मेमोरी रिकन्सॉलिडेशन और रिलैप्स भाग 4 की अल्कोहल-विशिष्ट ट्रांसक्रिप्शनल डायनेमिक्स

आर्क के अलावा, हमने पाया कि अल्कोहल मेमोरी पुनर्प्राप्ति द्वारा डीएच और एमपीएफसी में ईजीआर1 का एमआरएनए स्तर बढ़ाया गया था, लेकिन बीडीएनएफ का नहीं।

जैसे-जैसे समय बीतता है, लोगों को धीरे-धीरे भूलने की बीमारी के रहस्य की एक नई समझ प्राप्त होती है। इस प्रक्रिया में, एक नई तकनीक मेमोरी पुनर्प्राप्ति धीरे-धीरे एक अनुसंधान हॉटस्पॉट बन गई है।

तो क्या अल्कोहल मेमोरी पुनर्प्राप्ति और मेमोरी प्रदर्शन के बीच कोई संबंध है? आओ अभी देख लें! सबसे पहले, हमें स्पष्ट होना चाहिए: अल्कोहल मेमोरी पुनर्प्राप्ति एक अलग तकनीक नहीं है। यह एक ऐसी तकनीक है जो शराब के माध्यम से मस्तिष्क के न्यूरॉन्स को प्रभावित करती है। यह प्रक्रिया मस्तिष्क में कुछ "सोई हुई" यादों को सक्रिय कर सकती है, जिससे हमें इन यादों को ताज़ा करने की अनुमति मिलती है।

दूसरे, हमें यह जानने की जरूरत है कि याददाश्त में सुधार हमें केवल अधिक चीजों को "याद रखने" की अनुमति नहीं देता है, बल्कि विभिन्न तरीकों से यादों को पुनः प्राप्त करने और पुनर्निर्माण करने की एक प्रक्रिया है। यह प्रक्रिया हमें सीखे गए ज्ञान को बेहतर ढंग से समेकित करने और समझने में मदद कर सकती है, जिससे हमारी याददाश्त में सुधार होता है।

इसलिए, हम यह निष्कर्ष निकाल सकते हैं कि अल्कोहल मेमोरी पुनर्प्राप्ति और मेमोरी प्रदर्शन के बीच एक संबंध है। जब हम शराब पीने के बाद पिछली यादों को फिर से निकालने के लिए इस तकनीक का उपयोग करते हैं, तो हम इन यादों को फिर से मजबूत करने की प्रक्रिया से गुजर रहे होते हैं, जिससे हमारी याददाश्त में कुछ हद तक सुधार होता है।

बेशक, हमें यह भी ध्यान रखना चाहिए कि अल्कोहल मेमोरी पुनर्प्राप्ति स्मृति में सुधार के लिए लंबे समय तक चलने वाली और विश्वसनीय तकनीक नहीं है। यदि हम लंबे समय तक उत्कृष्ट स्मृति रखना चाहते हैं, तो हमें अन्य स्मृति प्रशिक्षण तकनीकों के साथ-साथ दैनिक अध्ययन और जीवन के माध्यम से अपनी स्मृति को लगातार मजबूत करने और सुधारने की आवश्यकता है।

इस प्रक्रिया में, हमें अपनी सीखने की प्रेरणा और स्मृति क्षमता को बेहतर ढंग से उत्तेजित करने के लिए, हर समय आशावादी रवैया बनाए रखने की आवश्यकता है। इसलिए, आइए हम सक्रिय रूप से स्मृति प्रशिक्षण का सामना करें, निरंतर स्वयं बने रहें, और स्मृति में निरंतर सुधार की राह पर साहसपूर्वक आगे बढ़ें! यह देखा जा सकता है कि हमें याददाश्त में सुधार करने की आवश्यकता है, और सिस्टैंच डेजर्टिकोला याददाश्त में काफी सुधार कर सकता है, क्योंकि सिस्टैंच डेजर्टिकोला न्यूरोट्रांसमीटर के संतुलन को भी नियंत्रित कर सकता है, जैसे एसिटाइलकोलाइन और विकास कारकों के स्तर को बढ़ाना। ये पदार्थ याददाश्त और सीखने के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं। इसके अलावा, मांस रक्त प्रवाह में भी सुधार कर सकता है और ऑक्सीजन वितरण को बढ़ावा दे सकता है, जो यह सुनिश्चित कर सकता है कि मस्तिष्क को पर्याप्त पोषक तत्व और ऊर्जा प्राप्त हो, जिससे मस्तिष्क की जीवन शक्ति और सहनशक्ति में सुधार हो।

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बढ़ी हुई ईजीआर1 एमआरएनए अभिव्यक्ति को पहले डर और नशीली दवाओं की यादों के पुनर्संयोजन में शामिल किया गया है [19, 21, 48, 61], जिससे यह संभावना बढ़ गई है कि यह प्रतिलेखन कारक शराब की यादों के पुनर्संयोजन में भी भूमिका निभाता है।

जबकि स्मृति पुनर्संगठन में Bdnf की भूमिका विवादास्पद बनी हुई है [19, 49], स्मृति अधिग्रहण और विलुप्ति सीखने के लिए Bdnf प्रेरण को महत्वपूर्ण माना जाता है [19, 62]। इस प्रकार, हमारे अध्ययन में बीडीएनएफ अभिव्यक्ति में परिवर्तन की कमी यह सुझाव दे सकती है कि हमारी मेमोरी पुनर्प्राप्ति प्रक्रिया ने मेमोरी पुनर्प्राप्ति के समानांतर विलुप्त होने की सीख शुरू नहीं की है।

इसके अलावा, हमने हाल ही में रिपोर्ट किया है कि यद्यपि डीएच में बीडीएनएफ का एमआरएनए स्तर अल्कोहल मेमोरी पुनर्प्राप्ति द्वारा नहीं बढ़ाया गया है, वृद्धि कारक की अभिव्यक्ति तब बढ़ गई थी जब पुनर्प्राप्ति के बाद प्रतिकूल काउंटरकंडीशनिंग होती है जो पुनरावृत्ति को रोकती है [44], जो बीडीएनएफ की एक जटिल भूमिका का सुझाव देती है। शराब स्मृति गतिशीलता में.

हमारे निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि IEG अभिव्यक्ति में वृद्धि शराब से संबंधित यादों के पुनर्संयोजन के लिए अद्वितीय नहीं है।

दरअसल, एआरसी और ईजीआर1 को पहले कई प्रकार की यादों के समेकन में फंसाया गया था, जिसमें डर की यादें [19, 46, 47, 62], पहचान की यादें [21], और दुरुपयोग की विभिन्न दवाओं से जुड़ी यादें [20, 22, 61] शामिल थीं।

हालाँकि, इस बात के भी प्रमाण बढ़ रहे हैं कि शराब की तलाश में अंतर्निहित कुछ तंत्र प्राकृतिक इनाम की तलाश को नियंत्रित करने वाले तंत्र से भिन्न हो सकते हैं [5, 27, 28, 63]। इसके अलावा, इस बात के भी प्रमाण हैं कि अलग-अलग पुरस्कारों (और विशेष रूप से अलग-अलग दवाओं के लिए) की यादों को अलग-अलग तरीके से संसाधित किया जाता है [29-32]। हमारे RNAseq विश्लेषण निष्कर्षों ने वास्तव में अल्कोहल मेमोरी पुनर्प्राप्ति से प्रेरित अद्वितीय ट्रांसक्रिपटोमिक हस्ताक्षर का खुलासा किया।

विशेष रूप से, हमें डीएच में 44 जीन और उनके पीएफसी में 9 जीनों का एक अलग सेट मिला, जिसमें अल्कोहलमेमोरी पुनर्प्राप्ति के बाद महत्वपूर्ण परिवर्तन दिखाई दिए। आगे के डेटा सत्यापन के बाद, हमने mPFC (Fkbp5) में एक जीन और DH (Adcy8, Scl8a3, और Neto1) में तीन जीन पर ध्यान केंद्रित किया और पाया कि उनकी अभिव्यक्ति सुक्रोज से जुड़ी यादों की पुनर्प्राप्ति से प्रभावित नहीं हुई थी।

इससे पता चलता है कि, आर्क और ईजीआर1 के विपरीत, ये 4 विशिष्ट जीन संभवतः इनाम यादों के प्रसंस्करण में सामान्य भूमिका नहीं निभाते हैं, फिर भी अल्कोहल यादों के प्रसंस्करण में चयनात्मक भूमिका निभा सकते हैं।

दिलचस्प बात यह है कि ये चार जीन पहले शराब के सेवन विकार और सीखने और स्मृति में शामिल थे। इस प्रकार, Fkbp5 FK506 बाइंडिंग प्रोटीन 5 को एनकोड करता है, जो तनाव न्यूरोएंडोक्राइन सिस्टम का नियामक है [64]।

FKBP5 वेरिएंट अल्कोहल विदड्रॉल सिंड्रोम की गंभीरता को नियंत्रित करते हैं [65] और मनुष्यों में भारी शराब पीने की प्रवृत्ति की भविष्यवाणी करते हैं [66-68]। एफकेबीपी5 को हटाने से चूहों में शराब वापसी की गंभीरता [65] और शराब पीने की लत [67] में वृद्धि देखी गई, जबकि प्रोटीन के औषधीय निषेध ने मध्यम शराब की खपत को कम कर दिया, और चूहों में सीपीपी की बहाली [69] और तनावग्रस्त पुरुष चूहों में शराब पीने में कमी आई [70]।

Adcy8 mRNA का स्तर, एन्कोडिंग एडिनाइलेटसाइक्लेज़ 8 (AC8) जो कैल्शियम प्रवाह के जवाब में सीएमपी गठन को उत्प्रेरित करता है और हाल ही में शराब सेवन के संभावित नियामक के रूप में चिह्नित किया गया है [28, 71], लंबे समय तक शराब पीने वालों के रक्त कोशिकाओं में कम हो गया था [72]।

Adcy8 का विलोपन पहले शराब पीने को कम करने और चूहों में शराब के शामक प्रभावों के प्रति संवेदनशीलता बढ़ाने के लिए दिखाया गया था [73]। इसके अलावा, चूहों में क्रोनिक अल्कोहल एक्सपोजर ने सोल्यूट कैरियरफैमिली 8 (सोडियम/कैल्शियम एक्सचेंजर), सदस्य 3 (एनसीएक्स3), एससीएल8ए3 द्वारा एन्कोड किए गए प्रोटीन [74, 75] की मस्तिष्क अभिव्यक्ति को बढ़ा दिया।

चूहों में शराब का सेवन नेटो1[76] की कम मस्तिष्क अभिव्यक्ति से भी जुड़ा था, जो एनएमडीए-रिसेप्टर कॉम्प्लेक्स [77] के एक घटक, न्यूरोपिलिन टोलॉइड-जैसे 1 (एनआरपी1) को एन्कोडिंग करता है।

यह प्रोटीन हिप्पोकैम्पस में सिनैप्टिक पुनर्गठन और संचरण में शामिल है [78] और स्थानिक सीखने और स्मृति के लिए आवश्यक है [77]।

इस प्रकार, हमारे निष्कर्षों से पता चलता है कि अल्कोहल की यादों की पुनर्प्राप्ति, यहां तक ​​​​कि अल्कोहल के औषधीय प्रभाव के बिना भी, इन जीनों की अभिव्यक्ति को प्रभावित करती है। हालाँकि, अल्कोहल मेमोरी रीकंसोलिडेशन और रिलैप्स में उनकी विशिष्ट भूमिका का परीक्षण किया जाना बाकी है।

वर्तमान अध्ययन की एक सीमा यह है कि आरएनए-सीक्यू परख मेमोरी पुनर्प्राप्ति द्वारा सक्रिय व्यक्तिगत कोशिकाओं के बजाय थोक एमपीएफसी और डीएच ऊतकों पर आयोजित की गई थी। विशेष रूप से, हाल के अध्ययनों ने सुझाव दिया है कि सामान्य रूप से यादें [79, 80], और विशेष रूप से शराब से संबंधित यादें [32, 81, 82], कम संख्या में न्यूरॉन्स से बने न्यूरोनल एन्सेम्बल के सक्रियण के माध्यम से एन्कोड की जाती हैं, जिन्हें न्यूरोनल एक्टिवेशन मार्करों के माध्यम से पहचाना जा सकता है ( उदाहरण के लिए, सीएफओएस) [80]।

दरअसल, चूहे के मस्तिष्क में एमपीएफसी और अतिरिक्त मेसोलेम्बिक क्षेत्रों में संचालक-वातानुकूलित अल्कोहल और मीठी इनाम यादों की पुनर्प्राप्ति द्वारा समान आईईजी (सीएफओएस) सक्रियण पैटर्न पाए गए थे [32, 81]। इस प्रकार, यह संभव है कि मेमोरी पुनर्प्राप्ति द्वारा सक्रिय न्यूरोनलेंसेबल पर आरएनए-सीक्यू परख को चुनिंदा रूप से आयोजित करने से अधिक सटीक परिणाम प्राप्त होंगे।

संक्षेप में, हमारे निष्कर्ष बताते हैं कि अल्कोहल मेमोरी पुनर्प्राप्ति दो समानांतर प्रतिलेखन कार्यक्रमों को प्रेरित करती है। IEGs आर्क और Egr1 सहित सीखने और स्मृति के सामान्य आणविक तंत्रों के माध्यम से संप्रेषित एक कार्यक्रम, सामान्य तौर पर यादों के समेकन में लगा हुआ है।

अल्कोहल मेमोरी रिट्रीवल द्वारा लॉन्च किया गया अन्य ट्रांसक्रिप्शन प्रोग्राम उन जीनों द्वारा नियंत्रित होता है जो विशेष रूप से अल्कोहल-संबंधी व्यवहार को बढ़ावा देते हैं। अल्कोहल यादों के लिए यह दोहरा-प्रसंस्करण मॉडल इस संभावना को बढ़ाता है कि विभिन्न यादों के लिए स्मृति पुनर्समन्वय में समान दोहरे-प्रसंस्करण आणविक तंत्र हो सकते हैं, जिसमें कुछ घटक कई यादों द्वारा साझा किए जाते हैं, और अन्य प्रत्येक स्मृति प्रकार के लिए अद्वितीय होते हैं।

इस काल्पनिक मॉडल का मूल्यांकन यह परीक्षण करके किया जाना बाकी है कि क्या इन जीनों में हेरफेर करने से अल्कोहल और सुक्रोज-मेमोरी पुनर्समन्वय पर अलग-अलग प्रभाव पड़ता है। यदि ऐसा है, तो यह सुझाव देगा कि शराब स्मृति पुनर्संकलन से परे कई कार्यों के लिए आवश्यक प्रमुख आणविक तंत्र को बाधित करने के बजाय, लत जैसे रोगजनक यादों से संबंधित विकारों के इलाज के लिए इनाम-विशिष्ट आणविक लक्ष्यों को लक्षित करना संभव हो सकता है।

सामग्री और तरीके

उपकरण, दवाओं और अभिकर्मकों, ऑलिगोडॉक्सीन्यूक्लियोटाइड (ओडीएन) डिजाइन और तैयारी, वेस्टर्नब्लॉट और क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण, और आरएनए-सीक्यू लाइब्रेरी तैयारी पर विवरण के लिए पूरक सूचना देखें।

जानवरों

नर और मादा C57BL/JRccHsd चूहों (25-30 ग्राम) को तेल-अवीव विश्वविद्यालय पशु सुविधा (इज़राइल) में 3-4/पिंजरे में रखा गया, और 12 घंटे के प्रकाश-अंधेरे चक्र (सुबह 7 बजे रोशनी चालू) के तहत रखा गया। भोजन और पानी उपलब्ध एड्लिबिटम के साथ।

सुक्रोज प्लेस-कंडीशनिंग से जुड़े प्रयोगों में, सुक्रोज छर्रों को इकट्ठा करने के लिए चूहों की प्रेरणा को बढ़ावा देने के लिए प्रशिक्षण सत्र से पहले भोजन तक पहुंच को 6 घंटे के लिए प्रतिबंधित कर दिया गया था। भोजन की कमी की यह छोटी अवधि इस निष्कर्ष पर आधारित है कि दिन के समय, 2-6 घंटे का उपवास भोजन व्यवहार को प्रभावित नहीं करता है [83], और चयापचय मार्करों में एक महत्वपूर्ण बदलाव को ट्रिगर नहीं करता है [84], इस प्रकार भोजन प्रतिबंध के प्रभाव को कम करता है। .

वजन घटाने को नियंत्रित करने के लिए सप्ताह में दो बार चूहों का वजन किया गया। सभी प्रायोगिक प्रोटोकॉल तेल अवीव विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों और एनआईएच दिशानिर्देशों (पशु कल्याण आश्वासन संख्या ए 5010-01) द्वारा अनुमोदित और उनके अनुरूप थे। इस्तेमाल किए गए जानवरों की संख्या को कम करने के लिए सभी प्रयास किए गए।

व्यवहारिक प्रक्रियाएँ

कंडीशनिंग लगाएं

अल्कोहल-वातानुकूलित स्थान वरीयता (सीपीपी): सभी चूहों को 3 दिनों के लिए दैनिक आईपी सेलाइन इंजेक्शन की आदत थी।

बेसलाइन परीक्षण (दिन 1): पहले दिन, स्लाइडिंग दरवाज़ा वापस ले लिया गया और चूहों को 30 मिनट के लिए पूरे उपकरण का स्वतंत्र रूप से पता लगाने की अनुमति दी गई। अल्कोहल स्थान कंडीशनिंग (दिन 2-9): बेसलाइन परीक्षण के 24 घंटे बाद एक सत्र के साथ प्रशिक्षण शुरू हुआ स्लाइडिंग दरवाज़ा बंद करके, 8 दिनों तक प्रति दिन प्रशासित किया जाता है। 3, 5, 7, और 9वें दिन, चूहों को अल्कोहल (1.8 ग्राम/किग्रा, 20% वी/वी; आईपी) प्राप्त हुआ और उन्हें तुरंत 5 मिनट के लिए युग्मित डिब्बे में सीमित कर दिया गया।

इस खुराक और कंडीशनिंग अवधि को पहले अल्कोहल-प्रेरित सीपीपी [42, 85] का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया था। वैकल्पिक दिनों में (अर्थात, 2, 4,6, और 8 दिन), चूहों को एक खारा समाधान प्राप्त हुआ और उन्हें अल्कोहल कंडीशनिंग वाले दिन के समान अवधि के लिए अयुग्मित डिब्बे में सीमित कर दिया गया।

युग्मित डिब्बों को संतुलित किया गया। स्थान वरीयता परीक्षण 1 (दिन 10): स्थान वरीयता परीक्षण बेसलाइन परीक्षण के लिए वर्णित था, और इंडेक्स अल्कोहल-सीपीपी [41] के लिए परोसा गया था। वरीयता को बेसलाइन परीक्षण की तुलना में स्थान वरीयता परीक्षण 1 के दौरान अल्कोहल-युग्मित डिब्बे में बिताए गए समय के प्रतिशत में वृद्धि के रूप में परिभाषित किया गया था।

मेमोरी पुनर्प्राप्ति (दिन 11): इस चरण से पहले, चूहों को विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों (सीपीपी स्कोर और लिंग के लिए मिलान) को सौंपा गया था। स्मृति पुनर्प्राप्ति सत्र के दौरान, चूहों को 3 मिनट के लिए अल्कोहल-युग्मित डिब्बे तक सीमित रखा गया और फिर वे अपने घर के पिंजरे में लौट आए। नियंत्रण चूहों को संक्षेप में संभाला गया। स्थान वरीयता परीक्षण 2 (दिन 12): चूहों को स्थान वरीयता परीक्षण 1 के समान स्थान वरीयता परीक्षण के अधीन किया गया था।

सुक्रोज सीपीपी: सुक्रोज पूर्व-प्रशिक्षण (दिन 1-6): 1-3 दिनों में, चूहों को 5-6 सुक्रोज छर्रों (45 मिलीग्राम, डस्टलेस प्रिसिजनपेलेट्स, बायो-सर्व, फ्रेंचटाउन, एनजे, यूएसए) को घरेलू पिंजरों में इकट्ठा करने की आदत थी। . 4-6 दिनों में, चूहों को 12 मिनट के सत्र के दौरान एक खाली प्लेक्सीग्लास बॉक्स में 3 छर्रों को इकट्ठा करने के लिए प्रशिक्षित किया गया। सुक्रोज प्रशिक्षण के दौरान जिन चूहों ने छह से कम छर्रे (तीन दिनों में कुल नौ छर्रों में से) एकत्र किए, उन्हें प्रयोग से बाहर रखा गया (32 में से 2 चूहे)।

बेसलाइन परीक्षण (दिन 7): सातवें दिन, सीपीपी कक्ष में स्लाइडिंग दरवाजा वापस ले लिया गया और चूहों को 30 मिनट के लिए पूरे उपकरण का पता लगाने की अनुमति दी गई। एक निष्पक्ष उपकरण/निष्पक्ष असाइनमेंट दृष्टिकोण, जैसा कि अल्कोहल-सीपीपी प्रक्रिया में वर्णित है, को भी यहां अपनाया गया था। सुक्रोज प्लेस-कंडीशनिंग (दिन 8-15): बेसलाइन परीक्षण के 24 घंटे बाद प्रशिक्षण शुरू हुआ, 8 दिनों में प्रति दिन एक सत्र के साथ, स्लाइडिंग के साथ बंद दरवाज़ा। 9, 11, 13 और 15वें दिन, चूहों को जोड़े वाले डिब्बे में रखा गया, और एक मिनट बाद, तीन सुक्रोज छर्रे फर्श पर बिखरे हुए थे।
15 मिनट बाद चूहों को उनके घरेलू पिंजरे में लौटा दिया गया। वैकल्पिक दिनों में (यानी, 8, 10, 12 और 14 दिन), चूहों को बिना किसी हस्तक्षेप के 15 मिनट के लिए अयुग्मित डिब्बे में रखा गया।

युग्मित डिब्बों को संतुलित किया गया था। स्थान वरीयता परीक्षण 1 (दिन 16): स्थान वरीयता परीक्षण बेसलाइन परीक्षण के लिए वर्णित था, और सुक्रोज-सीपीपी सूचकांक के लिए परोसा गया था। वरीयता को बेसलाइन परीक्षण की तुलना में स्थान वरीयता परीक्षण 1 के दौरान सुक्रोज-युग्मित डिब्बे में बिताए गए समय के प्रतिशत में वृद्धि के रूप में परिभाषित किया गया था। मेमोरी पुनर्प्राप्ति (17 दिन): सुक्रोज मेमोरी पुनर्प्राप्ति प्रक्रिया अल्कोहल मेमोरी पुनर्प्राप्ति प्रक्रिया के समान थी (ऊपर देखें) ).

ऑलिगोडॉक्सीन्यूक्लियोटाइड (ओडीएन) सत्यापन

आर्क एंटीसेंस ओडीएन (एएस-ओडीएन) और स्क्रैम्बल ओडीएन (एससीआर-ओडीएन) (सिग्मा-एल्ड्रिच, रेहोवोट, इज़राइल) डिज़ाइन ने पहले वर्णित दिशानिर्देशों का पालन किया [56, 86]।

आर्क एएस-ओडीएन कार्यात्मक सत्यापन। आर्क एएस-ओडीएन (2 एनएमओएल/μl, 0.5 μl, 0.25 μl/मिनट) को एक गोलार्ध में डीएच में डाला गया था, और एससीआर-ओडीएन (2 एनएमओएल/µएल, { {9}}.5 µl, 0.25 µl/मिनट) को दूसरे गोलार्ध में प्रवाहित किया गया (किनारे असंतुलित थे)। दो या चार घंटे बाद, उपचारित चूहों ने नवीनता-निर्भर एआरसी अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए 5 मिनट के लिए एक अपरिचित संदर्भ (सीपीपी डिब्बे, ऊपर उपकरण विवरण देखें) का पता लगाया। चूहों को एक घंटे बाद (यानी, ओडीएन जलसेक के 3 या 5 घंटे बाद) इच्छामृत्यु दी गई, मस्तिष्क के ऊतकों को एकत्र किया गया, और एआरसी प्रोटीन के स्तर का मूल्यांकन पश्चिमी ब्लोटानालिसिस (चित्रा एस 4) द्वारा किया गया।

सर्जरी और इंट्रा-हिप्पोकैम्पल माइक्रोइन्फ्यूजनसर्जरी और माइक्रोइंफ्यूजन पहले वर्णित के अनुसार आयोजित किए गए थे [42, 87]।

शल्य चिकित्सा। आइसोफ्लुरेन एनेस्थेसिया के तहत स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी की गई। चूहों को एक स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम (आरडब्ल्यूडी लाइफ साइंस, शेन्ज़ेन, चीन) में रखा गया था, और द्विपक्षीय गाइड कैनुला (सी235जी-2.6, 26जी; प्लास्टिक वन इंक., रोनोक, वीए, यूएसए) को डीएच पर लक्षित किया गया था। निम्नलिखित निर्देशांक (-ब्रेग्मा के पीछे −2 मिमी, ±1.3 मिमी मध्यपार्श्व, खोपड़ी की सतह पर −1.45 मिमी उदर)। कैनुला को डेंटल ऐक्रेलिक से सुरक्षित किया गया था। मैचिंग डमीकैन्युला (प्लास्टिक्स वन इंक., रानोके, वीए, यूएसए) को गाइडकैन्युला में डाला गया और इंजेक्टर साइट को ढंके रखने और मलबे से मुक्त रखने के लिए डस्ट कप के साथ शीर्ष पर रखा गया। चूहों को अल्कोहल-सीपीपी प्रशिक्षण से पहले 7-10 दिन तक ठीक होने दिया गया।

इंट्रा-हिप्पोकैम्पल इन्फ्यूजन। एक्टिनोमाइसिन डी (4 μg/μl, 0.5 μl प्रति पक्ष, 0.25 μl/मिनट, डीएमएसओ में) [19] या स्मृति पुनर्प्राप्ति के तुरंत बाद डीएच में वाहन के बराबर मात्रा में माइक्रोइंजेक्ट किया गया था . एक समान सांद्रता में हिप्पोकैम्पस में एक्टिनोमाइसिन डी को डालने से स्मृति पुनर्संगठन में बाधा उत्पन्न होती है [19]। आर्क एएस-ओडीएन या नियंत्रण एससीआर-ओडीएन (2nmol/μl, 0.5 μl/साइड, 0.25 μl/मिनट; पीबीएस में) को डीएच 4 घंटे 2 घंटे पहले या में माइक्रोइंजेक्ट किया गया था। स्मृति पुनर्प्राप्ति के 4 घंटे बाद।

डस्ट कप और डमी कैनुला को हटाने के बाद, इंजेक्शन कैनुला (33 जी; प्लास्टिक्स वन इंक., रानोके, वीए, यूएसए) का उपयोग करके जागृत रूप से नियंत्रित चूहों को 2 मिनट तक माइक्रोइन्फ्यूजन आयोजित किया गया, जो गाइड से 0.5 मिमी आगे तक फैला हुआ था। कैनुला टिप। इंजेक्शन कैनुला को अतिरिक्त 2 मिनट के लिए उसी स्थान पर छोड़ दिया गया। जलसेक के बाद, डमी कैनुला को गाइड कैनुला में डाला गया, डस्ट कप से सुरक्षित किया गया, और जानवर अपने घर के पिंजरों में लौट आए। क्रेसिल वायलेट से रंगे पैराफॉर्मल्डिहाइड-फिक्स्ड ऊतक के 30 माइक्रोन-मोटे कोरोनल खंडों में कैनुला स्थानों को सत्यापित किया गया था।

डेटा विश्लेषण

Place preference was assessed as the percentage of time spent in the alcohol/sucrose-paired compartment, relative to the total test time. Mice that spent >बेसलाइन परीक्षण के दौरान किसी भी डिब्बे में 75% समय को अध्ययन से बाहर रखा गया (267 में से 9)। सीपीपी स्थापना की पुष्टि बेसलाइन और सीपीपी परीक्षण 1 के बीच सीपीपी स्कोर की तुलना करके की गई थी और एक युग्मित टी-टेस्ट द्वारा विश्लेषण किया गया था। चूंकि मेमोरी पुनर्प्राप्ति के लिए सीपीपी (यानी, मेमोरी गठन) की अभिव्यक्ति आवश्यक है, चूहों के डेटा जिन्होंने सीपीपी नहीं दिखाया (बेसलाइन और टेस्ट 1 के बीच वरीयता में न्यूनतम 5% की वृद्धि) को प्रयोग से बाहर रखा गया (258 में से 48)।

स्मृति पुनर्संगठन में हस्तक्षेप के बाद अल्कोहल-सीपीपी का उपचार के बीच-विषय कारक (एक्टिनोमाइसिन डी या ओडीएन) और परीक्षण के भीतर-विषय कारक (सीपीपी परीक्षण 1, सीपीपी परीक्षण 2) के साथ एक मिश्रित-मॉडल एनोवा द्वारा विश्लेषण किया गया था। स्टूडेंट-न्यूमैन-केल्स पोस्ट हॉक टेस्ट द्वारा महत्वपूर्ण इंटरैक्शन का विश्लेषण किया गया। पश्चिमी ब्लॉटिम्यूनोरिएक्टिव एआरसी प्रोटीन स्तर की घनत्व को उन जीएपीडीएच के लिए सामान्यीकृत किया गया और उपचार के बीच-विषयों के कारक के साथ एक तरफा एनोवा द्वारा विश्लेषण किया गया, इसके बाद डननेट का पोस्ट हॉक परीक्षण किया गया। क्यूआरटी-पीसीआर एमआरएनए अभिव्यक्ति डेटा को गैपडीएच के लिए सामान्यीकृत किया गया और एक नियंत्रण समूह की अभिव्यक्ति के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया।

प्रत्येक मस्तिष्क क्षेत्र के लिए सभी जीनों के डेटा का विश्लेषण एक-तरफ़ा एनोवा द्वारा उपचार के बीच-विषयों के कारक के साथ किया गया, इसके बाद नियंत्रण (कोई पुनर्प्राप्ति) समूह से प्राप्त डेटा की तुलना के लिए प्रत्येक जीन के लिए डननेट का परीक्षण किया गया। आरएनए-सेक के लिए, हमने प्रत्येक प्रतिकृति के लिए 3 जानवरों के ऊतकों को एकत्रित किया और प्रतिकृतियों की निम्नलिखित संख्या तैयार की: पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस (डीएच) के लिए 3 - कोई पुनर्प्राप्ति नहीं, डीएच-पुनर्प्राप्ति के लिए 2, प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (पीएफसी) के लिए 3 - कोई पुनर्प्राप्ति नहीं, और 2 ( पीएफसी)-पुनर्प्राप्ति। ट्राइज़ोल के साथ कुल आरएनए अलगाव के बाद, हमारे द्वारा विकसित विधि का उपयोग करके अनुक्रमण पुस्तकालय तैयार किए गए थे [88]।

पुस्तकालयों को इलुमिनाहिसेक 2000 के साथ 50 बीपी सिंगल-एंड अनुक्रमण के अधीन किया गया था। फास्टक्यूसी द्वारा अनुक्रमण डेटा की गुणवत्ता की पुष्टि करने के बाद, बोटी2 [89] का उपयोग करके रीड्स को एमएम9 संदर्भ जीनोम में मैप किया गया था और टॉपहैट2 [90] के साथ एनोटेट किया गया था।

जीन में मैप किए गए रीड्स को फ़ीचरकाउंट्स [91] द्वारा निर्धारित किया गया था। हमने अति-प्रवर्धित जीनों की गिनती से बचने के लिए Rn45s, Lars2, Rn4.5s, Cdk8, Zc3h7a, और माइटोकॉन्ड्रियल क्रोमोसोम को बाहर कर दिया, जो कि पहले वर्णित [92] के अनुसार लाइब्रेरी सामान्यीकरण को ख़राब कर सकता है। DESeq2 [58] का उपयोग रिट्रीवलग्रुप में विभेदित रूप से व्यक्त जीन (डीईजी) की पहचान करने के लिए किया गया था, नो रिट्रीवल नियंत्रण समूह की तुलना में, एक महत्वपूर्ण कटऑफ-समायोजित पी-वैल्यू (पी (एडज) <{14}}.05) के साथ।

डेटा उपलब्धताRNA-seq डेटा एनसीबीआई जीन एक्सप्रेशन ऑम्निबस पर https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi (GSE205586) पर एक समीक्षक टोकन:knyfwwiorbutvuv के साथ उपलब्ध है।

प्रतिक्रिया दें संदर्भ

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