रीढ़ की हड्डी में चोट के एक माउस मॉडल में पॉली (प्रो -17 एस्ट्राडियोल) के तीव्र खुराक-निर्भर न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव

अमूर्त

17 -एस्ट्राडियोल (ई2) व्यवस्थित रूप से प्रशासित होने पर रीढ़ की हड्डी की चोट के प्रीक्लिनिकल मॉडल में न्यूरोप्रोटेक्शन प्रदान करता है। इस अध्ययन का लक्ष्य पॉली (प्रो-ई2) फिल्म बायोमटेरियल्स का उपयोग करके निरंतर अवधि के लिए घायल रीढ़ की हड्डी पर ई2 को स्थानीय रूप से लागू करना था।

जैसे-जैसे लोग रीढ़ की हड्डी की चोटों के बारे में अधिक जानने लगते हैं, हमें लोगों के शारीरिक और मानसिक स्वास्थ्य पर इसके प्रभाव का एहसास होने लगता है। यद्यपि रीढ़ की हड्डी की चोटें कई प्रतिकूल प्रभाव पैदा कर सकती हैं, सौभाग्य से, स्मृति पर उनके प्रभाव को नियंत्रित किया जा सकता है।

सबसे पहले, हमें यह स्पष्ट करना होगा कि रीढ़ की हड्डी की चोट क्या है। रीढ़ की हड्डी रीढ़ की हड्डी में संरक्षित एक तंत्रिका है जो मस्तिष्क से शरीर के विभिन्न हिस्सों तक निर्देशों को प्रसारित करने के लिए जिम्मेदार है। यदि रीढ़ की हड्डी घायल हो जाती है, तो शरीर के कुछ हिस्से मस्तिष्क के साथ अच्छा संबंध खो देंगे, जिसके परिणामस्वरूप अंगों की गति, संवेदना और स्वायत्त नियंत्रण प्रभावित होगा।

रीढ़ की हड्डी की चोटों का लोगों की याददाश्त पर एक निश्चित प्रभाव पड़ सकता है, खासकर रीढ़ की हड्डी की चोटों वाले रोगियों के पुनर्वास के शुरुआती चरणों में। रीढ़ की हड्डी की चोटों के कारण व्यक्ति का ध्यान, कार्यशील स्मृति और भावनात्मक प्रसंस्करण क्षमता ख़राब हो सकती है, जो व्यक्ति की स्मृति क्षमता को प्रभावित करेगी।

हालाँकि, ये नकारात्मक प्रभाव धीरे-धीरे कम हो जाएंगे क्योंकि मरीज पुनर्वास उपचार से गुजरेंगे। मेमोरी गेम और अन्य संज्ञानात्मक प्रशिक्षण में भाग लेकर मरीज़ अपनी याददाश्त में सुधार कर सकते हैं। साथ ही, शारीरिक पुनर्वास शरीर के मोटर और संवेदी कार्यों को बहाल करने के लिए भी अनुकूल है, जिससे भावनात्मक और संज्ञानात्मक कार्यों में सुधार होता है।

हमें रीढ़ की हड्डी की चोट वाले रोगियों को पुनर्वास उपचार में सक्रिय रूप से भाग लेने और शारीरिक और मानसिक स्वास्थ्य में सुधार के लिए पुनर्वास प्रशिक्षण जारी रखने के लिए प्रोत्साहित करना चाहिए। कृपया विश्वास करें कि सही अनुभूति और पश्चात उपचार की मदद से, मरीज रीढ़ की हड्डी की चोट के स्मृति पर प्रभाव को दूर कर सकते हैं और सक्रिय जीवन जीना जारी रख सकते हैं। यह देखा जा सकता है कि हमें याददाश्त में सुधार करने की आवश्यकता है, और सिस्टैंच मेमोरी में काफी सुधार कर सकता है क्योंकि सिस्टैंच न्यूरोट्रांसमीटर के संतुलन को भी नियंत्रित कर सकता है, जैसे एसिटाइलकोलाइन और विकास कारकों के स्तर को बढ़ाना, जो स्मृति और सीखने के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं। इसके अलावा, सिस्टैंच रक्त प्रवाह में भी सुधार कर सकता है और ऑक्सीजन वितरण को बढ़ावा दे सकता है, जो यह सुनिश्चित कर सकता है कि मस्तिष्क को पर्याप्त पोषण और ऊर्जा प्राप्त हो, जिससे मस्तिष्क की जीवन शक्ति और सहनशक्ति में सुधार हो।

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वयस्क नर चूहों में रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद, पॉली (प्रो-ई2) फिल्मों को सबड्यूरल रूप से प्रत्यारोपित किया गया था, और चोट और आरोपण के 7 दिन बाद इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करके न्यूरोप्रोटेक्शन का मूल्यांकन किया गया था। इन अध्ययनों में, पॉली (प्रो-ई2) फिल्मों ने सूजन प्रतिक्रिया को प्रभावित किए बिना न्यूरोप्रोटेक्शन में मामूली सुधार किया। जब घायल नियंत्रणों से तुलना की गई।

जारी E2 खुराक को बढ़ाने के लिए, पॉली (proE2) फिल्मों में अनबाउंड E2 को शामिल करके बोलस-रिलीज़िंग पॉली (प्रो-ई 2) फिल्में बनाई गईं।

हालाँकि, घायल नियंत्रणों की तुलना में, बोलस-रिलीज़िंग पॉली (प्रो-ई2) फिल्मों ने चोट के बाद 7 या 21 दिनों में न्यूरोप्रोटेक्शन को महत्वपूर्ण रूप से नहीं बढ़ाया या सूजन को सीमित नहीं किया। भविष्य में काम करने में सक्षम पॉली (प्रो-ई2) बायोमटेरियल विकसित करने पर ध्यान केंद्रित किया जाएगा। अधिक सटीक रूप से E2 की चिकित्सीय खुराक जारी करना।

परिचय

दर्दनाक रीढ़ की हड्डी की चोट (एससीआई) एक दुर्बल करने वाली स्थिति है जो संयुक्त राज्य अमेरिका में हर साल 18 से अधिक लोगों को प्रभावित करती है, जबकि एससीआई का वैश्विक प्रसार प्रति मिलियन 236 से 1009 के बीच होने का अनुमान है।2

एससीआई से प्रभावित मरीजों में संवेदना की हानि, बिगड़ा हुआ आंत्र/मूत्राशय कार्य और पक्षाघात सहित गंभीर न्यूरोलॉजिकल घाटे का सामना करना पड़ता है। 3,4 रीढ़ की हड्डी पर प्राथमिक प्रभाव के परिणामस्वरूप चोट स्थल पर न्यूरोनल मृत्यु हो जाती है जो एस्ट्रोसाइट्स और मैक्रोफेज से जुड़े कई माध्यमिक चोट कैस्केड द्वारा और भी बढ़ जाती है। .

समय के साथ, ये एस्ट्रोसाइट्स एक ग्लियाल निशान बनाते हैं जो घाव के किनारे से परे अक्षतंतु के विस्तार को रोकता है। एससीआई के इलाज के लिए आज तक कोई एफडीए-अनुमोदित न्यूरोप्रोटेक्टिव दवाएं नहीं हैं।

कई दशकों से चल रहे अनुसंधान ने द्वितीयक चोट के कारण न्यूरोनल हानि को रोकने और/या एक्सोनल पुनर्जनन को बढ़ावा देने के लिए बायोमोलेक्युलस के प्रणालीगत प्रशासन पर ध्यान केंद्रित किया है, जिससे अंततः खोए हुए कार्य की बहाली हो सकती है। 6 एक बायोमोलेक्यूल जिसने एससीआई के प्रीक्लिनिकल मॉडल में महत्वपूर्ण वादा दिखाया है वह महिला है सेक्स हार्मोन, 17 -एस्ट्राडियोल(ई2)।

E2 प्रशासन सूजन को कम करके, ग्लियाल सेल प्रतिक्रिया को कम करके, ऑक्सीडेटिव तनाव को सीमित करके, 11-14 और ग्लूटामेट-प्रेरित एक्साइटोटॉक्सिक न्यूरोनल मौत को कम करके केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के लिए व्यापक रूप से फायदेमंद है। E2 SCI.10 के विभिन्न कृंतक मॉडल में कार्यात्मक वसूली में सुधार करता है। 16,17 दिलचस्प बात यह है कि ई2 का बहु-खुराक प्रणालीगत प्रशासन केवल एक खुराक प्राप्त करने वाले जानवरों की तुलना में 18,19 में अधिक तेजी से कार्यात्मक सुधार लाता है।17

चूंकि E2 बहु-खुराक आहार के माध्यम से कार्यात्मक पुनर्प्राप्ति को अधिक प्रभावी ढंग से बढ़ावा देता है, हमारा लक्ष्य E2 की एकाधिक खुराक/प्रणालीगत इंजेक्शन से उत्पन्न होने वाली समस्याओं को रोकने के लिए चोट स्थल पर स्थानीय रूप से E2 को स्थिर रूप से जारी करना था (किसी भी ऑफ-टारगेट प्रभाव को रोकने के लिए)।

उस अंत तक, हमने एक पॉली (प्रोड्रग) बायोमटेरियल रणनीति को नियोजित किया जिसमें मूल दवा (ई 2) को पहले प्रतिक्रियाशील एलिल समूहों के साथ क्रियाशील किया गया और फिर एक लचीले ऑलिगो- (एथिलीन ग्लाइकॉल) डाइथियोल के साथ फोटोइनिटिएटेडथिओल-एन रेडिकल जोड़ के माध्यम से पोलीमराइज़ किया गया, जैसा कि पहले बताया गया है। .20 हमने उच्च आणविक भार पॉलिमर श्रृंखलाएं प्राप्त कीं, जिसमें पॉलिमर के भीतर दोहराई जाने वाली इकाई के रूप में एक E2प्रोड्रग शामिल है।

हाइड्रोलाइटिक क्षरण पर, पॉलिमर धीरे-धीरे आसपास के मीडिया में E2 छोड़ता है। रिलीज से केवल अन्य उप-उत्पाद कार्बन डाइऑक्साइड और ऑलिगो (एथिलीन ग्लाइकॉल) (ओईजी) (चित्र 1) हैं। फिल्मों या माइक्रोफाइबर में निर्मित पॉली (प्रो-ई 2) श्रृंखलाएं महीनों से वर्षों के समय पैमाने पर इन विट्रो में नैनोमोलर सांद्रता में ई 2 जारी कर सकती हैं। .20

इन पॉली (प्रो-ई2) मचानों से निकलने वाला ई2 बायोएक्टिव है, और ये मचान हाइड्रोजन पेरोक्साइड-प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव से न्यूरॉन्स की रक्षा करके इन विट्रो में न्यूरोट्रॉफिज्म और न्यूरोप्रोटेक्शन को बढ़ावा देते हैं। यहां, हमने चोट के तुरंत बाद, चोट लगने के तुरंत बाद, चोट लगने वाले एससीआई के एक म्यूरिन मॉडल में पॉली (प्रो-ई 2) फिल्मों को लागू किया, और विवो में उनकी न्यूरोप्रोटेक्टिव क्षमता का आकलन किया।

हमारी प्रारंभिक पॉली (प्रो-ई2) फिल्म डिज़ाइन ने सूजन संबंधी प्रतिक्रिया को प्रभावित किए बिना चोट वाली जगह पर (चोट के 7 दिन बाद) न्यूरोप्रोटेक्शन को तीव्र रूप से बढ़ा दिया। चूंकि पॉली(प्रो-ई2) फिल्में प्रति दिन ई2 के नैनोग्राम रिलीज करती हैं, इसलिए हमने एक और रिलीज रणनीति विकसित की जहां अनबाउंडई2 को पॉली(प्रो-ई2) मैट्रिक्स में शामिल किया गया। हमने अनुमान लगाया कि अनबाउंड E2 का बोलस रिलीज़ अतिरिक्त न्यूरोप्रोटेक्टिव लाभ प्रदान कर सकता है।

पॉली (प्रो-ई2) फिल्मों ने ई2 को विस्फोटित तरीके से जारी किया, जिसके बाद कम सांद्रता में पॉलिमर से ई2 की निरंतर रिहाई हुई। इम्यूनोहिस्टोलॉजिकल स्टेनिंग ने इन बोलस-रिलीजिंग पॉली (प्रो-ई2) फिल्मों की उपस्थिति में एससीआई के बाद चोट स्थल पर मौजूद न्यूरॉन्स, एस्ट्रोसाइट्स और मैक्रोफेज/माइक्रोग्लिया का तीव्रता से (चोट के 7 दिन बाद) और लंबे समय तक (चोट के 21 दिन बाद) मूल्यांकन किया।

परिणाम और चर्चा

पॉली (प्रो-ई2) फिल्में नैनोमोलर सांद्रता पर ई2 जारी करती हैं, पृष्ठीय जड़ नाड़ीग्रन्थि से न्यूरोनल वृद्धि को बढ़ावा देती हैं, और इन विट्रो में हाइड्रोजन पेरोक्साइड-प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव से न्यूरॉन्स की रक्षा करती हैं। 20 यहां प्रस्तुत अध्ययन पॉली (प्रो-ई2) की क्षमता निर्धारित करने का प्रयास करता है। संलयन एससीआई के मुरीन मॉडल का उपयोग करके विवो में न्यूरोप्रोटेक्शन प्रदान करने वाली फिल्में।

वयस्क नर चूहों में मध्यम संलयन एससीआई को प्रेरित किया गया था, और चोट के तुरंत बाद, पॉली (प्रो-ई2) फिल्मों को सीधे चोट के ऊपर रखा गया था (चित्र 2ए)। यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रत्यारोपण के बाद पॉली (प्रो-ई2) फिल्में अपनी जगह पर बनी रहें, रोडामाइन बी से भरी पॉली (प्रो-ई2) फिल्मों को घायल जानवरों की रीढ़ की हड्डी में प्रत्यारोपित किया गया। प्रत्यारोपण के सात दिन बाद, रीढ़ की हड्डी को एकत्र किया गया और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप (चित्रा 2बी) का उपयोग करके उसकी छवि ली गई। सभी जानवरों में, प्रत्यारोपित रोडामाइन बी-लोडेड पॉली (प्रो-ई2) फिल्में इम्प्लांटेशन प्रोटोकॉल को मान्य करने वाली जगह पर बनी रहीं।

न्यूरोप्रोटेक्शन प्रदान करने और सूजन को कम करने के लिए पॉली (प्रो-ई2) फिल्मों की क्षमता का परीक्षण करने के लिए, पॉली (प्रो-ई2) फिल्मों (बिना रोडामाइन बी) को रीढ़ की हड्डी में चोट के बाद प्रत्यारोपित किया गया था, और चोट और प्रत्यारोपण के 7 दिन बाद रीढ़ की हड्डी को एकत्र किया गया था। चोट के केंद्र के आसपास केंद्रित अनुदैर्ध्य खंड (10 माइक्रोन मोटे) काटे गए, और रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स और मैक्रोफेज को देखने के लिए इम्यूनोलैबल्ड किया गया (चित्रा 3)।

न्यूरोनल उपस्थिति का आकलन करने के लिए अनुभागों को न्यूरॉन के लिए लेबल किया गया था, और धुंधलापन के मात्रात्मक विश्लेषण से पता चला कि पॉली (प्रो-ई 2) फिल्मों ने घायल नियंत्रणों की तुलना में चोट के केंद्र के आसपास न्यूरॉन सकारात्मक क्षेत्र में काफी वृद्धि की, जिन्हें फिल्म प्रत्यारोपण नहीं मिला (चित्र 3 ए; पी)=0.0002). एनएफएच (न्यूरोफिलामेंट हैवीचेन) का उपयोग करके एक्सोन के लिए अतिरिक्त धुंधलापन से प्रत्यारोपित पॉली (प्रो-ई2) फिल्मों के तीव्र न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव का भी पता चला (चित्र 3बी; पी=0.0017)।

हमने देखा कि न्यूरोप्रोटेक्शन में यह बदलाव चोट वाली जगह पर एपोप्टोसिस (कैस्पेज़ 3) में बदलाव के कारण नहीं था (चित्रा एस 1 का समर्थन; पी=0 .9966)। सक्रिय मैक्रोफेज (सीडी 68) के लिए धुंधला होने से भी कोई पता नहीं चला पॉली (प्रो-ई2) फिल्म-उपचारित जानवरों और अनुपचारित जानवरों के बीच महत्वपूर्ण अंतर (चित्रा 3सी; पी= 0.7207)।

कुल मिलाकर, पॉली (प्रो-ई2) फिल्में भड़काऊ प्रतिक्रिया में बदलाव किए बिना न्यूरोप्रोटेक्शन को मामूली रूप से बढ़ाती हैं। पॉली (प्रो-ई2) फिल्मों ने न्यूरोनल घनत्व को लगभग 20% तक बढ़ा दिया, लेकिन फिल्मों में कोई स्पष्ट सूजन-रोधी प्रभाव नहीं था (की मात्रा के आधार पर) सक्रिय मैक्रोफेज द्वारा कब्जा किया गया क्षेत्र) (चित्रा 3)।

सूजन में कमी की यह कमी यह संकेत दे सकती है कि E2 की सूजन-रोधी और न्यूरोप्रोटेक्टिव खुराक अलग-अलग हैं और दोनों ही मौजूदा फिल्म फॉर्मूलेशन के साथ हासिल नहीं की जा सकीं।20 हमने अनुमान लगाया कि पॉली (प्रो-ई2) फिल्मों से ई2 रिलीज को तेजी से बढ़ाने से सूजन कम हो सकती है। और अधिक मजबूत न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रतिक्रिया सक्षम करें।

E2 की खुराक को तेजी से बढ़ाने के लिए, पॉली (प्रो-E2) फिल्मों को संशोधित किया गया ताकि बोलस E2 रिलीज इम्प्लांटेशन के तुरंत बाद हो सके। E2 के बोलस रिलीज़ के बाद, पॉलिमर क्षरण के बाद E2 पहले की तरह ही सांद्रता में रिलीज़ होगा। ऊपर वर्णित प्रयोग को इन बोलस-रिलीज़िंग पॉली (प्रो-ई2) फिल्मों का उपयोग करके दोहराया गया था, और चोट के 7 दिनों के बाद (डीपीआई) न्यूरोप्रोटेक्शन और सूजन का आकलन किया गया था।

हालाँकि, अतिरिक्त लाभ के बजाय, बोलुस रिलीज़िंग पॉली (प्रो-ई2) फिल्मों ने घायल, अनुपचारित नियंत्रणों की तुलना में न्यूरॉन सकारात्मक क्षेत्र में उल्लेखनीय वृद्धि नहीं की (चित्र 4ए; पी=0.6770)। बोलस-रिलीज़िंग पॉली(प्रोई2) फिल्मों ने सीडी68 अभिव्यक्ति में वृद्धि की, लेकिन वृद्धि सांख्यिकीय रूप से भिन्न नहीं थी (पी= 0.1780)।

जीएफएपी (एस्ट्रोसाइट्स) और आईबीए 1 (माइक्रोग्लिया) अभिव्यक्ति में वृद्धि के कारण बोलस-रिलीज़िंग पॉली (प्रो-ई 2) फिल्मों की उपस्थिति में ग्लियाल प्रतिक्रियाशीलता और माइक्रोग्लिया सूजन में बढ़ती प्रवृत्तियां भी देखी गईं; हालाँकि, ये वृद्धियाँ घायल, अनुपचारित नियंत्रणों (क्रमशः पी=0.3233 और पी=0.3053) में देखी गई वृद्धि से अधिक नहीं थीं। कुल मिलाकर, बोलस-रिलीज़िंग पॉली (प्रो-ई2) फिल्मों ने न्यूरोप्रोटेक्शन को नहीं बढ़ाया, और एस्ट्रोसाइट प्रतिक्रियाशीलता और मैक्रोफेज/माइक्रोग्लिया उपस्थिति को कम नहीं किया गया जैसा कि शुरू में अनुमान लगाया गया था।

चूंकि घायल, अनुपचारित जानवरों और घायल, बोलस-रिलीज़िंग पॉली (प्रोई 2) फिल्म-उपचारित जानवरों के बीच अंतर तीव्र, 7 डीपीआई समय बिंदु पर नहीं देखा गया था, पॉली (प्रो-ई 2) फिल्मों के बाद से आगे की जांच के लिए एक क्रोनिक समय बिंदु का चयन किया गया था। E2 को लंबे समय तक रिलीज़ कर सकते हैं। 20 ऊपर वर्णित प्रयोग को बोलस-रिलीज़िंग पॉली (प्रो-ई 2) फिल्मों के साथ दोहराया गया था, लेकिन जानवरों का मूल्यांकन 21 डीपीआई (चित्रा 5) पर कालानुक्रमिक रूप से किया गया था।

स्पाइनलकॉर्ड्स को पहले बताए गए समान सेल प्रकारों के लिए लेबल किया गया था। विश्लेषण के बाद, घायल, अनुपचारित जानवरों की तुलना में बोलस-रिलीज़िंग पॉली (प्रो-ई2) फिल्म-प्रत्यारोपित जानवरों में न्यूरॉन के क्षेत्र अंश में वृद्धि की ओर रुझान था (चित्रा 5ए; पी=0.0897) इसके अलावा, ऐसे रुझान देखे गए जहां बोल्ट-रिलीजिंग पॉली (प्रो-ई2) फिल्मों ने अनुपचारित, घायल पशु नियंत्रण (चित्र 5बी, सी; पी=0.0859 और पी) के डेटा की तुलना में सीडी68 और जीएफएपी अभिव्यक्ति के क्षेत्र अंश में कमी की।=0.2780).

हालाँकि, इनमें से कोई भी रुझान सांख्यिकीय रूप से भिन्न नहीं था। दूसरी ओर, बोलस-रिलीजिंग पॉली (प्रो-ई2) उपचारित जानवरों के आईबीए1 लेबल वाले ऊतक वर्गों ने अनुपचारित, घायल नियंत्रण (पी <{4}}.0001) के डेटा की तुलना में बढ़ी हुई अभिव्यक्ति प्रदर्शित की। हमारा पिछला काम दिखाता है कि पॉली (प्रो) -ई2) 15 मिमी × 15 मिमी कवरस्लिप्स पर डाली गई फिल्में प्रति दिन लगभग 266 एनजी ई2 रिलीज करती हैं,20 जो यहां इस्तेमाल की गई फिल्मों (1 मिमी × 1.8 मिमी) से प्रति दिन लगभग 2 एनजी ई2 का अनुवाद करती है। बोलस-रिलीज़िंग पॉली (प्रो-ई2) फ़िल्में आरोपण के तुरंत बाद अतिरिक्त 40 यूजी अनबाउंड ई2 रिलीज़ करती हैं।

कृंतक एससीआई मॉडल में ई2 के उपयोग पर केंद्रित शोध से पता चलता है कि कम खुराक वाला एस्ट्रोजन (10 यूजी/किग्रा) अंतःशिरा में प्रशासित प्रतिक्रियाशील ग्लियोसिस को कम करता है और सूजन संबंधी घटनाओं को कम करते हुए न्यूरोप्रोटेक्शन प्रदान करता है, एपोप्टोसिस को रोकता है, और एंजियोजेनेसिस को बढ़ाता है। इसके विपरीत, एस्ट्रोजेन की उच्च, प्रणालीगत खुराक में सुधार होता है। प्रतिकूल प्रभाव जिसमें डीप वेनथ्रोम्बोसिस और कैंसर22,23 की बढ़ी हुई दर और पुरुषों में स्त्री शारीरिक लक्षणों का विकास शामिल है। यह उल्लेखनीय है क्योंकि अधिकांश E2 अनुसंधानों ने E2 को व्यवस्थित रूप से या तो अंतःशिरा या इंट्रापेरिटोनियल रूप से वितरित करने पर ध्यान केंद्रित किया है।

व्यवस्थित रूप से E2 की उच्च खुराक के उपयोग के साथ सुरक्षा चिंताओं को ध्यान में रखते हुए, साइड इफेक्ट को रोकने के लिए घायल रीढ़ की हड्डी में स्थानीय वितरण के लिए E2 एकाग्रता को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है। आज तक, केवल एक अध्ययन ने नैनोकणों का उपयोग करके बायोमटेरियल से E2 को फोकल रूप से E2 (2.5 ug या 25 ug) वितरित किया है। नैनोकणों की रिहाई से संलयन एससीआई के एक चूहे के मॉडल में तेजी से सूजन कम हो गई। हमारे डेटा (आंकड़े 4 और 5) में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया की कमी ई 2 की मात्रा में असंतुलन के कारण हो सकती है जिसे हम स्थानीय रूप से रीढ़ की हड्डी में पहुंचा रहे हैं बहुत अधिक E2 (40 ug) तीव्रता से जारी किया जा रहा है जबकि बहुत कम (2 एनजी) क्रमिक रूप से जारी किया जा रहा है।

हालाँकि इन आंकड़ों से हम जो देखते हैं वह मामूली रुझान हैं, यह अध्ययन विवो में न्यूरोप्रोटेक्शन को बढ़ावा देने के लिए ई2 खुराक के महत्व पर प्रकाश डालता है। E2 की प्रारंभिक खुराक को कम करने और पॉली (प्रो-E2) बायोमटेरियल के डिग्रेडेशन कैनेटीक्स को समायोजित करने से इस समस्या को कम करने में मदद मिल सकती है और संभावित रूप से बेहतर न्यूरोप्रोटेक्टिव परिणाम मिल सकते हैं।

हालाँकि यह अध्ययन केवल पुरुषों में किया गया था, लेकिन इस बायोमटेरियल के लिए एक वैध अनुवाद क्षमता स्थापित करने के लिए दोनों लिंगों में इन पॉली (प्रो-ई2) फिल्मों के प्रभाव का आकलन करना महत्वपूर्ण है। शोध से पता चला है कि एससीआई के बाद, महिलाओं में एस्ट्रोजन का बढ़ा हुआ स्तर पुरुषों की तुलना में उनके बेहतर कार्यात्मक परिणामों के लिए आंशिक रूप से जिम्मेदार हो सकता है। चूंकि महिलाओं में एस्ट्रोजन की उपस्थिति बढ़ गई है, इसलिए एस्ट्रोजन का उपयोग करने वाली किसी भी बायोमटेरियल रणनीति को इस बढ़े हुए स्तर को ध्यान में रखना होगा और सामग्री को संशोधित करना होगा। यह सुनिश्चित करने के लिए कि दी गई खुराक पुरुषों और महिलाओं के लिए समान है, तदनुसार कैनेटीक्स जारी करें।

विधि

पॉली(प्रो-ई2) फिल्म निर्माण।

पॉली (प्रो-ई2) पॉलिमर पी1 को संश्लेषित किया गया और जैसा कि पहले विस्तार से बताया गया है, इसकी विशेषता बताई गई है। जेल परमीशन क्रोमैटोग्राफी (जीपीसी) के अनुसार, पॉलिमर का वजन-औसत आणविक भार मेगावाट ~ 80 केडीए और फैलाव Đ ~ 3 है। पॉली (प्रो-ई2) फिल्में पॉलिमर को क्लोरोफॉर्म (5 wt %/wt; पॉलिमर/क्लोरोफॉर्म) में घोलकर, घोल को 15 मिमी × 15 मिमी ग्लास कवरस्लिप्स (प्रति कवरस्लिप 100 μL घोल) पर ड्रॉप-कास्ट करके और उन्हें छोड़ कर बनाई गई थीं। वैक्यूम के तहत रात भर सूखने के लिए (<100 mTorr) at room temperature (RT). In a subset of experiments, the polymer solution was supplemented with rhodamine B (0.005 wt %/wt; rhodamine B/chloroform) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) to verify the presence of the poly(pro-E2) films in animals post-implantation.
अनबाउंड E2 के साथ पॉली (प्रो-E2) फिल्में बनाने के लिए, ड्रॉप-कास्टिंग से पहले पॉलीमर सॉल्यूशन (0.0625 wt %/wt; E2/क्लोरोफॉर्म) में अनबाउंड E2 (Abcam, कैम्ब्रिज, MA) जोड़कर फिल्में बनाई गईं। कवरस्लिप्स पर समाधान। आरोपण से पहले, फिल्म के साथ कवरलिप्स को 30 मिनट के लिए पराबैंगनी (यूवी) विकिरण का उपयोग करके निष्फल कर दिया गया था और फिल्मों को एक बाँझ जैव सुरक्षा कैबिनेट में कवरलिप्स से छील दिया गया था। फिर पॉली (प्रो-ई2) फिल्मों को 1 मिमी × 1.8 मिमी के टुकड़ों में काटा गया, जो नीचे बताए अनुसार एक वयस्क चूहे में आरोपण के लिए उपयुक्त थे।

संलयन रीढ़ की हड्डी की चोट और पॉली (प्रो-ई2) फिल्म्स प्रत्यारोपण।

सभी सर्जिकल और पोस्टऑपरेटिव देखभाल प्रक्रियाओं को रेंससेलर पॉलिटेक्निक इंस्टीट्यूट और ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज़ कमेटियों (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था। एक संलयन एससीआई को प्रेरित करने के लिए, जैक्सन प्रयोगशाला (स्टॉक संख्या 000664; बार हार्बर, एमई) से खरीदे गए वयस्क पुरुष C57BL/6 चूहों (10- से 12- सप्ताह पुराने) को इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ एनेस्थेटाइज किया गया था। केटामाइन (80 मिलीग्राम/किग्रा) और जाइलाज़ीन (10 मिलीग्राम/किग्रा)। जानवरों की पीठ को 70% इथेनॉल और बीटाडीन का उपयोग करके मुंडाया गया और सड़न रोकनेवाला तरीके से तैयार किया गया।

जानवर को 37 डिग्री पर बनाए गए हीटिंग पैड पर रखने के बाद, कशेरुक स्तंभ को उजागर करने के लिए त्वचा और मांसपेशियों की परतों को खोला गया, और रीढ़ की हड्डी को उजागर करने के लिए वक्षीय नौवें (टी 9) कशेरुका पर एक पृष्ठीय लैमिनेक्टॉमी की गई। एक अनंत क्षितिज प्रभावकारक (प्रिसिजन सिस्टम और इंस्ट्रुमेंटेशन, लेक्सिंगटन, केवाई) का उपयोग करके इस स्तर पर एक मध्यम (75 kdyn) संलयन एससीआई को प्रेरित किया गया था।

हेमोस्टेसिस प्राप्त होने के बाद, ड्यूरा को खोला गया (चित्रा 2) और पॉली (प्रो-ई 2) फिल्म या एक बोलस-रिलीजिंग पॉली (प्रो-ई 2) फिल्म (1 मिमी × 1.8 मिमी) को ड्यूरा के नीचे और रीढ़ की हड्डी के ऊपर रखा गया, कवर किया गया चोट स्थल. नियंत्रण जानवरों में, ड्यूरा खोला गया था लेकिन पॉली (प्रो-ई2) फिल्में प्रत्यारोपित नहीं की गईं। फिर मांसपेशियों की परतों को बाँझ टांके का उपयोग करके बंद कर दिया गया, और त्वचा को बाँझ धातु घाव क्लिप का उपयोग करके बंद कर दिया गया।

चूहों को चमड़े के नीचे 2 एमएल स्टेराइल सेलाइन इंजेक्ट किया गया और उन्हें उनके पिंजरों में लौटा दिया गया और रात भर 37 डिग्री पर सेट स्लाइड वार्मर पर रखा गया। उचित जलयोजन सुनिश्चित करने और संक्रमण को रोकने के लिए, चूहों को चोट के बाद पहले 5 दिनों (डीपीआई) के लिए प्रतिदिन 1-2 एमएल स्टेराइल सेलाइन और जेन्टोसिन (1 मिलीग्राम/किग्रा) का इंजेक्शन लगाया गया। प्रयोगों की अवधि के लिए मूत्राशय को दिन में दो बार मैन्युअल रूप से व्यक्त किया गया। सभी जानवरों को पारंपरिक परिस्थितियों में भोजन और पानी तक पहुंच के साथ {{7}घंटे के प्रकाश-अंधेरे चक्र पर रखा गया था।

ऊतक संचयन.

7 या 21 डीपीआई के निर्दिष्ट टर्मिनल समय बिंदुओं पर, चूहों को केटामाइन/ज़ाइलाज़ीन की घातक खुराक (1.5× सर्जिकल खुराक) के साथ इंजेक्ट किया गया और ट्रांसकार्डियली रूप से 0.1 एमफॉस्फेट-बफर सलाइन (पीबीएस; पीएच 7.4) के साथ छिड़का गया। इसके बाद 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड (पीएफए; पीएच 7.4) डाला गया। रीढ़ की हड्डी को हटा दिया गया, 4% पीएफए ​​में 2 घंटे के लिए पोस्ट-फिक्स्ड किया गया, और फिर रात भर में 0.2एम फॉस्फेट बफर (पीबी; पीएच 7.4) में स्थानांतरित कर दिया गया।

रीढ़ की हड्डी को 4 डिग्री पर 48 घंटे के लिए 30% सुक्रोज में क्रायोप्रोटेक्ट किया गया और फिर पृष्ठीय स्तंभों को ऊपर की ओर रखते हुए चोट स्थल के आसपास केंद्रित 10 मिमी खंडों में अवरुद्ध कर दिया गया। इन वर्गों को टिश्यू-टेक इष्टतमकटिंग तापमान माध्यम (वीडब्ल्यूआर इंटरनेशनल, रेडनर, पीए) में एम्बेडेड किया गया था और सूखी बर्फ पर तेजी से जमे हुए थे। सभी रीढ़ की हड्डी को माइक्रोएम एचएम 505 ई क्रायोस्टेट पर 10 माइक्रोन पर विभाजित किया गया था, जो कलरफ्रॉस्ट प्लस स्लाइड्स (थर्मोफिशर साइंटिफिक) पर रखा गया था। वाल्थम, एमए), और फिर इम्यूनोस्टेनिंग के लिए उपयोग किए जाने तक -20 डिग्री पर संग्रहीत किया जाता है।

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और मात्रा का ठहराव।

स्लाइडों को 1 घंटे के लिए स्लाइड वार्मर पर पिघलाया गया और फिर 0.1 एमपीबीएस में 3 बार धोया गया। अंतर्जात पेरोक्सीडेज गतिविधि को आरटी पर 15 मिनट के लिए मेथनॉल में पतला 6% H2O2 में स्लाइडों को इनक्यूबेट करके बुझाया गया था। 0.1 एम पीबीएस में 3 बार धोने के बाद, अनुभागों को 4% बीएसए और 0.1% ट्राइटन एक्स-100 के साथ 0.1 एम पीबीएस में 1 के लिए इनक्यूबेट किया गया। एच के बाद 4 डिग्री या आरटी (तालिका 1) पर प्राथमिक एंटीबॉडी का रात भर ऊष्मायन होता है।

स्लाइडों को 1 घंटे के लिए आरटी पर उपयुक्त बायोटिनाइलेटेड माध्यमिक एंटीबॉडी (1: 1000; वेक्टर प्रयोगशालाएं, बर्लिंगम, सीए) के साथ ऊष्मायन किया गया था। बाध्य एंटीबॉडी की कल्पना करने के लिए, स्लाइड्स को 1 घंटे के लिए वेक्टैस्टेन एलीट-एबीसी (वेक्टर प्रयोगशालाओं) के साथ जोड़ा गया और 10 मिनट के लिए ImmPACT3,3′-डायमिनोबेंज़िडाइन (डीएबी) या वेक्टर एसजी सब्सट्रेट (वेक्टर प्रयोगशालाओं) के साथ विकसित किया गया।

अनुभागों को 70% और 90% इथेनॉल में क्रमिक 2 × 2 मिनट ऊष्मायन के माध्यम से निर्जलित किया गया, 100% इथेनॉल में 2 × 3 मिनट, इसके बाद हिस्टोक्लीयर में 3 × 3 मिनट, और अंत में पर्माउंट (थर्मोफिशर साइंटिफिक) के साथ कवर किया गया। परिमाणीकरण विश्लेषण के लिए प्रति जानवर छह खंड, घायल रीढ़ की हड्डी के बीच 100 μm की दूरी का उपयोग किया गया।

इम्युनोलैबल्ड अनुभागों को एक एक्सियोकैमडिजिटल कैमरा और एक्सियोविज़न संस्करण 4.8.2 सॉफ़्टवेयर (कार्ल ज़ीस माइक्रोस्कोपी जीएमबीएच, जेना, जर्मनी) और 5× उद्देश्य से सुसज्जित एक्सियोप्लान 2 इमेजिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया गया था।

प्रत्येक अनुभाग में प्रतिशत सकारात्मक क्षेत्र अंश की गणना करने के लिए MIPAR छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर (MIPAR, वर्थिंगटन, OH) का उपयोग करके प्रत्येक अनुभाग में सकारात्मक पिक्सेल की संख्या की गणना की गई थी। प्रत्येक दाग के लिए प्रति जानवर छह खंडों के औसत प्रतिशत सकारात्मक क्षेत्र की गणना की गई और रिपोर्ट की गई।

सांख्यिकीय विश्लेषण.

सभी डेटा को माध्य ± मानक विचलन के रूप में रिपोर्ट किया गया है। ग्राफपैड प्रिज्म 9 सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर, सैन डिएगो, सीए) का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया था। सभी प्रयोगों में, प्रति समूह 5-6 जानवरों का उपयोग किया गया, जो कम से कम दो अलग-अलग जानवरों से उत्पन्न हुए थे। नियंत्रण और पॉली (प्रो-ई2) फिल्म समूहों के बीच अंतर का परीक्षण करने के लिए, छात्र के टी-टेस्ट (आंकड़े 3, 4, और 5) का उपयोग किया गया था। महत्व p से कम या उसके बराबर 0.05 पर स्थापित किया गया था।

अनुपूरक सामग्री

पूरक सामग्री के लिए पबमेड सेंट्रल पर वेब संस्करण देखें।

आभार

लेखक चूहे की सर्जरी में सहायता के लिए वेनमिन लाई को धन्यवाद देते हैं।

अनुदान

इस कार्य को एमकेजी को क्रेग एच. नीलसन फाउंडेशन फ़ेलोशिप (ग्रांट 468116) और पैरालाइज़्ड वेटरन्सऑफ़ अमेरिका रिसर्च फ़ाउंडेशन फ़ेलोशिप (ग्रांट 3171) और एनआईएच आर01 (ग्रांट एनएस092754) और न्यूयॉर्क स्टेट स्पाइनल कॉर्ड इंजरी रिव्यू बोर्ड इंस्टीट्यूशनल सपोर्ट ग्रांट सी32245जीजी से आरजेजी को समर्थन मिला। सभी पशु कार्य एनआईएनडीएस अनुदान P30NS104177 द्वारा समर्थित ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी न्यूरोसाइंस विभाग सर्जिकल कोर की सहायता से किए गए थे।

प्रतिक्रिया दें संदर्भ

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