) ने m/z 351.1652 पर एक (M-H-आयन दिखाया, जो CsH2gOg (Calcd forC; हाइड्रॉक्सिल (3376 सेमी-एल) और कार्बोनिल (1725 सेमी-एल) कार्यात्मकता के लिए अवशोषण दिखाया। एक आयामी (1डी) एनएमआर में दो मिथाइल, पांच मिथाइलीन, सात मेथिन और एक चतुर्धातुक कार्बन सहित पंद्रह कार्बन सिग्नल देखे गए। 1 का स्पेक्ट्रा (तालिका 1)। चतुष्कोणीय कार्बन को रासायनिक बदलाव 6c 176.6 के आधार पर कार्बोनिल कार्बन के रूप में पहचाना गया था। 1D और HSOC (हेटेरोन्यूक्लियर सिंगल क्वांटम सुसंगतता) NMR स्पेक्ट्रा ने एक एनोमेरिक (0/8c: 4.27 प्रदर्शित किया (d, J=8.0 Hz)/1{{30}}4.9), पांच ऑक्सीमिथोलोन (0h/8c: 3.21(t, J { {34}}.0 हर्ट्ज़)/75.1, 3.28 (ओवरलैप)/71.6, 3.28 (ओवरलैप)/78.0, 3.35 (टी, जे=8.{{67} } Hz)/77.9, और 3.89 (td, I=7। 0, 2.5 Hz)/73.6), और तीन ऑक्सीमिथिलीन (6,/6c: 3.57 (dd, J {{64}) }.5, 7.0 हर्ट्ज)4.01 (डीडी, आई {{70}}.5, 2.5 हर्ट्ज)/73.1, 3.66 (डीडी, आई { {78}}.0, 5.0 हर्ट्ज), 3.85 (बीआरडी, आई=12.0 हर्ट्ज)/62.7 और 4.10 (2एच, टी, जे=7.5 हर्ट्ज)/65.5) सिग्नल। मेथिन प्रोटॉन H-2 (8 2.67, क्विंट के साथ C-1 (6 176) पर यौगिक 1 का HMBC (हेटेरोन्यूक्लियर मल्टीपल बॉन्ड सहसंबंध) सहसंबंध (चित्र 2)। 6)/सी-3 (6 73.6)/सी-4 (6 73.1)/सी-5 (6 13.9) , एच-3 (6 3.89, टीडी) सी-1/सी-2(6 44.6)/सी-4/सी के साथ -5, H-1' (6 4.27, d) C-4 के साथ, और मिथाइल प्रोटॉन H-5 (8 1.14 , डी) सी -1 / सी -2 / सी -3 के साथ सुझाव दिया गया है कि मिथाइल और हाइड्रॉक्सिल moieties क्रमशः सी -2 और सी -3 पर स्थित थे, इसके अलावा, H,-1" (8 4.10, t) और H-4 (6 3.57dd; 4.01, dd) पर मेथिलीन प्रोटॉन ने C{{ 142}} और C-1' (8 104.9), क्रमशः, HMBCस्पेक्ट्रम (चित्र 2) में, जिसने C-1 पर n-butyl समूह के असाइनमेंट का समर्थन किया और एक बीटा -ग्लूकोज (एच-1', 8 4.27, डी, जे=8.0 हर्ट्ज) सी-4 8] पर।

चित्र 2 1 के लिए देखे गए प्रमुख COZY और HMBC सहसंबंधों को दर्शाता है। 1 के C -2 और C -3 (3- हाइड्रॉक्सी -2- मिथाइल मौएटिटी) पर सापेक्ष विन्यास निर्धारित किया जा सकता है। -3 JH2-H3 मान 7.0 Hz (एंटी-फॉर्म: 7.0 Hz; syn-form: 4.0 Hz) [ 9]। पूर्ण विन्यास का निर्धारण करने के लिए, यौगिक 1 को (R)- और (S) - - मेथॉक्सी - - (trifluoromethyl)-फेनिल एसिटाइल क्लोराइड [(R)- और (S)-MTPA- के साथ अलग से व्यवहार किया गया था। सीएल] क्रमशः (एस) - और (आर) - एमटीपीए एस्टर (1 ए और 1 बी) प्राप्त करने के लिए पाइरीडीन-डी 5 की उपस्थिति में। एमटीपीए एस्टर C-3 और C-20/C-30/C-40 पर सफलतापूर्वक उत्पन्न हुए, जैसा कि 1H NMR और 1H-1H COZY से स्पष्ट किया गया है स्पेक्ट्रा (1a, H-3, δ 5.82, m; H-20 , δ 5.70, t, J=9.5 Hz; H-30 , δ 4.39, t, जे=9.5 हर्ट्ज; एच-40, δ 5.76, टी, जे=9.5 हर्ट्ज; 1बी, एच-3, δ 5.81, एम; एच{{64 }} , δ 5.56, टी, जे=9.5 हर्ट्ज; टी, जे=9 .5 हर्ट्ज)। 1a और 1b के लिए 1H NMR रासायनिक बदलावों के बीच अंतर (∆ चित्र 3 में दिखाए गए मान) क्रमशः C-3 और C-2 पर S- और R-कॉन्फ़िगरेशन के असाइनमेंट का कारण बने। नतीजतन, यौगिक 1 को ब्यूटाइल 4- - डी-ग्लूकोपायरानोज़- (एस) -3- हाइड्रॉक्सी- (आर) -2- मिथाइल ब्यूटेनोएट के रूप में स्पष्ट किया गया और ट्यूलिप साइड एच नाम दिया गया।

यौगिक 2, ट्यूलिप साइड I, ने HRESIMS (m/z 359.1686 [M plus Na] plus , 359.1682 के लिए calcd) द्वारा स्थापित आणविक सूत्र, C15H28O8 दिया। 2 का 1D NMR स्पेक्ट्रा भी 1 के समान था, इस तथ्य को छोड़कर कि मेथिलीन सिग्नल δH 1.65 (सेक्स्ट, जे=7। 0 हर्ट्ज) और 1.96 (सेक्स्ट, जे) के रासायनिक बदलाव=7। 0 हर्ट्ज)/δसी 34.6 की पहचान 1 (तालिका 1) के सी -3 में एक मेथिन के बजाय की गई थी। COZY और HMBC डेटा (चित्र 2) के आधार पर, यौगिक 2 को एक आइसोप्रेनॉइड, एक ग्लूकोज और n-ब्यूटाइल समूहों के रूप में भी बनाया गया था। H2-1" (δ 4.04, 2H, t, J=7.5 Hz/δC 65.4) के साथ C-1 (δ) का HMBC 3 J सहसंबंध 178.5) और H-10 (δ 4.19, d, J=8.0 Hz/δC 104.4) के साथ C-4 (δ 68.4) ने सुझाव दिया कि n-ब्यूटाइल समूह और एक-ग्लूकोज आंशिक [8] क्रमशः C -1 और C -4 से जुड़े थे (चित्र 2)। कुंजी HMBC और COZY सहसंबंध चित्र 2 में दिखाए गए हैं। H 3-5 का R-कॉन्फ़िगरेशन 2 का C-2 2 के एसिड हाइड्रोलिसिस द्वारा इसी ट्यूलिपलिन यौगिक की पेशकश करने के लिए निर्धारित किया गया था, 3-मिथाइलडीहाइड्रोफ्यूरान-2(3H)-एक (चित्र S28) [8] एक सकारात्मक ऑप्टिकल घुमाव के साथ मूल्य ([ ] 23 डी प्लस 18.7, सीएच2सीएल2) (आर: [ ] 25 डी प्लस 14.7, सीएचसीएल3) [10]। यौगिक 2 की संरचना की पहचान ब्यूटाइल 4- -डी-ग्लूकोपीरेनोज-(आर){{ 81}}मिथाइल बुटानोएट.

3 का आणविक सूत्र HRESIMS में m/z 303.1049 (303.1050 के लिए कैलसीडी) पर [एम प्लस Na] प्लस आयन की उपस्थिति के कारण C11H20O8 के रूप में निकाला गया था। एक मिथाइल (δ 17.6), तीन मेथिलीन (δ 34.7, 62.8, और 68.6), छह मिथाइन (δ 37.6, 71.6, 75.1, 77.9, 78.0, और 104.4), और एक चतुर्धातुक कार्बन (δ 180.6) सहित ग्यारह कार्बन संकेत , 3 (तालिका 1) के 1डी एनएमआर स्पेक्ट्रा में देखे गए थे। चतुर्धातुक कार्बन की पहचान δ 180.6 पर कार्बन रासायनिक बदलाव के आधार पर कार्बोनिल कार्बन के रूप में की गई थी। इसके अलावा, यौगिक 3 ने n -butyl संकेतों को छोड़कर, 2 के समान स्पेक्ट्रोस्कोपिक डेटा दिखाया। HMBC स्पेक्ट्रम (चित्र S15) में, δ 4.23 (d, J=8.0 Hz) पर एनोमेरिक प्रोटॉन ने C -4 (δ 68.6) के साथ 3 J अंतःक्रिया प्रदर्शित की, जिसके कारण -ग्लूकोज स्थित है सी -4। कुंजी HMBC और COZY कनेक्शन चित्र 2 में दिखाए गए हैं। C -2 पर पूर्ण कॉन्फ़िगरेशन निर्धारित करने के लिए यौगिक 3 को पर्याप्त मात्रा में अलग नहीं किया गया था। अंत में, ट्यूलिप साइड जे (3), 4- - डी-ग्लूकोपीरेनोज़- (आर) -2- मिथाइल ब्यूटेनोइक एसिड, की पहचान इस अध्ययन में 1 और 2 के उपर्युक्त संरचनात्मक स्पष्टीकरण के कारण की गई।

यौगिक 1–3 ट्यूलिप पक्ष हैं, एक प्रकार का विशेष उत्पाद जिसमें 4-हाइड्रॉक्सी2-मिथाइलीन ब्यूटेनोइक एसिड (HMBA) और/या (3S)-3,4-डायहाइड्रॉक्सी शामिल हैं -2-मेथिलीन ब्यूटेनोइक एसिड (डीएचएमबीए) समूह सी -1 और/या सी -6 स्थितियों में ए-डी-ग्लूकोज (जीएलसी) की स्थिति में मुख्य रूप से जीनस ट्यूलिपा [8,11] में पाया जाता है। . अभी तक, 1-ट्यूलिप साइड ए, 6-ट्यूलिप साइड ए, 1-ट्यूलिप साइड बी, 6-ट्यूलिप साइड बी, और ट्यूलिप साइड डी-जी सहित ट्यूलिप साइड एनालॉग्स , ट्यूलिपा [8,11] से अलग कर दिया गया है। हालांकि, ट्यूलिप साइड सी की संरचना की रिपोर्ट नहीं की गई है और पिछले साहित्य [11] में गायब हो सकती है। ट्यूलिपालिन ए और (-) - ट्यूलिपलिन बी, ट्यूलिप पक्षों के एग्लीकोन भाग हैं, जो ट्यूलिप साइड-कनवर्टिंग एंजाइम [8,11] द्वारा एचएमबीए और / या डीएचएमबीए समूहों को जारी करने के बाद स्वचालित रूप से लैक्टोन होते हैं। इस अध्ययन में, यौगिक 1-3 नामित ट्यूलिप पक्ष एच-जे ट्यूलिप पक्षों से संबंधित हैं, लेकिन सी -2 पर उनके दोहरे बंधन कम हो गए थे और -डी-ग्लूकोज समूह सी -4 (ऑक्सीमेथिलीन) से जुड़े थे ), एचएमबीए या डीएचएमबीए (चित्र 1) में सी -1 (ओ-एसाइल कार्यक्षमता) के बजाय। इसके अतिरिक्त, यौगिक 10 (2S, 3S) ट्यूलिपलिन है लेकिन C -2 पर विभिन्न विन्यासों के कारण 1 (2R, 3S) से मेटाबोलाइज़ नहीं किया जा सका। ट्यूलिप पक्षों के संभावित जैवसंश्लेषण 1–3 चित्र S29 [8,11] में दिखाए गए हैं।

इसके अलावा, तीन पायरोग्लुटेमिक एसिड एनालॉग्स (4-6), तीन साइट्रिक एसिड डेरिवेटिव्स (7-9), दो फुरानोन (10-11), एक फुरान (12), और दो स्टेरॉयड (13-14) सहित 11 ज्ञात यौगिक थे। ए। एडुलिस से पहली बार अलग किया गया। यौगिक 1-9 और 10-14 क्रमशः टीईबी और टीईई कच्चे अंशों से प्राप्त किए गए थे। उनकी पहचान (प्लस)-पायरोग्लूटामिक एसिड (4) [12], (प्लस)-मिथाइल 5-ऑक्सो पायरोलिडीन-2-कार्बोक्सिलेट (5) [12], (प्लस)-ब्यूटाइल {{23) के रूप में की गई }}ऑक्सो पायरोलिडाइन-2-कार्बोक्सिलेट (6) [12], 1-ब्यूटाइल साइट्रेट (7) [13], 1,10 -डिब्यूटाइल 5-मिथाइल साइट्रेट (8) [ 13], ट्राइब्यूटिल साइट्रेट (9) [13], (-) -3-हाइड्रॉक्सी-2-मिथाइलब्यूटिरोलैक्टोन (10) [14-16], (-)-मिथाइल 3-हाइड्रॉक्सी{{ 44}}ऑक्सो टेट्राहाइड्रोफ्यूरान-3-कार्बोक्सिलेट (11) [17], 5-(हाइड्रॉक्सीमिथाइल)फुरफ्यूरल (12) [18], साइटोस्टेरॉल (13) [19], और साइटोस्टेरॉल-3- -डी -ग्लूकोज (14) [20] स्पेक्ट्रोस्कोपिक डेटा से और साहित्य के साथ तुलना में।

2.2। TEW के रासायनिक अवयव स्पष्टीकरण

TEW का 1H और 13C NMR स्पेक्ट्रा, TEM एक्सट्रैक्ट से पानी में घुलनशील क्रूड अंश, कार्बोहाइड्रेट (आंकड़े S16 और S17) के समान है। इस प्रजाति से तैयार किए गए पॉलीसेकेराइड में मोनोसेकेराइड विश्लेषण [3,8] के बाद रमनोस, ज़ाइलोज़, अरबीनोज़, गैलेक्टोज़, मैनोज़, ग्लूकोज और फ्रुक्टोज़ होने की सूचना दी गई है। चीनी मानकों (आंकड़े S18-S23) की तुलना में TEW के NMR स्पेक्ट्रोस्कोपिक डेटा और TLC (पतली-परत क्रोमैटोग्राफी) प्रतिधारण कारक ने सुझाव दिया कि TEW अर्क में डी-ग्लूकोज और डी-फ्रुक्टोज मुख्य घटक थे।

2.3। मेलानोजेनेसिस पर अर्क और आइसोलेट्स के प्रभाव

इस प्रजाति के MeOH एक्सट्रैक्ट (TEM) को TEE, TEB, और TEW क्रूड फ्रैक्शंस में अलग किया गया था, और 12.5 से 200 µg/mL (चित्रा S24) की सांद्रता पर B16 मेलेनोमा कोशिकाओं में साइटोटॉक्सिसिटी और मेलानोजेनेसिस प्रभावों के लिए उपरोक्त चार अर्क का मूल्यांकन किया गया था। . TEE ने 200 µg/mL और TEB पर B16 की ओर स्पष्ट साइटोटॉक्सिसिटी दिखाई और साथ ही TEW में 12.5 से 200 µg/mL तक सांद्रता पर साइटोटॉक्सिक गतिविधियां थीं (चित्र S24A-1, B-1, C{{13} }, डी -1)। बायोसे में, -मेलानोसाइट-उत्तेजक हार्मोन (-MSH) का उपयोग अधिक मेलेनिन को संश्लेषित करने के लिए B16 कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए किया गया था, और TEM मेलानोजेनेसिस (चित्र S24A -2) को मध्यम रूप से उत्तेजित कर सकता है।

13 और 14 को छोड़कर सभी आइसोलेट्स (चित्र 1) में से अधिकांश को 10 से 40 माइक्रोन तक की सांद्रता पर मेलानोजेनेसिस प्रभावों के नियमन के लिए आगे परख लिया गया था, जिसमें आर्बुटिन को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था (चित्र 4)। जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है, यौगिक 9 स्पष्ट रूप से और खुराक पर निर्भर मेलेनिन उत्पादन को रोकता है, जिसके परिणामस्वरूप 81.9 माइक्रोन (चित्रा S25) के IC50 (आधा अधिकतम निरोधात्मक एकाग्रता) मूल्य के साथ B16 कोशिकाओं की ओर साइटोटोक्सिसिटी होती है। 4, 6, 10, और 12 बढ़ी हुई मेलेनिन सामग्री खुराक-निर्भरता को क्रमशः 11.9 प्रतिशत, 29.8 प्रतिशत, 27.2 प्रतिशत, और 17.6 प्रतिशत के अधिकतम प्रतिशत तक अलग करता है, बिना सेलुलर विषाक्तता के 40 माइक्रोन पर। मेलानोजेनेसिस [6] के पहले दो चरणों में टाइरोसिनेज एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है; इसलिए, यौगिकों 4, 6, 10, और 12 के इंट्रासेल्युलर टाइरोसिनेज पर प्रभाव का और मूल्यांकन किया गया। -MSH ने नियंत्रण समूह (100 प्रतिशत) (चित्र 5 और तालिका S1) की तुलना में 254.3–305.5 प्रतिशत तक टाइरोसिनेज गतिविधि बढ़ा दी।

नतीजतन, 4 (14.1–21.9 प्रतिशत), 6 (15.8–21.9 प्रतिशत), 10 (8.5–13.1 प्रतिशत), और 12 (7.5–11.8 प्रतिशत) ने खुराक पर निर्भर तरीके से एंजाइम, टायरोसिनेज की गतिविधि में मामूली वृद्धि की -MSH समूह (चित्र 5 और तालिका S1) की तुलना में 10 से 40 µM की सांद्रता पर। सेलुलर मेलेनिन सामग्री और यौगिक 4, 6, 10 और 12 के टायरोसिनेस पर प्रभाव के बीच एक सहसंबंध ग्राफ चित्र S26 में दिखाया गया है। इसके अलावा, 4, 6, 10 और 12 के मेलानोजेनेसिस-उत्प्रेरण प्रभावों की पुष्टि करने के लिए, प्रत्येक यौगिक को सह-उपचारित -MSH के बिना B16 कोशिकाओं में जोड़ा गया था जो इस परख (चित्रा S27) में एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। नतीजतन, व्यक्तियों 4, 6, 10, और 12 ने अकेले मेलेनिन उत्पादन में वृद्धि नहीं की (चित्र S27) जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है। यह सुझाव दिया गया था कि उपर्युक्त चार यौगिक केवल -MSH के मेलानोजेनेसिस प्रभाव को बढ़ा सकते हैं। तदनुसार, मेलानोजेनेसिस में अतिरिक्त सिग्नल पाथवे, जैसे टायरोसिनेस-संबंधित प्रोटीन -1 (टीआरपी -1), टीआरपी -2, माइक्रोफथाल्मिया-संबंधित ट्रांसक्रिप्शन कारक, मेलानोकोर्टिन 1 रिसेप्टर, चक्रीय एडेनोसिन मोनोफॉस्फेट, प्रोटीन काइनेज ए, सीएमपीरिस्पॉन्स एलिमेंट-बाइंडिंग प्रोटीन, सी-जून एन-टर्मिनल किनेज, एक्स्ट्रासेलुलर सिग्नल-रेगुलेटेड किनेज, पी38, और फॉस्फॉइनोसाइटाइड 3-किनेज/प्रोटीन किनेज बी [7,21] का और परीक्षण किया जाना चाहिए और इसके लिए पुष्टि की जानी चाहिए। वे सक्रिय घटक।

3. सामग्री और तरीके

3.1। सामान्य प्रायोगिक प्रक्रियाएं

NMR स्पेक्ट्रा को 13C-NMR के लिए 1H और 125 MHz के लिए एक Bruker Avance Ill 500 MHz इंस्ट्रूमेंट (BrukerBillerica, America) पर मापा गया। रासायनिक बदलाव (0) मूल्य पीपीएम में थे, और युग्मन स्थिरांक () सीडी के साथ हर्ट्ज में थे; ओडी, सीडीसीएल, और/या डी, ओ सॉल्वैंट्स के रूप में इस्तेमाल किया गया। एक JASCO-P-2000 पोलीमीटर (JASCO, TokyoJapan) (कोशिका की लंबाई 10 मिमी) पर ऑप्टिकल घुमाव प्राप्त किए गए थे। IR स्पेक्ट्रा एक PerkinElmer स्पेक्ट्रम TwoFT-IR स्पेक्ट्रोमीटर (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) पर दर्ज किए गए थे। लो- और हाई-रिज़ॉल्यूशन ESIMSइलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री) को क्रमशः ब्रूकर डाल्टनिक्स एस्क्वायरएचसीटी अल्ट्रा हाई कैपेसिटी ट्रैप मास स्पेक्ट्रोमीटर और ऑर्बिट्रैप मास स्पेक्ट्रोमीटर (एलआईओऑर्बिट्रप एक्सएल, थर्मो फिशर साइंटिफिक) पर मापा गया। Kieselgel6 0 F254 (0.25 मिमी; मर्क) और / या RP -18 F254S (0.25 मिमी; मर्क), लेपित प्लेटों पर टीएलसी का प्रदर्शन किया गया और फिर 5 प्रतिशत (o/u) सल्फ्यूरिक के साथ छिड़काव करके दाग दिया गया एक MeOH समाधान में एसिड और एक गर्म प्लेट पर गर्म करना। सिलिका जेल (सिलिसाइकल: 70 230 और 230 400 मेश), RP-18 (LiChroprepe 4063 um: Merck. Sephadexn C20 CE एपिसोड 0 pe open w Bre apply foSupelcoTM, Bellefonte), और MCI CHP20P (SupelcoTcolumn क्रोमैटोग्राफी। एक शिमदज़ु एलसी -20 एटी पंप और एक शिमदज़ु आरआईडी -10 एक अपवर्तक सूचकांक डिटेक्टर (शिमाद्ज़ु इंक, क्योटो, जापान), एक कॉस्मोसिल 5सी 18- एमएस- II ( 2.0 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर 250 x10 मिमी आईडी, 5 उम) कॉलम, एचपीएलसी के लिए उपयोग किए गए थे। डी-ग्लूकोज (एमपी बायोमेडिकल, एलएलसी, इलकिर्च, फ्रांस) और डी-फ्रुक्टोज (टीसीआई, टोक्योपैन) सहित चीनी अभिकर्मकों का उपयोग किया गया था। पानी में घुलनशील क्रूड अंश (TEW) विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है।

3.2। संयंत्र के लिए सामग्री

A. edulis (पूर्व में T. edulis) के सूखे बल्ब सितंबर 2018 में ताइवान के ताइचुंग में एक पारंपरिक चीनी दवा फार्मेसी से खरीदे गए थे और लेखक प्रो चांग द्वारा पहचाने गए थे। एक वाउचर नमूना (TE201809) चाइनीज मेडिसिन रिसर्च एंड डेवलपमेंट सेंटर, CMUH ताइवान में जमा किया गया था।

3.3। निष्कर्षण और अलगाव

A. edulis (5. 0 किग्रा) के बल्बों को आठ बार MeOH (8. 0 L प्रत्येक) के साथ कमरे के तापमान पर कच्चे तेल का अर्क प्राप्त करने के लिए निकाला गया। MeOH एक्सट्रैक्ट (TEM, 525.0 g) को एथिल एसीटेट (EtOAc) और H2O (1500:1500, v/v) के बीच तीन बार विभाजित किया गया ताकि एक EtOAc दिया जा सके। -घुलनशील अंश (टीईई, 45.0 ग्राम) और एक जलीय चरण, जिसे आगे n-BuOH/H2O (1500:1500, v/v × 3) के साथ विभाजित किया गया था, और फिर n-BuOH-घुलनशील (TEB, 53.6 ग्राम) में अलग किया गया ) और H2O-घुलनशील (TEW, 410.0 g) अंश।

टीईई को सिलिका जेल ({{0}}.063–0.200 मिमी, कॉलम पर ओपन कॉलम क्रोमैटोग्राफी के अधीन किया गया था: 7 × 26 सेमी, व्यास × लंबाई), हेक्सेन-EtOAc-MeOH (3{{20}}:1:0; 1:1:0; { {67}}:0:1, v/v/v) और 14 सबफ़्रेक्शन दिए (TEE1–TEE14)। अवक्षेपण 14 (249.0 mg; आइसोलेशन यील्ड: 0.{{100}}0498 प्रतिशत) उप-अंश TEE12 (2.2 g) से प्राप्त किया गया था जिसे MeOH से फ़िल्टर और धोया गया था। TEE9 (3.6 g) को सिलिका जेल (स्तंभ: 5 × 24 सेमी; CH2Cl2-MeOH, 7:1; 1:1; 0:1) द्वारा सात उप-अंशों (TEE9-1 से 9-7) में विभाजित किया गया था। , v/v), सबफ़्रेक्शन TEE 9-4 (1.1 g) के साथ, और फिर सेफ़ाडेक्स LH -20 कॉलम क्रोमैटोग्राफी (कॉलम: 5 × 54 सेमी; CH2Cl2-MeOH, 1:1 से 0: 1, v/v), सात सबफ्रैक्शन देने के लिए (TEE9-4-1 से 9-4-7)। TEE 9- 4-5 और TEE 9-4-6 संयुक्त थे (कुल 551.7 mg) और बार-बार RP-HPLC (MeOH-H2O, 45:55; 20:80, v/v) द्वारा 12 (21.0 mg) देने के लिए शुद्ध किया गया ; टीआर=13 मिनट; आइसोलेशन यील्ड: 0.00042 प्रतिशत) और एक मदर लिकर (131.2 मिलीग्राम), जिसे आगे आरपी-एचपीएलसी (मेओएच-एच2ओ; 10:90, वी/वी) के अधीन किया गया ताकि यौगिक 10 ( 35.5 मिलीग्राम; टीआर=13 मिनट; आइसोलेशन यील्ड: 0.00071 प्रतिशत) और 11 (1.2 मिलीग्राम; टीआर=15 मिनट; आइसोलेशन यील्ड: 0.000024 प्रतिशत)। अंश TEE6 (2.7 ग्राम) को सेफेडेक्स एलएच -20 (स्तंभ: 2.5 × 45 सेमी; CH2Cl2-MeOH, 1:1; 0:1, v/v) द्वारा 13 (6.8 मिलीग्राम; अलगाव उपज) प्राप्त करने के लिए अलग किया गया था: 0.000136 प्रतिशत)।

TEB को एक Diaion HP {{0}} कॉलम (6 × 6 0 सेमी; H2O-MeOH– एसीटोन, 100:{{15}) पर क्रोमैटोग्राफ किया गया था। }:0; 25:75:0; 50:5{{20}}:0; 75:25:{{41 }}; 0:10{{70}}:{{90}}; {{1{{105} 0}}:0:100, v/v/v) छह सबफ्रैक्शन देने के लिए (TEB1-TEB6)। सबफ़्रेक्शन TEB5 (5 0 2. 0 mg) RP-HPLC (MeOH-H2O, 85:15, v/v) द्वारा यौगिक 8 (9.3 mg; tR {{34}) प्राप्त करने के लिए शुद्ध किया गया था। } मिनट; आइसोलेशन यील्ड: 0.000186 प्रतिशत) और 9 (144.2 मिलीग्राम; टीआर {{4{{2{{2{{218} }9}}3}}}} मिनट; आइसोलेशन यील्ड: 0.002884 प्रतिशत)। अंश TEB3 (5.5 ग्राम) RP -18 क्रोमैटोग्राफी (स्तंभ: 7 × 25 सेमी; MeOH-H2O, 1:1; 1:0, v/v), और सबफ़्रेक्शन TEB 3-6 के अधीन था ( 1.0 ग्राम) को सेफेडेक्स एलएच -20 (स्तंभ: 5 × 54 सेमी; मेओएच) द्वारा सात उप-अंश (टीईबी 3-6-1 से 3-6-7) प्राप्त करने के लिए अलग किया गया था। TEB 3-6-4 (377.1 mg) को MCI जेल क्रोमैटोग्राफी (कॉलम: 2.5 × 23 सेमी; H2O-MeOH, 100:0; 80:20; 60:40; 40:60; 20:80; 0: 100, v/v) सात सबफ्रैक्शन देने के लिए (TEB3-6-4-1 से 3-6-4-7)। TEB 3-6-4-4 (38.1 mg) को RP-HPLC (MeOH-H2O, 45:55 में 0.1 प्रतिशत फॉर्मिक एसिड, v/v) द्वारा शुद्ध किया गया ताकि शुद्ध 1 (12.2 mg; tR=17 मिनट; अलगाव उपज: 0.000244 प्रतिशत)। इसके अतिरिक्त, TEB 3-6-4-6 (31.0 mg) RP-HPLC (MeOH-H2O, 40:60 में 0.1 प्रतिशत फॉर्मिक एसिड, v/v) के साथ 6 (7.1 mg; tR=28 मिनट) प्राप्त करने के लिए आयोजित किया गया था ; आइसोलेशन यील्ड: 0.000142 प्रतिशत)। TEB 3-6-5 (410.7 mg) MCI जेल क्रोमैटोग्राफी (स्तंभ: 2.5 × 23 सेमी; H2O-MeOH, 100:0; 80:20; 60:40; 50:50; 40:60; 30) द्वारा पृथक किया गया था। 70; 20:80; 0:100, v/v) आठ सबफ्रैक्शन देने के लिए (TEB3-6-5-1 से 3-6-5-8)। TEB 3-6-5-3 (75.1 mg) को MCI जेल क्रोमैटोग्राफी (स्तंभ: 1 × 20 सेमी; H2O-MeOH, 80:20; 70:30; 0:100, v/v) द्वारा शुद्ध किया गया था ताकि यौगिक 4 (59.3) वहन किया जा सके mg; आइसोलेशन यील्ड: 0.001186 प्रतिशत) और 5 (10.2 mg; आइसोलेशन यील्ड: 0.000204 प्रतिशत)। सबफ्रैक्शन टीईबी 3-6-5-4 (97.0 मिलीग्राम) 7 (46.4 मिलीग्राम; टीआर=18 मिनट प्राप्त करने के लिए आरपी-एचपीएलसी (मेओएच-एच 2 ओ, 40:60 में 0.1 प्रतिशत फॉर्मिक एसिड, वी / वी) द्वारा शुद्ध किया गया था; अलगाव उपज: 0.000928 प्रतिशत)। TEB 3-10 (925.4 mg) को MCI जेल क्रोमैटोग्राफी (स्तंभ: 2.5 × 28 सेमी; H2O-MeOH, 100:0; 80:20; 60:40; 50:50; 40:60; 30) पर क्रोमैटोग्राफ किया गया था। :70; 10:90; 0:100, v/v) आठ सबफ्रैक्शन देने के लिए (TEB3-10-1 से 3-10-8) और शुद्ध 2 (393.4 mg; आइसोलेशन यील्ड: 0.007868 प्रतिशत)। कंपाउंड 3 (6.3 mg; tR=8 मिनट; आइसोलेशन यील्ड: 0.000126 प्रतिशत) TEB 3-10-2 (20.9 mg) से RP-HPLC शुद्धि द्वारा प्राप्त किया गया था (MeOH-H2O, 30:70 0.1 प्रतिशत फॉर्मिक में एसिड, वी/वी).

3.3.1। ट्यूलिपोसाइड एच (1)

[ ] 23 डी -23.1 (सी 0.12, मीओएच); IR (स्वच्छ) νmax 3376 (OH), 2960, 2934, 2875 (CH), 1725 (C=O), 1640, 1589, 1459, 1382, 1259, 1167, 1075, 1041 (C–O– सी), 926, 900, 632, 521 सेमी−1; 1एच और 13सी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपिक डेटा, तालिका 1 देखें; HRESIMS m/z 351.1652 [M - H]- (C15H27O9, 351.1655 के लिए गणना)।

3.3.2। ट्यूलिपोसाइड I (2)

[ ] 23 डी -25.8 (सी 0.2, मेओएच); IR (स्वच्छ) νmax 3404 (OH), 2961, 2934, 2876 (CH), 1729 (C=O), 1638, 1461, 1378, 1277, 1185, 1165, 1077, 1036 (C–O– सी), 897, 736, 625, 517 सेमी−1; 1एच और 13सी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपिक डेटा, तालिका 1 देखें; HRESIMS m/z 359.1686 [M plus Na] plus (C15H28O8Na, 359.1682 के लिए calcd)।

3.3.3। ट्यूलिपोसाइड जे (3)

[] 23 डी प्लस 9। 0 (सी 0। 1, मीओएच); IR (स्वच्छ) νmax 3424 (OH), 2953, 2924, 2853 (CH), 1740 (C=O), 1632, 1441, 1401 (C-O-C), 1284, 1205, 1182, 1120 , 1078, 1039, 893, 768, 721 सेमी−1; 1एच और 13सी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपिक डेटा, तालिका 1 देखें; HRESIMS m/z 303.1049 [M plus Na] plus (C11H20O8Na, 303.1050 के लिए calcd)।

3.4। (आर)- और (एस)-एमटीपीए 1 के डेरिवेटिव

(S)-MTPA एस्टर व्युत्पन्न 1 की तैयारी एक सुविधाजनक मोशर एस्टर प्रक्रिया [22,23] द्वारा की गई थी। यौगिक 1 (3.4 मिलीग्राम, 0। 01 मिमीोल) को एक साफ एनएमआर ट्यूब में स्थानांतरित किया गया था और फिर नाइट्रोजन से भरे होने से पहले पूरी तरह से वैक्यूम के नीचे सुखाया गया था। इसके अलावा, C5D5N ({{20}}.5 mL) और (R)-(−)- -मेथॉक्सी- -(trifluoromethyl)-फेनिल-एसिटाइल क्लोराइड (MTPA क्लोराइड, 12.2 mg, 0.05 mmole) को तुरंत सीलबंद NMR ट्यूब में जोड़ा गया जिसे नमूना और MTPA क्लोराइड को मिलाने के लिए सावधानीपूर्वक हिलाया गया। 1H NMR और 1H -1 H COZY मिश्रण के स्पेक्ट्रा को कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए प्रतिक्रिया करने के बाद दर्ज किया गया। 1 का (आर)-एमटीपीए एस्टर भी उपरोक्त प्रक्रिया द्वारा इसी तरह तैयार किया गया था। यौगिक 1: 1H NMR (C5D5N, 500 MHz) δ 0.78 (H-400, t), 1.26 (H-300, sext), 1.28 (H3-5, d), 1.52 ( एच-200, क्विंट), 3.08 (एच-2, क्विंट), 3.95 (एच-50, एम), 4.03 (एच-4ए, डीडी), 4.05 (एच -20, ओवरलैप), 4.15 (एच -100, टी), 4.23 (एच -30, ओवरलैप), 4.23 (एच -40, ओवरलैप), 4.36 (एच {{ 68}}ए, डीडी), 4.39 (एच-3, ओवरलैप), 4.43 (एच-4बी, डीडी), 4.53 (एच-60बी, डी), और 4.95 (एच -10, डी)।

3.4.1। (एस)-एमटीपीए 1 (1ए) का एस्टर

1H NMR (C5D5N, 500 MHz) δ 0.77 (H-400, t), 1.17 (H-300, sext), 1.21 (H3-5, d) , 1.37 (एच-200, क्विंट), 3.18 (एच-2, क्विंट), 3.92 (एच-100, टी), 3.97 (एच-4ए, डीडी), 4.33 (एच-50 , एम), 4.39 (एच-30 , टी), 4.49 (एच-4बी, बीआरडी), 4.64 (एच-60ए, डीडी), 4.96 (एच-10 , डी), 5.05 (एच-60बी, डी), 5.70 (एच-20 , टी), 5.76 (एच-40 , टी), और 5.82 (एच -3, एम)।

3.4.2। (आर)-एमटीपीए 1 (1बी) का एस्टर

1H NMR (C5D5N, 500 MHz) δ 0.79 (H-400, t), 1.26 (H-300, sext), 1.30 (H3-5, d) , 1.50 (एच-200, क्विंट), 3.33 (एच-2, क्विंट), 3.60 (एच-50 , एम), 3.94 (एच-4ए, डीडी), 4.11 (एच-100, टी), 4.12 (एच-30 , टी), 4.13 (एच-60ए, डीडी), 4.50 (एच-4बी, बीआरडी), 4.70 (एच-10 , डी), 4.85 (एच-60बी, डी), 5.56 (एच-20 , टी), 5.66 (एच-40 , टी), और 5.81 (एच -3, एम)।

3.5। ट्यूलिपोसाइड I का एसिड हाइड्रोलिसिस (2)

आइसोलेट 2 (78.6 मिलीग्राम) को 1 एम एचसीएल (1.5 एमएल) में 100 ◦C पर 2 घंटे [8] के लिए हाइड्रोलाइज्ड किया गया। ठंडा करने के बाद, प्रतिक्रिया मिश्रण को CH2Cl2 (2.0 एमएल × 3) के साथ ट्यूलिपलिन एनालॉग, 3- मेथिल्डिहाइड्रोफ्यूरान -2(3H)-एक (11.1 मिलीग्राम) की पेशकश के लिए निकाला गया था। [ ] 23 डी प्लस 18.7 (सी 1.1, सीएच2सीएल2); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.30 (3H, d, J=7.0 Hz), 1.94 (m), 2.45 (m), 2.61 (m), 4.20 (ddd, J {{43} }.8, 6.8, 6.4 हर्ट्ज), 4.33 (डीडी, जे=8.8, 8.8, 2.8 हर्ट्ज)। 13सी एनएमआर (सीडीसीएल3, 100 मेगाहर्ट्ज) δ 15.2, 30.7, 34.1, 66.2, 180.1 (चित्रा S28); ईएसआईएमएस एम/जेड 101.06 [एम प्लस एच] प्लस।

3.6। कोश पालन

Dulbecco के संशोधित ईगल मीडियम (DMEM; GIBCO Invitrogen Corporation, New York, NY, USA) में murine B16 मेलेनोमा कोशिकाओं को 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम, पेनिसिलिन के 100 U/mL, और 37 पर स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 µg/mL के साथ पूरक किया गया था। ◦C 5 प्रतिशत CO2 इनक्यूबेटर में।

3.7। B16 सेल व्यवहार्यता का मापन

परीक्षण यौगिकों के लिए B16 कोशिकाओं की साइटोटॉक्सिसिटी को MTT द्वारा पहले वर्णित प्रोटोकॉल के साथ मामूली संशोधन [6] के साथ मापा गया था। कोशिकाओं को 96-वेल प्लेट्स (1 × 103 सेल/वेल) में सीड किया गया और 72 घंटे के लिए यौगिकों के साथ इलाज करने से पहले 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया गया। उसके बाद, माध्यम को हटा दिया गया, एमटीटी अभिकर्मक (थर्मो साइंटिफिक, वॉलथम, एमए, यूएसए) के 100 μL (0.5 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता पर) को प्रत्येक कुएं में जोड़ा गया और फिर 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया। फॉर्मेज़न क्रिस्टल को 100 μL DMSO में घोल दिया गया था, और ऑप्टिकल घनत्व को 570 एनएम पर एक माइक्रोप्लेट रीडर (SPPECTORstar® Nano, BMG LABTECH, Ortenberg, Germany) का उपयोग करके मापा गया था।

3.8। बी16 कोशिकाओं में मेलेनिन सामग्री का मापन

B16 कोशिकाओं में मेलेनिन सामग्री को मामूली संशोधन [6] के साथ पहले वर्णित विधि के अनुसार परख लिया गया था। कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए 24-वेल प्लेट में 5 × 103 सेल/वेल के घनत्व पर सीड किया गया था। माध्यम को 500 μL ताजा संस्कृति माध्यम से बदल दिया गया था जिसमें 72 घंटे के लिए या बिना यौगिकों के 0.5 μM-MSH था। Arbutin (1 मिमी) का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। उसके बाद, माध्यम को हटा दिया गया और दो बार पीबीएस (पीएच 6.8) से धोया गया। कोशिकाओं को NaOH (200 µ l, 2 N) द्वारा काटा गया और फिर 30 मिनट के लिए 85 ◦C पर गर्म किया गया। कमरे के तापमान को ठंडा करने और अपकेंद्रित होने के बाद, माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके अवशोषण को 405 एनएम पर मापा गया।

3.9। इंट्रासेल्युलर टायरोसिनेस गतिविधि

इंट्रासेल्युलर टाइरोसिनेस गतिविधि परख थोड़ा संशोधित विधि द्वारा किया गया था, जिसे पहले [6] रिपोर्ट किया गया था। कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए 24-वेल प्लेट्स में 5 × 103 सेल/वेल के घनत्व पर सीड किया गया था। कोशिकाओं को DMEM में 72 घंटे के लिए या बिना यौगिकों के 0.5 µM-MSH युक्त उपचारित किया गया था। माध्यम को हटाने के बाद, कोशिकाओं को ठंडे पीबीएस (पीएच 6.8) से दो बार धोया गया। कोशिकाओं को 100 μL लिसीज़ बफर (पीबीएस में 1 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100) के साथ लिस किया गया था और 15 मिनट के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए थे।

फिर, सतह पर तैरनेवाला प्राप्त करने के लिए 30 मिनट के लिए सेल lysates को 13,200 × g पर 4 ◦C पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। सतह पर तैरनेवाला की कुल प्रोटीन सामग्री बीसीए प्रोटीन परख द्वारा निर्धारित की गई थी। इसके बाद, प्रत्येक परिमाणित लाइसेट (30 µg/90 µL) को 96-वेल प्लेट में L-DOPA (15 mM) के 10 µL के साथ मिलाया गया और फिर 1 घंटे के लिए 37 ◦C पर इनक्यूबेट किया गया, और अवशोषक को मापा गया माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 405 एनएम पर।

4 निर्णय

कुल मिलाकर, 14 शुद्ध यौगिक, जिनमें तीन नए आइसोप्रेनॉइड ग्लाइकोसाइड और ट्यूलिप पक्ष H–J (1–3) शामिल हैं, A. edulis से पृथक किए गए थे। साइट्रिक एसिड व्युत्पन्न 9, ट्रिब्यूटाइल साइट्रेट, में महत्वपूर्ण रूप से एंटी-मेलानोजेनेसिस गतिविधि थी, लेकिन बी 16 मेलेनोमा कोशिकाओं की ओर साइटोटॉक्सिसिटी दिखाई दी, जिसे एंटी-मेलेनोमा दवाओं के लिए आगे शोध किया जा सकता है। जबकि पाइरोग्लूटामिक एसिड एनालॉग्स 4 और 6, फ्यूरानोन 10, और फ्यूरान 12 में खुराक पर निर्भर मेलेनिन सामग्री और सक्रिय टाइरोसिनेस में वृद्धि हुई थी, जिसे विटिलिगो त्वचा रोग या बालों के लिए एंटी-व्हाइटनिंग और एंटी-हाइपोपिगमेंटेशन एजेंटों के लिए आगे अध्ययन किया जा सकता है। हालांकि, सक्रिय घटकों की प्रभावकारिता को सत्यापित करने के लिए इन विट्रो तंत्र और / या विवो अध्ययनों में अधिक विस्तार से जांच करने की आवश्यकता है।

पूरक सामग्री:

निम्नलिखित ऑनलाइन उपलब्ध हैं, आंकड़े S1-S5: यौगिक 1 का NMR वर्णक्रमीय डेटा, आंकड़े S6-S10: यौगिक 2 का NMR वर्णक्रमीय डेटा, आंकड़े S11-S15: यौगिक 3 का NMR वर्णक्रमीय डेटा, आंकड़े S16-S22: NMR वर्णक्रमीय डेटा TEW की, चित्र S23: TEW का TLC विश्लेषण, चित्र S24: साइटोटॉक्सिसिटी और TEM, TEE, TEB, और TEW के मेलेनोजेनेसिस प्रभावों का नियमन, चित्र S25: यौगिकों का साइटोटॉक्सिसिटी डेटा 1–12, चित्र S26: के बीच एक सहसंबंध ग्राफ सेलुलर मेलेनिन सामग्री और यौगिक 4, 6, 10, और 12 के टाइरोसिनेस पर प्रभाव, चित्र S27: यौगिक 4, 6, 10, और 12 के मेलेनोजेनेसिस प्रभाव अकेले -MSH के बिना, चित्र S28: NMR वर्णक्रमीय और ऑप्टिकल रोटेशन डेटा यौगिक 2 के एसिड हाइड्रोलिसिस से प्राप्त उत्पाद, चित्र S29: यौगिकों का संभावित जैवसंश्लेषण 1−3, तालिका S1: यौगिक 4, 6, 10 और 12 के टायरोसिनेस गतिविधि प्रभाव।

लेखक योगदान:

अवधारणा, सी.-एलएल; संयंत्र सामग्री की पहचान, Y.-SC; अलगाव और शुद्धिकरण का संचालन, C.-LL और Z.-AG; बायोसेज़ का संचालन, Y.-LJ; सभी वर्णक्रमीय विश्लेषण और संरचना निर्धारण, C.-LL और C.-JC; मूल मसौदा तैयार करने का लेखन, सी.-एलएल सभी लेखकों ने पांडुलिपि के प्रकाशित संस्करण को पढ़ लिया है और उससे सहमत हैं।

अनुदान:

इस शोध को विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (MOST 108-2320-B039-035-) और चाइना मेडिकल यूनिवर्सिटी (CMU108-MF-84), ताइवान द्वारा वित्त पोषित किया गया था। एपीसी को ताइवान में शिक्षा मंत्रालय (एमओई) द्वारा उच्च शिक्षा स्प्राउट प्रोजेक्ट के ढांचे के भीतर फीचर्ड एरिया रिसर्च सेंटर प्रोग्राम से "चीनी चिकित्सा अनुसंधान केंद्र, चीन मेडिकल यूनिवर्सिटी" द्वारा वित्त पोषित किया गया था (सीएमआरसी-सीएचएम {{5} }).

संस्थागत समीक्षा बोर्ड का वक्तव्य:

लागू नहीं।

सूचित सहमति वक्तव्य:

लागू नहीं।

डेटा उपलब्धता विवरण:

लागू नहीं।

स्वीकृतियां:

इस काम को विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (मोस्ट 108-2320-बी-039-035-) और चाइना मेडिकल यूनिवर्सिटी (सीएमयू108-एमएफ-84), ताइवान, साथ ही साथ द्वारा आर्थिक रूप से समर्थित किया गया था ताइवान में शिक्षा मंत्रालय (एमओई) (सीएमआरसी-सीएचएम-1) द्वारा उच्च शिक्षा स्प्राउट प्रोजेक्ट के ढांचे के भीतर फीचर्ड एरिया रिसर्च सेंटर प्रोग्राम से "चाइनीज मेडिसिन रिसर्च सेंटर, चाइना मेडिकल यूनिवर्सिटी" सी को प्रदान किया गया -एलएल

हितों का टकराव:

ऑथर ने किसी हित संघर्ष की घोषणा नहीं की है।

नमूना उपलब्धता:

यौगिकों के नमूने 1-14 लेखकों के पास उपलब्ध हैं।

संदर्भ

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2 चाइनीज मेडिसिन रिसर्च एंड डेवलपमेंट सेंटर, चाइना मेडिकल यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल, ताइचुंग 40402, ताइवान।

3 चाइनीज मेडिसिन रिसर्च सेंटर, चाइना मेडिकल यूनिवर्सिटी, ताइचुंग 40402, ताइवान।

4 चीनी औषधि विज्ञान और चीनी चिकित्सा संसाधन विभाग, चीन चिकित्सा विश्वविद्यालय, ताइचुंग 40402, ताइवान।

5 ग्रेजुएट इंस्टीट्यूट ऑफ इंटीग्रेटेड मेडिसिन, चाइना मेडिकल यूनिवर्सिटी, ताइचुंग 40402, ताइवान।

6 प्रोटिओमिक्स कोर प्रयोगशाला, चिकित्सा अनुसंधान विभाग, चीन चिकित्सा विश्वविद्यालय अस्पताल, ताइचुंग 40402, ताइवान।

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