एक नवीन नेट्रिन -1-व्युत्पन्न पेप्टाइड न्यूरोनल मृत्यु के खिलाफ सुरक्षा बढ़ाता है और चूहों में इंट्रासेरेब्रल रक्तस्राव को कम करता है भाग 1

अमूर्त:

यह बताया गया है कि नेट्रिन-1 केंद्रीय तंत्रिका तंत्र पर चोट के बाद न्यूरोप्रोटेक्शन में शामिल है। हालाँकि, नेट्रिन का न्यूनतम कार्यात्मक डोमेन -1 जो न्यूरोप्रोटेक्शन को संरक्षित कर सकता है लेकिन नेट्रिन के प्रमुख दुष्प्रभावों से बच सकता है, मायावी बना हुआ है।

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र मानव शरीर में सबसे महत्वपूर्ण तंत्रिका तंत्रों में से एक है, जो लोगों की सोच, भावनाओं और कार्यों को नियंत्रित करता है। जब केंद्रीय तंत्रिका तंत्र क्षतिग्रस्त हो जाता है, तो लोगों की याददाश्त भी प्रभावित होगी। लेकिन चिंता न करें, हम याददाश्त बहाल करने में मदद के लिए कुछ सकारात्मक तरीके अपना सकते हैं।

सबसे पहले, आपको स्मृति क्षति के प्रभाव को समझने की आवश्यकता है। केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को नुकसान लोगों की संज्ञानात्मक क्षमताओं, सोचने की प्रक्रियाओं और ध्यान को प्रभावित कर सकता है, ये सभी सीधे तौर पर लोगों की याददाश्त को प्रभावित करते हैं। इसके अलावा, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को नुकसान भी भावनात्मक अस्थिरता का कारण बन सकता है, जिससे लोग घबराहट, चिंता और अवसाद से ग्रस्त हो जाते हैं, जिससे स्मृति की वसूली प्रभावित होती है।

हालाँकि, हालांकि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को नुकसान कुछ नकारात्मक प्रभाव ला सकता है, हम स्मृति पुनर्प्राप्ति को बढ़ावा देने के लिए कुछ सकारात्मक उपाय कर सकते हैं। सबसे पहले, हम कुछ संज्ञानात्मक प्रशिक्षण का प्रयास कर सकते हैं, जैसे पढ़ना, लिखना और पहेलियाँ सुलझाना। ये गतिविधियाँ मस्तिष्क को नए न्यूरॉन्स उत्पन्न करने के लिए उत्तेजित कर सकती हैं और मस्तिष्क को नई यादें और सोचने के तरीके बनाने में मदद कर सकती हैं।

दूसरे, हम कुछ शारीरिक व्यायाम के माध्यम से भी मेमोरी रिकवरी को बढ़ावा दे सकते हैं। अध्ययनों से पता चला है कि उचित व्यायाम मस्तिष्क को नए न्यूरॉन्स और न्यूरोनल कनेक्शन बनाने के लिए उत्तेजित कर सकता है और मस्तिष्क की नई जानकारी के प्रसंस्करण को बढ़ावा दे सकता है। यही कारण है कि कुछ लोग दौड़ते या चलते समय अचानक कोई अच्छा विचार लेकर आते हैं या किसी कठिन समस्या का समाधान कर लेते हैं।

अंत में, हमें याददाश्त पर सही पोषण सेवन की भूमिका पर ध्यान देने की आवश्यकता है। मस्तिष्क के सामान्य कामकाज के लिए कुछ आवश्यक पोषक तत्वों, जैसे प्रोटीन, विटामिन और ट्रेस तत्वों की आवश्यकता होती है। यदि हमारे भोजन में इन पोषक तत्वों की कमी है, तो इसका असर हमारी याददाश्त और सोचने की क्षमता पर पड़ेगा। इसलिए, हमें अपने आहार में इन पोषक तत्वों से भरपूर कुछ खाद्य पदार्थों का चयन करना चाहिए, जैसे मछली, दुबला मांस, सब्जियां और फल।

संक्षेप में, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को नुकसान होने से लोगों की याददाश्त पर एक निश्चित प्रभाव पड़ेगा, लेकिन हम उचित संज्ञानात्मक प्रशिक्षण, शारीरिक व्यायाम और आहार नियंत्रण के माध्यम से स्मृति पुनर्प्राप्ति को बढ़ावा दे सकते हैं। मुझे आशा है कि हर कोई जीवन में चुनौतियों का सकारात्मक रूप से सामना कर सकता है, आशावादी रवैया बनाए रख सकता है, और एक स्वस्थ केंद्रीय तंत्रिका तंत्र और अच्छी याददाश्त को बहाल करने का प्रयास कर सकता है। यह देखा जा सकता है कि हमें याददाश्त में सुधार करने की आवश्यकता है, और सिस्टैंच याददाश्त में काफी सुधार कर सकता है क्योंकि सिस्टैंच एक पारंपरिक चीनी दवा है जिसके कई अनोखे प्रभाव हैं, जिनमें से एक है याददाश्त में सुधार करना। सिस्टैंच की प्रभावकारिता इसमें मौजूद विभिन्न सक्रिय तत्वों से आती है, जिसमें टैनिक एसिड, पॉलीसेकेराइड, फ्लेवोनोइड ग्लाइकोसाइड आदि शामिल हैं, जो कई तरीकों से मस्तिष्क स्वास्थ्य को बढ़ावा दे सकते हैं।

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यहां, हमने नेट्रिन के ईजीएफ3 डोमेन (अवशेष 407-422) से प्राप्त पेप्टाइड ई1 के न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव की जांच की। हमने पाया कि यह न्यूरोप्रोटेक्शन प्रदर्शित करने वाले फोकल आसंजन कीनेज फॉस्फोराइलेशन को सक्रिय करने के लिए हटाए गए कोलोरेक्टल कार्सिनोमा (डीसीसी) के साथ इंटरैक्ट करता है।

पेप्टाइड ई1 का प्रशासन इंट्रासेरेब्रलहेमरेज (आईसीएच) के एक प्रयोगात्मक म्यूरिन मॉडल में एपोप्टोसिस को कम करके कार्यात्मक पुनर्प्राप्ति में सुधार करने में सक्षम था।

संक्षेप में, हम नेट्रिन -1 का एक कार्यात्मक अनुक्रम प्रकट करते हैं जो आईसीएच के बाद पुनर्प्राप्ति प्रक्रिया में शामिल है और आईसीएच के उपचार के लिए एक उम्मीदवार पेप्टाइड की पहचान करते हैं।

कीवर्ड: इंट्रासेरेब्रल रक्तस्राव; हेमिन; न्यूरोप्रोटेक्शन; नेट्रिन-1; पेप्टाइड.

1 परिचय

इंट्रासेरेब्रल हेमरेज (आईसीएच) उच्च मृत्यु दर और रुग्णता दर के साथ एक विनाशकारी स्ट्रोक उपप्रकार है [1-3] जिसमें मस्तिष्क के भीतर मस्तिष्क रक्त वाहिकाओं का असामान्य टूटना शामिल है [4,5]।

हेमोस्टेसिस प्राप्त करने और इंट्राक्रैनील दबाव से राहत पाने के लिए हेमटॉमस को सर्जिकल हटाने को प्राथमिकता दी जाती है [6]। हालाँकि, अवशेष हेमेटिक अवशेष और रक्त-विभाजन उत्पाद अभी भी आईसीएच के बाद माध्यमिक मस्तिष्क की चोट को बढ़ावा दे सकते हैं, न्यूरोनल क्षति को प्रेरित कर सकते हैं और कार्यात्मक वसूली में देरी कर सकते हैं [7-9]।

इस प्रकार, द्वितीयक मस्तिष्क की चोट-प्रेरित न्यूरोनल क्षति को लक्षित करने वाली प्रभावी रणनीतियों का विकास स्ट्रोक के उपचार के लिए फायदेमंद होगा। नेट्रिन -1 सबसे अच्छी तरह से अध्ययन किए गए प्रोटीन में से एक है जो अपने रिसेप्टर्स के साथ बातचीत के माध्यम से एक्सोनल मार्गदर्शन और सिनैप्टोजेनेसिस [10-12] को नियंत्रित करता है। कोशिका अस्तित्व, विभेदन और प्रसार को सक्रिय करने के लिए कोलोरेक्टल कैंसर (डीसीसी) और यूएनसी5एच (असंगठित-5 होमोलॉग) में हटा दिया गया [13-15]।

जब नेट्रिन -1 अनुपस्थित होता है [16] तो रिसेप्टर्स एपोप्टोसिस में मध्यस्थता करने के लिए मृत्यु संकेत उत्पन्न करते हैं। यह ज्ञात है कि नेट्रिन को डीसीसी के साथ बांधने से डीसीसी का मंदीकरण हो जाता है और न्यूराइट के विकास और एक्सोनल मार्गदर्शन को प्रेरित करने के लिए फोकल एडिसियोनकिनेज (एफएके) के टायरोसिन 861 फॉस्फोराइलेशन की शुरुआत होती है [17,18]।

डीसीसी के साथ नेट्रिन के बंधन में नेट्रिन के ईजीएफ 3 डोमेन और नेट्रिन के सिग्नलिंग मार्ग [19,20] के सक्रियण में डीसीसी के एफएन 5 डोमेन शामिल हैं। हाल ही में, नेट्रिन -1 को इस्केमिक क्षेत्रों में न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव दिखाते हुए दिखाया गया है [21]।

सीरम का नेट्रिन -1 का अभिव्यक्ति स्तर, जो कोशिका एपोप्टोसिस को रोकता है और न्यूरोनल पुनर्जनन को बढ़ावा देता है, इस्केमिक स्ट्रोक से रोगी की रिकवरी के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबद्ध है [22,23]।

दिलचस्प बात यह है कि, अस्थि मज्जा मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं का प्रत्यारोपण जो नेट्रिन -1 को क्षतिग्रस्त चूहे की कटिस्नायुशूल तंत्रिका में स्रावित करता है, एक्सोनल पुनर्जनन शुरू करता है [24] और मोटर न्यूरॉन की मृत्यु को कम करता है [25]। वेंट्रिकल में नेट्रिन -1 प्रोटीन का स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन DCC/APPL1/AKT सिग्नलिंग [26] के सक्रियण के माध्यम से सबराचोनोइड रक्तस्राव के बाद तंत्रिका कोशिका मृत्यु को कम करता है।

नेट्रिन के ईजीएफ3 डोमेन (अमीनो एसिड 423-433) से प्राप्त एक पॉलीपेप्टाइड स्पष्ट रूप से ईआरके फॉस्फोराइलेशन को सक्रिय करता है और एनओ के उत्पादन को बढ़ावा देता है, जिसका कार्डियोप्रोटेक्टिव प्रभाव होता है [27,28]। हालाँकि, नेट्रिन -1 को ट्यूमरजेनिसिस के लिए एक संभावित बायोमार्कर के रूप में पहचाना गया है [29-31] क्योंकि नेट्रिन -1 स्थिति का विनियमन कई ऊतक-व्युत्पन्न कैंसर [32] में पाया जाता है।

जब नेट्रिन -1 अपने रिसेप्टरDCC या Unc5H से बंधा होता है, तो रिसेप्टर एक सकारात्मक संकेत प्रसारित करते हैं जिससे जीवित रहने, सूजन, एंजियोजेनेसिस और एंटी-एपोप्टोसिस होता है, जो बदले में ट्यूमरजेनिसिस को नियंत्रित करता है [31]।

इसलिए, नेट्रिन के न्यूनतम कार्यात्मक डोमेन की पहचान करना बहुत महत्वपूर्ण है, जो न्यूरोप्रोटेक्शन को संरक्षित कर सकता है और नेट्रिन के प्रमुख दुष्प्रभावों से बच सकता है। यहां, हमने पाया कि पेप्टाइड ई1 (अवशेष 407-422), जो नेट्रिन के ईजीएफ3डोमेन से प्राप्त होता है, हेमिन-प्रेरित विषाक्तता से न्यूरॉन्स की रक्षा के लिए डीसीसी के साथ इंटरैक्ट करता है।

ICH चूहों के एक प्रयोगात्मक मॉडल में, पेप्टाइड E1 के अनुप्रयोग ने कार्यात्मक पुनर्प्राप्ति में सुधार किया, जैसा कि व्यवहारिक परीक्षणों द्वारा निर्धारित किया गया है। इसके अलावा, पेप्टाइड E1 ICH के बाद न्यूरॉन्स को ख़राब होने से रोक सकता है।

इन परिणामों के आधार पर, हमने नेट्रिन के एक कार्यात्मक अनुक्रम की पहचान की है जो आईसीएच के बाद रिकवरी में शामिल है और यह निर्धारित किया है कि इस पेप्टाइड का उपयोग आईसीएच के उपचार के लिए किया जा सकता है।

2. परिणाम

2.1. ईजीएफ3 डोमेन नेट्रिन-डीसीसी इंटरेक्शन के लिए महत्वपूर्ण है

नेट्रिन-1 में एक VI डोमेन, तीन ईजीएफ रिपीट और एक सी-टर्मिनल डोमेन [33] शामिल है। मानव नेट्रिन -1/डीसीसी कॉम्प्लेक्स की क्रिस्टल संरचना से पता चलता है कि नेट्रिन -1 ईजीएफ3 डोमेन नेट्रिन -1/डीसीसी इंटरैक्शन के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन ईजीएफ1 और ईजीएफ2 डोमेन के लिए नहीं [34]।

EGF3 डोमेन पर प्रमुख अमीनो एसिड अवशेषों (His407, Gln442, या Gln443) के उत्परिवर्तन ने नेट्रिन -1/DCC बाइंडिंग [19] को पूरी तरह से बाधित कर दिया। जब Unc5 DCC के साथ सह-अस्तित्व में होता है तो आकर्षक सिग्नलिंग को प्रतिकारक सिग्नलिंग में बदलने के लिए EGF1/2 डोमेन की आवश्यकता होती है [20]।

इस प्रकार, हमने सबसे पहले पूर्ण-लंबाई और ईजीएफ 3-हटाए गए (नेट्रिन -1 ∆407-443) नेट्रिन {5}} निर्माण (चित्र 1ए) उत्पन्न किए और इन निर्माणों को जीएसटीपुलडाउन के लिए सुसंस्कृत HEK293T कोशिकाओं में क्षणिक रूप से व्यक्त किया। .

उन निर्माणों के लिए बाइंडिंग देखी गई जो नेट्रिन को व्यक्त करते हैं -1 लेकिन नेट्रिन को नहीं -1(∆407–443) (चित्र 1सी)। इन परिणामों से पता चलता है कि 407-443 एमिनोएसिड युक्त ईजीएफ3 का डोमेन डीसीसी के साथ नेट्रिन-1 की परस्पर क्रिया के लिए जिम्मेदार है। नेट्रिन-डीसीसी में ईजीएफ3 डोमेन की भूमिका की जांच करने के लिए, हमने सबसे पहले माइसी-टैग नेट्रिन{{12) को शुद्ध किया। }} या काट दिया गया नेट्रिन-1 (∆407-443) (चित्र 1बी)।

इसके बाद, HEK293T कोशिकाओं को डीसीसी सीडीएनए ले जाने वाले प्लास्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया और नेट्रिन -1 प्रोटीन के साथ इनक्यूबेट किया गया, और फिर नेट्रिन -1 बाइंडिंग का मूल्यांकन इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा किया गया।

हमने पाया कि पूर्ण-लंबाई नेट्रिन-1, लेकिन छोटा नहीं किया गया नेट्रिन-1, प्लाज्मा झिल्ली पर डीसीसी से बंधने में सक्षम था (चित्रा 1डी)। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या ईजीएफ3 डोमेन डीसीसी के साथ इंटरैक्ट कर सकता है, हमने डीसीसी को ओवरएक्सप्रेस करने वाली लाइस्ड कोशिकाओं को खींचने के लिए एक जीएसटी-ईजीएफ3कंस्ट्रक्ट तैयार किया। हमने जीएसटी-ईजीएफ3 (चित्रा 1ई) के साथ डीसीसी की विशिष्ट बाइंडिंग देखी।

इसके अलावा, हमने एफआईटीसी-लेबल पेप्टाइडईजीएफ3 को संश्लेषित किया और पुष्टि की कि, पूर्ण लंबाई वाले नेट्रिन-1 की तरह, यह प्लाज्मा झिल्ली पर डीसीसी से जुड़ने में सक्षम था (चित्रा 1एफ)। कुल मिलाकर, हमारा डेटा बताता है कि ईजीएफ3 डोमेन डीसीसी के साथ नेट्रिन-1 की बातचीत के लिए जिम्मेदार है।

2.2. EGF3 डोमेन नेट्रिन के डाउनस्ट्रीम पथों के फॉस्फोराइलेशन को प्रेरित करता है-1

नेट्रिन -1 और डीसीसी की परस्पर क्रिया एफएके, एसएफके और ईआरके [16,35] सहित कई सिग्नलिंग मार्गों को सक्रिय करती है। फोकल आसंजन काइनेज (FAK) नेट्रिन -1/DCC सिग्नलिंग से जुड़ी प्रमुख टायरोसिनफॉस्फोराइलेशन गतिविधियों में से एक है।

नेट्रिन-1 FAKफॉस्फोराइलेशन और Src परिवार प्रोटीन टायरोसिन किनेसेस (SFKs) फॉस्फोराइलेशन [17] को सक्रिय करता है। FAK और SFK सिग्नलिंग मार्ग दोनों तंत्रिका तंत्र के विकास चरण और चोट की मरम्मत में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं [36,37]। इसके अलावा, नेट्रिन -1 एक्स्ट्रासेल्यूलर सिग्नल-रेगुलेटेड किनेज़ -1/2 (ईआरके1/2) को सक्रिय कर सकता है, जो मिटोजेन-सक्रिय प्रोटीनकिनेज़ (एमएपीके) मार्ग [38-40] की कार्रवाई में मध्यस्थता करता है।

यह जांचने के लिए कि क्या EGF3 डोमेन नेट्रिन -1 को DCC से बाइंडिंग के माध्यम से डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग पथों के सक्रियण के लिए महत्वपूर्ण है, हमने सबसे पहले FAK के टायरोसिन 861 फॉस्फोराइलेशन पर EGF3 डोमेन के प्रभाव की जांच की (चित्र 2A) . हमने पाया कि EGF3 के विलोपन ने सुसंस्कृत कॉर्टिकल न्यूरॉन्स (चित्र 2B, C) में FAK फॉस्फोराइलेशन को रोक दिया, इस प्रकार नेट्रिन -1 सिग्नलिंग मार्ग में EGF3 के लिए एक आवश्यक भूमिका की पुष्टि की गई।

इसके बाद, सुसंस्कृत कॉर्टिकल न्यूरॉन्स को 20 मिनट के लिए जीएसटी-ईजीएफ3फ्यूजन प्रोटीन से उत्तेजित किया गया, और वेस्टर्न ब्लॉटिंग ने आगे पुष्टि की कि जीएसटी-ईजीएफ3 फ्यूजन प्रोटीन के साथ उपचार ने एफएके, ईआरके और एसएफके फॉस्फोराइलेशन (चित्र 2डी-जी) को प्रेरित किया।

ये परिणाम बताते हैं कि नेट्रिन का ईजीएफ3 डोमेन -1 डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग मार्गों को सक्रिय करने के लिए एक शक्तिशाली उत्तेजक के रूप में कार्य करता है।

चित्र 1. नेट्रिन-1 का ईजीएफ3 डोमेन नेट्रिन-1/डीसीसी इंटरेक्शन के लिए महत्वपूर्ण क्षेत्र है। (ए) नेट्रिन के निर्माण के चित्रण। नेट्रिन -1 संरचनाएं नेट्रिन -1 पूर्ण-लंबाई, नेट्रिन -1-(∆407–443) और जीएसटी-ईजीएफ3 हैं। (बी) शुद्ध नेट्रिन-1-(∆407-443)-माइसी/उसकी मात्रा बीएसए मानक वक्र के साथ तुलना के माध्यम से निर्धारित की गई थी। (सी) अकेले जीएसटी-डीसीसी एफएन5 डोमेन फ्यूजन प्रोटीन और जीएसटी द्वारा पुल-डाउन अंश का इम्यूनोब्लॉटिंग। (डी) फ्लैग-डीसीसी की इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां क्रमशः नियंत्रण माध्यम, नेट्रिन -1- myc/his और नेट्रिन -1- (∆407-443) - Myc/his for30 मिनट के साथ ऊष्मायनित 293T कोशिकाओं को व्यक्त करती हैं, और मात्रात्मक विश्लेषण। स्केल बार, 10 µm. (ई) जीएसटी-ईजीएफ3 संलयन प्रोटीन और जीएसटी द्वारा पुल-डाउन अंश का इम्यूनोब्लॉटिंग। (एफ) फ्लैग-डीसीसी की इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां, नियंत्रण माध्यम के साथ ऊष्मायनित 293टी कोशिकाओं को व्यक्त करती हैं और एफआईटीसी ने क्रमशः 30 मिनट के लिए पेप ईजीएफ3 लेबल किया है, और मात्रात्मक विश्लेषण किया है। स्केल बार, 10 µm.

चित्र 2. ईजीएफ3 डोमेन नेट्रिन के डाउनस्ट्रीम पथों को सक्रिय करता है। (ए) प्रायोगिक प्रक्रिया। (बी) कॉर्टिकल न्यूरॉन्स (ई17और डीआईवी3) को नेट्रिन-1, नेट्रिन{6}}(∆407-443) या नियंत्रण माध्यम से 20 मिनट के लिए उत्तेजित किया गया। नेट्रिन गतिविधि की पुष्टि करने के लिए सेल लाइसेट्स को एक एंटी-पी-एफएके एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया। (सी) पश्चिमी धब्बा परिणामों का मात्रात्मक विश्लेषण (बी) में दिखाया गया है। एन=3. (डी) कॉर्टिकल न्यूरॉन्स (डीआईवी3) को 20 मिनट के लिए 1.5 µM जीएसटी (+), 1.5 µM जीएसटी-ईजीएफ3 फ्यूजन प्रोटीन (+), या 1.5 µMनेट्रिन {{26 }} (+) माध्यम से उपचारित किया गया। सेल लाइसेट्स को एंटी-पी-एफएके -861, एंटी-पी-एसएफके -418 और एंटी-पी-ईआरके -202/204 के साथ इनक्यूबेट किया गया था। (ई-जी) पश्चिमी का मात्रात्मक विश्लेषण ब्लॉट परिणाम (डी) में दिखाए गए हैं। एन=3. डेटा को ± SEM के साधन के रूप में प्रस्तुत किया गया है। इस आंकड़े में दिखाए गए सभी सांख्यिकीय विश्लेषणों के लिए वन-वे एनोवा का उपयोग किया गया था (* पी < 0.05, ** पी < 0.01; एनएस, महत्वपूर्ण नहीं)। डेटा विश्लेषण का विवरण पूरक तालिका S1 में देखा गया है।

2.3पेप्टाइड ई1 और ई2 नेट्रिन के डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग पाथवे को सक्रिय करने के लिए डीसीसी के साथ इंटरैक्ट करते हैं।

जैसा कि पहले बताया गया है, नेट्रिन के ईजीएफ3 डोमेन से प्राप्त एक छोटा पेप्टाइड -1 (अमीनो एसिड 423-433) ने ईआरके फॉस्फोराइलेशन [27] को प्रेरित किया। हमने पेप्टाइड्स ई1 (अवशेष 407-422) और ई2 (अवशेष 423-433) को संश्लेषित किया जो नेट्रिन के ईजीएफ3 डोमेन से प्राप्त हुए थे (चित्र 3ए)।

हमने पाया कि पेप्टाइड ई1 के ऊष्मायन ने खुराक पर निर्भर तरीके से कल्चर कोशिकाओं में फॉस्फोराइलेटेड एफएके और एसएफके (चित्रा 3बी, डी, ई) के स्तर को बढ़ा दिया, लेकिन फॉस्फोराइलेटेड ईआरके (चित्रा 3बी, एफ) के स्तर में कोई बदलाव नहीं किया।

पेप्टाइडई1 के विपरीत, पेप्टाइड ई2 ने न केवल एफएके (चित्रा 3सी, जी) के टायरोसिन फॉस्फोराइलेशन और एसएफके (चित्रा 3सी, एच) के टायरोसिन फॉस्फोराइलेशन को प्रेरित किया, बल्कि सुसंस्कृत कॉर्टिकल न्यूरॉन्स में ईआरके (चित्रा 3सी, आई) के टायरोसिन फॉस्फोराइलेशन को भी प्रेरित किया।

नियंत्रण पेप्टाइड (पेप Ctrl) का FAK, SFK और ERK (चित्रा S1) के टायरोसिन फॉस्फोराइलेशन पर कोई पता लगाने योग्य प्रभाव नहीं था। इसके अलावा, हमने देखा कि पेप्टाइड E1 द्वारा प्रेरित FAK सिग्नलिंग मार्ग के घटकों का फॉस्फोराइलेशन समय-निर्भर था (चित्रा) एस2). इन परिणामों से संकेत मिलता है कि E1 और E2 नेट्रिन के न्यूनतम कार्यात्मक पेप्टाइड्स हैं।

चित्र 3. ईजीएफ3 डोमेन के न्यूनतम अनुक्रम नेट्रिन के डाउनस्ट्रीम पथों को सक्रिय करते हैं। (ए) पेप्टाइड्स के चित्रण। (बी) कॉर्टिकल न्यूरॉन्स (डीआईवी3) को पेप्टाइड ई1 की क्रमिक सांद्रता से उत्तेजित किया गया था। सेल लाइसेट्स को एंटी-पी-एफएके -861, एंटी-पी-एसएफके -418 और एंटी-पी-ईआरके -202/204 के साथ इनक्यूबेट किया गया। (सी) संवर्धित कॉर्टिकल न्यूरॉन्स का इलाज पेप्टाइड ई2 की क्रमिक सांद्रता के साथ किया गया।

FAK, SFK और ERK के फॉस्फोराइलेशन को मापने के लिए लाइसेट्स को एकत्र किया गया और संकेतित एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया। (डी-एफ) न्यूरॉन्स में पेप्टाइड ई1 द्वारा प्रेरित एफएके, एसएफके और ईआरके फॉस्फोराइलेशन की सीमा का परिमाणीकरण (बी) में दिखाया गया है। एन=3. (जी-आई) पेप्टाइड ई2 द्वारा प्रेरित एफएके, एसएफके और ईआरके फॉस्फोराइलेशन की सीमा का परिमाणीकरण (सी) में दिखाया गया है। एन=3. (जे) डीसीसी वाइल्ड-टाइप और होमोज़ीगोट म्यूटेंटेम्ब्रियोस से प्राप्त कॉर्टिकल न्यूरॉन्स को नेट्रिन -1 या नेट्रिन -1- व्युत्पन्न पेप्टाइड्स से उत्तेजित किया गया था और लाइज़ किया गया था।

परिणामी लाइसेट्स को इम्युनोब्लॉटिंग के अधीन किया गया। (के) डीसीसी उत्परिवर्ती न्यूरॉन्स में एफएके पीवाई और डीसीसी स्तरों की मात्रा (जे) में दिखाई गई है। एन=3. डेटा को ± SEM के साधन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। इस आंकड़े में दिखाए गए सभी सांख्यिकीय विश्लेषणों के लिए एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग किया गया था (* पी <0.05;एनएस, महत्वपूर्ण नहीं)। डेटा विश्लेषण का विवरण पूरक तालिका S1 में देखा गया है।

यह निर्धारित करने के लिए कि क्या FAK सिग्नलिंग मार्ग का सक्रियण DCC-निर्भर है, हमने DCC+/+ और DCC-/- न्यूरॉन्स में इन पेप्टाइड्स द्वारा प्रेरित FAK के टायरोसिन फॉस्फोराइलेशन की सीमा को मापा। हमने पाया कि पेप्टाइड्स E1 और E2 दोनों DCC-/- न्यूरॉन्स में FAK के फॉस्फोराइलेशन को प्रेरित करने में विफल रहे (चित्र 3J, K)।

हमने यह भी पाया कि संश्लेषित एन-टर्मली फ्लैग-टैग किए गए पेप्टाइड्स ई1 और ई2 (फ्लैग-ई1 और फ्लैग-ई2) सीधे डीसीसीएफएन5 डोमेन (चित्रा एस3) से जुड़ते हैं।

2.4. पेप्टाइड E1 इन विट्रो में हेमिन-प्रेरित कोशिका मृत्यु से न्यूरॉन्स की रक्षा करता है

पेप्टाइड ई1 की न्यूरोनल चोट से सुरक्षा प्रदर्शित करने के लिए, हमने इंट्रासेरेब्रलहेमोरेज [41,42] के बाद माध्यमिक मस्तिष्क की चोट की नकल करने के लिए एहेमिन प्रेरक विषाक्तता प्रतिक्रिया को नियोजित किया।

संवर्धित जीएनआरएच-व्यक्त करने वाली न्यूरोनल कोशिकाएं (एनएलटी) [43-45] को विभिन्न सांद्रता और अवधि में हेमिन के साथ ऊष्मायन किया गया था। औसत दर्जे की घातक खुराक (60 µM) पर हेमिन के साथ एनएलटी कोशिकाओं के ऊष्मायन के परिणामस्वरूप कोशिका जीवित रहने की दर में समय-निर्भर कमी आई, जिससे पता चलता है कि हेमिन को न्यूरॉन्स द्वारा लिया गया था और चयापचय किया गया था (चित्रा एस4)।

यह जांचने के लिए कि क्या नेट्रिन -1 और डीसीसी की अभिव्यक्ति हेमिन-प्रेरित न्यूरोनल कोशिका मृत्यु पर प्रतिक्रिया करती है, सुसंस्कृत एनएलटी कोशिकाओं को अलग-अलग अवधि के लिए हेमिन के साथ ऊष्मायन किया गया था। पश्चिमी धब्बा परिणामों से पता चला कि हेमिन ऊष्मायन के बाद 6 घंटे में नेट्रिन और डीसीसी की अभिव्यक्ति का स्तर काफी बढ़ गया और फिर धीरे-धीरे कम हो गया (चित्र 4ए, बी)।

यह जांचने के लिए कि क्या पेप्टाइड्स E1 और E2 हेमिन-प्रेरित न्यूरोनल मृत्यु को कम करने में सक्षम थे, हमने नेट्रिन -1, PepCtrl, पेप्टाइड E1 और पेप्टाइड E2 के साथ एक CCK -8 परख की।

हमने पाया कि इन पेप्टाइड्स का सेल व्यवहार्यता पर कोई पता लगाने योग्य प्रभाव नहीं था (चित्र 4C और चित्र S5)। पेप Ctrl और पेप्टाइडE2 के साथ ऊष्मायन की तुलना में, पेप्टाइड E1 और नेट्रिन -1 ने हेमिन से प्रेरित न्यूरोनल मृत्यु में सुधार किया (चित्रा 4D)। हमने जीवित और मृत कोशिकाओं को अलग करने के लिए कैल्सिन-एएम और पीआई के साथ भी दाग ​​दिया।

परिणामों से पता चला कि नेट्रिन -1 और पेप्टाइड E1 दोनों ही इन विट्रो में हेमिन-प्रेरित मृत्यु से रक्षा करते हैं (चित्र 4E-G)। इसके अलावा, 1.5 µM पेप्टाइड E1 ने प्राथमिक सुसंस्कृत न्यूरॉन्स में हेमिन-प्रेरित मृत्यु को कम किया (चित्र 4H, I)। कुल मिलाकर, इन परिणामों से पता चला कि पेप्टाइड ई1 न्यूरॉन्स को हेमिन-प्रेरित कोशिका मृत्यु से बचाता है।

2.5. नेट्रिन-1-व्युत्पन्न पेप्टाइड E1 ICH के बाद कार्यात्मक पुनर्प्राप्ति को बढ़ावा देता है

यह जांचने के लिए कि क्या नेट्रिन से प्राप्त पेप्टाइड ई1 हेमरेज स्ट्रोक के बाद कार्यात्मक रिकवरी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, हमने स्ट्रिएटम में स्याही के साथ मिश्रित कोलेजनेज़ को इंजेक्ट करके चूहों में एक प्रयोगात्मक आईसीएच मॉडल स्थापित किया (चित्र एस6ए)।

तीन दिनों के बाद, इंजेक्शन की स्थिति और स्याही के साथ कोलेजनसेवॉल्यूम को ट्रैक करने के लिए मस्तिष्क के टुकड़े की छवियां दिखाई गईं (चित्रा एस 6 बी, सी)। स्ट्राइटल हेमरेज वाले चूहों ने मस्तिष्क की चोट के कारण इप्सिलेटरल साइड में कमजोरी प्रदर्शित की (चित्र S7A-C)।

आईसीएच के बाद स्ट्रिएटम में हेमेटोमा सेलाइन के इंजेक्शन की तुलना में दिखाई दे रहा था (चित्र S7D)। दूसरे दिन नियंत्रण चूहों की तुलना में आईसीएच चूहों में पेरिहेमेटोमल कॉर्टेक्स में नेट्रिन {1}} और डीसीसी के सापेक्ष प्रोटीन स्तर में वृद्धि हुई थी और नेट्रिन -1 तीसरे दिन अभी भी काफी अधिक था, जो दर्शाता है कि नेट्रिन -1 मस्तिष्क की चोट की रिकवरी के लिए महत्वपूर्ण है (चित्र S7E, F)।

इसके बाद, FITC-लेबल TAT-पेप्टाइड E1 (FITC-Pep TE1), जिसमें पेप्टाइड E1 के एन-टर्मिनस का TAT अनुक्रम जोड़ा गया, को ICH चूहों में इंजेक्ट किया गया और FITC-Pep TE1 को रक्त-मस्तिष्क बाधा को पार करते हुए दिखाया गया ( चित्र S8).

आईसीएच और नियंत्रण चूहों को प्रतिदिन पेप्टाइड (12 मिलीग्राम/किग्रा) या समान मात्रा में खारा (चित्र 5ए) इंजेक्ट किया गया। हमने पाया कि पेप्टाइड टीई1 के प्रशासन ने जीवित रहने की दर में सुधार किया और आईसीएच के बाद शरीर के वजन में दोषों से बचा लिया (चित्र 5बी, सी)।

हमने यह भी पाया कि प्रत्येक समूह में स्याही के समान अनुपात के साथ ट्रेस किया गया कोलेजनसेवॉल्यूम समान था, जिससे पुष्टि होती है कि कोलेजनेज के इस मानकICH मॉडल के परिणामस्वरूप पुनरुत्पादित इंट्रास्ट्रिएटल हेमटॉमस (चित्र 5D) हुआ। पेप्टाइड TE1 ने टेप रिमूवल टेस्ट में ICH चूहों के व्यवहार स्कोर में सुधार किया (चित्र 5E) ) और सिलेंडर परीक्षण (चित्र 5एफ)।

जैसा कि अपेक्षित था, पेप्टाइड TE1 ने ICH के बाद रोधगलन की मात्रा कम कर दी (चित्र 5G, H)। कुल मिलाकर, इन परिणामों से पता चलता है कि पेप्टाइड ई1 हेमेटोमा की मात्रा को कम करने और आईसीएच के माउस मॉडल में कार्यात्मक पुनर्प्राप्ति में सुधार करने में सक्षम था।

चित्र 4. पेप्टाइड ई1 इन विट्रो में हेमिन-प्रेरित कोशिका मृत्यु में सुधार करता है। (ए) हेमिन के संपर्क में आने वाली संवर्धित एनएलटी कोशिकाओं में नेट्रिन -1 और डीसीसी का पश्चिमी धब्बा (6 {{26 }} µM)। (बी) पश्चिमी ब्लॉटरपरिणामों का मात्रात्मक विश्लेषण (ए) में दिखाया गया है। एन=3. (सी) सीसीके -8 परीक्षणों से पता चला कि श्रृंखला पेप्टाइड्स ने सेलविबिलिटी को नहीं बदला। एन=4. (डी) 1.5 µM पेप ई1 ने एनएलटी सेल व्यवहार्यता को संरक्षित किया जब हेमिन (6 {{28 }} µM) के संपर्क में आने के बाद इसे अच्छी तरह से जोड़ा गया। एन=4. (ई) हेमिन के संपर्क में आने वाली एनएलटी कोशिकाओं की जीवित (हरा)/मृत (लाल) परख (6{{30%) µM,6 घंटे)। स्केल बार, 50 µm. (एफ, जी) (ई) में जीवित/मृत परख का मात्रात्मक विश्लेषण। एन=9. (एच) सीसीके-8परखों से पता चला कि पेप ई1 प्राथमिक संस्कृति न्यूरॉन्स में हेमिन-प्रेरित कोशिका मृत्यु को कम कर सकता है। n=8.(I) प्राथमिक संस्कृति न्यूरॉन्स की जीवित/मृत परख इमेजिंग (50 µM, 6 घंटे)। स्केल बार, 50 µm. डेटा को साधन ± SEM के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। इस आंकड़े में दिखाए गए सभी सांख्यिकीय विश्लेषणों के लिए एक-तरफ़ा एनोवा या दो-तरफ़ा एनोवा का उपयोग किया गया था (* पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001; एनएस, महत्वपूर्ण नहीं)। डेटाविश्लेषण का विवरण पूरक तालिका S1 में देखा गया है।

चित्र 5. नेट्रिन-1-व्युत्पन्न पेप्टाइड E1 ICH के बाद पुनर्प्राप्ति प्रक्रिया को बढ़ावा देता है। (ए) चूहों के आईसीएच मॉडलिंग में पेप्टाइड टीई1 के इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन के प्रयोगात्मक प्रतिमान की योजनाबद्ध। (बी) प्रत्येक समूह के आईसीएच के बाद जीवित रहने का अनुपात दर्ज किया गया था, और कपलान-मेयर विधि को नियोजित किया गया था। एन=10. (सी) आईसीएच के 5 दिन बाद शरीर का वजन बदल जाता है। n=6.(डी) स्याही के समान अनुपात के साथ कोलाज/सेलाइन मिश्रण (कुल {{9%).6 μL) C57 चूहों के स्ट्रिएटम में इंजेक्ट किया गया, स्याही क्षेत्र दिखाने वाली प्रतिनिधि छवियां / के साथ इलाज किए गए चूहों में समान थीं आईसीएच के बाद पेप्टाइड टीई के बिना 1 5 दिन। (ई, एफ) पेप्टाइड टीई1 (12 मिलीग्राम/किग्रा) का आईपी इंजेक्शन, लेकिन टीएटी (12 मिलीग्राम/किग्रा) नियंत्रण नहीं, टेप हटाने के कार्य (ई) या कोने के कार्य (एफ) द्वारा निगरानी के अनुसार व्यवहार में सुधार।

खारा,एन=10 व्यक्तिगत जानवर; आईसीएच, एन=6 व्यक्तिगत जानवर; आईसीएच + टीएटी, एन=6 व्यक्तिगत जानवर; आईसीएच + टीई1, एन=8 व्यक्तिगत जानवर। (जी) आईसीएच के बाद पेप्टाइड टीई के साथ/बिना इलाज किए गए चूहों में प्रतिनिधि हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन-सना हुआ अनुभाग। स्केल बार, 1 मिमी. (एच) मस्तिष्क वर्गों में रक्तस्राव की मात्रा की मात्रा (जी) में दिखाई गई है।

खारा, एन {{0}} वैयक्तिक जानवर; आईसीएच, एन=6 व्यक्तिगत जानवर; आईसीएच + टीएटी, एन=6 व्यक्तिगत जानवर; आईसीएच + टीई1, एन=8 व्यक्तिगत जानवर। डेटा को साधन ± SEM के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। इस चित्र में दिखाए गए सभी सांख्यिकीय विश्लेषणों के लिए एक-तरफ़ा एनोवा या दो-तरफ़ा एनोवा का उपयोग किया गया था (* p < {{11 }}.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001; ns, महत्वपूर्ण नहीं है)। डेटा विश्लेषण का विवरण पूरक तालिका S1 में देखा गया है।

2.6. नेट्रिन -1-व्युत्पन्न पेप्टाइड ई1 आईसीएच के बाद न्यूरोनल एपोप्टोसिस को कम करता है

ICH की कार्यात्मक पुनर्प्राप्ति की प्रक्रिया में पेप्टाइड E1 के अंतर्निहित तंत्र का पता लगाना। हमने फ्लोरो-जेड सी (एफजेसी) स्टेनिंग द्वारा पेरीहेमेटोमल क्षेत्र में न्यूरोनल अध: पतन का पता लगाया।

हमने पाया कि पेप्टाइड टीई1 के प्रशासन ने पेरीहेमेटोमा क्षेत्रों में एफजेसी-पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या को काफी कम कर दिया है, यह दर्शाता है कि पेप टीई1 ने आईसीएच के बाद न्यूरोनल अध: पतन को रोक दिया है (चित्र 6ए, बी)। हमने TUNEL स्टेनिंग का प्रदर्शन किया और पाया कि पेप्टाइड TE1 ने TUNEL-पॉजिटिव न्यूरॉन्स की संख्या में काफी कमी कर दी है (चित्र 6C, D)।

पेप्टाइड TE1 उपचार के बाद TUNEL-पॉजिटिव एस्ट्रोसाइट्स की संख्या में पता लगाने योग्य परिवर्तन नहीं था (चित्र 6E, F)। इसके अलावा, रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) की पारगम्यता को इंगित करने के लिए एट्रेसर के रूप में एफआईटीसी-लेबल 4 केडीए डेक्सट्रान का उपयोग करके, हमने पाया कि पेप्टाइड टीई1 ने बीबीबी पारगम्यता (चित्रा एस9ए, बी) की वसूली को प्रभावित नहीं किया है।

सीरम कच्ची प्रतिदीप्ति इकाइयों (आरएफयू) का स्तर समान था, जो विश्लेषण किए गए सभी जानवरों में इंजेक्शन ट्रेसर की उपस्थिति की पुष्टि करता है (चित्रा एस9सी)। हमने माइक्रोवेसल्स को लेबल करने के लिए फ़्लोरेसिन-लेबल वाले लेक्टिन का भी उपयोग किया लेकिन TE1 उपचार (चित्र S9D, E) के बाद कोई सुधार देखने में विफल रहे। सबसे ऊपर, इन निष्कर्षों से पता चलता है कि पेप्टाइड E1 न्यूरोनल एपोप्टोसिस को रोककर ICH के बाद न्यूरोनल रिकवरी को बढ़ावा देता है।

चित्र 6. नेट्रिन -1- व्युत्पन्न पेप्टाइड E1 न्यूरोनल मृत्यु और अध:पतन से रक्षा कर सकता है, लेकिन ICH के बाद एस्ट्रोसाइट्स से नहीं। स्केल बार, क्रमशः 50 µm, और 10 µm. (बी) पेरीहेमेटोमल क्षेत्र में फ्लोरो-जेड सी पॉजिटिव कोशिकाओं की मात्रा (एन=4)। (सी) ट्यूनेलस्टेनिंग आईसीएच की शुरुआत के 5 दिन बाद माध्यमिक मस्तिष्क चोट (एसबीआई) पर टीई1 का प्रभाव दिखा रहा है। सेलाइन, आईसीएच, आईसीएच + टीएटी, और आईसीएच + टीई1 समूहों से प्रतिनिधि छवियां।

सेलाइन समूह को छोड़कर प्रत्येक समूह को आईसीएच के अधीन किया गया था। स्केल बार, क्रमशः 50 µm, और 10 µm. (डी) ट्यूनल-पॉजिटिव न्यूरॉन्स के प्रतिशत के लिए मात्रात्मक विश्लेषण (सी) में दिखाए गए हैं। एन=4. (ई)आईसीएच के 5 दिन बाद जीएफएपी के साथ ट्यूनेल का कोलोकलाइजेशन। सेलाइन, आईसीएच, आईसीएच + टीएटी, और आईसीएच + टीई1समूहों से प्रतिनिधि छवियां। स्केल बार, क्रमशः 50 µm, और 10 µm. (एफ) ट्यूनल-पॉजिटिव एस्ट्रोसाइट्स के प्रतिशत के लिए मात्रात्मक विश्लेषण (ई) में दिखाए गए हैं। एन=4. डेटा को साधन ± SEM के रूप में प्रस्तुत किया जाता है।

इस आंकड़े में दिखाए गए सभी सांख्यिकीय विश्लेषणों के लिए एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग किया गया था (* पी < 0। 05, ** पी < 0। 01, *** पी <0.001, **** पी <0.0001; महत्वपूर्ण नहीं)। डेटा विश्लेषण का विवरण पूरक तालिका S1 में देखा गया है।

3. चर्चा

हमारे अध्ययन ने नेट्रिन के एक कोर पेप्टाइड अनुक्रम की पहचान की है जो आईसीएच के बाद कार्यात्मक पुनर्प्राप्ति के लिए महत्वपूर्ण है। डीसीसी के साथ बातचीत करके, यह नेट्रिन -1- व्युत्पन्न पेप्टाइड आईसीएच के बाद द्वितीयक क्षति के कारण न्यूरोनल मृत्यु से बचाता है और इस प्रकार आईसीएच के लिए एक आशाजनक उपचार है।

उच्च आणविक भार प्रोटीन, नेट्रिन -1 के चिकित्सीय अनुप्रयोग के लिए नेट्रिन -1 के न्यूनतम कार्यात्मक अनुक्रम की पहचान की आवश्यकता होती है जो डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग को बढ़ावा देता है। हमारे अध्ययन में, पेप्टाइड्स ई1 (अवशेष 407-422) और ई2 (अवशेष 423-433), जो क्रमशः नेट्रिन के ईजीएफ3 डोमेन से प्राप्त हुए थे। हमने पाया कि पेप्टाइड ई1 (अवशेष 407-422) आईसीएच के बाद न्यूरोनल मृत्यु से बचाता है।

हमने पाया कि एनएलटी कोशिकाओं में हेमिन उपचार के बाद नेट्रिन -1 और डीसीसी अभिव्यक्ति का स्तर बढ़ गया था। आईसीएच के बाद हीमोग्लोबिन से हेमिन निकलता है और ग्लिया और न्यूरोनल कोशिकाओं दोनों को द्वितीयक क्षति पहुंचाता है [46-48]।

इसके अतिरिक्त, हमने प्रयोगात्मक आईसीएच के बाद नेट्रिन -1 और डीसीसी के प्रोटीन स्तर में भी वृद्धि देखी। इसके अतिरिक्त, हमने प्रयोगात्मक आईसीएच के बाद नेट्रिन -1 और डीसीसी के प्रोटीन स्तर में भी वृद्धि देखी।

ये परिणाम पिछले परिणामों के अनुरूप हैं जो दिखाते हैं कि आईसीएच [49] के बाद नेट्रिन -1 रिकवरी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

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