Tu9 भेदभाव और टी-सेल संचालित एल पैथोलॉजी में BATF3 के लिए एक भूमिका MuCOsal (भाग 1)

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टी हेल्पर 9 (टी, 9) कोशिकाएं सूजन और एलर्जी रोगों के विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं। TH9 ट्रांसक्रिप्शनल नेटवर्क साइटोकिन्स और एंटीजन प्रस्तुति से संकेतों को परिवर्तित करता है लेकिन अपूर्ण रूप से समझा जाता है। यहाँ, हमने TL1A की पहचान की, जो कि TNF सुपरफैमिली का एक सदस्य है, जो माउस और मानव TH9 भेदभाव के एक मजबूत संकेतक के रूप में है।यंत्रवत्, TL1A ने प्रतिलेखन कारकों BATF और BATF3 की अभिव्यक्ति को प्रेरित किया और //9 प्रमोटर के लिए उनके बंधन को सुगम बनाया, जिससे I -9, BATF- और BATF 3- की कमियों ने IL{{6} का स्राव बढ़ाया। } Tμ9 और Ty9-TL1A- ध्रुवीकरण स्थितियों के तहत स्राव। विवो में, एक टी-सेल ट्रांसफर मॉडल का उपयोग करते हुए, हमने दिखाया कि टीएल1ए ने आईएल -9-आश्रित, टी, 9 सेल-प्रेरित आंतों और फेफड़ों की सूजन को बढ़ावा दिया। आईएल -9 एंटीबॉडी को निष्क्रिय करने से टीएल1ए-चालित म्यूकोसल सूजन में कमी आई। बैटफ3-7T_9-TL1A कोशिकाओं ने सूजन को कम करने के लिए प्रेरित किया औरसाइटोकिन अभिव्यक्तिWT कोशिकाओं की तुलना में विवो में। हमारे परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि TL1A T _9 सेल भेदभाव और कार्य को बढ़ावा देता है और T-सेल-संचालित म्यूकोसल सूजन में BATF3 के लिए एक भूमिका को परिभाषित करता है।

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परिचय

टी हेल्पर (टी-) कोशिकाओं के विशिष्ट उपसमुच्चय ऊतक होमियोस्टेसिस को बनाए रखने और म्यूकोसल सतहों पर सूजन संबंधी बीमारियों के विकास के दौरान एक अभिन्न भूमिका निभाते हैं। TH9 कोशिकाओं को हाल ही में एक स्वतंत्र टी सेल उपसमुच्चय के रूप में पहचाना गया है जो मुख्य रूप से IL-9 का उत्पादन करता है, लेकिन साथ ही IL-10 और IL-21.12 Tμ9 कोशिकाओं को एलर्जी फेफड़े सहित कई बीमारियों में फंसाया गया है। सूजन, प्रयोगात्मक ऑटोइम्यूनइंसेफैलोमाईलिटिस(EAE), कोलाइटिस, 3- हाल ही में, TH9 कोशिकाओं में परजीवी कृमि संक्रमण और कैंसर हुआ है। सूजन आंत्र रोगों (आईबीडी) में भूमिका निभाने के लिए सूचित किया गया है। -9अल्सरेटिव कोलाइटिस (यूसी) के रोगियों में म्यूकोसल आईएल -9 प्लस टी कोशिकाओं और आईएल -9 रिसेप्टर (आईएल) की संख्या बढ़ गई है। -9R) आंतों के उपकला पर अपग्रेड होता है। आईएल-9 की कमी तीव्र और पुरानी के विकास को दबा देती हैऑक्साजोलोन-प्रेरित बृहदांत्रशोथ, एक मॉडल जो UC की नकल करता है। क्रोहन रोग (सीडी) के रोगियों में, उच्च-8-10 सीरम आईएल-9 स्तर गंभीर बीमारी से संबंधित होते हैं।

Fig.1 TL1A murine और मानव TH9 कोशिकाओं के भेदभाव को बढ़ाता है। Naive murine CD4 plus T कोशिकाओं को Ty 0- या T 9- के तहत 3 दिनों के लिए TL1A के साथ या बिना ध्रुवीकरण की स्थिति में विभेदित किया गया था, और ]L -9, IL {{9} का ELJSA विश्लेषण किया गया था। }, और आईएल-13 स्राव। b Naive मानव CD4 T कोशिकाओं (CD4'CD45RACD45ROCD25) को स्वस्थ दाताओं के PBMCs से अलग किया गया और 3 दिनों के लिए TL1A के साथ या उसके बिना TH 9- ध्रुवीकरण स्थितियों के तहत विभेदित किया गया। 48 और 72 घंटे में मानव आईएल -9 स्राव का एलिसा विश्लेषण। TH9 और TH 9- TL1A- उपचारित कोशिकाओं के लिए संस्कृति सतह पर तैरनेवाला में IL -9 सांद्रता दिखाने वाला बॉक्स-व्हिस्कर प्लॉट। बक्से माध्यिका और 25वें और 75वें प्रतिशतक का प्रतिनिधित्व करते हैं, और मूंछें वितरण के न्यूनतम और अधिकतम मूल्यों का प्रतिनिधित्व करती हैं। एन=7-9. डेटा प्रतिनिधित्व का अर्थ है ± चार में से एक स्वतंत्र प्रयोग का एसडी (स्वतंत्र प्रयोग। *p< 0.05,***p=""><0.005 determined="" by="" student's="">

टीजीएफ- 1 और आईएल-4 की उपस्थिति में टीएच9 कोशिकाएं भोले सीडी4 प्लस टी कोशिकाओं से अंतर करती हैं। टी-सेल रिसेप्टर (TCR), TGF- 1, और IL-4 रिसेप्टर्स के डाउनस्ट्रीम में कई ट्रांसक्रिप्शन कारक IRF4, STAT6, GATA3, PU.1, NF- सहित TH9 कोशिकाओं के भेदभाव के लिए आवश्यक हैं। kB, और बेसिक ल्यूसीन ज़िपर ट्रांसक्रिप्शन फ़ैक्टर ATF-लाइक (BATF.11-15 हालांकि, ट्रांसक्रिप्शनल प्रोग्राम और इंफ्लेमेटरी ट्रिगर्स जो Tμ9 कोशिकाओं के विभेदन को प्रेरित करते हैं, अभी भी अच्छी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं और lL{{{{{{{{{{{{}}}}}}}}}} 17}} अभिव्यक्ति की पहचान नहीं की गई है।

BATF प्रतिलेखन कारकों के परिवार में शामिल हैंBATF, BATF2, तथाBATF3और एपी-1 ट्रांसक्रिप्शन कारकों के परिवार से संबंधित है जिसमें जून और एफओएस शामिल हैं। BATF परिवार में ट्रांसक्रिप्शन कारक एक डीएनए-बाइंडिंग डोमेन और ल्यूसीन ज़िपर मोटिफ से बने होते हैं, लेकिन एक लेन-देन डोमेन की कमी होती है और शुरू में इन्हें AP-1 गतिविधि के नकारात्मक नियामकों के रूप में वर्णित किया गया था।" हालाँकि, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि BATF परिवार के सदस्य IRF4 और IRF8 सहित IRF प्रतिलेखन कारकों के साथ बातचीत, और AP-1-IRF समग्र तत्व अनुक्रमों को T कोशिकाओं और वृक्ष के समान कोशिकाओं में अपने लक्ष्य जीन को विनियमित करने के लिए बाँधते हैं। BATF को Ty9 कोशिकाओं के विकास के लिए भी आवश्यक दिखाया गया है TH2, TA17, और ट्राई सेल के रूप में। प्रदर्शन किया। इसके अलावा, सीडी 4 प्लस टीयू कोशिकाओं में BATF3 मार्ग को सक्रिय करने वाली बाह्य उत्तेजनाओं को स्पष्ट किया जाना बाकी है।

Fig.2 TL1A T,9 विभेदन के दौरान BATF और BATF3 अभिव्यक्ति को अपग्रेड करता है। RNA अनुक्रमण द्वारा TH9 और TH 9-TL1A कोशिकाओं की ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइलिंग। सबसे बड़े IQR (इंटरक्वेर्टाइल रेंज) के साथ शीर्ष 100 जीनों का उपयोग करके RNA-अनुक्रमण डेटा प्रदर्शित करने वाला हीट मैप। गर्मी के नक्शे के बाईं ओर और ऊपर के डेंड्रोग्राम जीन (पंक्तियों) और नमूनों (कॉलम) के क्लस्टरिंग का प्रतिनिधित्व करते हैं। b Naive CD4 plus T कोशिकाओं को 3 दिनों के लिए अलग-अलग TH उपसमुच्चय और Tregs में विभेदित किया गया। सापेक्ष BATF mRNA अभिव्यक्ति का विश्लेषण पीसीआर द्वारा किया गया था, c Naive CD4 plus T कोशिकाओं को TH 0- या TH 9- के तहत संकेतित समय अवधि के लिए TL1A के साथ या बिना ध्रुवीकरण की स्थिति में विभेदित किया गया था। सापेक्ष BATF mRNA अभिव्यक्ति का पीसीआर विश्लेषण, BATF और IRF4 (शीर्ष) का सह-धुंधला होना। BATFIRF4 कोशिकाओं (नीचे) के प्रतिशत का मात्रात्मक विश्लेषण। BATF और IL के सह-धुंधलापन -9। एफजी

टीएल1ए. f प्रतिनिधि इंट्रासेल्युलर धुंधला हो जाना IL-9 और BATF 48h.g पर आवृत्तिBATFfIL-9 प्लस टी सेलTy9 और T9-TL1A स्थितियों के तहत विभेदित। साधन दिखाए गए हैं। प्रत्येक प्रतीक एक व्यक्तिगत दाता का प्रतिनिधित्व करता है। एन=4. विभिन्न murine Th उपसमुच्चय और Tregs में सापेक्ष Batf3 mRNA अभिव्यक्ति का विश्लेषण qPCR द्वारा किया गया था। संकेतित समय बिंदुओं पर I सापेक्ष Batf3 mRNA अभिव्यक्ति। j BATF3 और IL-9 के प्रतिनिधि सह-धुंधला हो जाना। कश्मीर की आवृत्तिBATF3IL-9 प्लस टी सेलTy9 और TH9-TL1A स्थितियों के तहत विभेदित। साधन दिखाए गए हैं। प्रत्येक प्रतीक एक व्यक्तिगत प्रयोग का प्रतिनिधित्व करता है। एन=3. Im Naive मानव CD4 प्लस T कोशिकाओं को T के तहत विभेदित किया गया था, 9- TL1A के साथ या उसके बिना ध्रुवीकरण की स्थिति। I प्रतिनिधि इंट्रासेल्युलर धुंधला हो जाना आईएल -9 और BATF3 48 घंटे में। एम BATF3L की आवृत्ति -9 प्लस टी कोशिकाओं को TH9 और TH 9- TL1A स्थितियों के तहत विभेदित किया जाता है। साधन दिखाए गए हैं। प्रत्येक प्रतीक एक व्यक्तिगत दाता का प्रतिनिधित्व करता है। एन=4. डेटा प्रतिनिधित्व का मतलब है ± दो (ए) या कम से कम तीन (बीडी यानी के) स्वतंत्र प्रयोगों में से एक स्वतंत्र प्रयोग का एसडी। * एन<0.05. n=""><0.01.***n <="" 0.005="" as="" determined="" by="" student's="">

हमने हाल ही में दिखाया है कि TL1A, एक TNF सुपरफैमिली सदस्य जो IBD सहित प्रतिरक्षा-मध्यस्थता रोगों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, 25 Tu17 कोशिकाओं में IL -9 के स्राव को प्रेरित करता है। "इसके अलावा, हाल ही के एक प्रकाशन ने प्रदर्शित किया कि TL1A, अपने रिसेप्टर DR3 के माध्यम से TA9 भेदभाव को बढ़ावा देता हैआईएल-2-तथास्थिति5-निर्भर लेकिन PU.1- और STAT6-एलर्जी फेफड़ों की सूजन में स्वतंत्र तंत्र।2' हालांकि, TL1A द्वारा प्रेरित ट्रांसक्रिप्शनल प्रोग्राम और आंतों की सूजन और IBD में TL1A- प्रेरित TH9 कोशिकाओं की रोगजनकता बनी हुई है स्पष्ट किया।

यहां, हम प्रदर्शित करते हैं कि TL1A एक उपन्यास सिग्नलिंग मार्ग के माध्यम से मानव और murine TH9 कोशिकाओं के भेदभाव को बढ़ावा देता है। हम BATF3 को Tp9 कोशिकाओं के विभेदन के लिए एक उपन्यास ट्रांसक्रिप्शनल रेगुलेटर के रूप में परिभाषित करते हैं। TL1A क्रोमेटिन रीमॉडेलिंग को lI9 ठिकाने पर ले जाता है और अग्रणी ट्रांसक्रिप्शन कारकों IRF4 और BATF की भर्ती करता है, जो IL -9 ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिवेशन के लिए महत्वपूर्ण घटक हैं, और BATF3 9 प्रमोटरों के भीतर संरक्षित क्षेत्रों में हैं। इसके अलावा, TL1A STAT6-आश्रित तरीके से BATF और BATF3 की अभिव्यक्ति को अपग्रेड करता है। BATF- और Batf3-कमी T-9 और TL1A- प्रेरित TH9(T-9-TL1A ) कोशिकाएं अपने IL-9 उत्पादन में क्षीण होती हैं।वें9-TL1Aविवो में कोशिकाएं अत्यधिक प्रो-इंफ्लेमेटरी होती हैं जब आंतों और फेफड़ों में गंभीर म्यूकोसल सूजन से स्पष्ट रूप से रागी-7-चूहों में स्थानांतरित किया जाता है, जिसे IL-9 एंटीबॉडी को निष्क्रिय करने के साथ उपचार द्वारा क्षीण किया गया था। बैटफ 3-/TH9-TL1A कोशिकाओं को रैग1-7चूहों में अपनाने से WT TH9-TL1A कोशिकाओं की तुलना में म्यूकोसल सूजन और साइटोकाइन उत्पादन में काफी कमी आती है। हमारा डेटा रोगजनक प्रभावकारक टी, 9 कोशिकाओं को विकसित करने में टीएल1ए और बीएटीएफ3 के लिए एक नई भूमिका प्रदर्शित करता है और इस सिग्नलिंग मार्ग को टी _9- में संभावित चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में पहचानता है, जिसमें आईबीडी और एलर्जी फेफड़ों की बीमारी शामिल है।

परिणाम

TL1A इन विट्रो में murine और मानव Tμ9 सेल भेदभाव को बढ़ाता है TH9 भेदभाव पर TL1A के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, हमने TL1A के साथ या उसके बिना TH9 स्थितियों के तहत अनुभवहीन CD4 T कोशिकाओं को उत्तेजित किया। TL1A ने IL-9 स्राव और I/9 mRNA अभिव्यक्ति (चित्र 1a, अनुपूरक चित्र 1a) को काफी बढ़ाया है। अकेले TL1A ने IL-9 स्राव को प्रेरित नहीं किया, यह सुझाव देते हुए कि TL1A IL-9 उत्पादन को बढ़ावा देने के लिए TGF- 1 और IL-4 के साथ सहक्रियात्मक रूप से कार्य करता है। T-9-संबंधित साइटोकिन्स L-10 और IL-13 के स्राव और mRNA अभिव्यक्ति को भी TL1A (Fig.1a, अनुपूरक चित्र 1a, b) द्वारा बढ़ाया गया था। पिछली रिपोर्टों के अनुरूप, इंट्रासेल्युलर आईएल -9 धुंधला के समय-पाठ्यक्रम प्रयोगों ने क्षणिक आईएल -9 अभिव्यक्ति को टी के तहत अधिकतम प्रेरण के साथ -9 दिन 3 पर और बेसलाइन पर वापस गिरावट का खुलासा किया। 5 (सप्लीमेंट्री फिगर 1 बी)। 28,2TL1A ने आईएल -9- के काफी उच्च प्रतिशत को प्रेरित किया, जो कि पहले और मजबूत आईएल -9 इंडक्शन की ओर कैनेटीक्स में बदलाव के साथ प्रयोगों के पूरे समय में कोशिकाओं का उत्पादन करता है। प्रारंभिक समय बिंदु पर TH9 स्थितियों (पूरक चित्रा 1 बी) के तहत प्रेरित अधिकतम आईएल -9 उत्पादन से अधिक हो गया। हमने TL1A (पूरक चित्रा 1b) की उपस्थिति में IL-9 प्लस IL-10 प्लस कोशिकाओं की वृद्धि भी देखी। हमने अन्य टीयू उपसमुच्चय (पूरक चित्रा 1 सी) की ओर कोई बदलाव नहीं देखा। TL1A द्वारा TH9 विभेदन की वृद्धि पूरी तरह से इसके रिसेप्टर DR3 (पूरक चित्रा 1d) पर निर्भर थी। एक साथ लिया गया, ये आंकड़े बताते हैं कि TL1A TA9 भेदभाव और IL -9 उत्पादन में TGF - 1 और IL -4 के साथ तालमेल बिठाता है।

TL1A ने OVA- विशिष्ट OT-ll कोशिकाओं (पूरक चित्रा 1e, f) का उपयोग करके एंटीजन-विशिष्ट सेटिंग में TH9 भेदभाव को भी काफी बढ़ाया। TL1A ने TH9 विभेदन (पूरक चित्रा 1g) के दौरान सेल प्रसार को प्रभावित नहीं किया, जैसा कि मेमोरी सीडी 4 प्लस टी कोशिकाओं के लिए प्रदर्शित किया गया है। "इन आंकड़ों से पता चलता है कि TL1A ने प्रसार को प्रभावित किए बिना TH9 भेदभाव को बढ़ाया। इसके अलावा, हमने कोशिकाओं में IL-9 उत्पादन की जांच की, जिन्हें Ty9 और TH9-TL1A शर्तों के तहत 3 दिनों के लिए विभेदित किया गया था और एंटी-सीडी3/ CD28। हमने देखा कि द्वितीयक उत्तेजना के बाद TH9 कोशिकाओं की तुलना में TH9-TL1A कोशिकाओं में IL-9 उत्पादन में वृद्धि हुई है जिसे TL1A (पूरक चित्रा 1h, i) की उपस्थिति में और बढ़ाया गया था। ये आंकड़े बताते हैं कि TL1A विभेदित TH9 कोशिकाओं से IL-9 उत्पादन भी बढ़ाया। इसके बाद, हमने मानव Tu9 कोशिकाओं के भेदभाव पर TL1A के प्रभाव को निर्धारित किया। Naive CD4 plus T कोशिकाओं को स्वस्थ दाताओं से PBMC से अलग किया गया और उपस्थिति में Tu9 स्थिति के तहत उत्तेजित किया गया। मानव TL1A का माउस TH9 कोशिकाओं से हमारे डेटा के अनुरूप, TL1A के अलावा मानव TH9 सेल संस्कृतियों (छवि 1 बी) से आईएल -9 स्राव में काफी वृद्धि हुई है।

TL1A प्रतिलेखन कारकों BATF और BATF3 की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है TL1A द्वारा प्रेरित सिग्नलिंग मार्ग को स्पष्ट करने के लिए, हमने TH9 और TH 9- TL1A कोशिकाओं में ट्रांसक्रिपटामिक प्रोफ़ाइल का आकलन करने के लिए RNA अनुक्रमण का उपयोग किया। TL1A ने TH9 ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल को पर्याप्त रूप से नहीं बदला, जो दर्शाता है कि TL1A ने विश्व स्तर पर TH9 भेदभाव (डेटा नहीं दिखाया गया) को तिरछा नहीं किया। हालाँकि, 219 जीनों को TH 9- TL1A कोशिकाओं (चित्र 2a, अनुपूरक तालिका 1 और 2) में आंशिक रूप से व्यक्त किया गया था। पाथवे संवर्धन विश्लेषण ने टी में साइटोकाइन-साइटोकाइन रिसेप्टर और JAK-STAT सिग्नलिंग पाथवे में शामिल जीनों में महत्वपूर्ण परिवर्तनों की पहचान की, 9-TL1A स्थितियां (सप्लीमेंट्री टेबल्स 1 और 2, डेटा नहीं दिखाया गया)। BATF3 और कई BATF-विनियमित जीनों को T, 9- TL1A शर्तों (पूरक तालिका 3) के तहत महत्वपूर्ण रूप से अपग्रेड किया गया था, यह सुझाव देते हुए कि प्रतिलेखन कारक BATF3 और BATF TH 9- TL1A कोशिकाओं के भेदभाव में शामिल हो सकते हैं। BATF को आवश्यक बताया गया है Tp17 और TA9 कोशिकाओं के विकास को निर्धारित करने के लिए।15,31-34 -क्या TL1A BATF परिवार के सदस्यों को सक्रिय करता है, हमने पहले विभिन्न Tu सबसेट में BATF के अभिव्यक्ति स्तर का आकलन किया और मजबूत BATF mRNA अभिव्यक्ति का पता लगाया। TH9 और TH2 कोशिकाएँ (चित्र। 2b)। TL1A ने Tu9 स्थितियों के तहत BATF की अभिव्यक्ति को और बढ़ाया, विशेष रूप से पहले दिन जब TH9 स्थितियां अकेले BATF mRNA (Fig.2c) को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त नहीं हैं। अकेले TL1A ने BATF mRNA को Tp9 स्थितियों (छवि 2c) के समान डिग्री के लिए प्रेरित किया। BATF के लिए इंट्रासेल्युलर धुंधलापन ने पुष्टि की कि Ty 9- TL1A उत्तेजना ने BATF प्लस कोशिकाओं (छवि 2d) के प्रतिशत में काफी वृद्धि की है। इसके अलावा, अकेले TL1A ने BATF प्लस कोशिकाओं के प्रतिशत में वृद्धि की और इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि TH9 स्थितियों की तुलना में BATF * IRF4 प्लस कोशिकाओं का प्रतिशत यह सुझाव देता है कि TL1A IRF 4- BATF सहकारी परिसरों (छवि 2d) के गठन को बढ़ा सकता है। TH 9-TL1A उत्तेजना ने BATF प्लस IL-9 प्लस कोशिकाओं (छवि 2e) के प्रतिशत को भी बढ़ाया।

इसके अलावा, मानव TH9 कोशिकाओं में TL1A (छवि 2f, g) से प्रेरित होने पर IL -9- उत्पादन करने वाली कोशिकाओं का प्रतिशत काफी अधिक था। विशेष रूप से, अधिकांश IL-9-उत्पादक कोशिकाएं BATF को सह-व्यक्त करती हैं। BATF और IRF4 के सह-धुंधलापन ने दिखाया कि TL1A के जुड़ने से मानव T -9 (डेटा नहीं दिखाया गया) के विभेदन के दौरान BATF*IRF4 प्लस कोशिकाओं का प्रतिशत बढ़ गया, यह सुझाव देते हुए कि IL-9 उत्पादन में वृद्धि TL1A द्वारा BATF सिग्नलिंग मार्ग के माध्यम से माउस और मानव TH9 कोशिकाओं के बीच संरक्षित है। BATF के विपरीत, TH कोशिकाओं के विभेदन में BATF3 की भूमिका कम परिभाषित है। अपने RNA-seq डेटा की पुष्टि करने के लिए, हमने T-9 कोशिकाओं और अन्य TH उपसमुच्चय में Batf3 के अभिव्यक्ति स्तर को निर्धारित किया और पाया कि T-9, T,1 और TH2 में Batf3 mRNA अभिव्यक्ति उच्चतम थी। कोशिकाएं (चित्र। 2h)। TL1A ने T -9 स्थितियों (Fig.2i) के तहत Batf3 की अभिव्यक्ति को बढ़ाया। BATF3 के लिए इंट्रासेल्युलर धुंधलापन ने पुष्टि की कि T, 9-TL1A उत्तेजना ने BATF3 प्लस IL-9 प्लस कोशिकाओं (Fig.2j, k) के प्रतिशत में काफी वृद्धि की। मानव T9 कोशिकाओं में, TL1A ने BATF3 की अभिव्यक्ति को काफी बढ़ाया। प्लस आईएल -9 प्लस सेल (छवि 2 एल, एम)। BATF के समान, अधिकांश IL-9-कोशिकाओं का निर्माण करने वाले BATF3 को सह-व्यक्त करते हैं।

अंजीर, 3 TL1A, BATE IRF4 के बंधन को बढ़ाता है, और BATF3 को //9 प्रमोटर के लिए Ty9 भेदभाव के दौरान, a, b Naive murine CD4 plus T कोशिकाओं को TH 0- या Tμ 9- के साथ ध्रुवीकरण की स्थिति के तहत विभेदित किया गया था। या बिना TL1A के 2（BATF, IRF4 और AcH3）, या 3（BATF3） दिनों के लिए। ChP assays BATF, IRF4, BATF3, या AcH3 बाइंडिंग के लिए संरक्षित नॉनकोडिंग सीक्वेंस (CNS) 1 (a) और CNS 0 (b) // 9 के लिए किए गए थे। डेटा दो स्वतंत्र प्रयोगों में से एक स्वतंत्र प्रयोग के ± एसडी का मतलब दर्शाता है। * पी<><>< 0.005="" as="" determined="" by="" student's="">

BATF और BATF3 TL1A-प्रेरित T_9 विभेदन में महत्वपूर्ण प्रतिलेखन कारक हैं

BATF और BATF3 की भूमिका को और अधिक परिभाषित करने के लिए, हमने दो Il9 संरक्षित नॉनकोडिंग अनुक्रमों (Il9 CNS1, CNSO) पर बाइंडिंग निर्धारित करने के लिए क्रोमैटिन इम्यूनोप्रूवेरेशन (चिप) assays का प्रदर्शन किया। अकेले TL1A ने TH9 स्थितियों की तुलना में II9 CNS1 के लिए BATF के काफी अधिक बंधन को प्रेरित किया। और TH9-TL1A ने BATF बाइंडिंग को और बढ़ाया (Fig.3a)। अधिक अपस्ट्रीम I/9 CNS0 पर, TL1A ने T,9 शर्तों के तहत BATF बाइंडिंग को भी बढ़ाया, जबकि अकेले TL1A का कोई प्रभाव नहीं पड़ा (Fig.3b)। TL1A ने CNS1 और CNS 0 (Fig.3a, b) पर Ty9 शर्तों के तहत IRF4 बाइंडिंग को बढ़ाया। दिलचस्प बात यह है कि CNS1 और CNSO में एसिटिलेटेड हिस्टोन 3 (AcH3) का बंधन जिसे पहले TH9 भेदभाव के दौरान Il9 ठिकाने पर क्रोमैटिन रीमॉडेलिंग की सुविधा के लिए वर्णित किया गया था, को भी Ty 9- TL1A शर्तों (Fig.3a, b) के तहत बढ़ाया गया था। CNS1 के लिए BATF3 बाइंडिंग को TH9 कोशिकाओं में अपग्रेड किया गया था और बाइंडिंग को TH 9- TL1A शर्तों के तहत बढ़ाया गया था, जबकि BATF3 CNS 0 (Fig.3a, डेटा नहीं दिखाया गया) के लिए बाध्य नहीं था। ये आंकड़े बताते हैं कि TL1A BATF, BATF3 और IFR4 बाइंडिंग को //9 प्रमोटर के लिए TH9 शर्तों के तहत ll9 अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए बढ़ाता है। TL1A-आश्रित और Batf3-7-T कोशिकाओं में BATF और BATF3 की भूमिकाओं की पुष्टि करने के लिए। IL-9, IL- Ty9 विभेदन, हमने Batf7- a 10 का उपयोग किया, और IL-13 का उत्पादन BATF-/- कोशिकाओं में Tμ9 स्थितियों Fig के तहत गंभीर रूप से बिगड़ा हुआ था। 4a-d）. हालाँकि, TL1A उत्तेजना ने Ty9 भेदभाव (Fig.4a, b, d) के दौरान IL -9 और IL -13 उत्पादन के लिए BATF की आवश्यकता को कम से कम आंशिक रूप से पार कर लिया। BATF3 की अनुपस्थिति में, IL-9 का प्रेरण काफी कम हो गया था, विशेष रूप से Tμ9-TL1A शर्तों Fig.4e, f, अनुपूरक चित्र 2a के तहत। BATF के विपरीत, BATF3 की आवश्यकता नहीं थी। -10 या आईएल -13 अभिव्यक्ति (छवि 4 जी, एच, पूरक चित्रा 2 बी, सी) के लिए। सिग्नलिंग मार्ग को परिभाषित करने के लिए जो टीएल 1 ए की उपस्थिति में बीएटीएफ और बीएटीएफ 3 अपग्रेड की ओर जाता है, हमने स्टेट का इस्तेमाल किया { {79}}और p50-/कोशिकाएं। p50-/TH9 कोशिकाओं ने BATF प्लस IRF4t कोशिकाओं के प्रतिशत को कम कर दिया था और TL1A उत्तेजना के तहत BATF प्लस IRF4 प्लस कोशिकाओं के प्रतिशत में वृद्धि को लगभग पूरी तरह से समाप्त कर दिया गया था (पूरक चित्रा 3a, b)। T.9 शर्तों के तहत BATF और Batf3 mRNA का अपग्रेडेशन p50-स्वतंत्र था, जबकि TH9-TL1A शर्तों के तहत BATF और Batf3 अभिव्यक्ति की वृद्धि पूरी तरह से p50-निर्भर थी (पूरक चित्रा 3c , डी)। Stat6-/T9 कोशिकाओं ने BATFIRF4 प्लस कोशिकाओं के प्रतिशत को कम कर दिया था और Tμ9-TL1A उत्तेजना के तहत उनकी वृद्धि को पूरी तरह से समाप्त कर दिया गया था-पूरक चित्रा 4ए, बी)। इसी तरह, BATF और Batf3 mRNA का अपग्रेडेशन पूरी तरह से TH9 और TH 9- TL1A शर्तों (पूरक चित्रा 4c, d) के तहत STAT6 पर निर्भर था। हमने क्रमशः बैटफ 3 और बीएटीएफ की अभिव्यक्ति पर बीएटीएफ या बीएटीएफ 3 की कमी का कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं देखा, यह सुझाव देते हुए कि दो प्रतिलेखन कारकों (पूरक चित्रा 5) के बीच कोई मुआवजा नहीं है। साथ में, ये आंकड़े बताते हैं कि BATF और BATF3 TL1A की उपस्थिति में T _9 भेदभाव के दौरान महत्वपूर्ण और विशिष्ट भूमिका निभाते हैं और TL1A उत्तेजना के तहत BATF और BATF3 अभिव्यक्ति में वृद्धि STAT6 और विहित NF-KB मार्ग पर निर्भर है। इसके बाद, हमने WT और Batf 3-/-Tμ9-TL1A कोशिकाओं पर RNA अनुक्रमण किया। पूरी तरह से, 139 जीनों को WT बनाम बैटफ 3-7 Ty 9- TL1A कोशिकाओं (Fig.4i, अनुपूरक तालिका 4) में आंशिक रूप से व्यक्त किया गया था। जीन ऑन्कोलॉजी पाथवे संवर्धन विश्लेषण ने प्रतिलेखन, सेल प्रसार, और इंट्रासेल्युलर सिग्नल ट्रांसडक्शन (सप्लीमेंट्री टेबल्स 5 और 6) के नियमन में शामिल जीनों में महत्वपूर्ण परिवर्तनों की पहचान की। ये परिणाम Ty 9-TL1A कोशिकाओं के विभेदन में BATF3 की भूमिका को प्रकट करते हैं। टी -9- TL1A कोशिकाएं विवो में अत्यधिक रोगजनक हैं TH 9- TL1A कोशिकाओं की विवो में रोगजनक क्षमता का निर्धारण करने के लिए, हमने पूर्व विवो-विभेदित CD45.1 प्लस Tμ9 या TA 9- TL1A को गोद लिया है। कोशिकाओं को चीर में 1-'-चूहों। Ty9 कोशिकाओं को प्राप्त करने वाले चूहे ने महत्वपूर्ण वजन घटाने (छवि 5 ए) का विकास नहीं किया। हालांकि, जिन चूहों ने TH 9- TL1A कोशिकाओं को प्राप्त किया, उन्होंने अपना वजन कम किया और अधिक गंभीर आंतों की सूजन विकसित की, विशेष रूप से छोटी आंत में (चित्र 5a-c)। हमने टीए 9- TL1A प्राप्तकर्ताओं में भड़काऊ कोशिकाओं के पेरिब्रोनचियल और पेरिवास्कुलर सेलुलर घुसपैठ की विशेषता वाले गंभीर फुफ्फुसीय सूजन को भी देखा। एल्सीन ब्लू पीरियोडिक एसिड-शिफ (एबी-पीएएस) के साथ धुंधला होने से टाय 9- TL1A प्राप्तकर्ताओं (पूरक चित्रा 6a, b) के वायुमार्ग उपकला में श्लेष्म-उत्पादक कोशिकाओं के हाइपरप्रोलिफरेशन को दिखाया गया है। हमने तिल्ली और लैमिना प्रोप्रिया मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (एलपीएमसी) में उच्च सेल्युलैरिटी देखी, और टीएच 9- टीएल 1 ए प्राप्तकर्ताओं (छवि 5 डी, ई) में उच्च प्रतिशत और प्लीहा, एमएलएन और एलपीएमसी सीडी4 प्लस कोशिकाओं की पूर्ण संख्या का सुझाव दिया। 9-TL1A कोशिकाओं में विवो में उच्च प्रसार क्षमता होती है। Ki67 धुंधला ने पुष्टि की कि TH 9- TL1A प्राप्तकर्ताओं से MLN, प्लीहा और LPMC की कोशिकाएं टी-सेल स्थानान्तरण (छवि 5f) के 6 सप्ताह बाद भी अधिक प्रोलिफ़ेरेटिव हैं। एंटी-सीडी3/एंटी-सीडी में आईएल -13 और आईएल -17 का महत्वपूर्ण रूप से उच्च स्राव 28- टीएच से MLN कोशिकाओं को बहाल किया गया 9- TL1A प्राप्तकर्ताओं को देखा गया (चित्र 5g), और एंटी-सीडी3/एंटी-सीडी में आईएल -9 और आईएल -13 का काफी अधिक स्राव 28- एलपीएमसी को Ty 9- TL1A प्राप्तकर्ताओं (छवि 5h) से बहाल कर दिया। हमने स्प्लेनिक और एमएलएन आईएल -9 प्लस, आईएल -13 प्लस, और आईएल -17 प्लस कोशिकाओं और एमएलएन, स्प्लेनिक, और एलपीएमसी सीसीआर6 प्लस की एक उच्च पूर्ण संख्या देखी। TH में CD103 प्लस T कोशिकाएं 9- TL1A प्राप्तकर्ता म्यूकोसल सतहों पर इन कोशिकाओं की भूमिका के अनुरूप हैं (चित्र 5i, j)। टी#9-टीएल1ए कोशिकाओं द्वारा संचालित विवो सूजन के लिए आईएल-9 की आवश्यकता है यह जांचने के लिए कि क्या टीएच द्वारा आईएल-9 उत्पादन में वृद्धि हुई है9-टीएल1ए कोशिकाओं ने आंतों और फेफड़ों की सूजन में योगदान दिया है, हमने टी-सेल ट्रांसफर प्रयोग की अवधि के लिए टीएच 9- टीएल1ए कोशिकाओं को आईएल को बेअसर करने वाले -9 या एंटीबॉडी को नियंत्रित करने वाले चूहों का इलाज किया। हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण ने आइसोटाइप नियंत्रण (छवि 6 ए, बी) की तुलना में एंटी-एल -9- उपचारित चूहों में आंतों की सूजन को काफी कम कर दिया। हमने पेरिब्रोनचियल घुसपैठ में कमी और एंटी-एलएल -9- उपचारित चूहों (पूरक चित्रा 6 सी) में बलगम पैदा करने वाली कोशिकाओं में कमी के साथ फेफड़े की सूजन को भी देखा। एमएलएन में कुल सेल नंबर और कुल सीडी 4 टी सीडी 45.1 प्लस टी कोशिकाओं को आइसोटाइप नियंत्रण (छवि 6 सी) की तुलना में एंटी-आईएल -9- उपचारित चूहों में कम किया गया था। एंटी-आईएल -9 उपचार ने एमएलएन और स्पलीन में आईएल -13 और आईएल -17 के उत्पादन को भी कम कर दिया, जबकि आईएफएन-वाई उत्पादन अपरिवर्तित था (छवि 6 डी, डेटा नहीं दिखाया गया)। साथ में, इन आंकड़ों से पता चलता है कि T -9- TL1A कोशिकाएं शक्तिशाली प्रभावकारी कोशिकाएं थीं और इसके परिणामस्वरूप विवो में आंतों और फेफड़ों में सूजन आ गई और रोगजनक प्रभाव IL -9- पर निर्भर था।

Fig.4 TH9 भेदभाव पर BATF और BATF3 कमियों के प्रभाव। Ad Naive CD4 T कोशिकाओं को Batf7or WT चूहों से TH 0- या TH 9- TL1A के साथ या बिना 3 दिनों के लिए ध्रुवीकरण की स्थिति के तहत विभेदित किया गया था। आईएल -9 और आईएल -10 का इंट्रासेल्युलर धुंधला हो जाना। बी आईएल का एलिसा विश्लेषण -9 उत्पादन। सी आईएल का एलिसा विश्लेषण -10 उत्पादन। आईएल का एलिसा विश्लेषण {{14} } उत्पादन। eh Naive CD4 plus T कोशिकाओं को Batf 3-7- या WT चूहों से T के तहत विभेदित किया गया, 9- 3 दिनों के लिए TL1A के साथ या बिना ध्रुवीकरण की स्थिति। आईएल -9 और आईएल -10 का ई इंट्रासेल्युलर धुंधला हो जाना। आईएल -9 उत्पादन का एलिसा विश्लेषण। जी आईएल -10 उत्पादन का ईएलएसए विश्लेषण। ज आईएल -13 उत्पादन का एलिसा विश्लेषण। I RNA अनुक्रमण द्वारा WT और Batf3-TH9-TL1A कोशिकाओं की ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइलिंग। पी . के साथ व्यक्त किए गए जीन के आरएनए-अनुक्रमण डेटा को प्रदर्शित करने वाला हीट मैप<0.01. the="" dendrograms="" to="" the="" left="" and="" above="" the="" heat="" map="" represent="" the="" clustering="" of="" genes="" (rows)="" and="" samples="" (columns).="" data="" represent="" means±="" sd="" of="" one="" independent="" experiment="" out="" of="" two="" (i)="" or="" three="" (a-h)="" independent=""><0.05,**p <="" 0.01,="" ***p=""><0.005 determined="" by="" student's="">

BATF3 TH 9- TL1A कोशिकाओं द्वारा संचालित विवो सूजन में योगदान देता है यह निर्धारित करने के लिए कि क्या BATF3 विवो में Tu 9- संचालित विकृति में एक भूमिका निभाता है, हमने पूर्व vivo-विभेदित WT या Batf को अपनाया 3- /-TA9-TL1A से रग में1-/-चूहे। चूहे जो बैटफ प्राप्त करते हैं 3-'- टीए 9- टीएल1ए कोशिकाएं काफी कम फुफ्फुसीय (छवि 7 ए, बी, पूरक चित्रा 6e) विकसित करती हैं और आंतों की सूजन को कम करने की प्रवृत्ति (हिस्टोस्कोर: 3.6 बनाम 1.2) ( अंजीर। 7 ए)। हमने WT TH 9- TL1A प्राप्तकर्ताओं (छवि 7c, पूरक चित्रा 6d) की तुलना में फेफड़ों और LPMC में कम सेल्युलरिटी, और Batf37′-TL1A प्राप्तकर्ताओं में MLN और फेफड़े के CD4 प्लस T कोशिकाओं के कम प्रतिशत का अवलोकन किया। गौरतलब है कि बैटफ से आईएल -13 प्लस और आईएल -17 प्लस कोशिकाओं का प्रतिशत, एमएलएन, और फेफड़ों से कम प्रतिशत 3-'-Ty 9- TL1A प्राप्तकर्ताओं को देखा गया था (अंजीर। 7डी)। सामूहिक रूप से, हमारे डेटा से संकेत मिलता है कि BATF3 इन विट्रो में IL -9 उत्पादन और T # 9 विकास और विवो में Tp 9- TL1A- संचालित म्यूकोसल सूजन में भूमिका निभाता है।

Fig.6 IL-9, Ty9-TL1A कोशिकाओं द्वारा संचालित विवो म्यूकोसल सूजन के लिए आवश्यक है। T, 9 या Ty 9- TL1A कोशिकाओं को Rgg 1-7 चूहों में इंजेक्ट किया गया था, और चूहों को प्रति सप्ताह तीन बार एंटी-IL -9 एंटीबॉडी या आइसोटाइप नियंत्रण के साथ इलाज किया गया था, एक प्रतिनिधि एच एंड ई दाग ग्रहणी, स्केल बार; 200 माइक्रोन। b आंत के लिए हिस्टोलॉजी स्कोर। c कुल MLN सेल काउंट्स 'लेफ्ट', CD45.1 प्लस सेल्स 'मिडल' की फ्रीक्वेंसी, और CD45.1 प्लस सेल्स (राइट) की टोटल सेल काउंट्स।d IL का एलिसा एनालिसिस {{15} }, IL-17, और IL-13 का उत्पादन MLN से एंटी-सीडी3 और एंटी-सीडी28 के साथ पूर्व विवो रेस्टिम्यूलेशन के बाद होता है। डेटा प्रतिनिधित्व का अर्थ है ± दो स्वतंत्र प्रयोगों में से एक स्वतंत्र प्रयोग का एसडी। एन=4-5/समूह।*पी<><0.01, as="" determined="" by="" student's="" t-test="" (b)="" or="" mann-whitney="" u="" test="" (c,="">