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गुर्दा उपकला लक्षित माइटोकॉन्ड्रियल प्रतिलेखन कारक ए की कमी के परिणामस्वरूप गंभीर सिस्टिक रोग से जुड़े प्रगतिशील माइटोकॉन्ड्रियल कमी होती है--भाग I

केन इशीओ^1,2,11 और अन्य

असामान्य माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन तीव्र और जीर्ण की एक अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त विशेषता हैगुर्दा बीमारी. माइटोकॉन्ड्रिया की भूमिका में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिएगुर्दाहोमियोस्टेसिस और रोगजनन, हमने माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर ए (टीएफएएम) को लक्षित किया, जो माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए प्रतिकृति और ट्रांसक्रिप्शन के लिए आवश्यक प्रोटीन है जो माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान और कार्य के रखरखाव में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। बाधित माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के परिणामों की जांच करने के लिएगुर्दाउपकला कोशिकाओं, हमने साइन ओकुलिस-संबंधित होमोबॉक्स में TFAM को निष्क्रिय कर दिया 2-व्यक्त करनागुर्दाप्रोगेनिटर सेल। TFAM की कमी के परिणामस्वरूप माइटोकॉन्ड्रियल जीन अभिव्यक्ति में काफी कमी आई, माइटोकॉन्ड्रियल कमी, नेफ्रॉन परिपक्वता का निषेध, और गंभीर प्रसवोत्तर सिस्टिक रोग का विकास हुआ, जिसके परिणामस्वरूप समय से पहले मृत्यु हो गई। यह असामान्य माइटोकॉन्ड्रियल आकारिकी, ऑक्सीजन की खपत में कमी और ग्लाइकोलाइटिक प्रवाह में वृद्धि से जुड़ा था। इसके अलावा, हमने पाया कि murine और मानव में TFAM की अभिव्यक्ति कम हो गई थीपॉलीसिस्टिक किडनी, जो माइटोकॉन्ड्रियल रिक्तीकरण के साथ था। इस प्रकार, हमारा डेटा बताता है कि TFAM अभिव्यक्ति और माइटोकॉन्ड्रियल रिक्तीकरण की विकृति आणविक विशेषताएं हैंगुर्दासिस्टिक रोग जो इसके रोगजनन में योगदान कर सकता है।

कीवर्ड: ग्लाइकोलाइसिस; गुर्दे का विकास; माइटोकॉन्ड्रिया;पॉलीसिस्टिक किडनी रोग; टीएफएएम

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अनुवाद संबंधी वक्तव्य

हमने माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन की भूमिका को समझने के लिए माउस आनुवंशिकी का उपयोग किया हैगुर्दाहोमियोस्टेसिस। साइन ओकुलिस से संबंधित होमोबॉक्स 2 एपिथेलियल पूर्वज कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर ए (टीएफएएम) की निष्क्रियता के परिणामस्वरूपगुर्देअसफलतागंभीर होने के कारणपॉलीसिस्टिक किडनी बीमारी. हमारे निष्कर्षों से पता चलता है कि प्रगतिशील माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता दोषपूर्ण उपकला भेदभाव से जुड़ी है औरगुर्देसिस्टोजेनेसिस इसके अलावा, हमने स्थापित किया कि मानव में टीएफएएम अभिव्यक्ति और माइटोकॉन्ड्रियल संख्या कम हो गई थीपॉलीसिस्टिक किडनीऊतक। हमारे अध्ययन से पता चलता है कि चिकित्सीय रणनीतियाँ, जिसका उद्देश्य माइटोकॉन्ड्रियल स्वास्थ्य में सुधार करना है, ऑटोसोमल प्रमुख वाले रोगियों के उपचार में फायदेमंद हो सकती हैपॉलीसिस्टिक किडनीबीमारी.

माइटोकॉन्ड्रियल (एमटी) डिसफंक्शन सामान्य की एक अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त रोग संबंधी विशेषता हैगुर्दा बीमारीऔर सेलुलर चोट, सूजन, और फाइब्रोसिस को ट्रिगर कर सकता है। 1 मेंगुर्दा, ट्यूबलर उपकला कोशिकाएं ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण (OXPHOS) से उत्पन्न एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) पर अत्यधिक निर्भर होती हैं क्योंकि वे कई ऊर्जा-खपत उपकला परिवहन कार्य करती हैं। इसलिए, गुर्दे के सामान्य कार्य और प्रणालीगत इलेक्ट्रोलाइट होमियोस्टेसिस के लिए कुशल एमटी एटीपी उत्पादन का निर्वाह आवश्यक है। इसके अलावा, हाल के साक्ष्य इंगित करते हैं कि मध्यस्थ मेटाबोलाइट्स और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) की पीढ़ी के माध्यम से जीन विनियमन, सेलुलर सिग्नलिंग और सेल भेदभाव में माइटोकॉन्ड्रिया की एक प्रमुख भूमिका है। इन प्रगति के बावजूद, सामान्य के रोगजनन में एमटी सिग्नलिंग की भूमिकागुर्दाबीमारीअच्छी तरह से समझ में नहीं आता है।

एमटी फ़ंक्शन की जांच करने के लिएगुर्देहोमियोस्टेसिस और रोगजनन, हमने माइटोकॉन्ड्रियल प्रतिलेखन कारक ए (टीएफएएम) को लक्षित किया। टीएफएएम एमटी फ़ंक्शन, एमटी कॉपी नंबर के रखरखाव और एमटी डीएनए की संरचनात्मक स्थिरता के लिए आवश्यक एक परमाणु-एन्कोडेड कारक है क्योंकि यह प्रमोटर डीएनए को झुकाकर एमटी जीनोम की प्रतिकृति और प्रतिलेखन को नियंत्रित करता है। 3,4 स्तनधारी एमटी डीएनए में 37 जीन होते हैं, 13 जिनमें से श्वसन श्रृंखला परिसर के प्रोटीन सबयूनिट्स, 22 एनकोड ट्रांसफर आरएनए, और 2 राइबोसोमल आरएनए। MT-CYB), माइटोकॉन्ड्रियल रूप से एन्कोडेड साइटोक्रोम c ऑक्सीडेज सबयूनिट 1 (MT-CO1) और माइटोकॉन्ड्रियल रूप से एन्कोडेड ATP सिंथेज़ मेम्ब्रेन सबयूनिट 6 (MTATP6) .3,5TFAM के बिना, कोशिकाएं OXPHOS के माध्यम से ATP का उत्पादन करने की क्षमता खो देती हैं, महत्वपूर्ण मात्रा में mt उत्पन्न नहीं कर सकती हैं। ROS, और माइटोकॉन्ड्रिया से उत्तरोत्तर समाप्त हो जाते हैं। 6–9 आनुवंशिक अध्ययनों से पता चला है कि TFAM सामान्य भ्रूणजनन के लिए आवश्यक है क्योंकि वैश्विक समरूप Tfam निष्क्रियता के परिणामस्वरूप अंतर्गर्भाशयी भ्रूण के दिन 10.5 तक घातकता, जबकि विषमयुग्मजी कमी, हालांकि इसने एमटी कॉपी संख्या को ~ 40 प्रतिशत तक कम कर दिया और श्वसन श्रृंखला की कमी का कारण बना, इससे भ्रूण की मृत्यु नहीं हुई। इस प्रकार, टीएफएएम का आनुवंशिक लक्ष्य भूमिका की जांच के लिए एक उपयोगी प्रयोगात्मक रणनीति है। कोशिकीय विभेदन और ऊतक होमियोस्टेसिस में प्रगतिशील एमटी शिथिलता। Tfam के सेल-प्रकार-विशिष्ट सशर्त निष्क्रियता ने सुझाव दिया कि OXPHOS और/या mt ROS पीढ़ी सेलुलर भेदभाव, कार्य और सामान्य शरीर क्रिया विज्ञान के लिए महत्वपूर्ण है। 6-10

परमाणु या एमटी जीन उत्परिवर्तन के कारण प्राथमिक एमटी विकार उपस्थित हो सकते हैंगुर्दा बीमारीसबसे आम तौर पर ट्यूबलोइन्टरस्टिशियल चोट या पृथक ट्यूबलर डिसफंक्शन के रूप में प्रकट होता है। 11,12 हालांकि कुछ मानव रोगों जैसे कि न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के रोगजनन में निहित है, टीएफएएम में 13 विशिष्ट उत्परिवर्तन के कारणगुर्देरोग की सूचना नहीं मिली है। हाल ही में, घटी हुई TFAM अभिव्यक्ति को क्रोनिक से जोड़ा गया हैगुर्दाबीमारी. Tfam निष्क्रियता के कारण एमटी अखंडता का नुकसान ट्यूबलोइन्टरस्टिशियल रोग का कारण बना औरगुर्दे असफलताचूहों में, जो आंशिक रूप से एमटी डीएनए तनाव-प्रेरित चक्रीय जीएमपी-एएमपी सिंथेज़ (सीजीएएस) के सक्रियण के कारण था - इंटरफेरॉन जीन (स्टिंग) के उत्तेजक-निर्भर भड़काऊ प्रतिक्रियाएं।14

यहां हम रिपोर्ट करते हैं कि साइन ओकुलिस-संबंधित होमोबॉक्स 2 (SIX2) -एक्सप्रेसिंग नेफ्रॉन पूर्वज कोशिकाओं में सशर्त Tfam निष्क्रियता वाले चूहों में गंभीर सिस्टिक रोग विकसित होता है और समय से पहले मर जाता हैगुर्देअसफलतायुवा किशोर चूहों के रूप में।तफ़ाम^-/- चूहों को नेफ्रॉन परिपक्वता में दोषों की विशेषता थी, जो एमटी कमी, ओएक्सपीएचओएस में कमी और ग्लाइकोलाइसिस की ओर एक चयापचय बदलाव से जुड़ा था।तफ़ाम^-/- गुर्देउपकला. में सिस्टिक रोग की गंभीरता को देखते हुएतफ़ाम^-/- चूहों, हमने 2 माउस मॉडल का विश्लेषण कियापॉलीसिस्टिक किडनीबीमारी(पीकेडी), जो या तो पॉलीसिस्टिन में उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप होता है-1 (पीकेडी(पॉलीसिस्टिक किडनी रोग)1) या सिस्टिन-1 (Cys1), साथ ही ऑटोसोमल डोमिनेंट पॉलीसिस्टिक किडनी रोग (ADPKD) के रोगियों के मानव ऊतक। हम इसे स्थापित करते हैंतफ़ाम^-/- दोनों murine और मानव PKD . से अल्सर में विकृत है(पॉलीसिस्टिक किडनी रोग), ऊतक। एक साथ लिया गया, हमारे अध्ययन से पता चलता है कि टीएफएएम डिसरेग्यूलेशन और एमटी रिक्तीकरण इसकी विशेषता विशेषताएं हैंगुर्देसिस्टिक रोग और उनके रोगजनन में एक सहायक भूमिका हो सकती है।

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परिणाम

SIX2 वंश कोशिकाओं में Tfam निष्क्रियता गंभीर पुटीय रोग का कारण बनती है जिसके परिणामस्वरूपगुर्देअसफलतामें एमटी फ़ंक्शन की जांच करने के लिएगुर्देएपिथेलियम, हमने Tfam को SIX 2- में पूर्वज कोशिकाओं को व्यक्त करते हुए निष्क्रिय कर दिया, जो कलेक्टिंग डक्ट (CD) को छोड़कर सभी नेफ्रॉन सेगमेंट को जन्म देते हैं। इसके लिए, हमने बैक्टीरियल कृत्रिम क्रोमोसोम ट्रांसजेनिक चूहों के साथ Tfam floxed एलील को पार किया जो व्यक्त करते हैं सिक्स2 प्रमोटर (चित्रा 1 ए) के ट्रांसक्रिप्शनल कंट्रोल के तहत एक उन्नत हरित फ्लोरोसेंट प्रोटीन / आरई रीकॉम्बिनेज फ्यूजन प्रोटीन (ईजीएफपी / आरई)। 16 टीएफएम फ्लोक्स एलील के लिए समरूप चूहे और ईजीएफपी / आरई ट्रांसजीन के लिए विषमयुग्मजी (छह2-eGFP/Cretg/^{टीजी प्लस}; तफ़ाम^fl/fl) यहां से सिक्स के रूप में संदर्भित है2-तफ़ाम^-/- म्यूटेंट छह2-तफ़ाम^-/- चूहों का जन्म अपेक्षित मेंडेलियन अनुपात में हुआ था और जन्म के समय दृश्य निरीक्षण द्वारा Cre कूड़े के नियंत्रण से अलग नहीं थे। हालांकि, छह के बीच शरीर के वजन में अंतर2-तफ़ाम^-/- प्रसवोत्तर दिन (पी) 14 (5.7 प्लस -0। म्यूटेंट बनाम 7.5 प्लस -0.3 ग्राम नियंत्रण के लिए, एन =4 प्रत्येक के लिए म्यूटेंट और आरई लिटमेट नियंत्रण स्पष्ट हो गए, पी =0.004; अनुपूरक तालिका S1)। छह2-तफ़ाम^-/- उत्परिवर्ती चूहों को बढ़े हुए की विशेषता थीगुर्देनियंत्रण के साथ तुलना (गुर्दा/शरीर के वजन का अनुपात 1.45 प्रतिशत प्लस -0.19 प्रतिशत म्यूटेंट बनाम 0.60 प्रतिशत प्लस - 0.02 प्रतिशत नियंत्रण के लिए, n {{8} } प्रत्येक, पी <0.001; चित्र="" 1b,="" अनुपूरक="" तालिका="" s1)="" और="" p20="" और="" p30="" (चित्र="" 1b)="" की="" आयु="" के="" बीच="" मृत्यु="" हो="" गई।="" उत्परिवर्ती="" सहवास="" में="" किशोर="" घातकता="" किसके="" साथ="" जुड़ी="">गुर्देअसफलता68.4 के रक्त यूरिया नाइट्रोजन के स्तर के साथ गंभीर सिस्टिक रोग से 0 प्लस -5। उत्परिवर्ती चूहों के लिए 32 मिलीग्राम/डेसीलीटर बनाम 16.8 2।0 नियंत्रण के लिए मिलीग्राम/डीएल ( n= 6 और 7, क्रमशः; P < 0.0001;="" चित्र="" 1b="" और="" c)।="" इसके="" अलावा,="" छह2-tfam="" म्यूटेंट="" ने="" महत्वपूर्ण="" एल्बुमिनुरिया="" (मूत्र="" एल्बुमिन/क्रिएटिनिन="" अनुपात="" 43.58="" प्लस="" -362.475.18="" mg/g="" इन="" सिक्स2-tfam="" म्यूटेंट="" बनाम="" 3.39="" mg/g="" नियंत्रण="" में="" विकसित="" किया="" है।="" p14,="" n="6" और="" 10="" पर="" क्रमशः;="" p=""><0.0001)। यह="" six2="" नेफ्रॉन="" पूर्वज="" कोशिकाओं="" में="" cre="" recombinase="" के="" अभिव्यक्ति="" पैटर्न="" के="" अनुरूप="" है,="" जो="" कैप="" मेसेनचाइम-व्युत्पन्न="" को="" जन्म="" देता="">गुर्देनलिकाएं और पोडोसाइट्स.15 छह के विपरीत2-तफ़ाम^-/- म्यूटेंट, सामान्य रूप से विकसित SIX2 पूर्वज कोशिकाओं में विषमयुग्मजी Tfam की कमी वाले चूहे उपजाऊ थे, और विकसित नहीं हुए थेगुर्दाबीमारी(पूरक चित्रा S1)।

चित्र 1|SIX2 वंश कोशिकाओं में Tfam निष्क्रियता के परिणामस्वरूप गंभीर सिस्टिक रोग और गुर्दे की विफलता होती है। (ए) Tfam फ्लक्स एलील के भीतर लक्षित अनुक्रमों के प्रयोगात्मक दृष्टिकोण और स्थान को दर्शाने वाला एक योजनाबद्ध। लिटमेट कंट्रोल (Cre ) और सिक्स से पृथक कुल जीनोमिक किडनी डीएनए का पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन विश्लेषण 2-तफ़ाम^-/-प्रसवोत्तर दिन में चूहों (पी) 7; गैर-संयोजन Tfam floxed एलील को 2-lox (2) द्वारा निरूपित किया जाता है; 1-lox द्वारा पुनर्संयोजित एलील, wt द्वारा वाइल्ड टाइप एलील; þ या - सिक्स2-eGFP/Cre ट्रांसजीन की उपस्थिति या अनुपस्थिति का संकेत देते हैं। (बी) बाएं पैनल, Cre नियंत्रण से गुर्दे की तस्वीरें और छह2-तफ़ाम^-/- P20 की उम्र में चूहे। गुर्दा भार (KWs) को शरीर के भार (BW) (n= 4–14) के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जाता है। Cre लिटमेट कंट्रोल (सह) और छह 2- में दाएं पैनल, रक्त यूरिया नाइट्रोजन (बीयूएन) का स्तरतफ़ाम^-/-चूहों की उम्र P7 (n=7 और 6, क्रमशः) और कपलान-मीयर जीवित रहने के लिए Cre नियंत्रण और छह 2-तफ़ाम^-/- लॉग-रैंक टेस्ट (n=10–13) के साथ तुलना में चूहों। (सी) Cre नियंत्रण से फॉर्मेलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड किडनी वर्गों की प्रतिनिधि छवियां और छह2-तफ़ाम^-/-P7 और P29 की उम्र के चूहों को हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन (H&E) से सना हुआ है और एक चिकनी पेशी एक्टिन (ACTA2) और क्लस्टर विभेदन (CD) एंटीजन 31 के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा विश्लेषण किया गया है। संख्या संकेत सिस्टिक संरचनाओं को दर्शाते हैं और तारक ग्लोमेरुली को दर्शाते हैं। बार्स पूरे किडनी क्रॉस-सेक्शन के लिए 1 मिमी, उच्च-शक्ति एच एंड ई छवियों के लिए 1 0 0 मिमी, और आईएचसी छवियों के लिए 50 मिमी। डेटा को माध्य प्लस - SEM के रूप में व्यक्त किया जाता है और 2-पूंछ वाले छात्र के t -est द्वारा विश्लेषण किया गया था। *** पी <0.001। इस="" छवि="" को="" देखने="" का="" अनुकूलन="" करने="" के="" लिए,="" कृपया="" इस="" लेख="" का="" ऑनलाइन="" संस्करण="" www.kidney-international.org="" .="" पर="">

छह का विश्लेषण2-तफ़ाम^-/- चूहों, जिसने ROSA26-ACTB-tdTomato,-eGFP Cre रिपोर्टर एलील भी व्यक्त किया, जिसे यहां सिक्स2-mT/mG कहा गया है;तफ़ाम^-/- चूहों, यह दर्शाता है कि सिस्टिक संरचनाओं के विशाल बहुमत मेंतफ़ाम^-/- गुर्दे छह2-eGFP/Cre अभिव्यक्ति (सप्लीमेंट्री फिगर S2) के इतिहास वाली कोशिकाओं से प्राप्त किए गए थे। छह में अल्सर2-तफ़ाम^-/- गुर्देKi67-पॉजिटिव सिस्ट लाइनिंग एपिथेलियल कोशिकाओं (औसतन सभी सिस्ट लाइनिंग एपिथेलियल कोशिकाओं का w40 प्रतिशत) की उपस्थिति द्वारा प्रदर्शित प्रसार के प्रमाण दिखाए गए, जबकि सिस्ट के भीतर क्लीवेड कास्पेज़ 3 के लिए सकारात्मक कोशिकाओं का पता नहीं चला था (सप्लीमेंट्री फिगर S3 ) ये निष्कर्ष सिक्स 2- में बढ़े हुए फॉस्फोराइलेटेड एक्स्ट्रासेलुलर सिग्नल-रेगुलेटेड किनसे (पी-ईआरके) और बी-कैटेनिन स्तरों के अनुरूप हैं।तफ़ाम^-/- गुर्दे के ऊतक (पूरक चित्रा S3)। एक साथ लिया गया, हमारा डेटा दर्शाता है कि छह2-तफ़ाम^-/- गुर्दे आणविक विशेषताओं का प्रदर्शन करते हैं जो अक्सर जुड़े होते हैंगुर्देसिस्टिक रोग।

चित्र 3 |तफ़ाम^-/-अल्सर सामान्य नेफ्रॉन खंड-विशिष्ट मार्करों को व्यक्त नहीं करते हैं। (ए) सिक्स2-mT/mG से फॉर्मेलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड किडनी वर्गों की प्रतिनिधि छवियां;तफ़ाम^-/-mice at age postnatal day (P) 14 stained for enhanced green fluorescent protein (eGFP), megalin, uromodulin, thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter (NCC), and aquaporin 2 (AQP2) by immunofluorescence (IF). 4',6-diamidino-2-phenylindole was used for nuclear staining (blue fluorescence). Arrows depict tubular structures expressing respective nephron segment-specific markers. Nephron segment marker expression was assessed in cysts with a maximal diameter of >50 मिमी। (बी) सिक्स2-mT/mG से फॉर्मेलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड किडनी वर्गों की प्रतिनिधि छवियां;तफ़ाम^-/-P14 की उम्र में चूहों को IF द्वारा eGFP और uromodulin के लिए दाग दिया गया। तारांकन सिस्ट को इंट्राल्यूमिनल यूरोमोडुलिन के साथ दर्शाते हैं। 50-100 . के अधिकतम व्यास वाले अल्सर में इंट्राल्यूमिनल यूरोमोडुलिन की उपस्थिति की जांच की गई थीμमी या अधिकतम व्यास में 100 मिमी से बड़े अल्सर में। बार्स=(ए, बी) 100 मिमी। इस छवि को देखने का अनुकूलन करने के लिए, कृपया इस लेख का ऑनलाइन संस्करण देखेंwww.kidney-international.org।

सिस्टैंचेके लिए अच्छा हैगुर्दा

छह में नेफ्रॉन की परिपक्वता दोषपूर्ण है2-Tfam^-/-चूहे

क्योंकि ऊतक-विशिष्ट Tfam निष्क्रियता वाले चूहों में विकृति विकसित होने में कई सप्ताह लग सकते हैं, हमने अगली बार इसके समय के पाठ्यक्रम की जांच की।गुर्देछह में रोग विकास2-तफ़ाम^-/-चूहे। हमने P0, P7, और P14 की उम्र में नियंत्रण और उत्परिवर्ती चूहों से गुर्दे एकत्र किए और हिस्टोलॉजिक विधियों, इम्यूनोफ्लोरेसेंस (IF) धुंधला हो जाना, और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण का इस्तेमाल किया।गुर्दामूल्यांकन के लिए अर्क। अगर P0 की उम्र में SIX2 और E-Cadherin के लिए धुंधला हो जाना दर्शाता है कि गुर्दे नियंत्रण से और छह2-तफ़ाम^-/-हिस्टोलॉजिकल रूप से समान थे। कॉर्टिकल नेफ्रोजेनिक ज़ोन संरचनाओं का निर्माण, जैसे कि SIX2þ कैप मेसेनकाइम, ई-कैडरिन- यूरेरिक टिप्स व्यक्त करना, और नवजात नेफ्रॉन संरचनाएं जैसे किगुर्देपुटिकाओं और अल्पविराम के आकार और एस-आकार के निकायों को छह में अवरुद्ध नहीं किया गया था2-तफ़ाम^-/-गुर्दे (चित्र 2a)। ये हिस्टोलॉजिक निष्कर्ष नेफ्रोजेनिक मार्करों को कूटने वाले जीन के अभिव्यक्ति स्तरों के अनुरूप थे। सिक्स2, पेयर्ड बॉक्स 2 (पैक्स2), लिम होमोबॉक्स प्रोटीन 1 (एलएचएक्स1), और स्पाल्ट-लाइक ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर 1 (सॉल1) एमआरएनए स्तर नियंत्रण और छह के बीच काफी भिन्न नहीं थे 2-तफ़ाम^-/- कुल मिलाकर चूहेगुर्दाP0 से समरूपगुर्दे(चित्रा 2बी)। इसने सुझाव दिया कि SIX2 नेफ्रॉन पूर्वजों में TFAM निष्क्रियता नेफ्रोजेनिक संरचनाओं के गठन को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं करती है।

हालांकि नवजात नेफ्रॉन संरचना के गठन को बाधित नहीं किया गया था, लेकिन एलिसियन ब्लू/पीरियोडिक एसिड-शिफ और लोटस टेट्रागोनोलोबस लेक्टिन के साथ धुंधला हो जाना सिक्स में दोषपूर्ण टर्मिनल नेफ्रॉन परिपक्वता का संकेत देता है2-तफ़ाम^-/-P{{0}} की उम्र में चूहे। एल्कियन ब्लू / पीरियोडिक एसिड-शिफ, जो ट्यूबलर बेसमेंट मेम्ब्रेन और ब्रश बॉर्डर पर दाग लगाता है, और लोटस टेट्रागोनोलोबस लेक्टिन, जो समीपस्थ ट्यूब्यूल कोशिकाओं के ब्रश बॉर्डर में विशिष्ट ओलिगोसेकेराइड की पहचान करता है, दोनों उत्परिवर्ती गुर्दे में कम हो गए थे। चित्र 2c में एल्कियन ब्लू/आवधिक अम्ल- P0, P7, और P14 समय बिंदुओं पर शिफ़ धुंधला दिखाई देता है। लोटस टेट्रागोनोलोबस लेक्टिन हिस्टोकेमिस्ट्री और आईएफ स्टेनिंग विल्म्स ट्यूमर 1 प्रोटीन के लिए पी {{1 0}}, पी 7, और पी 14 समय बिंदुओं पर पूरक चित्रा एस 4 में दिखाए गए हैं। P0 की उम्र में, कमल टेट्रागोनोलोबस लेक्टिन के साथ सकारात्मक दाग वाला सापेक्ष क्षेत्र 2.10 प्रतिशत, 0.51 प्रतिशत और {{30}}.39 प्रतिशत था। पी7 की उम्र में 0.1 प्रतिशत बनाम 6.25 प्रतिशत 0.28 प्रतिशत और 6.2 प्रतिशत नियंत्रण के लिए 1.1 प्रतिशत, क्रमशः (एन 3-4, पी 0.0004 और 0.0007, क्रमशः; पूरक चित्रा एस4)। इन हिस्टोलॉजिक निष्कर्षों के अनुरूप ग्लोमेरुलर और नेफ्रॉन सेगमेंट-विशिष्ट मार्कर पॉडोसिन, नेफ्रिन, एक्वापोरिन 1 (Aqp1), सोडियम-फॉस्फेट कोट्रांसपोर्टर 2a (NaPi2a), यूरोमोडुलिन, सोडियम-पोटेशियम क्लोराइड कोट्रांसपोर्टर 2 को एन्कोडिंग करने वाले जीन की अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण कमी है। Nkcc2), और थियाजाइड-संवेदनशील सोडियम क्लोराइड कोट्रांसपोर्टर (Ncc) सिक्स में2-तफ़ाम^-/-चूहों (चित्रा 2 बी)। एक साथ लिया गया, ये आंकड़े बताते हैं कि छह2-तफ़ाम^-/- गुर्देपरिपक्व समीपस्थ नेफ्रॉन खंडों और ग्लोमेरुली की संख्या में प्रगतिशील कमी प्रदर्शित करता है।

चूँकि छह2-eGFP/Cre गतिविधि का परिणाम TFAM-कमी वाले कैप मेसेनकाइम-व्युत्पन्न नेफ्रॉन खंडों में होता है, हमने भविष्यवाणी की थी कि सीडी उपकला कोशिकाओं की परिपक्वता, जो मूत्रवाहिनी कली-व्युत्पन्न हैं, छह में प्रभावित नहीं होंगी{{2} }तफ़ाम^-/-गुर्दे। इस धारणा के अनुरूप यह है कि डोलिचोस बाइफ्लोरस एग्लूटीनिन के साथ धुंधला हो जाना, जो डिस्टल ट्यूब्यूल और सीडी में एन-एसिटाइल-डी-गैलेक्टोज के साथ प्रतिक्रिया करता है, ने सिक्स 2- में डोलिचोस बाइफ्लोरस एग्लूटीनिन-पॉजिटिव संरचनाओं के एक सापेक्ष ओवररिप्रिटेशन का संकेत दिया।तफ़ाम^-/-गुर्दे। P7 की उम्र में, Dolichos biflorus agglutinin के लिए सकारात्मक दाग वाले क्षेत्रों में 13.91 प्रतिशत 0 शामिल थे। म्यूटेंट के लिए कुल क्षेत्रफल का 9 प्रतिशत बनाम 1.93 प्रतिशत 0। नियंत्रण के लिए 1 प्रतिशत (n ¼ 3, P ¼ { {10}}.0002; पूरक चित्र S4)। सोडियम चैनल एपिथेलियल 1 अल्फा सबयूनिट (Scnn1a) या एक्वापोरिन 2 (Aqp2) की mRNA अभिव्यक्ति, जो दोनों सीडी उपकला कोशिकाओं में व्यक्त की जाती हैं, नियंत्रण (चित्रा 2 बी) की तुलना में काफी कम नहीं हुई थी। सिक्स के विपरीत2-तफ़ाम^-/-गुर्दे, होमोबॉक्स B7 (HOXB7) पूर्वज कोशिकाओं में Tfam निष्क्रियता, जो सीडी उपकला कोशिकाओं को जन्म देती है, जिसके परिणामस्वरूप सीडी नेफ्रॉन मार्कर अभिव्यक्ति और हल्के ट्यूबलर फैलाव का नुकसान होता है लेकिन सिस्टोजेनेसिस (पूरक चित्रा S5) नहीं। एक साथ लिया गया, हमारे डेटा से संकेत मिलता है कि SIX2 पूर्वज कोशिकाओं में TFAM फ़ंक्शन का नुकसान नवजात नेफ्रॉन संरचनाओं के विकास को अवरुद्ध नहीं करता है, लेकिन टर्मिनल नेफ्रॉन परिपक्वता को रोकता है।

तफ़ाम^-/-आम नेफ्रॉन खंड मार्करों में अल्सर की कमी है

के हिस्टोजेनेटिक मूल को चिह्नित करने के लिएतफ़ाम^-/- गुर्देसिस्ट, हमने IF का विश्लेषण कियातफ़ाम^-/- गुर्देat age P14 and examined the expression of nephron segment markers megalin (proximal tubule), uromodulin (medullary thick ascending limb of Henle), thiazide sensitive sodium chloride cotransporter (distal tubule), and aquaporin 2 (CD). The majority of cysts with a maximal diameter of >50 mm did not express these segment-specific markers, indicating a lack of cellular differentiation (Figure 3a, Supplementary Figure S6). Furthermore, approximately 50% of cysts with a maximal diameter of >50 मिमी को यूरोमोडुलिन के इंट्राल्यूमिनल डिपॉजिट की विशेषता थी, जिसने नेफ्रॉन सेगमेंट से समीपस्थ नलिका और हेनले के अवरोही लूप (चित्रा 3 बी) की उत्पत्ति का सुझाव दिया।

एमटी फ़ंक्शन और आकारिकी में प्रगतिशील असामान्यताएंतफ़ाम^-/- उपकला कोशिकाएं

Tfam विलोपन के चयापचय परिणामों के समय के पाठ्यक्रम को चिह्नित करने के लिए, हमने पहले Tfam और TFAM-विनियमित mt-Co1, mt-Cyb, और mt-Atp6 के mRNA स्तर की जांच की।तफ़ाम^-/- गुर्देP0, P7, और P14 की उम्र में। जैसा कि अपेक्षित था, Tfam, mt-Co1, mt-Cyb, और mt-Atp6 mRNA स्तर काफी कम हो गए थे (चित्र 4a)।तफ़ाम^-/-eGFP (छह {0}} mT/mG; Tfam / चूहों) के साथ टैग की गई उपकला कोशिकाओं ने MT-CO1 प्रोटीन अभिव्यक्ति (पूरक चित्रा S7) में उल्लेखनीय कमी प्रदर्शित की। एमटी डीएनए कॉपी संख्या में 63 प्रतिशत की कमी आई थी, जो टीएफएएम की कमी (चित्रा 4 ए) की एक बानगी एमटी कमी के अनुरूप है। इसके विपरीत, निकोटिनमाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड को कूटने वाले परमाणु जीन की अभिव्यक्ति: ubiquinone oxidoreductase core सबयूनिट 3 (Ndufs3) और सक्सेनेट डिहाइड्रोजनेज कॉम्प्लेक्स फ्लेवोप्रोटीन सबयूनिट A (Sdha) P0 की उम्र में प्रभावित नहीं था, लेकिन P7 और P14 (चित्र 4a) की उम्र में कम हो गया था। एमटी जीन और प्रोटीन विश्लेषण के ये निष्कर्ष Tfam / एपिथेलियम में एमटी कॉपी संख्या के प्रगतिशील नुकसान के अनुरूप हैं।

हमने अगली बार P7 की उम्र में पृथक प्राथमिक समीपस्थ नलिका उपकला कोशिकाओं (PTECs) में Tfam निष्क्रियता के चयापचय प्रभावों की जांच की।तफ़ाम^-/- PTECs ने बेसल ऑक्सीजन खपत दर (40.77 4.10 म्यूटेंट बनाम 61.75 5.18 pmol/min/104 कोशिकाओं को नियंत्रण के लिए, n=3 प्रत्येक, P =0.034), एटीपी-लिंक्ड श्वसन (33.11 3.91 म्यूटेंट बनाम 46.92 4.91 pmol/min/104 कोशिकाओं को नियंत्रण के लिए, n{{18} } प्रत्येक, P=0.093), अधिकतम श्वसन (116.8 14.19 म्यूटेंट बनाम 225.5 13.55 pmol/min/104 कोशिकाओं को नियंत्रण के लिए, n{{ 28}} प्रत्येक, P=0.005), और अतिरिक्त श्वसन क्षमता (76.05 10.18 म्यूटेंट बनाम 163.7 8.61 pmol/min/104 कोशिकाओं को नियंत्रण के लिए , एन =3 प्रत्येक, पी=0.003; चित्रा 4बी)।

एमटी कमी और क्षति की डिग्री को आगे बढ़ाने के लिए, हमने जांच कीतफ़ाम^-/- गुर्देट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और {0}}आयामी संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (3D सिम) द्वारा। P7 की उम्र में, माइटोकॉन्ड्रिया ने अनियमित आकार और गुब्बारे का प्रदर्शन किया, जो Tfam नॉकआउट चूहों में पिछले निष्कर्षों के अनुरूप हैं। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म विश्लेषण ने संकेत दिया कि माइटोकॉन्ड्रिया की संरचनात्मक असामान्यताएं, जैसे कि बढ़े हुए आकार और असामान्य क्राइस्ट, प्रसवोत्तर रूप से आगे बढ़े क्योंकि म्यूटेंट और नियंत्रण के बीच रूपात्मक अंतर P 0 की उम्र में कम स्पष्ट थे और उम्र के साथ और अधिक गंभीर हो गए (चित्र 4c) ) 3डी सिम का उपयोग एमटी वॉल्यूम और नेटवर्क आकार की जांच के लिए सिक्स2-mT/mG में किया गया था; Tfam / म्यूटेंट की तुलना छह2-mT/mG नियंत्रण चूहों के साथ P7 आयु में की जाती है; 25 से 4 0 ईजीएफपी-पॉजिटिव कॉर्टिकल एपिथेलियल कोशिकाओं की जांच करते हुए, आईएफ धुंधला द्वारा वोल्टेज-निर्भर आयनों-चयनात्मक चैनल 1 के लिए दागे गए 5 से 8 नलिकाओं के क्रॉस-सेक्शन में एमटी वॉल्यूम को मापा गया था। हमने पाया कि प्रति ईजीएफपी पॉजिटिव सेल का कुल एमटी वॉल्यूम काफी कम हो गया था (62.66 16.46 एमएम3/ म्यूटेंट के लिए सेल बनाम 177.4 30.17 एमएम3/कंट्रोल के लिए सेल, एन 3 प्रत्येक , P ¼ 0.0289) और यह 0.230 0.01 से नियंत्रण में 0.{{{{{} 33}}.016 इन सिक्स2-Tfam / म्यूटेंट (n 3 प्रत्येक, P ¼ 0.0017; चित्र 4c)। अधिकतम एमटी नेटवर्क आकार, जो जांचे गए सभी ईजीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं में सामने आए सबसे बड़े एमटी नेटवर्क को मापता है, छह में घटाया गया था2-तफ़ाम^-/- गुर्दे(143.2 23.2 मिमी3 म्यूटेंट बनाम 318.3 49.45 मिमी3 नियंत्रण के लिए, n 3 प्रत्येक, P ¼ 0.0327)। एक साथ लिया गया, अल्ट्रास्ट्रक्चरल और सिम निष्कर्ष और एमटी जीन और प्रोटीन विश्लेषण से निष्कर्ष एमटी कॉपी संख्या के प्रगतिशील नुकसान के अनुरूप हैंतफ़ाम^-/- उपकला.

सिस्टांचेके लिए अच्छा हैपॉलीसिस्टिक किडनी रोग

TFAM की कमी गुर्दे के उपकला चयापचय को ग्लाइकोलाइसिस की ओर ले जाती है

में PTECsगुर्दाएटीपी पीढ़ी के लिए फैटी एसिड बी-ऑक्सीकरण और ओएक्सपीएचओएस का उपयोग करें और ग्लूकोनोजेनेटिक हैं। 18 टीएफएएम निष्क्रियता से जुड़े चयापचय परिवर्तनों में अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, हमने आरएनए अनुक्रमण विश्लेषण कियागुर्देछह से2-तफ़ाम^-/-और Cre लिटमेट नियंत्रण चूहों को P7 की उम्र में। हमने पाया कि ग्लाइकोलाइसिस में शामिल प्रमुख नियामक जीन, जैसे कि हेक्सोकाइनेज 2 (Hk2) और एनोलेज़ 2 (Eno2) को अपग्रेड किया गया था। इसके विपरीत, ट्राइकारबॉक्सिलिक एसिड चक्र में शामिल अधिकांश जीनों की अभिव्यक्ति कम हो गई थी (उदाहरण के लिए, आइसोसाइट्रेट डिहाइड्रोजनेज 1 [Idh1]), जैसा कि फैटी एसिड बी-ऑक्सीकरण में शामिल जीन की अभिव्यक्ति थी, जैसे एसिटाइल-कोएंजाइम ए एसाइलट्रांसफेरेज़ 1 बी ( Acaa1b), मध्यम-श्रृंखला एसाइल-कोएंजाइम A डिहाइड्रोजनेज (Acadm) (चित्र 5a और b, अनुपूरक चित्र S8)। ट्राइकारबॉक्सिलिक एसिड चक्र में शामिल जीनों की घटी हुई अभिव्यक्ति के अनुरूप -ऑक्सीडेशन जीन तटस्थ लिपिड का संचय था जैसा कि जमे हुए में तेल लाल ओ धुंधला द्वारा पता चला थागुर्दाP14 (चित्र 5c) की आयु में अनुभाग।

murine और मानव PKD ऊतकों में कम TFAM अभिव्यक्ति mt रिक्तीकरण के साथ जुड़ा हुआ है

क्योंकि छह2-तफ़ाम^-/- गुर्देPKD . के साथ एक मजबूत समानता बोर(पॉलीसिस्टिक किडनी रोग) गुर्दे, हमने अगला मूल्यांकन किया कि क्या TFAM को PKD . में विकृत किया गया था(पॉलीसिस्टिक किडनी रोग)ऊतक। हमने पहले 2 अच्छी तरह से स्थापित आनुवंशिक PKD माउस मॉडल में TFAM और TFAM विनियमित जीन अभिव्यक्ति की जांच की। Pkd . से पूरे गुर्दे के समरूपों में Tfam mRNA का स्तर काफी कम हो गया था^-/- और Cys^{सीपीके/सीपीके}चूहों, जो या तो PKD1 . में उत्परिवर्तन करते हैं(पॉलीसिस्टिक किडनी रोग)या Cys1. यह माइटोकॉन्ड्रियल और परमाणु-एन्कोडेड एमटी जीन की अभिव्यक्ति में कमी के साथ-साथ डिसरेग्युलेटेड ग्लाइकोलाइटिक जीन अभिव्यक्ति से जुड़ा था। छह के समान2-तफ़ाम^-/-गुर्दे, पीकेडी(पॉलीसिस्टिक किडनी रोग)^-/- और Cys^{सीपीके/सीपीके} गुर्देउन्नत Eno2 और Hk2 की विशेषता थी और फॉस्फोग्लाइसेरेट किनसे (Pgk) 1, पाइरूवेट डिहाइड्रोजनेज किनसे (Pdk) 1, और Pdk4 प्रतिलेख स्तर (चित्र 6a) में काफी कमी आई। टीएफएएम प्रोटीन अभिव्यक्ति, जैसा कि आईएफ धुंधला द्वारा मूल्यांकन किया गया था, आसन्न गैर-सिस्टिक नलिकाओं (चित्रा 6 बी) से उपकला कोशिकाओं की तुलना में पुटी अस्तर उपकला कोशिकाओं में कम हो गया था। यह स्वस्थानी संकरण में RNA प्रतिदीप्ति द्वारा कम mt-Co1 और mt-Atp6 अभिव्यक्ति से जुड़ा था (चित्र 6b, अनुपूरक चित्र S9); एमटी वॉल्यूम, जैसा कि 3 डी सिम द्वारा निर्धारित किया गया था, सामान्य नियंत्रण से आसन्न, गैर-सिस्टिक नलिकाओं या पीटीईसी से उपकला कोशिकाओं की तुलना में 55 प्रतिशत कम हो गया था।गुर्दे. गैर-सिस्टिक नलिकाओं से सामान्य नियंत्रण PTECs और PTECs के बीच mt मात्रा में अंतर नहीं पाया गया (चित्र 6c)।

यह जांचने के लिए कि क्या TFAM अभिव्यक्ति का नुकसान मानव PKD . की एक सामान्य आणविक विशेषता है(पॉलीसिस्टिक किडनी रोग), हमने इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, आईएफ स्टेनिंग, आरएनए फ्लोरेसेंस इन सीटू संकरण, और 3 डी सिम द्वारा 5 एडीपीकेडी रोगियों से नेफरेक्टोमी नमूनों का विश्लेषण किया। घटी हुई TFAM अभिव्यक्ति 75.2 प्रतिशत प्लस -7.5 प्रतिशत . में देखी गईगुर्देइम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा विश्लेषण किए गए सिस्ट। यह स्वस्थानी संकरण में RNA प्रतिदीप्ति द्वारा MT-CO1 और MT-ATP6 की घटी हुई अभिव्यक्ति से जुड़ा था (चित्र 7a, अनुपूरक चित्र S10); सिस्ट लाइनिंग एपिथेलियल कोशिकाओं में एमटी वॉल्यूम लगभग 70 प्रतिशत कम हो गया था जैसा कि 3डी सिम (चित्रा 7बी) द्वारा मूल्यांकन किया गया था। एक साथ लिया, 2 PKD . का विश्लेषण(पॉलीसिस्टिक किडनी रोग)माउस मॉडल और मानव ADPKD ऊतकों ने सुझाव दिया कि TFAM की कमी और MT की कमी PKD . में सामान्य निष्कर्ष हैं(पॉलीसिस्टिक किडनी रोग)ऊतकों और के रोगजनन को प्रभावित करने की संभावना हैगुर्देसिस्टिक रोग।

सिस्टैंच के लिए अच्छा हैपॉलीसिस्टिक किडनी रोग

बहस

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से अंश: 'गुर्दाएपिथेलियल लक्षित माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर ए की कमी के परिणामस्वरूप गंभीर सिस्टिक रोग से जुड़े प्रगतिशील माइटोकॉन्ड्रियल रिक्तीकरण 'केन इशी1,2,11 एट अल द्वारा।

---गुर्दाअंतर्राष्ट्रीय (2021) 99, 657-670