3. चर्चा

हालांकि ZER विभिन्न प्रकार के जैविक कार्यों को प्रदर्शित करता है, जिसमें एंटी-इंफ्लेमेटरी, एंटीकैंसर और एंटीमाइक्रोबियल गतिविधियां शामिल हैं, इसके एंटी-मेलेनोजेनिक गुणों की रिपोर्ट नहीं की गई है [12]। वर्तमान अध्ययन में, हमने पहली बार प्रदर्शित किया कि ज़िंजिबर ऑफिसिनल (ZO) एक्सट्रैक्ट और इसके सक्रिय संघटक, ZER, -मेलानोसाइट्स उत्तेजक हार्मोन (-MSH) -प्रेरित मेलानोजेनेसिस पर एक मजबूत निरोधात्मक प्रभाव डालते हैं।

प्रासंगिक अध्ययनों के अनुसार, सिस्टंच एक सामान्य जड़ी-बूटी है जिसे "चमत्कारिक जड़ी-बूटी जो जीवन को लम्बा खींचती है" के रूप में जाना जाता है। इसका मुख्य अवयव हैसिस्टेनोसाइडजिसके विभिन्न प्रभाव होते हैं जैसेएंटीऑक्सिडेंट, सूजनरोधी, औरप्रतिरक्षा समारोह को बढ़ावा देना. सिस्टैच और स्किन व्हाइटनिंग के बीच का तंत्र सिस्टैच ग्लाइकोसाइड्स के एंटीऑक्सीडेंट प्रभाव में निहित है। मानव त्वचा में मेलेनिन द्वारा उत्प्रेरित टाइरोसिन के ऑक्सीकरण द्वारा निर्मित होता हैटायरोसिनेस, और ऑक्सीकरण प्रतिक्रिया में ऑक्सीजन की भागीदारी की आवश्यकता होती है, इसलिए शरीर में ऑक्सीजन मुक्त रेडिकल प्रभावित करने वाला एक महत्वपूर्ण कारक बन जाता हैमेलेनिन उत्पादन।सिस्टैंच में शामिल हैसिस्टेनोसाइड, जो एक एंटीऑक्सीडेंट है और इस प्रकार शरीर में मुक्त कणों के उत्पादन को कम कर सकता हैमेलेनिन उत्पादन को रोकना.

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पराबैंगनी (यूवी) विकिरण, भड़काऊ साइटोकिन्स और हार्मोनल सिग्नलिंग के कारण असामान्य रूप से बढ़े हुए मेलेनोजेनेसिस, क्लोस्मा और झाई [4] जैसे रंजकता विकारों से निकटता से जुड़ा हुआ है। यूवी जोखिम पर, केराटिनोसाइट्स -MSH का स्राव करता है, जो एपिडर्मल मेलानोसाइट्स [1] में मेलेनिन जैवजनन को उत्तेजित करता है। वर्तमान अध्ययन में, हमने प्रदर्शित किया कि ज़िंजिबर ऑफिसिनल (ZO) और ZER के मेथेनॉलिक रूट एक्सट्रेक्ट -MSH-प्रेरित मेलेनिन संचय को दृढ़ता से दबा देता है। अर्बुटिन के निरोधात्मक प्रभावों की तुलना, जो एक प्रसिद्ध एंटी-मेलेनोजेनिक रसायन है, और मेलेनिन संचय पर ZER से पता चला है कि 10 µM सांद्रता पर ZER, -MSH-उपचारित B16F10 माउस मेलेनोजेनिक कोशिकाओं में अर्बुटिन की तुलना में लगभग 40 प्रतिशत मजबूत एंटी-मेलेनोजेनिक प्रभाव प्रदर्शित करता है। .

कई जैव रासायनिक अध्ययनों से पता चला है कि Zingiber zerumbet rhizomes के आवश्यक तेल में ZER की एक बड़ी मात्रा होती है, जो पौधे ZER सामग्री का लगभग 13–70 प्रतिशत होता है। हालाँकि, ज़िंगबर ऑफ़िसिनल [20] में भी ZER की थोड़ी मात्रा मौजूद होती है। दिलचस्प बात यह है कि पिछली रिपोर्टों से पता चला है कि दक्षिण भारत में जिंजिबर ज़ेरुम्बेट की खेती में 76.3 से 84.8 प्रतिशत ZER होता है। हालाँकि, भारत में एक सिल्विकल्चर फार्म ने दिखाया है कि 1.81 प्रतिशत ZER सामग्री प्रकंद में, 0.16 प्रतिशत जड़ में और 0.09 प्रतिशत Zingiber zerumbet [12] की पत्ती में पाई गई। इसलिए, इन पृष्ठभूमियों से पता चलता है कि Zingiber zerumbet की ZER सामग्री में अंतर को भौगोलिक या पारिस्थितिक विविधताओं के साथ सहसंबद्ध नहीं किया जा सकता है, बल्कि इसके बजाय ZER केमोटाइप [12] में अंतर के कारण हैं। यदि हां, तो ZO में मेलेनोजेनिक विरोधी गतिविधि क्यों है? एक संभावना का सुझाव दिया जा सकता है कि ZO के अन्य सक्रिय घटक, जो ZER से भिन्न हैं, मेलानोजेनेसिस को दबा सकते हैं। वास्तव में, एक पिछली रिपोर्ट से पता चला है कि ज़िंजिबर ऑफ़िसिनल राइज़ोम के आवश्यक तेल में कई बायोएक्टिव घटक होते हैं, जैसे -पीनिन, वैलेंसिन और ज़िंगिबेरिन [21]। इसके अलावा, B16F10 माउस मेलेनोमा कोशिकाओं [22,23] में -पीनिन और वैलेंसिन के एंटी-मेलेनोजेनिक प्रभाव भी देखे गए हैं। इसके अलावा, [6]-स्कूल का मेलानोजेनेसिस-निरोधात्मक प्रभाव, ज़िंजिबर ऑफ़िसिनल राइज़ोम में प्रमुख स्कूल, ईआरके1/2-मध्यस्थ एमआईटीएफ गिरावट [24] के त्वरण के माध्यम से देखा गया है। ये पिछली रिपोर्टें हमारे परिणाम का समर्थन करती हैं कि ZO के कई प्रकार के सक्रिय घटकों के साथ-साथ ZER में मेलानोजेनिक गतिविधि विरोधी है।

माइक्रोफथाल्मिया से जुड़े ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर (MITF) जीन के ट्रांसक्रिप्शन को सुगम बनाकर मेलानोजेनेसिस के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है, जैसे कि टायरोसिनेस, टायरोसिनेस-संबंधित प्रोटीन 1 (TYRP1), और टायरोसिनेस-संबंधित प्रोटीन 2 (TYRP2), जो मेलेनिन जैवसंश्लेषण के लिए आवश्यक हैं। और परिवहन [2,25]। यूवी विकिरण पर, केराटिनोसाइट्स से प्राप्त -MSH MITF को सक्रिय करता है और प्रोटीन किनेज A (PKA) -cAMP प्रतिक्रिया तत्व बाइंडिंग प्रोटीन (CREB) सिग्नलिंग अक्ष [25] के माध्यम से अपने लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है। इसके अलावा, कई ट्रांसक्रिप्शन कारक, जैसे SOX10 और LEF1, MITF [26] की ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को सक्रिय करते हैं। SOX10 (सेक्स-निर्धारण क्षेत्र Y-बॉक्स 10) MITF प्रमोटर को −264 और −266 के बीच बांध सकता है और MITF ट्रांसक्रिप्शन [27] बढ़ा सकता है। LEF1 (लिम्फोइड एनहांसर-बाइंडिंग फैक्टर 1) Wnt (विंगलेस-टाइप) सिग्नलिंग [28] पर MITF जीन एक्सप्रेशन को बढ़ावा देने के लिए गैर-डीएनए-बाइंडिंग एक्टिवेटर के रूप में MITF के साथ ट्रांसक्रिप्शनल रूप से सहयोग करता है। MITF के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन, जैसे फॉस्फोराइलेशन और एसिटिलिकेशन, इसकी प्रोटीन स्थिरता और गतिविधि [26] को नियंत्रित कर सकते हैं। विशेष रूप से, Ser73 पर MITF का फॉस्फोराइलेशन, जहां क्षरण को बढ़ावा देने वाला PEST अनुक्रम मौजूद है, यूवी विकिरण [17] के जवाब में प्रोटीसम-निर्भर MITF गिरावट की ओर जाता है। Ser409 [18] पर MITF के फॉस्फोराइलेशन के कारण प्रोटीसम-आश्रित MITF गिरावट भी होती है। Ser73 और Ser409 दोनों का फास्फोराइलेशन जो MITF गिरावट को बढ़ावा देता है, ERK1/2 पाथवे [17,18] की सक्रियता पर निर्भर है। वर्तमान अध्ययन में, हमने पाया कि ZER MITF और उसके लक्ष्य जीनों की अभिव्यक्ति को दबा देता है, जैसे tyrosinase, TYRP1, और TYRP2 ऑन-MSH उत्तेजना, PKA-CREB सिग्नलिंग पाथवे (चित्र 6) से स्वतंत्र। वास्तव में, हमारे परिणामों से पता चला है कि ZER, लेकिन आर्बुटिन और कोजिक एसिड नहीं, -MSH- प्रेरित टायरोसिनेस mRNA और प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर (चित्र 2) को कम करने के लिए पर्याप्त है। इन परिणामों से पता चलता है कि ZER मेलेनोजेनिक जीन और उनकी प्रोटीन अभिव्यक्ति के MITF-मध्यस्थता प्रतिलेखन के डाउन-रेगुलेशन के माध्यम से मेलानोजेनेसिस को दबा देता है। MITF का सर्वव्यापक-मध्यस्थता क्षरण आंशिक रूप से निरंतर बाह्य संकेत-नियंत्रित किनेसेस (ERK1/2) सक्रियण [6,7] द्वारा नियंत्रित किया जाता है। हमारे परिणामों से पता चला कि ज़िंजिबर ऑफिसिनल एक्सट्रेक्ट (ZO) और ZER ERK1/2 फॉस्फोराइलेशन को बढ़ाते हैं, और B16F10 कोशिकाओं में मेलेनिन संचय को कम करते हैं। इसके अलावा, माइटोजेन-एक्टिवेटेड प्रोटीन किनेज (एमएपीके), यू0126 के चयनात्मक अवरोधक, प्रभावी रूप से मेलेनिन सामग्री को बहाल करते हैं, जो जेडईआर से कम हो जाता है, यह सुझाव देता है कि ईआरके1/2 सिग्नलिंग ज़िंगिबर ऑफिसिनल (जेडओ) एक्सट्रैक्ट और ज़ेरुम्बोन के एंटी-मेलेनोजेनिक प्रभाव से जुड़ा है।

हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा और U937 मैक्रोफेज कोशिकाओं में ZER द्वारा ERK1 / 2 के घटे हुए फास्फारिलीकरण को पहले [29] देखा गया है। इसके अलावा, Zingiber zerumbet rhizomes के इथेनॉल के अर्क को डायबिटिक रेटिनस [30] में ERK1/2 फॉस्फोराइलेशन को दबाने के लिए दिखाया गया है। इसके विपरीत, इस अध्ययन में, हमने पाया कि ZER खुराक पर निर्भर तरीके से ERK1/2 के फॉस्फोराइलेशन को बढ़ाता है, लेकिन MEK को नहीं (चित्र 3ए)। हमारे परिणाम के अनुरूप, एक पिछली रिपोर्ट से पता चला है कि 6-जिंजरॉल और 6-स्कूल, जो अदरक के प्रमुख सक्रिय घटक हैं, माउस हिप्पोकैम्पस में तंत्रिका वृद्धि कारक (NGF)-प्रेरित ERK1/2 फॉस्फोराइलेशन को क्षीण करते हैं [31]। इसके अलावा, अन्य प्रायोगिक साक्ष्यों से पता चला है कि ZER और 6-शोगोल THP-1 मोनोसाइट्स और माउस B16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं में क्रमशः ERK1/2 फॉस्फोराइलेशन को तेज करते हैं [24,32]। इसके अलावा, माउस B16BL6 मेलानोमा कोशिकाओं में जिन्हें आइसोसकुरानेटिन के साथ इलाज किया गया था, एक 40 - O-मिथाइलेटेड फ्लेवोनोइड, MITF का घटा हुआ फॉस्फोराइलेशन और बढ़ी हुई MITF स्थिरता ERK1/2 के दमन के माध्यम से देखी गई है जो बाद में मेलानोजेनेसिस को उत्तेजित करती है [33 ]। इस प्रकार, हम दृढ़ता से सुझाव देते हैं कि ZER और ZO एक्सट्रैक्ट-प्रेरित ERK1 / 2 सक्रियण MITF के बढ़ते फॉस्फोराइलेशन और इसकी अस्थिरता का कारण हो सकता है, जो मेलानोजेनेसिस के दमन की ओर जाता है। फिर भी, कई प्रकार की कोशिकाओं या ऊतकों में Zingiber अर्क और उनके घटकों के फॉस्फोराइलेट ERK1 / 2 के बारे में इन विवादों को संबोधित करने के लिए व्यापक जांच आवश्यक है। क्योंकि MEK एक प्रमुख अपस्ट्रीम किनेज [34] है जो ऑन्कोजेनिक ग्रोथ सिग्नलिंग पर ERK1 / 2 को फॉस्फोराइलेट करता है, ZER को ERK1 / 2 अपस्ट्रीम किनेज की गतिविधि को भी बदलने के लिए माना जाता था। हालाँकि, हमारे परिणाम बताते हैं कि ZER MEK फॉस्फोराइलेशन को प्रभावित नहीं करता है। इस प्रकार, ZER क्रिया के आणविक तंत्र की व्याख्या करने के लिए दो परिकल्पनाएँ हैं। (1) ZER एक प्रतिस्पर्धी या एलोस्टेरिक निरोधात्मक तंत्र के माध्यम से MEK की कीनेज गतिविधि को सीधे इंटरैक्ट और बाधित करता है, और (2) अज्ञात सिग्नलिंग अणु हैं जो प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से ZER से प्रभावित होते हैं और ERK1 / 2 के सक्रियकर्ताओं के रूप में कार्य करते हैं। दिलचस्प बात यह है कि पिछली रिपोर्टों से पता चला है कि ZER क्रमशः कोलोरेक्टल और अग्नाशयी कैंसर कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर ग्लूटाथियोन (GSH) की कमी और इंट्रासेल्युलर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) को शामिल करने के माध्यम से ऑक्सीडेटिव तनाव का कारण बनता है [35,36]। इसके अलावा, यह भी बताया गया है कि Cys -124 [37] के ऑक्सीकरण द्वारा दोहरे विशिष्ट फॉस्फेट 3 (DUSP3) के दमन के माध्यम से बढ़ा हुआ इंट्रासेल्युलर ROS ERK1 / 2 फॉस्फोराइलेशन को नियंत्रित करता है। एक संभावित परिकल्पना यह हो सकती है कि बढ़े हुए ऑक्सीडेटिव तनाव और ZER द्वारा दबाए गए DUSP3 ERK1 / 2 फॉस्फोराइलेशन में शामिल हो सकते हैं। इसके अलावा, चेन एट अल। ने प्रस्तावित किया है कि ZER NF-κB और iNOS सिग्नलिंग पाथवे को दबाकर इंट्रासेल्युलर नाइट्रिक ऑक्साइड (NO) संचय को क्षीण करता है, जो माउस कॉर्निया को UVB- प्रेरित फोटोकैराटाइटिस [38] से रोकता है। नाइट्रिक ऑक्साइड (एनओ) एक मेलानोजेनेसिस-उत्तेजक कारक है जो यूवी विकिरण और प्रिनफ्लैमेटरी साइटोकिन्स [39,40] पर मेलानोसाइट्स और केराटिनोसाइट्स से जारी होता है। यह साहित्य इस संभावना का सुझाव देता है कि ZER इंट्रासेल्युलर NO को बनाए रखते हुए -MSH- प्रेरित मेलानोजेनेसिस को दर्शाता है। इसलिए, आणविक तंत्र को प्रदर्शित करने के लिए एक विस्तारित अध्ययन जिसके माध्यम से ZER ERK1/2 सिग्नलिंग मार्ग को सक्रिय करता है, त्वचा को सफेद करने वाले सौंदर्य प्रसाधनों के विकास के लिए वैज्ञानिक पृष्ठभूमि प्रदान कर सकता है।

ZER के कई जैविक कार्य हैं, जैसे कि विरोधी भड़काऊ [41], एंटी-माइक्रोबियल [42], एंटीऑक्सिडेंट [43], और एंटी-एलर्जिक [44]। पराबैंगनी ए (यूवीए) विकिरण के लंबे समय तक संपर्क में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) [2] के अत्यधिक संचय से झुर्रियां और त्वचा कैंसर जैसे फोटोएजिंग से संबंधित त्वचा संबंधी विकार होते हैं। एक पिछली रिपोर्ट में दिखाया गया है कि ZER परमाणु कारक (एरिथ्रोइड-व्युत्पन्न 2)-जैसे 2 (Nrf2)-मध्यस्थता वाले एंटीऑक्सिडेंट जीन अभिव्यक्ति [1] को बढ़ाकर त्वचा केराटिनोसाइट्स में यूवीए-विकिरण-प्रेरित सेलुलर क्षति के खिलाफ साइटोप्रोटेक्शन करता है। हमारा डेटा सुझाव देता है कि ZER, ZO अर्क के एक सक्रिय घटक के रूप में, त्वचा संबंधी विकारों के इलाज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे कि त्वचा कैंसर, झुर्रियाँ, और हाइपरपिग्मेंटेशन, जो यूवी विकिरण के कारण होते हैं। यद्यपि यहाँ हमने B16F10 माउस और G361 मानव मेलेनोमा कोशिकाओं में ZER और ZO अर्क के एंटी-मेलेनोजेनिक प्रभाव को दिखाया है, त्वचा को गोरा करने वाले सौंदर्य प्रसाधनों पर विचार करने से पहले उनकी एंटी-मेलानोजेनेसिस गतिविधियों का मानव प्राथमिक मेलानोसाइट्स में और मूल्यांकन किया जाना चाहिए।

4. सामग्री और तरीके

4.1। अभिकर्मकों और एंटीबॉडी

MITF के खिलाफ एंटीबॉडी (#12590), p-AKTS473 (#4060), p-CREB (#9398), p-ERK1/2 (#4370), ERK1/2 (#9102), p-MEK (#9154), MEK (#9122), और ERK1/2 अवरोध करनेवाला U0126 सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी (डेनवर, एमए, यूएसए) से खरीदे गए थे। सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी (डलास, TX, यूएसए) से एंटी-टायरोसिनेस (sc -7833) और -ट्यूबुलिन (sc -9104) प्राप्त किए गए थे। Anti-TYRP2 (DCT, ab74073) Abcam (कैम्ब्रिज, यूके) से खरीदा गया था। Zerumbone (Z3902), arbutin (A4256), kojic acid (K3125), -MSH (M4135), और L-DOPA (333786) सिग्मा-एल्ड्रिच (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से खरीदे गए थे। उपचार से पहले फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में मेलानोसाइट उत्तेजक हार्मोन का एक स्टॉक समाधान तैयार किया गया था। पुनः संयोजक मानव SCF को R & D सिस्टम (मिनियापोलिस, MN, USA) से प्राप्त किया गया था और इसका स्टॉक सॉल्यूशन (10 µM) PBS में तैयार किया गया था। ज़ेरुम्बोन (20 मिमी), अर्बुटिन (1 एम), और कोजिक एसिड (0.2 एम) के स्टॉक समाधान डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ) में तैयार किए गए थे। Lyophilized Zingiber ऑफिसिनल एक्सट्रैक्ट (035-061), 99 प्रतिशत मेथनॉल द्वारा पृथक, कोरिया प्लांट एक्सट्रैक्ट बैंक (KPEB) (डेजॉन, कोरिया) और कोरिया रिसर्च इंस्टीट्यूट ऑफ बायोसाइंस एंड बायोटेक्नोलॉजी (KRIBB) (डायजॉन, कोरिया) से प्राप्त किया गया था। इलाज से पहले DMSO में Zingiber ऑफिसिनल एक्सट्रेक्ट का स्टॉक सॉल्यूशन तैयार किया गया था।

4.2। सेल संस्कृति और सेल व्यवहार्यता परख

4.3। इम्यूनोब्लोटिंग और इम्यूनोप्रूवेरेशन

Ser73 में अंतर्जात MITF फॉस्फोराइलेटेड है या नहीं, इसका पता लगाने के लिए इम्यूनोप्रूवमेंट किया गया था। सेल lysates के 1 मिलीग्राम को 1 माइक्रोग्राम एंटी-फॉस्फो-एमआईटीएफ एंटीबॉडी (pSer73; सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) के साथ 16 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया, इसके बाद 20 μL प्रोटीन ए / के साथ ऊष्मायन किया गया। जी-एगरोज़ बीड्स (सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी, डलास, TX, यूएसए) 3 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। एसडीएस सैंपल बफर में अवक्षेपित प्रोटीनों को निकाला गया और फिर फॉस्फोराइलेटेड MITF (Ser73) प्रोटीन को एक एंटी-p-MITF एंटीबॉडी (pSer73) का उपयोग करके इम्युनोब्लॉटिंग द्वारा मापा गया। इम्यूनोब्लोटिंग का प्रदर्शन किया गया, जैसा कि पहले बताया गया था [4]। संक्षेप में, 1 प्रतिशत एनपी -40 (नॉनिडेट पी -40), 150 मिमी NaCl, 50 मिमी ट्रिस-एचसीएल (पीएच 7.4), 10 मिमी NaF, और एक युक्त लिसीज़ बफर का उपयोग करके कुल प्रोटीन नमूने तैयार किए गए थे। प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल। सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) का उपयोग प्रत्येक नमूने में उनके आणविक भार के आधार पर प्रोटीन को अलग करने के लिए किया गया था। अलग किए गए प्रोटीनों को तब एक पॉलीविनाइलिडिन डिफ़्लुओराइड (PVDF) झिल्ली (मिलिपोर, बर्लिंगटन, एमए, यूएसए) में स्थानांतरित किया गया था। हस्तांतरित प्रोटीन वाली झिल्लियों को प्राथमिक एंटीबॉडी (1:1000) और द्वितीयक एंटीबॉडी (1:10,000) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस या कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट किया गया। प्रोटीन अभिव्यक्तियों की कल्पना के लिए एक रसायनयुक्त ईसीएल प्राइम किट (जीई हेल्थकेयर, पिट्सबर्ग, पीए, यूएसए) का उपयोग किया गया था।

4.4। इंट्रासेल्युलर और एक्स्ट्रासेलुलर मेलेनिन सामग्री का मापन 

इंट्रासेल्युलर और बाह्य मेलेनिन सामग्री को पहले वर्णित [3] के रूप में मापा और विश्लेषण किया गया था। माउस मेलानोजेनिक B16F1 0 कोशिकाओं को फिनोल-रेड-फ्री DMEM के साथ संवर्धित किया गया। मेलानोजेनिक उत्तेजना को बढ़ावा देने के लिए कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए -MSH (0.1 मिमी) के साथ पूर्व-उपचार किया गया और तीन दिनों के लिए ज़ेरुम्बोन के साथ ऊष्मायन किया गया। ऊष्मायन के बाद, संस्कृति माध्यम को ताजा ट्यूबों में स्थानांतरित कर दिया गया था, और संवर्धित कोशिकाओं को काटा गया और 1 एन NaOH में 10 प्रतिशत डीएमएसओ युक्त 80 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए भंग कर दिया गया। एक अवशोषक पाठक का उपयोग करके संस्कृति माध्यम और सेल अर्क की मेलेनिन सामग्री को 475 एनएम (OD475) पर मापा गया था। मेलेनिन सामग्री को तब सेलुलर प्रोटीन एकाग्रता के लिए सामान्यीकृत किया गया था।

4.5। मात्रात्मक आरटी-पीसीआर

मात्रात्मक वास्तविक समय-पीसीआर पहले [4] के रूप में वर्णित किया गया था। संक्षेप में, सीडीएनए संश्लेषण के लिए एक उच्च क्षमता वाले सीडीएनए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट (एप्लाइड बायोसिस्टम्स, वॉलथम, एमए, यूएसए) और कुल आरएनए (2 माइक्रोग्राम) का उपयोग किया गया था। SYBR ग्रीन पीसीआर मास्टर मिक्स (डायनेबियो, सेन्गनाम, कोरिया) का उपयोग मात्रात्मक पीसीआर के लिए किया गया था। PCR प्राइमरों 50 और 30 का क्रम इस प्रकार था: MITF के लिए TCAAGTTTCCAGAGACGGGT और CATCATCAGCCTGGAATCAA; tyrosinase के लिए ATAGGTGCATTGGCTTCTGG और TCTTCACCATGCTTTTGTGG; TYRP1 के लिए CTCATCAAAGATGGCGTCTG और CTTCCTGAATGGGACCAATG।

4.6। सेलुलर टायरोसिनेस गतिविधि परख

संकेत के अनुसार माउस मेलेनोजेनिक बी16एफ10 कोशिकाओं को ज़ेरुम्बोन, अर्बुटिन, कोजिक एसिड, और ज़िंगिबर ऑफिसिनल (जेडओ) एक्सट्रैक्ट की अनुपस्थिति या उपस्थिति में 0.1 एमएम -एमएसएच के साथ इनक्यूबेट किया गया था। संवर्धित कोशिकाओं को तब धोया गया और 1 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100 वाले ठंडे पीबीएस का उपयोग करके लाइस किया गया, और टायरोसिनेस की एंजाइमिक गतिविधि को पहले वर्णित पद्धति [4] का उपयोग करके मापा गया।

4.7। सांख्यिकीय विश्लेषण

प्र. 5। निष्कर्ष

इस अध्ययन के प्रमुख निष्कर्ष हैं कि Zingiber ऑफिसिनल (ZO) एक्सट्रैक्ट और इसका सक्रिय संघटक, ज़ेरुम्बोन (ZER), (i) -MSH उत्तेजना पर मेलेनिन संचय को क्षीण करता है; और, (ii) PKA-CREB सिग्नलिंग पाथवे (चित्र 6) से स्वतंत्र ERK1 / 2 को सक्रिय करके मेलानोजेनेसिस-जुड़े प्रतिलेखन कारक, MITF और इसके लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति को कम करता है। इसलिए, इन परिणामों से पता चलता है कि Zingiber ऑफिसिनल (ZO) एक्सट्रैक्ट में एक सक्रिय संघटक के रूप में ZER होता है, जो त्वचा संबंधी सौंदर्य प्रसाधन और त्वचा को गोरा करने वाले उत्पादों दोनों के विकास में उपयोगी होगा।

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