सेप्सिस से पीड़ित गंभीर रूप से बीमार बुजुर्ग मरीजों में बिगड़ी हुई प्रतिरक्षा संबंधी विशेषताओं का पता लगाने के लिए संपूर्ण ट्रांस्क्रिप्टोम विश्लेषण

अमूर्त

पृष्ठभूमि

गंभीर रूप से बीमार रोगियों में सेप्सिस एक लगातार होने वाली जटिलता है, अत्यधिक विषम है, और उच्च रुग्णता और मृत्यु दर से जुड़ी है, खासकर बुजुर्ग आबादी में। जैविक मार्गों का विश्लेषण करने के लिए आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सेक) का उपयोग नैदानिक ​​​​और आणविक आनुवंशिक अध्ययनों में व्यापक रूप से किया जाता है, लेकिन सेप्सिस वाले बुजुर्ग रोगियों में अध्ययन की अभी भी कमी है। इसलिए, हमने उन बुजुर्ग मरीजों में मृत्यु-संबंधी जैविक विशेषताओं और ट्रांसक्रिप्टोमिक विशेषताओं की जांच की, जिन्हें सेप्सिस के लिए गहन देखभाल इकाई (आईसीयू) में भर्ती कराया गया था।

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तरीकों

हमने ताइचुंग वेटरन्स जनरल हॉस्पिटल के आईसीयू से सेप्सिस से पीड़ित 37 बुजुर्ग मरीजों को नामांकित किया। पहले और आठवें दिन, नैदानिक ​​और प्रयोगशाला डेटा, साथ ही रक्त के नमूने, आरएनए-सेक विश्लेषण के लिए एकत्र किए गए थे। हमने डीवीआईडी ​​संवर्धन विश्लेषण और जीन सेट संवर्धन विश्लेषण के माध्यम से दिन 8 और दिन 1 के बीच विभेदित रूप से व्यक्त जीन के गतिशील प्रतिलेख और समृद्ध मार्गों की पहचान की। फिर, टी सेल प्रदर्शनों की सूची की विविधता का MiXCR के साथ विश्लेषण किया गया।

परिणाम

कुल मिलाकर, 37 रोगियों को सेप्सिस था, और उत्तरदाताओं और गैर-उत्तरदाताओं को प्रमुख घटक विश्लेषण के माध्यम से समूहीकृत किया गया था। उत्तरदाता समूह की तुलना में गैर-उत्तरदाता समूह में 7वें दिन में उल्लेखनीय रूप से उच्च एसओएफए स्कोर, लंबे वेंटिलेटर दिन, आईसीयू में रहने की अवधि और अस्पताल में मृत्यु दर पाई गई। सेप्सिस से पीड़ित बुजुर्ग आईसीयू रोगियों में आठवें दिन, जन्मजात प्रतिरक्षा और सूजन से संबंधित जीन, जैसे कि ZDHCC19, ALOX15, FCER1A, HDC, PRSS33 और PCSK9 को अपग्रेड किया गया। विभेदित रूप से व्यक्त जीन (डीईजी) को प्रतिलेखन, अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, इम्युनोग्लोबुलिन उत्पादन, प्रतिलेखन के नकारात्मक विनियमन और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विनियमन में समृद्ध किया गया था। इसके अलावा, प्रतिक्रिया समूह में दिन की तुलना में उस दिन टी-सेल रिसेप्टर्स की विविधता अधिक थी। .

निष्कर्ष

बुजुर्ग व्यक्तियों में सेप्सिस मृत्यु दर और घटना दोनों अधिक थीं। हमने आरएनए-सेक डेटा के आधार पर कार्यात्मक मार्ग और MiXCR विश्लेषण के साथ मृत्यु-प्रासंगिक जैविक विशेषताओं और ट्रांसक्रिप्टोमिक विशेषताओं की पहचान की; और पाया कि प्रत्युत्तरकर्ता समूह ने जन्मजात प्रतिरक्षा को विनियमित किया था और टी-सेल विविधता में वृद्धि की थी; गैर-उत्तरदाता समूह के साथ तुलना की गई। आरएनए-सेक उपचार परिणामों की सटीक और प्रारंभिक भविष्यवाणी के लिए अतिरिक्त पूरक जानकारी प्रदान करने में सक्षम हो सकता है।

सिस्टैंच पौधा-बढ़ाने वाली प्रतिरक्षा प्रणाली

कीवर्ड

सेप्सिस, आरएनए-सेक, बुजुर्ग आईसीयू रोगी, विभेदित रूप से व्यक्त जीन, टी-सेल रिसेप्टर

परिचय

सेप्सिस एक नैदानिक ​​सिंड्रोम है जो संभावित रूप से जीवन के लिए खतरा है। यह संक्रमण के प्रति मेजबान की अव्यवस्थित प्रतिक्रिया से उत्पन्न होता है और यह एक अत्यधिक विषम और घातक वैश्विक स्वास्थ्य खतरा है, विशेष रूप से वृद्ध आबादी में [1, 2]। पिछले अध्ययनों में पाया गया है कि बुजुर्ग मरीजों में सेप्सिस का खतरा अधिक होता है और सामान्य आबादी की तुलना में उनमें रोग की गंभीरता अधिक होती है [3]। सेप्सिस के कारण गहन देखभाल इकाई (आईसीयू) में भर्ती होने वाले बुजुर्ग मरीजों की संख्या पिछले दो दशकों में लगातार बढ़ रही है, क्योंकि बुजुर्ग व्यक्तियों की संख्या में लगातार वृद्धि हो रही है [4]। विशेष रूप से, देखभाल की उच्च तीव्रता के बावजूद, आईसीयू में भर्ती बुजुर्ग मरीजों में मृत्यु दर अधिक रहती है, लेकिन सेप्सिस वाले बुजुर्ग मरीजों में उपचार प्रतिक्रिया के लिए प्रासंगिक जैविक मार्गों को संबोधित करने वाले अध्ययनों में अभी भी कमी है [5]। उम्र बढ़ने के साथ-साथ बुजुर्गों की प्रतिरक्षा प्रणाली में कई जैविक परिवर्तन होते हैं, जो बुजुर्गों की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रभावित करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप प्रतिरक्षाविहीन स्थितियों की अधिक संभावना होती है [6]। समझौता किए गए अनुकूली प्रतिरक्षा को बुजुर्गों में इम्यूनोसेन्सेंस की एक महत्वपूर्ण विशेषता माना जाता है [7, 8], लेकिन बुजुर्गों में सेप्सिस के दौरान ट्रांसक्रिप्टोमिक विशेषताएं अज्ञात रहती हैं। ये परिवर्तन न केवल जीवाणु संक्रमण की संवेदनशीलता को निर्धारित करते हैं बल्कि सेप्सिस की प्रगति और नैदानिक ​​​​परिणामों को भी निर्धारित करते हैं [6]। इसलिए, आईसीयू में भर्ती बुजुर्ग मरीजों में अलग-अलग प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रतिक्रियाओं और मृत्यु-संबंधी जैविक विशेषताओं की जांच करना महत्वपूर्ण है [9,10]।

सेप्सिस अत्यधिक विषम है और जटिल और गतिशील प्रतिरक्षात्मक प्रतिक्रियाओं की विशेषता है, जिसमें प्रारंभिक अत्यधिक सूजन प्रतिक्रिया शामिल होती है जिसके बाद विकृत/समाप्त अनुकूली प्रतिरक्षा होती है [11]। कई अध्ययनों से सेप्सिस के बाद परिवर्तित अनुकूली प्रतिरक्षा दिखाई गई है; तथाकथित इम्युनोपैरालिसिस प्रमुख प्रतिरक्षाविज्ञानी विशेषताओं में से एक प्रतीत होता है जो सेप्सिस के रोगियों में लगातार कमजोर प्रतिरक्षा का कारण बनता है [12]। आरएनए-सेक का उपयोग पिछले अध्ययनों में सेप्सिस के रोगियों में ट्रांसक्रिप्टोमिक हस्ताक्षर, या "सबएंडोटाइप" खोजने के लिए किया गया था। सेप्सिस से जुड़े उपजीनोटाइप में सेप्सिस के बाद अंग की शिथिलता में शीघ्र सुधार, कमजोर प्रतिरक्षा वाले रोगियों में अनुकूली प्रतिरक्षा में कमी, और सेप्टिक शॉक रोगियों में स्टेरॉयड के प्रति प्रतिक्रिया शामिल है [13, 14]। RNA-Seq डेटा का उपयोग करते हुए, MiXCR जैसे विश्लेषणात्मक उपकरण, हाल ही में टी-सेल रिसेप्टर्स (TCRs) की विविधता को मापने के लिए विकसित किए गए हैं [15, 16]। इस अध्ययन में, हमने दिन 1 और दिन 8 के युग्मित नमूनों की जांच करके सेप्टिक रोगियों के गतिशील ट्रांस्क्रिप्टोम की जांच की और पाया कि प्रतिरक्षाविहीन सेप्टिक रोगियों में टी सेल विविधता में कमी आई और टी सेल फ़ंक्शन से समझौता हुआ। इस अध्ययन का उद्देश्य सेप्सिस के लिए आईसीयू में भर्ती बुजुर्ग मरीजों में अनुकूली प्रतिरक्षा-संबंधी सिग्नलिंग की बेहतर समझ हासिल करने के लिए मृत्यु दर-प्रासंगिक जैविक विशेषताओं और ट्रांसक्रिप्टोमिक विशेषताओं का पता लगाना था।

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सामग्री और विधियाँ अध्ययन डिजाइन और डेटा संग्रह

अध्ययन को टीसीवीजीएच (आईआरबी संख्या सीई20069बी) के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था, और सभी प्रतिभागियों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी। दिसंबर 2018 से जनवरी 2022 तक ताइचुंग वेटरन्स जनरल हॉस्पिटल (टीसीवीजीएच) से सैंतीस बुजुर्ग आईसीयू रोगियों को भर्ती किया गया था। नामांकन के समय, जनसांख्यिकीय जानकारी एकत्र की गई थी, और पहले और आठवें दिन बेसलाइन रक्त के नमूने लिए गए थे। ट्रांस्क्रिप्टोम, रक्त के दो 4 मिलीलीटर एलिकोट्स को बाँझ ईडीटीए वैक्यूटेनर्स में एकत्र किया गया और तुरंत 10.5 मिलीलीटर आरएनएलेटर® (टर्मोफिशर, वाल्थम, एमए, यूएसए) युक्त आरएनएएस-मुक्त शीशियों में स्थानांतरित कर दिया गया।

आरएनए निष्कर्षण और अनुक्रमण

इस अध्ययन में, हमने PAXgene ब्लड RNA किट के साथ RNA निकाला, और औसत RNA अखंडता संख्या (RIN) 8.31±0.58 थी। लाइब्रेरी का निर्माण करते समय निर्माता के निर्देशों का पालन किया गया था, और बाद के प्रयोगों में खंडित आरएनए के 1, 000 एनजी का उपयोग किया गया था। 150-बीपी पेयर-एंड रीड्स का उपयोग नोवासेक प्लेटफॉर्म (इलुमिना, इंक., सैन डिएगो, सीए, संयुक्त राज्य अमेरिका) पर आरएनए-सेक के लिए किया गया था, और प्रत्येक नमूने में कम से कम 50-60 मिलियन रीड्स थे। RNA-seq डेटासेट को परिग्रहण संख्या GSE216902 के तहत राष्ट्रीय जैव प्रौद्योगिकी सूचना केंद्र (NCBI) जीन एक्सप्रेशन ऑम्निबस (GEO) में जमा किया गया था। डेटासेट का उपयोग सेल अनुपात और पाथवे विश्लेषण के लिए किया गया था।

अनुक्रमिक अंग विफलता मूल्यांकन (एसओएफए) स्कोर

अनुक्रमिक अंग विफलता मूल्यांकन (एसओएफए) स्कोर सेप्सिस से संबंधित अंग विफलता का एक संख्यात्मक मान है, अर्थात, यह विफल अंगों की संख्या और गंभीरता को निर्धारित करता है। प्रत्येक स्कोर 0 से 4 के बीच होता है, जिसमें अधिक स्कोर बिगड़ते अंग की शिथिलता का संकेत देता है [17]। हमने उत्तरदाताओं (आर) और गैर-उत्तरदाताओं (एनआर) को परिभाषित करने के लिए एसओएफए स्कोर में गतिशील परिवर्तन का उपयोग किया, और एक प्रतिभागी को एनआर के रूप में वर्गीकृत किया गया था यदि दिन 1 से 7 दिन तक एसओएफए स्कोर में कमी 2 से कम थी [13, 18, 19] .

जैव सूचना विज्ञान RNA-Seq डेटा का विश्लेषण करता है 

अनुक्रमण उच्च गुणवत्ता का था, 30 के Phred स्कोर का उपयोग किया गया था, और HISAT2 ने अनुक्रम को संदर्भ जीनोम (GRCh38/hg38) [20] पर मैप किया था। आर पैकेज DEseq2 [21] का उपयोग विभेदित रूप से व्यक्त जीन (डीईजी) की पहचान करने के लिए किया गया था, और रीड काउंट की गणना फीचरकाउंट्स [22] का उपयोग करके की गई थी। औसत मैपिंग दर और रीड काउंट क्रमशः 87.6±4.8% और 65.5±17.6 मिलियन रीड्स थे। प्रोफाइलर [23] आर पैकेज का उपयोग जीनोम (केईजीजी, https://www.genome.jp/kegg/) और जीन ओन्टोलॉजी (जीओ, http://geneontology.org) के आधार पर कार्यात्मक संवर्धन और मार्ग विश्लेषण करने के लिए किया गया था। /) डेटाबेस। 0.05 से कम के संशोधित पी-वैल्यू को काफी समृद्ध माना गया था। जीन सेट संवर्धन विश्लेषण (जीएसईए) [24] का उपयोग करके सभी विभेदित रूप से व्यक्त जीनों को कार्यात्मक रूप से एनोटेट किया गया था, और एक साइटोस्केप 3.9.0 [25] विज़ुअलाइज़्ड संवर्धन मानचित्र बनाया गया था। हमने एक संवर्धन मानचित्र का उपयोग करके जीएसईए परिणामों की कल्पना की, जो जीन सेट को एक समानता नेटवर्क में व्यवस्थित करता है। नोड, लिंक और नोड रंग क्रमशः जीन सेट, सदस्य जीन के ओवरलैप और संवर्धन स्कोर [24] का प्रतिनिधित्व करते हैं।

टीसीआर विश्लेषण की विविधता

पहले रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल [14] के आधार पर सेप्सिस रोगियों के क्लोनोटाइप को निर्धारित करने के लिए MiXCR v3.0.13 [15, 16] में RNA-Seq डेटा का उपयोग किया गया था। VDJTools v 1.2.1 [26] सॉफ़्टवेयर का उपयोग मात्रात्मक क्लोनोटाइप के अधिग्रहण के बाद पूरकता-निर्धारण क्षेत्र -3 (सीडीआर3) और नमूना विविधता की गणना के लिए किया गया था।

सांख्यिकीय आंकड़े

हमने सामान्यता की जांच करने के लिए कोलमोगोरोव-स्मिरनोव परीक्षण का उपयोग किया और पाया कि वेंटिलेटर दिवस, आईसीयू में रहने की अवधि और अस्पताल में रहने की अवधि सहित कई चर का वितरण बाएं-तिरछा था। डेटा को एकीकृत प्रारूप में प्रस्तुत करने के लिए, हमने श्रेणीबद्ध चर और निरंतर चर के लिए श्रेणीबद्ध चर आवृत्तियों (प्रतिशत) को माध्यिका (इंटरक्वेर्टाइल रेंज, आईक्यूआर) के रूप में प्रस्तुत किया। निरंतर चर के लिए मान-व्हिटनी यू परीक्षण और श्रेणीबद्ध चर के लिए फिशर के सटीक परीक्षण का उपयोग करके दोनों समूहों के बीच अंतर का विश्लेषण किया गया। महत्व का स्तर 0.05 पर निर्धारित किया गया था, और सांख्यिकीय विश्लेषण दोतरफा थे। सभी डेटा विश्लेषण करने के लिए आर संस्करण 4.1.0 का उपयोग किया गया था।

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परिणाम रोगी की विशेषताएं और SOFA स्कोर

इस अध्ययन में, हमने सेप्सिस से पीड़ित 37 बुजुर्ग रोगियों को नामांकित किया [औसत आयु 83 वर्ष (आईक्यूआर: 79-87 वर्ष)] (तालिका 1)। प्रमुख घटक विश्लेषण के साथ, हमने देखा कि गैर-प्रतिक्रियाशील रोगियों (गैर-उत्तरदाता समूह, एनआर) की तुलना में प्रतिक्रियाशील रोगियों (उत्तरदाता समूह, आर) में दिन{5}} और दिन-8 के बीच अंतर बेहतर था। प्रतिरक्षा सक्षम समूह में सेप्सिस से विनियमित रिकवरी का संकेत (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र। S1)। कुल मिलाकर, 37 रोगियों में, 23 प्रतिक्रियाशील रोगी (उत्तरदाता समूह, आर) जिनकी औसत आयु 82 वर्ष (आईक्यूआर: 79.5–{{15%).5 वर्ष) और 14 गैरप्रतिक्रियाशील रोगी (गैर-उत्तरदाता समूह, एनआर) थे। औसत आयु 84 वर्ष (आईक्यूआर: 79-88 वर्ष)। तालिका 1 अध्ययन समूह की बुनियादी विशेषताओं को दर्शाती है। उपचार में उनके समकक्षों की तुलना में उच्च एल्ब्यूमिन (माध्य 3.3 मिलीग्राम/डीएल, आईक्यूआर: 3-3.7 मिलीग्राम/डीएल) और कम सी-रिएक्टिव प्रोटीन (माध्य 9.16 मिलीग्राम/डीएल, आईक्यूआर: 3.9-17.5 मिलीग्राम/डीएल) देखा गया। प्रत्युत्तरदाता समूह की तुलना में, गैर-उत्तरदाता समूह में 7वें दिन काफी अधिक SOFA स्कोर, लंबे समय तक वेंटिलेटर पर रहने के दिन, लंबे समय तक आईसीयू में रहने की अवधि और उच्च अस्पताल मृत्यु दर थी।

सेप्सिस वाले बुजुर्ग आईसीयू रोगियों में विशिष्ट गतिशील ट्रांस्क्रिप्टोम

जैसा कि चित्र 1ए में दर्शाया गया है, सभी नमूनों में से शीर्ष 500 परिवर्तनीय जीनों पर प्रमुख घटक विश्लेषण का उपयोग करते हुए, हमने पाया कि गहन देखभाल इकाई में बुजुर्ग सेप्सिस रोगियों में दिन 1 और दिन 8 पर काफी अलग-अलग ट्रांस्क्रिप्टोम थे। विभेदक अभिव्यक्ति जीन ( पी के मानदंडों का उपयोग करके बुजुर्ग आईसीयू रोगियों में दिन 8 और दिन 1 के बीच जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल की तुलना करके डीईजी) की पहचान की गई।<0.01 and log fold change>0.25 या<− 0.25. Tree DEGs (two upregulated and one downregulated gene) were found in the R group, while the NR group only had 11 DEGs (five upregulated and six downregulated genes). We found that in elderly sepsis patients in the ICU, the top upregulated genes were innate immunity- and inflammation-relevant genes, namely, ZDHCC19, ALOX15, FCER1A, HDC, PRSS33, and PCSK9, which bind to low-density lipoprotein receptors (LDLRs), leading to LDLR degradation and increasing LDL cholesterol levels (Fig. 1B). 

गतिशील प्रतिलेख का डेविड संवर्धन विश्लेषण

बुजुर्ग आईसीयू रोगियों में दिन 8 और दिन 1 के बीच जैविक मार्गों के परिवर्तन को प्रदर्शित करने के लिए, हमने ऑनलाइन DAVID v6.8 सर्वर का उपयोग करके समृद्ध मार्ग का प्रदर्शन किया। जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है, डेटासेट से शीर्ष 20 डीईजी की जैविक प्रक्रियाओं के लिए जीन ओन्टोलॉजी (जीओ) बबल प्लॉट का निर्माण किया गया था। हमने पाया कि सेप्सिस से पीड़ित बुजुर्ग आईसीयू रोगियों के डीईजी प्रतिलेखन, अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, इम्युनोग्लोबुलिन उत्पादन, प्रतिलेखन के नकारात्मक विनियमन और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के नियमन में समृद्ध थे। डेविड कार्यात्मक जीओ विश्लेषण चित्र 3 में प्रस्तुत किया गया है। नियंत्रण की तुलना में, डीईजी में जीन द्वारा एन्कोड किए गए प्रोटीन के कार्यात्मक एनोटेशन में महत्वपूर्ण रूप से दिखाया गया है (पी)<0.05) increased or decreased enrichment. These annotations were categorized according to biological processes, cellular components, and molecular functions. There were significant differences between DEG-encoded proteins involved in the regulation of transcription, the immune response, protein phosphorylation, and Ras protein signal transduction at the level of biological processes (Fig. 3), whereas cellular component analysis revealed significant differences between the T-cell receptor complex, cytosol nucleoplasm, and nucleus (Fig. 3). Significant differences were found in the enrichment of encoded proteins associated with protein binding, metal ion binding, translation factor activity, or transcriptional activator activity according to molecular function analysis (Fig. 3). Ten, we used the Cytoscape ClueGO plugin to investigate the functional enrichment of the DEGs in the dataset to further refine the biological process from the analysis of DAVID-GO terms [27]. Additionally, the REACTOME pathway analysis from ClueGO revealed that cytokine signaling in the immune system, adaptive immune system, sensory perception, innate immune system, and immunoregulatory interactions between lymphoid and non-lymphoid cells were significantly enriched in many DEGs.

तालिका 1 सेप्सिस वाले बुजुर्ग आईसीयू रोगियों की विशेषताएं

चित्र 1 दिन{1}} और दिन{2}} के बीच प्रतिलेख का प्रमुख घटक विश्लेषण ए और ज्वालामुखी प्लॉट बी

चित्र 2 बबल प्लॉट द्वारा डेविड के साथ विभेदित रूप से व्यक्त जीन के कार्यात्मक और मार्ग संवर्धन विश्लेषण

चित्र 3 डेविड कार्यात्मक जीन ओन्टोलॉजी (जीओ) जैविक प्रक्रिया (बीपी), सेलुलर घटक (सीसी), और आणविक कार्य (एमएफ) का विश्लेषण

टीसीआर सेप्सिस से पीड़ित बुजुर्ग आईसीयू रोगियों में MiXCR के साथ विश्लेषण करता है

यह ध्यान में रखते हुए कि आर और एनआर समूह एक विशिष्ट टी-सेल रिसेप्टर सिग्नलिंग मार्ग के माध्यम से सेप्सिस से उबर गए, अद्वितीय सीडीआर 3, डी 50 और व्युत्क्रम सिम्पसन इंडेक्स की संख्या का उपयोग करते हुए, हमने टी-सेल रिसेप्टर (टीसीआर) की विविधता निर्धारित करने के लिए MiXCR का उपयोग किया। ) (चित्र 5ए-सी)। 8वें दिन, आर समूह का सीडीआर3, डी50, और व्युत्क्रम सिम्पसन सूचकांक 1 दिन की तुलना में काफी अधिक था। इसके अलावा, 8वें दिन एनआर समूह की तुलना में आर समूह में डी50 सूचकांक काफी अधिक था (चित्र 5बी)। अंत में, हमने व्युत्क्रम सिम्पसन इंडेक्स का उपयोग करके अद्वितीय सीडीआर3 की विविधता का आकलन किया, जो प्रचुर मात्रा में क्लोनोटाइप को दर्शाता है। हमने एक समान पैटर्न देखा, जिसमें आर समूह में टीसीआर की विविधता में काफी वृद्धि हुई, खासकर 8वें दिन (चित्र 5सी)।

बहस

यह अध्ययन दर्शाता है कि मृत्यु-प्रासंगिक जैविक विशेषताएं और ट्रांसक्रिपटॉमिक्स का उपयोग करके अनुकूली प्रतिरक्षा-संबंधित सिग्नलिंग, दिन 1 और दिन 8 (अतिरिक्त फ़ाइल 1: चित्र एस 1) के बीच अंतर की तुलना करके, सेप्सिस वाले बुजुर्ग आईसीयू रोगियों की विश्वसनीय रूप से पहचान की जा सकती है और प्रतिक्रियाशील रोगियों से अनुत्तरदायी को अलग किया जा सकता है। . सेप्सिस बायोमार्कर की जांच करने वाले पिछले अध्ययन ज्ञान-आधारित तरीकों [28] का उपयोग करके ज्ञात जैविक कार्यों और मार्गों के चयन पर निर्भर थे, और केवल कुछ ही अध्ययनों में सीधे तौर पर उन जीनों को लक्षित किया गया है जिनके कार्यों का पूरी तरह से वर्णन नहीं किया गया है [29]। इस अध्ययन में, हमने प्रमुख घटक विश्लेषण, विभेदक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण और MiXCR के माध्यम से सेप्सिस वाले बुजुर्ग आईसीयू रोगियों में जैविक और प्रतिरक्षाविज्ञानी विशेषताओं की पहचान करने के लिए आरएनए-सेक को अपनाया। सेप्सिस वाले बुजुर्ग आईसीयू रोगियों में जन्मजात प्रतिरक्षा और सूजन, जैसे ZDHCC19, ALOX15, FCER1A, HDC, PRSS33 और PCSK9 को अपग्रेड किया गया था। ZDHHC19 एक पामिटॉयलट्रांसफरेज़ है और आरआरएएस के पामिटॉयलेशन में मध्यस्थता करता है, जिससे सेल व्यवहार्यता में वृद्धि होती है [30]। जीनोम-वाइड जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण को फेकल पेरिटोनिटिस [31] के कारण होने वाले सेप्सिस वाले आईसीयू रोगियों में बढ़ी हुई अभिव्यक्ति से जोड़ा गया है। एचडीसी (हिस्टिडाइन डिकार्बोक्सिलेज, एचडीसी) समूह II डिकार्बोक्सिलेज परिवार का सदस्य है और एक होमोडीमर बनाता है जो एल-हिस्टिडाइन को हिस्टामाइन में परिवर्तित करने के लिए पाइरिडोक्सल फॉस्फेट का उपयोग करता है। हत्तोरी एट अल द्वारा आयोजित एक पशु अध्ययन। [32] एचडीसी जीन नॉकआउट (एचडीसी-/-) चूहों का इस्तेमाल किया गया। सेकल लिगेशन और पंचर (सीएलपी) द्वारा सेप्सिस को प्रेरित करने के बाद, एचडीसी-नॉकआउट चूहों ने प्लाज्मा हिस्टामाइन के स्तर को कम दिखाया, और सेप्सिस में टीएनएफ, आईएल -1 बी, आईएल -6 और एमसीपी 1 के स्तर में वृद्धि कम हो गई जब प्लाज्मा की कमी थी। हिस्टामाइन [32]। डब्ल्यूटी सी57बीएल/6 जे चूहों की तुलना में एचडीसी-नॉकआउट चूहों में सेप्सिस-प्रेरित असामान्य साइटोकिन उत्पादन और कई अंग की चोट (फेफड़े, यकृत और गुर्दे) में काफी कमी आई थी। एचडीसी अभिव्यक्ति के निषेध ने सूजन वाले ऊतकों की चोट को रोका और सीएलपी से प्रेरित सेप्सिस वाले चूहों में जीवित रहने में सुधार किया [32]। इसके अलावा, हिस्टामाइन प्रिनफ्लेमेटरी साइटोकिन्स के उत्पादन को बढ़ावा दे सकता है, जो प्रतिलेखन कारक NF-κB द्वारा नियंत्रित होते हैं। सीएलपी-प्रेरित सेप्सिस के तहत, एचडीसी-नॉकआउट चूहों में डब्ल्यूटी चूहों की तुलना में नाभिक में एनएफ-κबी की गतिविधि में काफी कमी आई थी [32]। यह परिणाम इंगित करता है कि हिस्टामाइन एनएफ-केबी गतिविधि को बढ़ाकर प्रिनफ्लेमेटरी साइटोकिन्स और केमोकाइन के संश्लेषण को प्रेरित करता है।

हाल के शोध से पता चला है कि ALOX15 और FCER1A बैक्टीरियल सेप्सिस के रोगजनन के लिए महत्वपूर्ण हैं [33, 34]। ALOX15, एक लिपिड पेरोक्सीडाइजिंग एंजाइम, एक कार्यात्मक लिपॉक्सीजिनेज (LOX) जीन है [35], जो पॉलीअनसेचुरेटेड फैटी एसिड को ऑक्सीकरण करता है और विभिन्न शारीरिक प्रक्रियाओं के साथ-साथ न्यूरोडीजेनेरेटिव, सूजन और हाइपरप्रोलिफेरेटिव रोगों के रोगजनन से जुड़ा हुआ है [35, 36]। ALOX15 और इसके मेटाबोलाइट्स सेप्सिस, गठिया, अस्थमा, सिस्टिक फाइब्रोसिस और एथेरोस्क्लेरोसिस [36] जैसी कई सूजन संबंधी बीमारियों के पैथोफिजियोलॉजी में शामिल हैं। FCER1A (IgE रिसेप्टर Ia का Fc टुकड़ा, FCER1A), एक प्रतिरक्षा-संबंधित प्रोटीन, एलर्जी प्रतिक्रियाओं का आरंभिक कारक है और एलर्जी की सूजन में भूमिका निभाता है [37, 38]। पिछले अध्ययनों में FCER1A को चयापचय प्रक्रियाओं और प्रतिरक्षा विनियमन को विनियमित करने में शामिल किया गया है। [38,39]। इसके अतिरिक्त, जब एफसीईआर1बी और अन्य इम्युनोग्लोबुलिन-संबंधित सूजन जीन परस्पर क्रिया करते हैं तो अस्थमा होने की संभावना अधिक होती है [39]। इसके अलावा, PCSK9 (प्रोप्रोटीन कन्वर्टेज़ सबटिलिसिन/केक्सिन टाइप{{22%), PCSK9) को एलडीएल रिसेप्टर (एलडीएलआर) से जुड़ने और कोशिकाओं में लाइसोसोमल क्षरण के लिए ट्रिगर करने की क्षमता के कारण प्लाज्मा एलडीएल-सी स्तरों के केंद्रीय नियामक के रूप में पहचाना गया है। , जिससे एलडीएलआर का क्षरण होता है और एलडीएल कोलेस्ट्रॉल का स्तर बढ़ता है [40]।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

वर्तमान अध्ययन में, हमने बीपी, एमएफ और एफएच के आणविक मार्गों में सेप्सिस वाले बुजुर्ग आईसीयू रोगियों से व्यक्त डीईजी की भागीदारी की जांच करने के लिए इन जीनों के कार्यात्मक एनोटेशन को निर्धारित करने के लिए केईजीजी संवर्धन और जीओ का उपयोग किया। ये डीईजी मुख्य रूप से प्रतिलेखन, अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, इम्युनोग्लोबुलिन उत्पादन, प्रतिलेखन के नकारात्मक विनियमन और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (छवि 2) के विनियमन में समृद्ध थे। हमने साइटोस्केप प्लगइन क्लूजीओ/क्लूपीडिया का उपयोग करके जीओ/पाथवे शब्दों का एक कार्यात्मक रूप से व्यवस्थित नेटवर्क बनाया, जो जैविक शब्दों के लिए एक बेहतर व्याख्या है। इस प्लगइन ने हमें उन नेटवर्कों की कल्पना करने में भी मदद की जो बड़े जीन समूहों से कार्यात्मक रूप से समूहीकृत हैं [41]। हमने सेप्सिस में शामिल डीईजी की एक व्यापक तस्वीर प्राप्त करने के लिए पी-वैल्यू और कप्पा आंकड़ों के आधार पर विभेदित रूप से विनियमित आणविक मार्गों और उनके महत्वपूर्ण जीन इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए क्लूजीओ प्लगइन का उपयोग किया। इसके अलावा, जब जीओ से एमएफ का विश्लेषण किया गया तो डीईजी प्रतिलेखन गतिविधि और प्रोटीन बाइंडिंग में काफी समृद्ध थे (चित्र 3)। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि कार्यात्मक संवर्धन विश्लेषण विशेष रूप से रोगजनक रूपांकनों या साइटोकिन्स के सेलुलर प्रतिक्रिया से संबंधित प्रतिरक्षा सेल सिग्नलिंग मार्गों को संदर्भित करता है। ये सेप्टिक रोगियों के लिए संभावित अपेक्षित परिणाम हैं और सेप्सिस के रास्ते स्पष्ट करने के लिए आगे की जांच की आवश्यकता है। कप्पा आँकड़ों और पी-मूल्यों के आधार पर, हमने पाया कि समृद्ध जैविक प्रक्रियाओं और आणविक मार्गों में, प्रतिरक्षा प्रणाली में साइटोकिन सिग्नलिंग, अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली, संवेदी धारणा, जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली और लिम्फोइड और गैर-लिम्फोइड के बीच इम्यूनोरेगुलेटरी इंटरैक्शन शामिल हैं। कोशिकाएं अनियमित थीं और सेप्सिस से पीड़ित बुजुर्ग आईसीयू रोगियों में सेप्सिस की प्रगति के साथ महत्वपूर्ण रूप से जुड़ी हुई थीं (चित्र 4)।

इसके अतिरिक्त, हमने सेप्सिस से पीड़ित बुजुर्ग रोगियों में टी कोशिकाओं की विविधता दिखाई और टीसीआर के क्लोनोटाइप निर्धारित करने के लिए आरएनए-सेक के कच्चे अनुक्रम का विश्लेषण करने के लिए MiXCR का उपयोग किया, जिससे हमारे लिए टीसीआर की विविधता और संपूर्ण ट्रांसक्रिप्टोम की एक साथ जांच करना संभव हो गया। 15]. इस अध्ययन में टी सेल सिग्नलिंग की पहचान करने के लिए आरएनए-सेक और एमआईएक्ससीआर का उपयोग किया गया था और परिणामों से पता चला कि दिन -8 पर आर समूह की टीसीआर विविधता दिन -1 की तुलना में अधिक थी (चित्र 5) . एनआर समूह की तुलना में, आर समूह का सीडीआर3, डी50, और व्युत्क्रम सिम्पसन सूचकांक मान दिन{8}} के मुकाबले काफी अधिक था। सेप्सिस वाले बुजुर्ग आईसीयू रोगियों में टीसीआर की प्रेरित विविधता के महत्व को भी इस साक्ष्य से उजागर किया गया है, जो सेप्सिस के रोगियों में टीसीआर की विविधता को संबोधित करने के लिए आरएनए-सेक और एमआईएक्ससीआर डेटा के उपयोग की व्यवहार्यता को दर्शाता है। हमारे अध्ययन की कुछ सीमाएँ हैं जिन पर ध्यान दिया जाना चाहिए। सबसे पहले, इस अध्ययन में जांच किए गए रोगियों का समूह छोटा था। इसलिए, बड़े नमूना आकार के साथ विविध आबादी की जांच से हमारे डेटा की पुष्टि करने में सहायता मिलेगी। दूसरा, हमने इस अध्ययन में थोक आरएनए-सेक का उपयोग किया, और भविष्य के एससी-आरएनए-सेक और कार्यात्मक प्रयोगों को सेलुलर स्तर पर सत्यापन के लिए जरूरी किया गया है। इसके अलावा, सीडीएनए सिरों के 5' तीव्र प्रवर्धन (5'-RACE) दृष्टिकोण का उपयोग टी-सेल प्रदर्शनों की सूची की जांच के लिए किया जा सकता है, जो हमारे निष्कर्षों की और पुष्टि कर सकता है। तीसरा, हमने आरएनए-सेक डेटा का उपयोग करके सेप्सिस वाले रोगियों में सूजन प्रतिक्रियाओं के जैविक और आणविक कार्यों का आकलन किया। सेप्सिस में भूमिकाओं को स्पष्ट करने के लिए आगे के कार्यात्मक अध्ययन की आवश्यकता है।

चित्र 4 जीन ओन्टोलॉजी (जीओ) शब्दों द्वारा संवर्धन को साइटोस्केप से क्लूजीओ/क्लूपीडिया प्लगइन का उपयोग करके देखा गया था।

चित्र 5 टी-सेल रिसेप्टर की दिन -1 और दिन -8 पर विविधता। व्युत्क्रम सिम्पसन सूचकांक की गणना (ए), अद्वितीय सीडीआर3 (बी), डी50, और (सी)। *<0.05, **<0.005

निष्कर्ष

बुजुर्ग व्यक्तियों में सेप्सिस की घटना और मृत्यु दर दोनों अधिक हैं। हमारे अध्ययन में सेप्सिस से पीड़ित गंभीर रूप से बीमार बुजुर्ग व्यक्तियों को नामांकित किया गया और आरएनए-सेक डेटा के आधार पर कार्यात्मक मार्ग और MiXCR विश्लेषण के साथ मृत्यु-प्रासंगिक जैविक विशेषताओं और ट्रांसक्रिप्टोमिक विशेषताओं की पहचान की गई। पहले दिन की तुलना में, हमने आठवें दिन प्रतिक्रियाशील रोगियों के बीच विनियमित जन्मजात प्रतिरक्षा और बढ़ी हुई टी सेल विविधता पाई, जो दर्शाता है कि प्रतिक्रियाशील रोगियों में गैर-प्रतिक्रियाशील रोगियों की तुलना में सेप्सिस से बेहतर विनियमित रिकवरी थी। सटीक और प्रारंभिक भविष्यवाणी को लागू करने के लिए, आरएनए-सेक के परीक्षण का उपयोग उपचार परिणामों की प्रारंभिक भविष्यवाणी के लिए अतिरिक्त पूरक जानकारी प्रदान कर सकता है।

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