ऑटोसोमल रिसेसिव स्यूडोहाइपोल्डोस्टेरोनिज्म टाइप II के कारण के रूप में एक उपन्यास समयुग्मक केएलएचएल3 उत्परिवर्तन का जीवन के अंत में निदान किया गया

सार परिचय:

स्यूडोहाइपोल्डोस्टेरोनिज्म टाइप II (पीएचए II) एक मेंडेलियन विकार है, जिसमें हाइपरकेलेमिक एसिडोसिस और कम प्लाज्मा रेनिन स्तर होते हैं, जो आमतौर पर उच्च रक्तचाप से जुड़े होते हैं। WNK1, WNK4, CUL3, और KLHL3 में उत्परिवर्तन PHA II का कारण बनते हैं, WNK1, WNK4, और CUL3 में प्रमुख उत्परिवर्तन और KLHL3 में या तो प्रमुख या अप्रभावी उत्परिवर्तन होते हैं। अप्रभावी केएलएचएल3 उत्परिवर्तन वाले चौदह परिवारों की सूचना मिली है, जिनका निदान 3 महीने से 56 वर्ष की आयु में किया गया है, आमतौर पर सामान्य किडनी फ़ंक्शन वाले व्यक्तियों में।

तरीके: हमने हाइपरकेलेमिक उच्च रक्तचाप वाले एक मरीज में नैदानिक ​​​​और आनुवंशिक जांच की और WNK4 प्रोटीन अभिव्यक्ति पर केएलएचएल 3 उम्मीदवार रोग उत्परिवर्तन के प्रभाव की जांच करने के लिए आणविक गतिशीलता सिमुलेशन, COS7 कोशिकाओं में विषम अभिव्यक्ति और वेस्टर्न ब्लॉटिंग का उपयोग किया।

किडनी के लिए सिस्तांचे का हर्बल फॉर्मूलेशन प्राप्त करने के लिए यहां क्लिक करें

परिणाम: रोगी, एक सजातीय परिवार की एक 58- वर्षीय महिला, उच्च रक्तचाप, गंभीर मांसपेशियों में दर्द, नेफ्रोलिथियासिस, क्रोनिक किडनी रोग (सीकेडी), और कोरोनरी हृदय रोग से जुड़ी लगातार हाइपरकेलेमिक एसिडोसिस दिखाती है। हाइड्रोक्लोरोथियाज़ाइड के साथ थेरेपी ने हाइपरकेलेमिया, उच्च रक्तचाप और मांसपेशियों में दर्द को ठीक किया। आनुवंशिक विश्लेषण से अत्यधिक संरक्षित KLHL3 स्थिति में एक समयुग्मजी p.Arg431Trp उत्परिवर्तन का पता चला। सिमुलेशन ने उत्परिवर्ती प्रोटीन की कम स्थिरता का सुझाव दिया, जिसकी पुष्टि वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा की गई। जंगली-प्रकार केएलएचएल3 की तुलना में, पी.आर्ग- 431टीआरपी केएलएचएल3 के सह-संक्रमण से डब्ल्यूएनके4 प्रोटीन स्तर में वृद्धि हुई, जिससे अनुमान लगाया गया कि थियाजाइड-संवेदनशील वाहक और पीएचए II के माध्यम से NaCl पुनर्अवशोषण में वृद्धि हुई है।

निष्कर्ष: यहां तक ​​कि जीवन में देर से आने वाले और सीकेडी की उपस्थिति वाले रोगियों में भी, पीएचए II पर संदेह किया जाना चाहिए यदि रेनिन का स्तर कम है और हाइपरकेलेमिक एसिडोसिस और उच्च रक्तचाप सीकेडी चरण के लिए अपर्याप्त हैं, खासकर एक संदिग्ध पारिवारिक इतिहास की उपस्थिति में।

परिचय

प्रणालीगत धमनी उच्च रक्तचाप दुनिया भर में 1.1 अरब से अधिक वयस्कों को प्रभावित करता है [1] और इसे दुनिया भर में सभी कारणों से होने वाली रुग्णता और मृत्यु दर के लिए सबसे महत्वपूर्ण परिवर्तनीय जोखिम कारक माना जाता है [2]। लगभग 90% वयस्क रोगियों में मल्टीफैक्टोरियल जीन-पर्यावरण एटियोलॉजी [2] के साथ तथाकथित प्राथमिक या आवश्यक उच्च रक्तचाप होता है, जबकि शेष में उच्च रक्तचाप के अंतर्निहित कारण की पहचान की जा सकती है। माध्यमिक उच्च रक्तचाप के सामान्य कारण हैं प्राथमिक एल्डोस्टेरोनिज्म, ऑब्सट्रक्टिव स्लीप एपनिया, पैरेन्काइमल रीनल डिजीज और रीनल आर्टरी स्टेनोसिस [3]। दुर्लभ मामलों में, उच्च रक्तचाप एक मोनो-जेनिक लक्षण के रूप में विरासत में मिला है। प्रभावित मरीज़ आमतौर पर कम प्लाज्मा रेनिन स्तर के साथ उपस्थित होते हैं, जबकि एल्डोस्टेरोन और इलेक्ट्रोलाइट स्तर अंतर्निहित एटियलजि के आधार पर भिन्न होते हैं [4]। उच्च रक्तचाप के मेंडेलियन रूप अक्सर बचपन या युवावस्था में प्रकट होते हैं। मोनो-जेनिक उच्च रक्तचाप के लिए वयस्कों की शायद ही कभी जांच की जाती है; इस प्रकार, सामान्य आबादी में इसकी व्यापकता अज्ञात बनी हुई है। एक चयनित समूह में (इनमें से कम से कम एक को शामिल करने का मानदंड: शुरुआत में उम्र 35 वर्ष से कम या इसके बराबर, प्रतिरोधी उच्च रक्तचाप, इलेक्ट्रोलाइट असामान्यताओं के साथ उच्च रक्तचाप, हार्मोनल असामान्यताएं, असामान्य इमेजिंग परिणाम, या विचारोत्तेजक नैदानिक ​​संकेत), 37 उम्मीदवार जीन की जांच की गई, और 1,179 मामलों में से 33 (2.8%) में रोगजनक या संभावित रोगजनक वेरिएंट की पहचान की गई थी [5]।

यह अध्ययन स्यूडोहाइपोल्डोस्टेरोनिज्म प्रकार II (पीएचए II) पर केंद्रित है, जो मेंडेलियन उच्च रक्तचाप का एक रूप है जिसमें हाइपरकेलेमिक एसिडोसिस और निम्न प्लाज्मा रेनिन स्तर शामिल हैं [6]। PHA II को पारिवारिक हाइपरकेलेमिक उच्च रक्तचाप के रूप में भी जाना जाता है। इसका वर्णन पहली बार 1964 में पेवर और पॉलीन द्वारा एक युवा पुरुष में किया गया था, जो अन्यथा सामान्य गुर्दे की कार्यप्रणाली के बावजूद गंभीर उच्च रक्तचाप और हाइपरकेलेमिया से पीड़ित था [7] जिसे स्टोक्स और उनके सहयोगियों [8] और अर्नोल्ड और हीली [9] द्वारा आगे दिखाया गया था और कम दिखाया गया था प्लाज्मा रेनिन. 1970 में गॉर्डन एट अल द्वारा छोटे कद, उच्च रक्तचाप, गंभीर हाइपरकेलेमिया, हल्के एसिडिमिया, आवधिक पक्षाघात और दबी हुई रेनिन से पीड़ित एक 10- वर्षीय लड़की की रिपोर्ट के बाद। [10], इस सिंड्रोम को कभी-कभी गॉर्डन सिंड्रोम भी कहा जाता है।

2001 में, विथ-नो-लाइसिन (डब्ल्यूएनके) सेरीन-थ्रेओनीन काइनेज जीन डब्ल्यूएनके1 और डब्ल्यूएनके4 में उत्परिवर्तन को पीएचए II [11] के कारणों के रूप में पहचाना गया, और केएलएचएल3 (एनकोडिंग केल्च-लाइक 3) और सीयूएल3 (एनकोडिंग) में और उत्परिवर्तन हुए। कलिन 3) जीन का वर्णन 2012 में किया गया था [12, 13]। WNK1, WNK4, और CUL3 में उत्परिवर्तन के कारण होने वाले PHA II सबफॉर्म ऑटोसोमल-प्रमुख विकार हैं, जबकि KLHL3 उत्परिवर्तन या तो ऑटोसोमल-प्रमुख या ऑटोसोमल-रिसेसिव फैशन में विरासत में मिल सकते हैं [12]। केएलएचएल3 में एक एन-टर्मिनल बीटीबी डोमेन है, इसके बाद एक बैक डोमेन और एक सी-टर्मिनल छह-ब्लेड-प्रोपेलर संरचना है जिसमें तथाकथित केल्च-जैसे दोहराव शामिल हैं (चित्र 1 डी, 2 ए में दिखाया गया है)। प्रमुख केएलएचएल3 उत्परिवर्तन प्रोपेलर ब्लेड में या उनके बीच क्लस्टर होते हैं, जबकि अप्रभावी उत्परिवर्तन पूरे प्रोटीन में वितरित होते हैं [12]। प्रमुख मामलों की तुलना में अप्रभावी मामले कम आम हैं; कुल मिलाकर, 14 परिवारों के 21 रोगियों में अप्रभावी केएलएचएल3 उत्परिवर्तन प्रकाशित किए गए हैं [12-15] (तालिका 1)।

PHA II में उच्च रक्तचाप की अंतर्निहित पैथोफिज़ियोलॉजी गुर्दे के दूरस्थ घुमावदार नलिका में थियाजाइड-संवेदनशील वाहक (Na-Cl कोट्रांसपोर्टर, NCCT) के माध्यम से NaCl पुनर्अवशोषण को बढ़ाती है, और थियाजाइड के साथ थेरेपी PHA II के रोगियों में उच्च रक्तचाप और इलेक्ट्रोलाइट असामान्यताएं दोनों को ठीक करती है। [16]. संक्षेप में, WNK1 और WNK4 फॉस्फोराइलेट OSR1 (ऑक्सीडेटिव तनाव-उत्तरदायी जीन 1) और SPAK (Ste20-संबंधित प्रोलाइन-अलैनिन-समृद्ध काइनेज), जो फिर फॉस्फोराइलेट करते हैं और NCCT को सक्रिय करते हैं [17,18]। KLHL3 यूबिकिटिन लिगेज CUL3 का एक सब्सट्रेट एडाप्टर है; KLHL3-CUL3 कॉम्प्लेक्स ubiquitinylates WNK किनेसेस को बढ़ावा देता है और इस प्रकार उनके क्षरण को बढ़ावा देता है [19]। यूबिकिटिन लिगेज फ़ंक्शन की हानि या डब्लूएनके किनेसेस के साथ खराब बंधन के कारण डब्लूएनके प्रचुरता में वृद्धि, एनसीसीटी फॉस्फोराइलेशन [18] में वृद्धि, और डिस्टल घुमावदार नलिका में NaCl अवशोषण में वृद्धि हुई है। नेफ्रॉन के बाद के खंडों में, ENaC (एपिथेलियल सोडियम चैनल) के माध्यम से NaCl पुनर्अवशोषण और ROMK (रीनल आउटर मेडुलरी पोटेशियम चैनल) के माध्यम से K+ स्राव कम हो जाता है [20, 21]। केएलएचएल3 नॉकआउट चूहों में दूरस्थ घुमावदार नलिका का हाइपोप्लेसिया, डब्लूएनके1 और डब्लूएनके4 के स्तर में जोरदार वृद्धि, और गुर्दे में ओएसआर1, एसपीएके और एनसीसी फॉस्फोराइलेशन में वृद्धि देखी गई है। इसके अलावा, वे हाइपरकेलेमिया, हाइपरक्लोरेमिया और मेटाबॉलिक एसिडोसिस [22] प्रदर्शित करते हैं। यहां, हम ऑटोसोमल-रिसेसिव पीएचए II वाले एक मरीज की रिपोर्ट करते हैं और अंतर्निहित आनुवंशिक उत्परिवर्तन और पैथोफिजियोलॉजी का वर्णन करते हैं।

सामग्री और तरीके

डीएनए तैयारी और सेंगर अनुक्रमण डीएनए को निर्माता के निर्देशों के अनुसार QIAamp डीएनए ब्लड मैक्सी किट (क्यूजेन) का उपयोग करके एक परिधीय शिरापरक रक्त नमूने से तैयार किया गया था। जीनोमिक डीएनए की मानक पीसीआर और प्रत्यक्ष द्विदिशात्मक सेंगर अनुक्रमण केएलएचएल3 [13], डब्लूएनके1, और डब्लूएनके4 [11] और सीयूएल3_9एफ (5′-AGGAGACACTTTCTCAAACCG-3′) के लिए प्रकाशित प्राइमरों का उपयोग करके किया गया था। और CUL3 के लिए CUL3_9R (5′-TGTTCTTCTCCAAAACAATCTACC-3′) प्राइमर। यूरोफिन्स जीनोमिक्स में सेंगर अनुक्रमण का प्रदर्शन किया गया।

अनुक्रम संरेखण

एनसीबीआई प्रोटीन ब्लास्ट (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) और एगएनओजी डेटाबेस (//eggnogdb.embl.de) का उपयोग करके समजात प्रोटीन अनुक्रमों की पहचान की गई। दिखाए गए अनुक्रमों में मानव केएलएचएल3 और उसके ऑर्थोलॉग शामिल हैं: होमो सेपियन्स (एनपी_059111.2), मस मस्कुलस (एनपी_001349344.2), गैलस गैलस (एक्सपी_015149442.1), डेनियो रेरियो (एक्सपी_021328460.1), सिओना इंटेस्टाइनलिस (एक्सपी_009862126.1), ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर (एनपी_724095.1), और कैनोर्हाडाइटिस एलिगेंस (एनपी_001254310.1) . मानव समानताएं साहित्य अनुसंधान द्वारा पहचानी गईं और इसमें केएलएचएल1 से केएलएचएल42 शामिल हैं जैसा कि ऑनलाइन पूरक तालिका 1 में दिखाया गया है (सभी ऑनलाइन आपूर्ति सामग्री के लिए, www.karger.com/doi/10.1159/000521626 देखें) [23]। जलव्यू संस्करण 2.10.5 [24] का उपयोग करके अनुक्रमों को संरेखित किया गया था। डोमेन संरचना UniProt (Q9UH77, 13 अप्रैल, 2021 को एक्सेस की गई) से थी और DOG [25] का उपयोग करके कल्पना की गई थी।

प्लास्मिड और साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन

pTRE2hyg WNK4 और pFN21A KLHL3 प्लास्मिड डॉ. शिनिची उचिदा (टोक्यो मेडिकल और डेंटल यूनिवर्सिटी) के दयालु उपहार थे। p.R431W उत्परिवर्तन को प्रस्तुत करने के लिए, प्राइमर को प्राइमर }F) और 5′- CCACACTGCTCCACCGCGTGTTCATC -3′ (KLHL3_R431W_1R). उत्परिवर्ती अवशेषों को बोल्ड में दिखाया गया है। निर्माता के निर्देशों के अनुसार पीएफयूअल्ट्रा हाई-फिडेलिटी डीएनए पॉलीमरेज़ (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज, सांता क्लारा, सीए, यूएसए) के साथ क्विकचेंज साइट-डायरेक्टेड म्यूटेनेसिस किट का उपयोग करके साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन किया गया था। सीडीएनए को यूरोफिन्स जीनोमिक्स में सेंगर-अनुक्रमित किया गया था। QIAGEN प्लास्मिड प्लस मैक्सी किट का उपयोग करके प्लास्मिड तैयार किए गए थे।

ऊतक संस्कृति, क्षणिक अभिकर्मक, और पश्चिमी धब्बा

COS7 कोशिकाओं को DMEM + L-ग्लूटामाइन, 10% FBS, और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (सभी गिब्को, थर्मो फिशर) में संवर्धित किया गया था। ट्रांसफ़ेक्शन के लिए, कोशिकाओं को 1.9 × 1{86}}5 कोशिकाओं/वेल के घनत्व पर {{5}वेल प्लेटों पर बोया गया और लगभग 9{87}}% घनत्व तक विकसित किया गया। निर्माता के निर्देशों के अनुसार कोशिकाओं को 1 µg pTRE2hyg WNK4 और 2 µg pFN21A (खाली वेक्टर या KLHL3 जंगली प्रकार [WT]) या KLHL3 R431W cDNA के साथ लिपोफ़ेक्टामाइन 2 (थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करके ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। अभिकर्मक के लिए दो-दो स्वतंत्र क्लोनों का उपयोग किया गया। ट्रांसफ़ेक्शन के अड़तालीस घंटे बाद, कोशिकाओं को ठंडे पीबीएस में धोया गया और 10 मिमी ट्रिस-एचसीएल (पीएच 7.5), 150 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, और 1% NP40 जिसमें पूर्ण प्रोटीज़ इनहिबिटर कॉकटेल (रोश, मर्क) शामिल था, में मिलाया गया। लाइसेट को 4 डिग्री पर 30 मिनट के लिए 20,{49}} ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था, और सतह पर तैरनेवाला को -20 डिग्री पर संग्रहीत किया गया था। निर्माता के निर्देशों के अनुसार बीसीए परख (पियर्स, थर्मो फिशर) द्वारा प्रोटीन सांद्रता डुप्लिकेट (मानक) या ट्रिपलिकेट्स (नमूने) में निर्धारित की गई थी। लगभग 20 माइक्रोग्राम कुल प्रोटीन को SDSPAGE द्वारा विभाजित किया गया और PVDF झिल्ली (1.5 h, 100 V) में स्थानांतरित किया गया। टीबीएसटी में 2% सूखे दूध में झिल्लियाँ अवरुद्ध हो गईं। वेस्टर्न ब्लॉट को पॉलीक्लोनल खरगोश एंटी-हेलोटैग (क्रोमेगा # जी9281, 1:500, 4 डिग्री रातोंरात) का उपयोग करके किया गया था, इसके बाद गधे आईजीजी एंटी-खरगोश आईजीजी (एच + एल) -एचआरपीओ (जैक्सन इम्यूनो रिसर्च # {{46) के साथ धुलाई और ऊष्मायन किया गया था। }}, डायनोवा, 1:20, 000, कमरे के तापमान पर 1 घंटे), धुलाई, और उन्नत केमिलुमिनसेंट डिटेक्शन (एमर्सहम ईसीएल प्राइम वेस्टर्न ब्लॉटिंग डिटेक्शन रिएजेंट, जीई हेल्थकेयर)। ROTIFree स्ट्रिपिंग बफर 2.0 (कार्ल रोथ) का उपयोग करके ब्लॉट्स को हटा दिया गया, 4 डिग्री पर रात भर TBST में 2% सूखे दूध में अवरुद्ध किया गया, और मोनोक्लोनल माउस एंटी-फ़्लैग M2 (सिग्माएल्ड्रिच # F1804, मर्क, 1: 1, {{69} के साथ इनक्यूबेट किया गया। }, कमरे के तापमान पर 1.5 घंटे), उसके बाद गधा आईजीजी एंटी-माउस आईजीजी (एच + एल)-एचआरपीओ (जैक्सन इम्यूनोरिसर्च # {{66 }}, डायनोवा, 1:20, {{76 }}, कमरे में 1 घंटे तापमान), ईसीएल का पता लगाना, अलग करना और ऊपर बताए अनुसार ब्लॉक करना। इसके बाद ब्लॉट्स को मोनोक्लोनल माउस एंटी-एक्टिन (सिग्मा-एल्ड्रिच # ए2228, मर्क, 1:5,000, कमरे के तापमान पर 1 घंटा) और गधे आईजीजी एंटी-माउस आईजीजी के साथ इनक्यूबेट किया गया, इसके बाद फिर से ईसीएल का पता लगाया गया। केमीडॉक एक्सआरएस+ (बायो-रेड) पर इमेज लैब सॉफ्टवेयर का उपयोग करके बैंड की मात्रा निर्धारित की गई थी। क्रमशः एंटी-हेलोटैग एंटीबॉडी और एंटी-फ़्लैग एम2 एंटीबॉडी द्वारा पता लगाए गए बैंड की तीव्रता को एंटी - - एक्टिन एंटीबॉडी द्वारा पता लगाए गए बैंड की संबंधित तीव्रता से विभाजित किया गया था। KLHL3 के अभिव्यक्ति स्तर का आकलन करने के लिए, कोशिकाओं को 0 µg, 0.5 µg, 1 µg, 2 µg, 4 µg, और 8 µg pFN21A KLHL3 WT या R431W का उपयोग करके ऊपर बताए अनुसार ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। ऊपर बताए अनुसार जेल वैद्युतकणसंचलन और ब्लॉटिंग का प्रदर्शन किया गया। साइक्लोहेक्सिमाइड चेज़ परख के लिए, कोशिकाओं को ऊपर बताए अनुसार सीड किया गया और ऊपर बताए अनुसार ट्रांसफ़ेक्ट किया गया, हालांकि 2 μg pFN21A KLHL3 WT या 4 μg KLHL3 R431W के साथ। ट्रांसफ़ेक्शन के अड़तालीस घंटे बाद, 100 µM साइक्लोहेक्सिमाइड जोड़ा गया, और संकेतित समय बिंदुओं के बाद कोशिकाओं को लाइज़ किया गया। आगे के विश्लेषण चरण उपरोक्तानुसार थे।

चित्र 2. WT और p.Arg431Trp (R431W) KLHL3 केल्च डोमेन के एमडी सिमुलेशन। केल्च डोमेन का ऊपर से नीचे का दृश्य (PDBID: 4CH9), -प्रोपेलर ब्लेड्स (K1-K6) द्वारा रंगीन। उत्परिवर्तन स्थल को एक पीले तारे द्वारा दर्शाया गया है, और रुचि का क्षेत्र भूरे रंग का है (अवशेष 425-465), और WNK4 पेप्टाइड (सिमुलेशन में शामिल नहीं) पारदर्शी और भूरे रंग का है। बी प्रोटीन बैकबोन पर मैप किए गए केल्च डोमेन के एमएसएफ में अंतर। उत्परिवर्तन स्थल को एक पीले तारे द्वारा दर्शाया गया है। लाल रंग प्रोटीन के अधिक गतिशील (कम स्थिर) भागों को इंगित करता है। तीन स्वतंत्र सिमुलेशन प्रतिकृतियों (बोल्ड लाइनें, रनिंग औसत) के लिए क्रिस्टल संरचना से पूरे प्रोटीन (शीर्ष), अवशेष 425-465 (मध्य), और डब्लूएनके 4- बाइंडिंग पॉकेट (नीचे) का सी आरएमएसडी। डी K3 (अवशेष 425-441) और K4 (442-465) के बीच hbonds (बाएं) और COM दूरी (मध्य) के वायलिन प्लॉट -प्रोपेलर ब्लेड और बाइंडिंग-पॉकेट इलेक्ट्रोस्टैटिक्स (दाएं)। प्रयोगात्मक/प्रारंभिक मॉडल (काला) के साथ प्रत्येक प्रतिकृति (WT, नीला; R431W, ग्रे) के अंतिम फ्रेम (1.1 μs) से K3-K4 इंटरफ़ेस का संरचनात्मक ओवरले। प्रोटीन बैकबोन को कार्टून के रूप में प्रदर्शित किया गया है, अवशेष 431 को छड़ियों के रूप में प्रदर्शित किया गया है। एमएसएफ, माध्य वर्ग उतार-चढ़ाव।

आणविक गतिशीलता सिमुलेशन

WT मॉडल WNK4 पेप्टाइड टुकड़े [26] के साथ जटिल रूप से मानव केल्च डोमेन के एक्स-रे क्रिस्टल संरचना (PDBID: 4CH9) पर आधारित था। दृश्य आणविक गतिशीलता संस्करण 1.9.3 [27] में पीएसएफजेन उपयोगिता का उपयोग करके लापता परमाणुओं और टर्मिनल कैप को जोड़ा गया था। उत्परिवर्ती (R431W) KLHL3 मॉडल मॉडेलर संस्करण 9.18 [28] का उपयोग करके तैयार किया गया था। प्रत्येक प्रणाली के लिए अंतिम अवशेष सीमा 300–585 थी। WT और R431W मॉडल के N- और C-टर्मिनी को क्रमशः एसिटिलीकरण और N-मिथाइलमिडेशन द्वारा बेअसर कर दिया गया। PROPKA संस्करण 3.0 [29] के विश्लेषण के अनुसार प्रत्येक अनुमापनीय अवशेष को डिफ़ॉल्ट प्रोटोनेशन स्थिति सौंपी गई थी। प्रारंभिक संतुलन सिमुलेशन के बाद केएलएचएल3 से पृथक्करण के कारण WNK4 पेप्टाइड को उत्पादन सिमुलेशन से हटा दिया गया था।

सभी सिमुलेशन GROMACS सॉफ़्टवेयर पैकेज संस्करण 2021 [30] का उपयोग करके आयोजित किए गए थे। CHARMM36m बल-क्षेत्र मापदंडों का उपयोग प्रोटीन परमाणुओं के लिए किया गया था [31]। आयनों का वर्णन डिफ़ॉल्ट CHARMM मापदंडों का उपयोग करके किया गया था, और TIP3P मॉडल का उपयोग पानी के लिए किया गया था [32]। प्रारंभिक संतुलन चरण के लिए 1 एफएस का एकीकरण समय चरण का उपयोग किया गया था, इसके बाद के सभी सिमुलेशन के लिए 2 एफएस का उपयोग किया गया था। हाइड्रोजन से जुड़े सभी बांडों को LINCS [33] का उपयोग करके नियंत्रित किया गया था। नॉनबॉन्डेड वैन डेर वाल्स इंटरैक्शन की गणना 1.2 एनएम के कटऑफ त्रिज्या के साथ लेनार्ड-जोन्स क्षमता का उपयोग करके की गई थी; 1.2-1.0 एनएम की सीमा में बलों को सुचारू रूप से बंद कर दिया गया। सभी इलेक्ट्रोस्टैटिक्स की गणना 1.2 एनएम की वास्तविक-अंतरिक्ष कटऑफ दूरी के साथ चिकनी कण-मेष इवाल्ड [34] विधि का उपयोग करके की गई थी। आइसोकोरिक-आइसोथर्मल एनसेंबल (एनवीटी) में एक प्रारंभिक सिमुलेशन के बाद, बाद के सभी सिमुलेशन 0.5 पीएस के समय स्थिरांक के साथ वेगरेस्केलिंग थर्मोस्टेट [35] का उपयोग करके 310.15 K के तापमान पर आइसोबैरिक-आइसोथर्मल असेंबल (एनपीटी) में किए गए थे। थर्मोस्टेट को प्रोटीन और विलायक (यानी, पानी और आयन) पर अलग से लगाया गया था; सेंटर-ऑफ-मास (COM) गति को हटाने के लिए समान समूहों का उपयोग किया गया था। 5 पीएस के समय स्थिरांक के साथ आइसोट्रोपिक तरीके से बेरेन्डसेन [36] या पैरिनेलो-रहमान [37] बैरोस्टेट का उपयोग करके 1 बार का दबाव लगाया गया था।

WT और R431W मॉडल को 1.2 × 1.2 × 1.2 एनएम3 के प्रारंभिक आयामों के साथ एक क्यूबिक बॉक्स में सॉल्व किया गया था। प्रत्येक प्रणाली को 150 mM NaCl से निष्प्रभावी कर दिया गया। प्रारंभिक तीव्रतम ऊर्जा न्यूनीकरण के बाद, प्रत्येक प्रणाली को सभी प्रोटीन परमाणुओं पर स्थिति प्रतिबंधों के साथ 5 एनएस के लिए एनवीटी समूह में संतुलित किया गया था। पिछले चरण के समान प्रतिबंधों के साथ 5 एनएस के लिए एनपीटी संयोजन में एक बाद का संतुलन चरण निष्पादित किया गया था। अंतिम संतुलन सिमुलेशन के लिए सभी पार्श्व श्रृंखलाओं से स्थिति प्रतिबंध हटा दिए गए थे। WT और R431W सिस्टम के स्वतंत्र उत्पादन सिमुलेशन के लिए संतुलन के अंतिम चरण से तीन प्रारंभिक संरचनाएं उत्पन्न की गईं, जिसमें सभी स्थिति प्रतिबंध हटा दिए गए। प्रत्येक उत्पादन प्रतिकृति को 1.1 μs के लिए सिम्युलेटेड किया गया था; पहले 0.1 μs को विश्लेषण से हटा दिया गया था।

सिमुलेशन के दौरान संरचनात्मक स्थिरता का आकलन करने के लिए, क्रिस्टल संरचना से मूल माध्य वर्ग विचलन (आरएमएसडी) की गणना संपूर्ण प्रोटीन के सी परमाणुओं के साथ-साथ K3-K4 इंटरफ़ेस (अवशेष 425-465) और के लिए की गई थी। WNK4- बाइंडिंग पॉकेट (अवशेष 339, 355, 360, 386, 402, 407, 432, 449, 451, 481, 498, 528, और 577)। आरएमएसडी ट्रेस के रनिंग औसत की गणना की गई और उसे कच्चे डेटा के साथ जोड़ा गया।

संरचनात्मक स्थिरता पर उत्परिवर्तन के प्रभाव को प्रोटीन सी परमाणुओं के औसत वर्ग उतार-चढ़ाव में अंतर की गणना करके, फ्रेम और प्रतिकृतियों पर औसत और डब्ल्यूटी प्रोटीन संरचना में मैप करके देखा गया था। सभी प्रोटीन विज़ुअलाइज़ेशन काइमेराएक्स [38] का उपयोग करके उत्पन्न किए गए थे। K3 (अवशेष 425-441) से K4 (अवशेष 442-465) इंटरफ़ेस पर R431W उत्परिवर्तन का प्रभाव हाइड्रोजन बॉन्ड (H-बॉन्ड) विश्लेषण और दो समूहों के बीच COM दूरी द्वारा चित्रित किया गया था। क्रमशः 3.5 Å और 30 डिग्री की दूरी और कोण कटऑफ के साथ, GROMACS टूल जीएमएक्स एचबॉन्ड का उपयोग करके प्रत्येक फ्रेम पर एच-बॉन्ड का मूल्यांकन किया गया था। प्रत्येक फ्रेम पर COM दूरियों का समान रूप से मूल्यांकन किया गया था - Hbonds और COM दोनों दूरियों के वितरण को वायलिन प्लॉट के रूप में देखा गया था। औसत की गणना प्रक्षेप पथों और प्रतिकृतियों पर की गई।

WNK {{0} बाइंडिंग पॉकेट के इलेक्ट्रोस्टैटिक्स की गणना g {{1} elpot [39] का उपयोग करके की गई थी। बाइंडिंग पॉकेट में इलेक्ट्रोस्टैटिक क्षमता के समय पाठ्यक्रम का मूल्यांकन 8 Å की त्रिज्या के साथ एक गोलाकार आयतन को परिभाषित करके किया गया था, जो बाइंडिंग पॉकेट में शामिल अवशेषों के ज्यामितीय केंद्र पर केंद्रित था। इलेक्ट्रोस्टैटिक्स में भिन्नता का मूल्यांकन करने के लिए, ns ब्लॉक औसत की गणना की गई। WT और R431W म्यूटेंट के लिए बाइंडिंग पॉकेट के भीतर इलेक्ट्रोस्टैटिक क्षमता के वितरण को वायलिन प्लॉट के रूप में देखा गया था, जिसमें औसत की गणना 50-ns ब्लॉक और प्रक्षेपवक्र पर की गई थी।

वेसिस्टैंच की सहायक सेवा-चीन में सबसे बड़ा सिस्टैंच निर्यातक:

ईमेल:wallence.suen@wecistanche.com

व्हाट्सएप/टेलीभाष:+86 15292862950

अधिक विशिष्ट विवरण के लिए खरीदारी करें:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

किडनी के लिए 25% इचिनाकोसाइड और 9% एक्टीओसाइड के साथ प्राकृतिक कार्बनिक सिस्टान्च अर्क प्राप्त करें