मेलनोसोम बायोजेनेसिस, ट्रांसफर और डिग्रेडेशन भाग 1 को विनियमित करके उपन्यास पेप्टाइड मिश्रण का श्वेत प्रभाव

अमूर्त

पेप्टाइड्स पेप्टाइड बांडों से जुड़े अमीनो एसिड की छोटी श्रृंखलाएं हैं। वे व्यापक रूप से कॉस्मेटिक उद्योग में प्रभावी और जैव-संगत सक्रिय अवयवों के रूप में उपयोग किए जाते हैं। इस अध्ययन में, हमने एक नया पेप्टाइड मिश्रण विकसित किया और मेलेनोसाइट्स और केराटिनोसाइट्स पर इसके एंटी-पिगमेंटेशन प्रभाव की पहचान की। हमारे परिणामों से पता चला है कि पेप्टाइड मिश्रण मेलानोसाइट्स में मेलानोजेनेसिस के एक प्रमुख कारक माइक्रोफथाल्मिया-जुड़े प्रतिलेखन कारक के नियमन के माध्यम से मेलेनोसोम जैवजनन को रोकता है। और हमने देखा कि पेप्टाइड मिश्रण ने केराटिनोसाइट्स में एक फैगोसाइटोसिस-संबंधी रिसेप्टर प्रोटीज-सक्रिय रिसेप्टर 2 की कमी के माध्यम से मेलेनोसोम तेज को रोक दिया। इसके अलावा, पेप्टाइड मिश्रण ने ऑटोफैगी सिस्टम को सक्रिय किया जिसके परिणामस्वरूप केराटिनोसाइट्स में स्थानांतरित मेलानोसोम्स का क्षरण हुआ। एक मानव त्वचा समकक्ष मॉडल (मेलानोडर्म) में बहु-लक्षित पेप्टाइड मिश्रण के एंटी-पिगमेंटेशन प्रभाव का मूल्यांकन किया गया था। पेप्टाइड मिश्रण के सामयिक उपचार से एपिडर्मल परत में मेलेनिन सामग्री में काफी कमी आई थी, यह सुझाव देते हुए कि इसे एक उपन्यास सौंदर्य प्रसाधन सामग्री के रूप में लागू किया जा सकता हैसफेदसमारोह.

प्रासंगिक अध्ययनों के अनुसार,धनियाएक आम जड़ी बूटी है जिसे "चमत्कारिक जड़ी बूटी जो जीवन को लम्बा खींचती है" के रूप में जाना जाता है। इसका मुख्य अवयव हैसिस्टेनोसाइड, जिसके विभिन्न प्रभाव हैं जैसे कि एंटीऑक्सिडेंट, विरोधी भड़काऊ और प्रतिरक्षा समारोह को बढ़ावा देना। सिस्टंच और के बीच का तंत्रत्वचा को सफ़ेदी प्रदान करने वालाके एंटीऑक्सीडेंट प्रभाव में निहित हैधनियाग्लाइकोसाइड. मानव त्वचा में मेलेनिन किसके ऑक्सीकरण द्वारा निर्मित होता है?टायरोसिनद्वारा उत्प्रेरितटायरोसिनेस।ऑक्सीकरण प्रतिक्रिया में ऑक्सीजन की भागीदारी की आवश्यकता होती है, इसलिए शरीर में ऑक्सीजन मुक्त कण मेलेनिन उत्पादन को प्रभावित करने वाला एक महत्वपूर्ण कारक बन जाता है। Cistanche में cistanoside होता है, जो एक एंटीऑक्सीडेंट है और इस प्रकार शरीर में मुक्त कणों के उत्पादन को कम कर सकता हैमेलेनिन उत्पादन को रोकना.

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जायदा के लिये पूछो:

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कुंजी शब्द

Autophagy ·Melanosome ·माइक्रोफ्थेल्मिया-एसोसिएटेड ट्रांसक्रिप्शन फ़ैक्टर ·PAR-2· पेप्टाइड

परिचय

मेलेनिन एपिडर्मिस की बेसल परत में स्थित मेलेनोसाइट्स द्वारा निर्मित होता है, जो त्वचा की कोशिकाओं को हानिकारक बाहरी एजेंटों से बचाने के लिए होता है, जिसमें पराबैंगनी (यूवी) किरणें, महीन धूल और विभिन्न रासायनिक यौगिक [1] शामिल हैं। मुख्य रूप से यूवी विकिरण द्वारा केराटिनोसाइट्स से स्रावित कारक, जिनमें अल्फा-मेलानोसाइट-उत्तेजक हार्मोन (MSH), एड्रेनोकोर्टिकोट्रोपिक हार्मोन, स्टेम सेल फैक्टर, एंडोटिलिन 1, हेपेटोसाइट ग्रोथ फैक्टर, बेसिक फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर और ग्रैनुलोसाइट-मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक शामिल हैं। मेलेनोसाइट्स और मेलेनिन की सतह पर प्रत्येक रिसेप्टर मेलेनोसोम [2-7] नामक एक लाइसोसोम-संबंधित ऑर्गेनेल में उत्पन्न होता है। इन कारकों में, MSH एक छोटा पेप्टाइड हार्मोन है जो प्रो-ओपिओमेलानोकोर्टिन से प्राप्त होता है। मेलानोकोर्टिन 1 रिसेप्टर के लिए -MSH का बंधन चक्रीय एडेनोसिन मोनोफॉस्फेट (cAMP) स्तर को बढ़ाता है जो प्रोटीन किनेज A (PKA) [8,9] को सक्रिय करता है। PKA तब cAMP- उत्तरदायी तत्व बाइंडिंग प्रोटीन (CREB) को फास्फोराइलेट करता है और माइक्रोफथाल्मिया से जुड़े ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर (MITF) का ट्रांसक्रिप्शन फॉस्फो-CREB [10] से प्रेरित होता है। MITF tyrosinase, tyrosinase-संबंधित प्रोटीन 1 (TYRP1), और डोपाक्रोम टॉटोमेरेज़ (Dct या TYRP2), मेलेनोजेनेसिस में प्रमुख एंजाइमों के लिए प्रतिलेखन कारक के रूप में कार्य करता है, और उनकी अभिव्यक्ति [11] को प्रेरित करता है। परिपक्व मेलेनोसोम डेन्ड्राइट टिप की ओर बढ़ता है, और मेलानोसोम मोटर प्रोटीन कॉम्प्लेक्स जिसमें रब27ए, मेलानोफिलिन और मायोसिन वा शामिल हैं, इस प्रक्रिया में एक भूमिका निभाते हैं [12-14]। मेलानोफिलिन, जिसमें रब27ए, मायोसिन वा और एक्टिन के लिए बाध्यकारी डोमेन हैं, साथ ही मेलेनोसोम की सतह पर रब27ए और एक्टिन फिलामेंट के साथ बातचीत करते हुए मायोसिन वा को बांधता है। एक्टिन फिलामेंट [15- 19] के साथ डेन्ड्राइट युक्तियों के मेलेनोसोम परिवहन के लिए इन मोटर प्रोटीनों की असेंबली आवश्यक है। इसके बाद, मेलेनोसोम मेलानोसाइट्स के डेन्ड्राइट युक्तियों से पड़ोसी केराटिनोसाइट्स में स्थानांतरित हो जाते हैं और केराटिनोसाइट्स [20,21] के पेरिन्यूक्लियर क्षेत्र में मेलेनोसोम का पता लगाते हैं। यद्यपि सामान्य कोशिका सुरक्षा के लिए उचित मेलेनिन का निर्माण महत्वपूर्ण है, अत्यधिक मेलेनिन उत्पादन हाइपरपिग्मेंटेशन को प्रेरित करता है, जिसमें मेलास्मा, झाईयां और सोलर लेंटिगो शामिल हैं, जिससे मानसिक तनाव और जीवन की खराब गुणवत्ता हो सकती है [22,23]। इस प्रकार, त्वचा की जलन, एलर्जी प्रेरण, और कार्सिनोजेनेसिस जैसे दुष्प्रभावों के बिना संतोषजनक वाइटनिंग एजेंटों के विकास की मांग है, और विभिन्न वाइटनिंग तंत्रों को लक्षित करने वाले कई अध्ययन [24,25] आयोजित किए गए हैं।

पेप्टाइड अमीनो एसिड की छोटी श्रृंखलाएं हैं, प्रोटीन की सबसे छोटी इकाई, पेप्टाइड बॉन्ड द्वारा एक दूसरे से जुड़ी हुई हैं। हाल ही में, कॉस्मेटिक्स और फार्मास्युटिकल उद्योगों में सक्रिय अवयवों के रूप में पेप्टाइड्स के बारे में व्यापक अनुसंधान और विकास किया गया है क्योंकि उनकी उच्च जैव-अनुकूलता और प्रोटीन-नकल क्षमता [26,27] है।

हमने अपनी पेप्टाइड लाइब्रेरी की जांच की और मेलेनिन संश्लेषण, प्रवासन, और हस्तांतरण के साथ-साथ मेलेनोसोम गिरावट-बढ़ावा देने वाली गतिविधि के अवरोध को प्रभावित करने वाले चार पेप्टाइड पाए। इसके बाद, इस अध्ययन का उद्देश्य समान मोलर अनुपात वाले चार पेप्टाइड युक्त पेप्टाइड मिश्रण की सफेदी गतिविधि की जांच करना था।

विधि

सामग्री

2-पेप्टाइड संश्लेषण में प्रयुक्त सीटीसी राल बीडटेक (सियोल, कोरिया) से खरीदा गया था। Fmoc-एमिनो एसिड, हाइड्रॉक्सी बेंज़ोट्रियाज़ोल (HOBt), और N, N, N´, N´-टेट्रामेथाइल-O-(1H-बेंजोट्रियाज़ोल - 1-yl) यूरोनियम हेक्साफ़्लुओरोफ़ॉस्फेट (HBTU) CS Bio Co. से खरीदे गए थे। सैन फ्रांसिस्को, सीए, यूएसए)। डाइमिथाइलफॉर्मैमाइड (डीएमएफ), एन, एन-डायसोप्रोपाइलथाइलामाइन (डीआईईए), पाइपरिडीन, ट्राइफ्लूरोएसेटिक एसिड (टीएफए), थायोनिसोल, फिनोल, इथेन डाइथियोल (ईडीटी), ट्राइसोप्रोपिलसिलेन (टीआईएस), और डायथाइल ईथर सहित संश्लेषण में प्रयुक्त अभिकर्मक थे। Daejung Chemical & Metal Co., Ltd. (सियोल, कोरिया) से खरीदा गया।

मेलानोसाइट्स और भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के लिए Dulbecco के संशोधित ईगल मीडियम (DMEM) पाउडर को थर्मो फिशर साइंटिफिक (वॉल्टहैम, MA, यूएसए) से खरीदा गया था, और लिक्विड DMEM मीडिया और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन को Welgene Inc. (Gyeongsan, कोरिया) से खरीदा गया था। . सोडियम बाइकार्बोनेट, सोडियम हाइड्रॉक्साइड, अरबुटिन, 3-[4,5-डाइमिथाइलथिज़ोल-2-yl]-2,5-डिफेनिलटेट्राज़ोलियम ब्रोमाइड (MTT), 3,{{ 7}} डायहाइड्रॉक्सी-एल-फेनिलएलनिन (LDOPA), ट्रिप्सिन, और रैपामाइसिन सिग्मा-एल्ड्रिच (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से खरीदे गए थे, और सॉल्वेबल को पर्किनएल्मर (वॉल्टहैम, एमए, यूएसए) से खरीदा गया था। Rab27A, मेलानोफिलिन, MITF, टायरोसिनेस और एक्टिन के खिलाफ एंटीबॉडी सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी (डलास, TX, यूएसए) से खरीदे गए थे, और बेकलिन -1, LC3, p62, p-CREB और p-ERK1 / 2 के खिलाफ एंटीबॉडी सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी (डेनवर, एमए, यूएसए) से खरीदे गए थे। कॉस्मो जेनेटेक (सियोल, कोरिया) में प्राइमर संश्लेषण किया गया था और आगे प्रयोग (तालिका 1) में उपयोग किया गया था।

पेप्टाइड संश्लेषण

0.84 mmol/g की क्षमता वाले CTC रेजिन को DMF विलायक वाले रिएक्टर में सूजन प्रतिक्रिया के अधीन किया गया था। फिर, Fmoc-C टर्मिनल अमीनो एसिड के 2 समतुल्य और DIEA के 2.5 समतुल्य डीएमएफ में रिएक्टर में जोड़े गए और आगे 2 घंटे के लिए प्रतिक्रिया के अधीन थे। कैसर परीक्षण किट (सिग्मा-एल्ड्रिच) के साथ प्रतिक्रिया की समाप्ति की पुष्टि की गई, और राल को डीएमएफ से धोया गया। धोए गए राल में दो बार 20 प्रतिशत पाइपरिडीन / डीएमएफ जोड़कर Fmoc को हटा दिया गया था। कैसर परीक्षण किट के साथ प्रतिक्रिया की समाप्ति की पुष्टि की गई, और राल को डीएमएफ से धोया गया। इसके बाद, सी टर्मिनल में एन टर्मिनल दिशा में अमीनो एसिड के अनुक्रम के अनुसार निम्नलिखित प्रक्रिया को दोहराया गया था। Fmoc-एमिनो एसिड के 2 समकक्षों के बाद, HBTU के 2 समकक्ष, HOBt के 2 समकक्ष और DIEA के 2.5 समकक्ष DMF में जोड़े गए, प्रतिक्रिया 2 घंटे के लिए की गई। कैसर परीक्षण किट के साथ प्रतिक्रिया की समाप्ति की पुष्टि की गई, और राल को डीएमएफ से धोया गया। धोए गए राल में दो बार 20 प्रतिशत पाइपरिडीन / डीएमएफ जोड़कर एक एमिनो एसिड से Fmoc को हटा दिया गया था। कैसर परीक्षण किट के साथ प्रतिक्रिया की समाप्ति की पुष्टि की गई, और राल को डीएमएफ से धोया गया। पेप -3 के मामले में, फेरिलिक एसिड संयुग्मन निम्नलिखित प्रक्रिया के माध्यम से किया गया था। डीएमएफ में फेरिलिक एसिड के 2 समतुल्य, एचबीटीयू के 2 समतुल्य, एचओबीटी के 2 समतुल्य और डीआईईए के 2.5 समतुल्य जोड़े जाने के बाद, प्रतिक्रिया 2 घंटे के लिए की गई। कैसर परीक्षण किट के साथ प्रतिक्रिया की समाप्ति की पुष्टि की गई, और राल को डीएमएफ से धोया गया। अंतिम संश्लेषण पूरा होने के बाद, एक दरार समाधान (टीएफए: एच 2 ओ: ओहियोन्स ओले: फिनोल: ईडीटी: टीआईएस=81। 5: 5: 5: 5: 2.5: 1) राल से पेप्टाइड को अलग करने के लिए जोड़ा गया था। . पेप्टाइड को डायथाइल ईथर का उपयोग करके अवक्षेपित किया गया और पांच बार धोया गया। इसके बाद, अंतिम पेप्टाइड उत्पाद को पुनर्प्राप्त करने के लिए सुखाने का प्रदर्शन किया गया।

संश्लेषित पेप्टाइड की शुद्धता की पहचान एचपीएलसी (थर्मो फिशर साइंटिफिक/यू{{0}}) विश्लेषण द्वारा की गई थी, और मोबाइल चरण {{{{0}}}) के तहत 1 मिली/मिनट की प्रवाह दर के तहत यूवी 214 एनएम पर इसका पता चला था। 5}}. पानी में 1 प्रतिशत टीएफए/सी18 (एगिलेंट, परस्यूट एक्सआर, 250 × 4.6 मिमी, 5 मीटर, 100Å) कॉलम का उपयोग करके एसीटोनिट्रिल में 0.1 प्रतिशत टीएफए।

आणविक भार की पहचान करने के लिए, LC-MS/MS (AB SCIEX, 3200 Q-trap) विश्लेषण किया गया था, और इसे MS/MS द्वारा {{7 की प्रवाह दर पर पता लगाया गया था। }}.25 मिली/मिनट चल चरण के तहत 0. पानी में 1 प्रतिशत फॉर्मिक एसिड/सी18 (एगिलेंट, परस्यूट एक्सआर, 100 × 2.0 मिमी, 5 मीटर, 100Å) कॉलम का उपयोग करके एसिटोनिट्राइल ग्रेडिएंट में 0.1 प्रतिशत फॉर्मिक एसिड . MS/MS विश्लेषण स्थितियों में ESI पॉजिटिव मोड, स्रोत/ गैस: CUR=20, CAD=High, IS=5500, TEM=350, GS1=50 शामिल हैं। , GS2=50/कंपाउंड DP=50–80, EP=10, CE=10–50, और CES=1–10 (तालिका 2)।

कोश पालन

इस प्रयोग में प्रयुक्त B16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं को ATCC (मानस, VA, यूएसए) से खरीदा गया था। B16F10 कोशिकाओं को DMEM मीडिया में 10 प्रतिशत ऊष्मा-निष्क्रिय FBS, 1 प्रतिशत पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 1.5 g/L सोडियम बाइकार्बोनेट 37 डिग्री पर और 5 प्रतिशत CO2 की स्थिति के तहत इनक्यूबेट किया गया था।

HaCaT केराटिनोसाइट्स CLS (एपेलहाइम, जर्मनी) से खरीदे गए थे। HaCaT कोशिकाओं को DMEM मीडिया में 10 प्रतिशत ऊष्मा-निष्क्रिय FBS और 1 प्रतिशत पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन 37 डिग्री पर और 5 प्रतिशत CO2 की स्थिति के तहत इनक्यूबेट किया गया था।

सेल व्यवहार्यता

B16F10 कोशिकाओं को 48-वेल प्लेट में 8 × 103 कोशिकाओं/वेल के घनत्व पर डाला गया और 16 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। फिर उन्हें 3 दिनों के लिए 2 प्रतिशत एफबीएस युक्त मीडिया में पेप्टाइड मिश्रण के विभिन्न सांद्रणों के साथ इलाज किया गया। ऊष्मायन के बाद, 4 मिलीग्राम / एमएल एमटीटी के 20 एल को 4 घंटे के लिए प्रत्येक कुएं में इलाज किया गया और मीडिया को हटा दिया गया। इसके बाद, फॉर्मेज़न को भंग करने के लिए डीएमएसओ के 500 एल के साथ कोशिकाओं का इलाज किया गया। एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (आणविक उपकरण, सैन जोस, सीए, यूएसए) का उपयोग करके अवशोषण को 570 एनएम पर मापा गया था।

मेलेनिन सामग्री परख

B16F10 कोशिकाओं को 6-वेल प्लेट में 5 × 104 कोशिकाओं/वेल के घनत्व पर डाला गया और 16 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। फिर उन्हें 3 दिनों के लिए 2 प्रतिशत एफबीएस युक्त मीडिया में पेप्टाइड मिश्रण के विभिन्न सांद्रणों के साथ इलाज किया गया। मेलेनिन उत्पादन को प्रेरित करने के लिए, 100 ng/ml -MSH का सह-उपचार किया गया और 200 M arbutin का सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया। कोशिकाओं को एकत्र किया गया और 1 M NaOH के 200 l के साथ उपचार करके lysed किया गया और 490 एनएम पर lysate के लिए अवशोषण को एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर से मापा गया।

टायरोसिनेस गतिविधि परीक्षण

B16F10 कोशिकाओं को 6-वेल प्लेट में 5 × 104 कोशिकाओं/वेल के घनत्व पर डाला गया और 16 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। फिर उन्हें 3 दिनों के लिए 2 प्रतिशत एफबीएस युक्त मीडिया में पेप्टाइड मिश्रण के विभिन्न सांद्रणों के साथ इलाज किया गया। मेलेनिन उत्पादन को प्रेरित करने के लिए, 100 एनजी / एमएल-एमएसएच का सह-उपचार किया गया और 200 एम आर्बुटिन का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया। लाइसेट को इकट्ठा करने के लिए प्रत्येक कुएं को 200 लीटर लिसीज़ बफर (सिग्मा-एल्ड्रिच) के साथ इलाज किया गया था। बीसीए किट (थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करके प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करने के बाद, प्रत्येक समूह से 90 ग्राम प्रोटीन को 37 डिग्री पर 30 मिनट के लिए 96- में 10 मिमी एल-डीओपीए के 20 एल के साथ ऊष्मायन किया गया था। 475 एनएम पर मिश्रण के लिए अवशोषण को स्पेक्ट्रोफोटोमीटर से मापा गया।

मेलानोसोम अलगाव

B16F1{{10}} कोशिकाओं को 6-वेल प्लेट में 5 × 104 कोशिकाओं/वेल के घनत्व पर सीड किया गया और 16 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। कोशिकाओं को मेलेनिन संश्लेषण को प्रेरित करने के लिए 72 घंटे के लिए 100 एनजी / एमएल-एमएसएच के साथ इलाज किया गया और ट्रिप्सिन / ईडीटीए उपचार द्वारा काटा गया। कोशिकाओं को तब 0.25 एम सुक्रोज (10 मिमी HEPES बफर में) के 10 मिलीलीटर से धोया गया और 0.25 एम सुक्रोज समाधान के 10 मिलीलीटर में फिर से जोड़ा गया। इसके बाद, तरल नाइट्रोजन के साथ जमने के बाद, 37 डिग्री पर विगलन किया गया, जिसे 10 बार दोहराया गया। 10 मिनट के लिए 1, 000 जी पर सेंट्रीफ्यूगेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया और आगे 45 मिनट के लिए 20,630 ग्राम और 4 डिग्री पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। इसके बाद, गोली को DPBS के साथ फिर से जोड़ा गया और उपयोग से पहले -80 डिग्री पर संग्रहीत किया गया।

मेलानोसोम तेज परीक्षण

HaCaT कोशिकाओं को 6-वेल प्लेट में 1 × 105 कोशिकाओं/वेल के घनत्व पर डाला गया और 16 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। फिर उन्हें 1 घंटे के लिए सीरम-मुक्त मीडिया में पेप्टाइड मिश्रण के साथ इलाज किया गया और आगे 40 घंटे के लिए पृथक मेलानोसोम के साथ इलाज किया गया। कोशिकाओं को 1 एम NaOH के 200 एल के साथ इलाज करके lysed किया गया था और 490 एनएम पर lysate के लिए अवशोषण को स्पेक्ट्रोफोटोमीटर से मापा गया था। इसके अलावा, फोंटाना-मैसन स्टेन किट (साइटेक लेबोरेटरीज, लोगान, यूटी, यूएसए) का उपयोग करके मेलेनोसोम स्टेनिंग का प्रदर्शन किया गया और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप द्वारा कोशिकाओं की छवियों का पता लगाया गया।

मेलानोसोम गिरावट परीक्षण

HaCaT कोशिकाओं को 6-वेल प्लेट में 1 × 105 कोशिकाओं/वेल के घनत्व पर डाला गया और 16 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। उन्हें 48 घंटे के लिए सीरम-मुक्त मीडिया में पृथक मेलानोसोम के साथ दिखाया गया और इसके अतिरिक्त 72 घंटे के लिए पेप्टाइड मिश्रण के साथ इलाज किया गया। रैपामाइसिन के एक माइक्रोमोल का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। कोशिकाओं को 1 एम NaOH के 200 एल के साथ इलाज करके lysed किया गया था और 490 एनएम पर lysate के लिए अवशोषण को स्पेक्ट्रोफोटोमीटर से मापा गया था। इसके अलावा, फोंटाना-मैसन स्टेन किट का उपयोग करके मेलेनोसोम स्टेनिंग का प्रदर्शन किया गया था, और एक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी द्वारा कोशिकाओं की छवियों का पता लगाया गया था।

जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण (आरटी-पीसीआर)

B16F10 कोशिकाओं को 6-वेल प्लेट में 5 × 104 कोशिकाओं/वेल के घनत्व पर डाला गया और 16 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। फिर उन्हें 3 दिनों के लिए 2 प्रतिशत एफबीएस युक्त मीडिया में पेप्टाइड मिश्रण के विभिन्न सांद्रणों के साथ इलाज किया गया। मेलेनिन उत्पादन को प्रेरित करने के लिए, 100 एनजी / एमएल-एमएसएच का सह-उपचार किया गया और 200 एम आर्बुटिन का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया। RNA निष्कर्षण किट (Qiagen, जर्मनी) का उपयोग करके RNA को कोशिकाओं से अलग किया गया था, और RT-PCR प्रीमिक्स (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea) का उपयोग करके cDNA संश्लेषण किया गया था। प्रत्येक जीन के लिए PCR प्रीमिक्स (iNtRON बायोटेक्नोलॉजी) और प्राइमर के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करने के बाद, PCR को एक PCR मशीन (Eppendorf, Germany) का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया। इसके बाद, mRNA अभिव्यक्ति पैटर्न agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा निर्धारित किए गए थे।

HaCaT कोशिकाओं को 6-वेल प्लेट में 3 × 10 कोशिकाओं/वेल के घनत्व पर डाला गया और 16 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। फिर उन्हें 1 घंटे के लिए सीरम मुक्त मीडिया में पेप्टाइड मिश्रण के विभिन्न सांद्रणों के साथ इलाज किया गया और इसके अतिरिक्त 16 घंटे के लिए 4U ट्रिप्सिन के साथ इलाज किया गया। कोशिकाओं को एकत्र किया गया था और जैसा कि ऊपर वर्णित है, उसी तरह आरटी-पीसीआर का प्रदर्शन किया गया था।

प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण (पश्चिमी सोख्ता)

B16F10 कोशिकाओं को 5 × 104 कोशिकाओं/कुओं के घनत्व पर 6-वेल प्लेट में डाला गया और 1 दिन के लिए इनक्यूबेट किया गया। फिर उन्हें 3 दिनों के लिए 2 प्रतिशत एफबीएस युक्त मीडिया में पेप्टाइड मिश्रण के विभिन्न सांद्रणों के साथ इलाज किया गया। मेलेनिन उत्पादन को प्रेरित करने के लिए, 100 एनजी / एमएल -एमएसएच का सह-उपचार किया गया और 200 एम आर्बुटिन का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया। कोशिकाओं को लिसीज़ बफर के साथ lysed किया गया था और BCA किट का उपयोग करके प्रोटीन की मात्रा निर्धारित की गई थी। बीस माइक्रोग्राम प्रोटीन को 8 प्रतिशत पॉलीएक्रिलामाइड जेल पर अलग किया गया और इलेक्ट्रोफोरेटिक रूप से पॉलीविनाइलिडीन फ्लोराइड झिल्ली में स्थानांतरित किया गया। पीबीएस में 0.5 प्रतिशत ट्वीन 20 (पीबीएस-टी) के साथ झिल्ली को 5 प्रतिशत डब्ल्यू/वी स्किम दूध में अवरुद्ध कर दिया गया था। अवरुद्ध समाधान में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन रातोंरात 4 डिग्री पर किया गया था और इसके बाद पीबीएस-टी से धोया गया था। उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी को अवरुद्ध समाधानों में पतला किया गया था और पीबीएस-टी के साथ धोने के बाद कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए झिल्ली के साथ ऊष्मायन किया गया था। झिल्लियों की कल्पना जेल डॉक (बायो-रेड, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) के साथ पश्चिमी पहचान अभिकर्मक (एल्पिस बायोटेक, डाइजॉन, कोरिया) के माध्यम से की गई थी।

p-CREB और p-ERK के विश्लेषण के लिए, B16F10 कोशिकाओं को 3 × 105 कोशिकाओं / कुओं के घनत्व पर 6- अच्छी प्लेट में डाला गया और 1 दिन के लिए ऊष्मायन किया गया। उसके बाद 2 प्रतिशत एफबीएस युक्त मीडिया में पेप्टाइड मिश्रण की विभिन्न सांद्रता के साथ उनका इलाज किया गया। पी-सीआरईबी के विश्लेषण के लिए ऊष्मायन समय 30 मिनट और पी-ईआरके के विश्लेषण के लिए 10 मिनट था। मेलेनिन उत्पादन को प्रेरित करने के लिए, 100 एनजी/एमएल -एमएसएच का सह-उपचार किया गया, और 200 एम आर्बुटिन का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया। जैसा कि ऊपर वर्णित है, उसी तरह पृथक प्रोटीन का उपयोग करके पश्चिमी सोख्ता का प्रदर्शन किया गया था।

HaCaT कोशिकाओं को 6-वेल प्लेट में 3 × 10 कोशिकाओं/वेल के घनत्व पर डाला गया और 16 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। फिर उन्हें 3 दिनों के लिए सीरम मुक्त मीडिया में पेप्टाइड मिश्रण के विभिन्न सांद्रणों के साथ इलाज किया गया। एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में 3 घंटे के लिए दो सौ नैनोग्राम रैपामाइसिन का इलाज किया गया। जैसा कि ऊपर वर्णित है, उसी तरह पृथक प्रोटीन का उपयोग करके पश्चिमी सोख्ता का प्रदर्शन किया गया था।

त्वचा समकक्ष विश्लेषण

त्वचा के समतुल्य का उपयोग करके पेप्टाइड मिश्रण के श्वेत प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, एक लिपोसोम नमूना निम्नानुसार तैयार किया गया था। पेप्टाइड मिश्रण को आसुत जल में 2,000 g/ml की सांद्रता में घोला गया और pH 7 में समायोजित किया गया। 0.22-m ताकना आकार फिल्टर का उपयोग करके छानने के बाद, 1 प्रतिशत हाइड्रोजनीकृत फॉस्फेटिडिलकोलाइन बफर को 10 प्रतिशत के अनुपात में मिलाया गया था। माइक्रोफ़्लुइडाइज़र का उपयोग करके नैनो-आकार के लिपोसोम का नमूना 75-मी कोशिकाओं से 1,000 बार में पांच बार गुज़र कर तैयार किया गया था।

MelanoDerm MEL-300-B (MatTek Corporation, Ashland, MA, USA) को 2 सप्ताह के लिए सप्ताह में तीन बार 2,000 g/ml पेप्टाइड मिश्रण युक्त 25 l या 50 l लाइपोसोम के साथ सामयिक रूप से उपचारित किया गया। ऊतक को नियंत्रित करने के लिए वाहन की समान मात्रा लागू की गई थी। उपचारित त्वचा के समकक्षों को DPBS से धोया गया और मेलानोसाइट्स की आकृति विज्ञान की जांच के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी की गई। इसके बाद, मेलेनिन के उत्पादन का विश्लेषण करने के लिए, त्वचा के समकक्षों को 30 मिनट के लिए -80 डिग्री पर जमे हुए और कमरे के तापमान पर पिघलाया गया। ऊतक के नमूनों को 30 मिनट के लिए 1 प्रतिशत सोडियम बाइकार्बोनेट के साथ डाला गया और सुखाया गया। 300 लीटर सॉल्वेबल के उपचार के बाद, नमूनों को रात भर 95 डिग्री पर छोड़ दिया गया और फिर कमरे के तापमान पर ठंडा किया गया। 490 एनएम पर ऊतक के अर्क का अवशोषण एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर से मापा गया था।

ऊतक विज्ञान के माध्यम से ऊतकों के भीतर मेलेनिन वितरण का निरीक्षण करने के लिए, सभी नमूनों को 24 घंटे के लिए 4 प्रतिशत फॉस्फेट-बफर फॉर्मेलिन में तय किया गया था। निश्चित नमूने पैराफिन-एम्बेडेड थे और एक माइक्रोटोम (लीका बायोसिस्टम्स, वेटज़लर, जर्मनी) का उपयोग करके 5-m सेक्शन में काटे गए थे। निर्माता के निर्देशों के अनुसार फोंटाना-मैसन स्टेन किट का उपयोग करके पैराफिन वर्गों को दाग दिया गया और प्रकाश माइक्रोस्कोपी का प्रदर्शन किया गया।

आंकड़े

इस अध्ययन में किए गए प्रयोगों को तीन या अधिक बार दोहराया गया। छात्र के टी-टेस्ट के माध्यम से डेटा के सांख्यिकीय महत्व का परीक्षण किया गया था। परिणामी मानों को औसत ± मानक विचलन के रूप में व्यक्त किया गया था और पी-मान 0.05 से कम होने पर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था।

परिणाम

पेप्टाइड मिश्रण B16F10 कोशिकाओं में एमएसएच-प्रेरित मेलेनिन संश्लेषण और टायरोसिनेस गतिविधि को रोकता है

सेल व्यवहार्यता पर पेप्टाइड मिश्रण के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, B16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं, और HaCaT केराटिनोसाइट्स को पेप्टाइड मिश्रण के साथ 10, 50, 100 और 200 M की सांद्रता पर इलाज किया गया और एक MTT परख की गई। परिणामों से पता चला कि पेप्टाइड मिश्रण समग्र उपचार सांद्रता में साइटोटॉक्सिक नहीं था, और बाद के प्रयोग उपरोक्त एकाग्रता सीमा (चित्र। 1 ए) में किए गए थे।

मेलेनिन संश्लेषण पर पेप्टाइड मिश्रण के निरोधात्मक प्रभाव की पहचान करने के लिए, मेलेनिन उत्पादन दरों की तुलना करने के लिए B16F10 कोशिकाओं का 10, 50, 100 और 200 M की सांद्रता पर उपचार किया गया। परिणामों ने पेप्टाइड मिश्रण द्वारा मेलेनिन उत्पादन के खुराक पर निर्भर अवरोध को दिखाया। निषेध दर 10 एम की सबसे कम एकाग्रता पर 3 प्रतिशत और 200 एम (छवि 1 बी) की उच्चतम एकाग्रता पर 26 प्रतिशत थी।

टायरोसिनेज मेलेनिन संश्लेषण में प्रमुख एंजाइमों में से एक है। टायरोसिनेस गतिविधि परख यह सत्यापित करने के लिए की गई थी कि पेप्टाइड मिश्रण का मेलानोजेनेसिस निरोधात्मक प्रभाव टायरोसिनेस के नियमन के कारण हुआ था। परिणामों ने B16F10 कोशिकाओं में पेप्टाइड मिश्रण द्वारा टायरोसिनेज गतिविधि के महत्वपूर्ण अवरोध को दिखाया। निषेध दर 10 माइक्रोन की सबसे कम एकाग्रता पर 8 प्रतिशत और 200 एम (छवि 1 सी) की उच्चतम एकाग्रता पर 33 प्रतिशत थी।

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