एक सहज रोगज़नक़ संवेदन रणनीति जिसमें जीवाणु सतह प्रोटीन का सर्वव्यापीकरण शामिल है भाग 1

परिचय

रोगजनक आक्रमण मेजबान के निगरानी तंत्र द्वारा प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला को ट्रिगर करता है। यह आम तौर पर रोगज़नक़-संबंधित आणविक पैटर्न (पीएएमपी) के रूप में ज्ञात संरक्षित माइक्रोबियल आणविक संरचनाओं को पहचानने से शुरू किया जाता है। पैटर्न रिकग्निशन रिसेप्टर्स (पीआरआर) द्वारा इन पीएएमपी की प्रभावी सेंसिंग रोगज़नक़ निकासी को ट्रिगर करने वाले जटिल सिग्नलिंग मार्गों के सक्रियण के माध्यम से विभिन्न मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को तेजी से प्रेरित करती है।

हाल के वर्षों में, जैव प्रौद्योगिकी के विकास और अनुसंधान प्रौद्योगिकी के निरंतर सुधार के साथ, लोगों को माइक्रोबियल अणुओं और प्रतिरक्षा के बीच संबंधों की गहरी समझ हो गई है। संरक्षित माइक्रोबियल अणु माइक्रोबियल अणुओं का एक वर्ग है जिन्हें जीवों द्वारा पहचाना जा सकता है और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को ट्रिगर किया जा सकता है। उनमें मुख्य रूप से बैक्टीरिया, वायरस और कवक जैसे सूक्ष्मजीवों के आणविक घटक शामिल हैं, और अत्यधिक संरक्षित और विशिष्ट हैं। अध्ययनों से पता चला है कि संरक्षित माइक्रोबियल अणु विभिन्न रोगजनकों का विरोध कर सकते हैं और शरीर की प्रतिरक्षा प्रणाली को सक्रिय करके प्रतिरक्षा बढ़ा सकते हैं।

संरक्षित माइक्रोबियल अणु प्रतिरक्षा प्रणाली में महत्वपूर्ण अणुओं, जैसे टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं और मैक्रोफेज को सक्रिय करके सूजन और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करते हैं। संरक्षित माइक्रोबियल अणुओं को पहचानने के बाद, ये कोशिकाएं साइटोकिन्स और केमोकाइन सहित विभिन्न प्रतिरक्षा मध्यस्थों को छोड़ेंगी, जिससे अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाएं प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में शामिल होने के लिए आकर्षित होंगी। साथ ही, संरक्षित माइक्रोबियल अणु शरीर में एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को सक्रिय करने के लिए एंटीजन के रूप में भी काम कर सकते हैं, जिससे एंटीबॉडी सुरक्षा बनती है। इन कोशिकाओं और प्रतिरक्षा कारकों की परस्पर क्रिया शरीर को रोगजनकों से बेहतर ढंग से बचा सकती है।

कई अध्ययनों से पता चला है कि संरक्षित माइक्रोबियल अणु शरीर की प्रतिरक्षा में सुधार कर सकते हैं, जिससे विभिन्न प्रकार की बीमारियों को रोका जा सकता है और उनका इलाज किया जा सकता है, जैसे संक्रामक रोग, एलर्जी रोग, कैंसर, आदि। उदाहरण के लिए, आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला पुनः संयोजक हेपेटाइटिस बी टीका इसी के आधार पर बनाया जाता है। हेपेटाइटिस बी वायरस की सतह एंटीजन पर संरक्षित माइक्रोबियल अणु। हेपेटाइटिस बी वायरस के संक्रमण को रोकने के उद्देश्य को प्राप्त करने के लिए, हेपेटाइटिस बी वायरस की सतह एंटीबॉडी उत्पन्न करने के लिए, टीके के टीकाकरण से शरीर की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित किया जा सकता है।

निष्कर्षतः, संरक्षित माइक्रोबियल अणुओं और प्रतिरक्षा के बीच एक मजबूत संबंध है। संरक्षित माइक्रोबियल अणुओं के इम्यूनोमॉड्यूलेटरी फ़ंक्शन का पूरा उपयोग करके, शरीर की प्रतिरक्षा में सुधार किया जा सकता है, और विभिन्न बीमारियों को बेहतर ढंग से रोका और इलाज किया जा सकता है। इसलिए, हमें सक्रिय रूप से संरक्षित माइक्रोबियल अणुओं के व्यावहारिक अनुसंधान पर ध्यान देना चाहिए और रोग की रोकथाम और उपचार में उनके अनुप्रयोग को बढ़ावा देना चाहिए। इस दृष्टि से हमें रोग प्रतिरोधक क्षमता को बेहतर करने की जरूरत है। सिस्टैंच प्रतिरक्षा में काफी सुधार कर सकता है, क्योंकि मांस की राख में विभिन्न प्रकार के जैविक रूप से सक्रिय तत्व होते हैं, जैसे पॉलीसेकेराइड, दो मशरूम, और हुआंगली, आदि। ये तत्व प्रतिरक्षा प्रणाली को उत्तेजित कर सकते हैं। विभिन्न प्रकार की कोशिकाएँ, अपनी प्रतिरक्षा सक्रियता बढ़ाती हैं।

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आज तक, पीआरआर के कई वर्ग, जैसे टोल-जैसे रिसेप्टर्स, रेटिनोइक एसिड-इंड्यूसिबल जीन I (आरआईजी-आई)-जैसे रिसेप्टर्स, एनओडीलाइक रिसेप्टर्स, और डीएनए रिसेप्टर्स (डीएनए के लिए साइटोसोलिक सेंसर) की खोज और विशेषता की गई है (1) ). ये पीआरआर बाह्यकोशिकीय और अंतःकोशिकीय रोगज़नक़ पहचान दोनों में सबसे आगे हैं और प्रोटीन, लिपिड, कार्बोहाइड्रेट और न्यूक्लिक एसिड (2) सहित रोगाणुओं में अणुओं के विभिन्न वर्गों को समझते हैं। यह रोग की प्रगति को रोकने और मेजबान के अस्तित्व को बढ़ावा देने के लिए महत्वपूर्ण है।

रोगज़नक़ प्रसार के प्रतिबंध के लिए इंट्रासेल्युलर परिवेश की निगरानी साइटोसोलिक बाँझपन को संरक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस तरह के रक्षा तंत्र का उल्लंघन रोगज़नक़ को बाह्य कोशिकीय जन्मजात प्रतिरक्षा से आश्रय प्रदान करता है और मेजबान (3) के भीतर तेजी से गुणा और प्रसार का अवसर प्रदान करता है। इसलिए, आक्रामक रोगज़नक़ों को प्रतिबंधित करने के लिए शक्तिशाली रोगज़नक़ संवेदन तंत्र और कोशिका-स्वायत्त रक्षा प्रणालियाँ महत्वपूर्ण हैं। सर्वव्यापकता एक ऐसी रणनीति है जो रोगज़नक़ की पहचान और उन्मूलन (4) में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है।

सर्वव्यापीकरण द्वारा तय किया गया अपमानजनक मार्ग साइटोसोल-निवास बैक्टीरिया के खिलाफ अंतिम सीमा के रूप में कार्य करता है जो अक्सर मेजबान साइटोसोल पर आक्रमण करने के लिए रोगज़नक़ युक्त रिक्तिका को तोड़कर शास्त्रीय एंडोसाइटिक हत्या से बच जाता है। पॉली-यूबिकिटिन (यूबी) श्रृंखलाओं (5) के साथ इंट्रासेल्युलर रोगजनकों सहित कार्गो को सजाने के लिए कई मेजबान ई 3 यूबिकिटिन लिगेज की पहचान की गई है, और हालांकि बाहरी झिल्ली प्रोटीन जैसे कुछ जीवाणु लक्ष्य का पता लगाया गया है (6), सब्सट्रेट पहचान रणनीति के बारे में व्यापक ज्ञान बना हुआ है सीमित।

एक हालिया अध्ययन में माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस (एमटीबी) में यूबिकिटिन-संबद्ध डोमेन (यूबीए) को शामिल करने के लिए स्रावित प्रभावकारक प्रोटीन का प्रदर्शन किया गया है, जो निष्क्रिय रूप से यूबिकिटिन अंशों को भर्ती करता है, अंततः माइक्रोट्यूब्यूल-संबंधित प्रोटीन 1 ए / 1 बी-प्रकाश श्रृंखला 3 (एलसी 3) -संबद्ध ऑटोफैगोसोम में रोगज़नक़ पहुंचाता है। (7). साथ ही, लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) और ग्लाइकेन जैसे असामान्य यूबिकिटिन सब्सट्रेट्स को कुछ जीवाणु रोगजनकों में सुंदर ढंग से चित्रित किया गया है, जो सर्वव्यापी सब्सट्रेट्स की बहुमुखी प्रतिभा को प्रदर्शित करता है (8, 9)।

पूरक रूप से, रिकेट्सिया पार्केरी को सतह प्रोटीन को सक्रिय रूप से संशोधित करने, उन्हें सर्वव्यापीकरण और बाद में हत्या (10) से बचाने के लिए पाया गया। साथ में, ये स्वतंत्र अध्ययन यूबिकिटिन सब्सट्रेट की सतह के स्थानीयकरण के महत्व पर जोर देते हैं। हालाँकि, रोगज़नक़ में एक प्रोटीनयुक्त सब्सट्रेट की पहचान और मेजबान E3 लिगेज द्वारा उन्हें कैसे सटीक रूप से पहचाना जा सकता है, यह अस्पष्ट है।
कुछ मेजबान यूबिकिटिन लिगेज, जैसे कि ल्यूसीन-समृद्ध दोहराव और बाँझ-मोटिफ युक्त 1 (एलआरएसएएम1), पार्किन, रिंग फिंगर प्रोटीन 166 (आरएनएफ166), आरएनएफ213, एराडने रिंग-बिटविनरिंग-रिंग (आरबीआर) ई3- यूबिकिटिन प्रोटीन लिगेज 1 (एआरआईएच1), एसएमएडी-विशिष्ट ई3-यूबिकिटिन प्रोटीन लिगेज 1 (स्मर्फ1), और स्किप-कुलिन-एफ-बॉक्स प्रोटीन 2 युक्त कॉम्प्लेक्स (एससीएफएफबीएक्सओ2) रोगज़नक़ या रोगज़नक़ युक्त रिक्तिका को सजाने की सूचना दी गई है। विभिन्न प्रकार की यूबिकिटिन श्रृंखला टोपोलॉजी (8, 9, 11-18) के साथ। विशेष रूप से, विशेष रूप से, ऑटो-यूबिकिटिनेशन के माध्यम से एलआरएसएएम1 संभवतः ऑटोफैजिक मशीनरी (19, 20) को भर्ती करने के लिए बैक्टीरिया के चारों ओर एक मजबूत यूबिकिटिन सिग्नल उत्पन्न करता है। रोगज़नक़ अंकन के लिए जिम्मेदार यूबिकिटिन लिगेज सेलुलर होमियोस्टैसिस को बनाए रखने में भी शामिल हैं, जो कुशल और इष्टतम संसाधन उपयोग के लिए एक अत्यंत मितव्ययी प्रणाली बनाते हैं।

रोगज़नक़ पर गठित विभिन्न यूबिकिटिन श्रृंखला टोपोलॉजी के बीच, एम {{0} यूबी सजावट मुख्य रूप से सूजन (21) को प्रेरित करती है, जबकि के 48- और के 63- यूबी श्रृंखला टोपोलॉजी दोनों प्रभावी ढंग से रोगाणुओं को लक्षित करती हैं। ऑटोफैगी या प्रोटीसोमल प्रणाली, क्रमशः (22)। हमने हाल ही में प्रदर्शित किया है कि K{{5}Ub श्रृंखला में K{6}}Ub (23) की तुलना में अधिक प्रभावी जीवाणुरोधी प्रभाव होता है। आम तौर पर, प्रोटीसोमल क्षरण के लिए नियत सेलुलर प्रोटीन को K 48- यूबी श्रृंखला-विशिष्ट लिगेज द्वारा टैग किया जाता है। ऐसे लिगेज द्वारा सब्सट्रेट पहचान के लिए महत्वपूर्ण संकेत मुख्य रूप से एक डिग्रोन मोटिफ (24) द्वारा निर्देशित होता है।

इस अध्ययन में, हम ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नेगेटिव दोनों मूल के फ़ाइलोजेनेटिक रूप से विविध बैक्टीरिया के सतह प्रोटीन में डीग्रोन रूपांकनों के अस्तित्व की पहचान करते हैं। सर्वव्यापी मशीनरी द्वारा ऐसे सबस्ट्रेट्स का लक्ष्यीकरण मेजबान कोशिका से कुशल रोगज़नक़ उन्मूलन को प्रेरित करता है। इसका उपयोग करते हुए, हम बैक्टीरियल क्लीयरेंस को बढ़ावा देने के लिए इंजीनियरिंग डिग्रॉन सम्मिलन द्वारा एक गैर-सर्वव्यापी सतह प्रोटीन के एक सर्वव्यापी सब्सट्रेट में रूपांतरण का प्रदर्शन करते हैं। बैक्टीरिया सब्सट्रेट की पहचान करने के लिए यह सरल लेकिन सामान्य सिद्धांत संभावित रूप से साइटोसोलिक रोगज़नक़ पहचान के एक संरक्षित तंत्र के रूप में कार्य करता है, जो बैक्टीरिया संक्रमण को रोकने में कुशल और बहुउद्देश्यीय होने का वादा करता है।

परिणाम

K48-Ub श्रृंखला साइटोसोलिक जीवाणु रोगज़नक़ों की अनुभूति को बढ़ावा देती है

रोगजनकों द्वारा साइटोसोलिक आक्रमण को महसूस करने पर, मेजबान ने उनकी निकासी को ट्रिगर करने के लिए उन्हें पॉली-यूबी श्रृंखलाओं के साथ चिह्नित किया (22)। चूंकि ऐसी पॉलीयूबी श्रृंखलाएं मुख्य रूप से के 48- और के 63-यूबी से बनी होती हैं, इसलिए हमने पहले दो फ़ाइलोजेनेटिक रूप से अलग-अलग रोगजनकों, स्ट्रेप्टोकोकस न्यूमोनिया (एसपीएन) और साल्मोनेला एंटरिका सेरोवर पर इन श्रृंखला प्रकारों की प्रबलता और स्थानिक स्थान का पता लगाया। टाइफिमुरियम (एसटीएम), जो क्रमशः मनुष्यों में निमोनिया और गैस्ट्रोएंटेराइटिस का कारण बनता है। इन रोगजनकों के लिए, मेजबान कोशिका साइटोसोल के भीतर अस्तित्व और प्रसार को प्रलेखित किया गया है (13, 25)। यूबिकिटिन लिंकेज-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए, हमने देखा कि इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया का काफी अधिक अनुपात K 48- यूबी श्रृंखला प्रकार (एसपीएन के लिए ~ 26 प्रतिशत और एसटीएम के लिए 37 प्रतिशत) के साथ चिह्नित किया गया था, जो कि के 63- के विपरीत था। उब (चित्र 1ए)।

संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) द्वारा स्थानिक स्थान के विश्लेषण से संकेत मिलता है कि साइटोसोलिक (वैक्यूलर अवशेषों से मुक्त) या साइटोसोल-एक्सपोज़्ड बैक्टीरिया (क्षतिग्रस्त एंडोसोम के भीतर) मुख्य रूप से के {{1}यूबी से जुड़े हुए हैं, जबकि के 63-यूबी सिग्नल क्षतिग्रस्त एंडोसोम पर स्थित था, जिसे गैलेक्टिन -8 (गैल8; एंडोसोम डैमेज सेंसिंग मार्कर) (छवि 1, बी से ई) (26) के साथ चिह्नित किया गया था। सर्वव्यापी एसपीएन और एसटीएम का लगभग 99 और ~76 प्रतिशत क्रमशः गैल8 (चित्र 1एफ) से रहित थे। साइटोसोल में बैक्टीरिया की उपस्थिति को ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) और एक झिल्ली मार्कर एफएम 4-64 (चित्र। एस1, ए से एफ) के साथ इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा और अधिक मान्य किया गया था। हमने पाया कि क्रमशः 78.4 और 80.4 प्रतिशत K48-Ub-पॉजिटिव SPN और STm, किसी भी झिल्ली संघ से रहित थे, जबकि 77.7 और 74.4 प्रतिशत K63-Ub-पॉजिटिव SPN और STm, क्रमशः, भीतर ही सीमित थे। रिक्तिका (चित्र 1जी)। सामूहिक रूप से, इन निष्कर्षों से पता चलता है कि बैक्टीरिया की सतह को K48-Ub श्रृंखलाओं से कोटिंग करना एक प्रमुख रोगज़नक़-संवेदन तंत्र है जिसका उपयोग मेजबान द्वारा साइटोसोल-निवास वाले रोगाणुओं को पहचानने के लिए किया जाता है।

डीग्रोन जीवाणु सर्वव्यापकता के लिए एक सामान्य कोड है

इसके बाद हमने बैक्टीरिया की सतह पर K48 के सर्वव्यापीकरण के लिए सब्सट्रेट की पहचान करने का प्रयास किया। गंभीर रूप से, मेजबान ई3 यूबिकिटिन लिगेज, जो कि जीवाणु सर्वव्यापीकरण में शामिल बताए गए हैं, महत्वपूर्ण सेलुलर कार्यों (12, 14) में भी शामिल हैं, जहां के 48-यूबी चेन सेलुलर प्रोटियोस्टैसिस के लिए एक प्रमुख संकेत के रूप में कार्य करते हैं। हमने अनुमान लगाया कि मेजबान द्वारा बैक्टीरिया की सतह पर K48-Ub सब्सट्रेट की पहचान के लिए समान सिद्धांतों को अपनाया जा सकता है। मेजबान प्रोटीन के लिए, एक त्रिपक्षीय रूपांकन (एक प्राथमिक डिग्रॉन अनुक्रम जिसके बाद समीपस्थ लाइसिन अवशेष और बीच में एक अव्यवस्थित क्षेत्र) की उपस्थिति को K48 सर्वव्यापकता (24) के लिए एक शर्त माना जाता है।

हमने समान विशेषताओं (छवि 1H) की उपस्थिति के लिए एसपीएन के सतह प्रोटीन की जांच की, सर्वव्यापकता के लिए अनुमानित लक्ष्य के रूप में BgaA और PspA की पहचान की (छवि 1H और छवि S2, ए, और बी)। BgaA एक -गैलेक्टोसिडेज़ है जो SPN के लिए चिपकने वाले पदार्थ के रूप में कार्य करता है, जबकि PspA एक कोलीन-बाइंडिंग प्रोटीन है जो लैक्टोफेरिन को बांधता है और पूरक चोरी के लिए आवश्यक है (27, 28)। हमने ΔbgaA और ΔpspA दोनों म्यूटेंट के लिए K 48-Ub श्रृंखला प्रकार के सहयोग में ~ 50 से 53 प्रतिशत की कमी देखी, K 63-Ub स्तर (छवि 1I) में किसी भी बदलाव के बिना। यह कमी डबल-नॉकआउट स्ट्रेन (ΔbgaAΔpspA) में स्पष्ट (~75 प्रतिशत) की गई थी, जो इन यूबिकिटिन सब्सट्रेट्स की गैर-निरर्थक प्रकृति का सुझाव देती है (चित्र 1आई)।

इसके अलावा, मेजबान कोशिकाओं में BgaA-T (प्रोटीन का एक छोटा संस्करण, जिसमें अमीनो एसिड 1 से 1049 शामिल है) और PspA की अभिव्यक्ति K 48-Ub टोपोलॉजी (छवि 1J) के साथ उनके सर्वव्यापीकरण की ओर ले जाती है। पूर्वानुमानित लक्ष्यों की वैधता की पुष्टि पूरकता द्वारा की गई थी, और मॉडल को K48-Ub एसोसिएशन स्तर (छवि 1I) स्कोर करने के नियंत्रण के रूप में उत्परिवर्ती ΔhysA (एसपीएन सतह प्रोटीन जो त्रिपक्षीय गिरावट मानदंडों को पूरा नहीं करता है) का उपयोग करके मजबूत किया गया था। ).

हमने आगे बैक्टीरिया क्लीयरेंस पर K48-Ub डेकोरेशन के प्रभाव का पता लगाया।

( चित्र 1K). हमारे सब्सट्रेट भविष्यवाणी दृष्टिकोण की सार्वभौमिकता को विभिन्न अन्य रोगजनकों में कई सतह-उजागर प्रोटीनों की पहचान द्वारा सर्वव्यापीकरण (तालिका एस 1) के लिए अनुमानित सब्सट्रेट के रूप में मान्य किया गया था। ऐसा ही एक अनुमानित उम्मीदवार, एसटीएम पर एक बाहरी झिल्ली प्रोटीन आरएलपीए को मेजबान सर्वव्यापक मशीनरी के लिए एक लक्ष्य के रूप में पुष्टि की गई थी, क्योंकि ΔrlpA उत्परिवर्ती ने ~1 का प्रदर्शन किया था। जंगली की तुलना में के के साथ 48- यूबी के साथ जुड़ाव कम हो गया था। -प्रकार (डब्ल्यूटी) एसटीएम (छवि 1 एल)। इस खोज ने हमारी सब्सट्रेट चयन रणनीति की व्यापक प्रयोज्यता स्थापित की। हमारी सर्वोत्तम जानकारी के अनुसार, ये पहले जीवाणु सतह प्रोटीन हैं जिन्हें रोगज़नक़ संवेदन और निकासी के लिए मेजबान सर्वव्यापक मशीनरी द्वारा मान्यता प्राप्त होने की सूचना मिली है।

जीवाणु सतह प्रोटीन की सटीक यूबिकिटिन टैगिंग के लिए एक त्रिपक्षीय रूपांकन एक शर्त है

सब्सट्रेट पहचान के बाद, हमने त्रिपक्षीय रूपांकन की महत्वपूर्ण विशेषताओं का परीक्षण करने का लक्ष्य रखा, जिसने हमारी स्क्रीन की रीढ़ बनाई (चित्र 2ए और चित्र एस2ए)। BgaA-T में डिग्रॉन अनुक्रम (102VTPKEE107) के विलोपन के परिणामस्वरूप समान विकास कैनेटीक्स और सेल पालन क्षमता (छवि 2सी) की परवाह किए बिना डब्ल्यूटी एसपीएन की तुलना में के 48- यूबी श्रृंखला प्रकार के सहयोग में ~ 50 प्रतिशत की गिरावट आई। और चित्र। S3, A, और B)। यह कमी ΔbgaA नॉकआउट स्ट्रेन के बराबर थी, जो डिग्रोन-विशिष्ट फेनोटाइप की पुष्टि करती है। डिग्रॉन अनुक्रम के अलावा, सब्सट्रेट के लिए यूबिकिटिन अंश के जुड़ाव के लिए निकट क्षेत्र में एक लाइसिन अवशेष महत्वपूर्ण है। BgaA में, डिग्रॉन अनुक्रम BgaA-T की तुलना में दो समीपस्थ काफी कम K48 सर्वव्यापकता के साथ होता है (चित्र 2D)। विशेष रूप से, सर्वव्यापकता को प्रभावित करने के लिए BgaA-TΔDegron प्रोटीन में गंभीर गठनात्मक परिवर्तन की संभावना को सिलिको भविष्यवाणी और शुद्ध BgaA-TΔDegron प्रोटीन की सर्कुलर डाइक्रोइज़म (सीडी) स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा शून्य कर दिया गया था, जिसने BgaA-T के समान संरचनात्मक हस्ताक्षर दिखाए थे (चित्र। S3, सी और डी)। BgaA की तरह, PspA में डीग्रोन अनुक्रम (327PETPAPE333) विलोपन और लाइसिन उत्परिवर्तन (K315R) के कारण भी K48-Ub एसोसिएशन में काफी कमी आई, साथ ही लंबे समय तक जीवित रहने की क्षमता (चित्र S4, A से D) भी हुई।

इसके बाद हमने SPN सतह प्रोटीन HysA को इंजीनियर किया, जिसमें मूल रूप से एक प्राथमिक डिग्रॉन अनुक्रम की कमी थी, प्रोटीन के संरचनात्मक रूप से अव्यवस्थित क्षेत्र के भीतर एक डिग्रॉन अनुक्रम को जोड़कर जिसमें लाइसिन अवशेष (छवि 2, एफ और जी, और अंजीर। एस 2, सी) शामिल हैं। पैर की अंगुली)। इस संशोधन ने पहले से गैर-सर्वव्यापी HysA प्रोटीन की मान्यता और K48 सर्वव्यापकता प्रदान की। इंजीनियर्ड HysA प्रोटीन (ΔbgaA:pHysADegron-BgaA और ΔpspA:pHysADegron-PspA) ले जाने वाले SPN उपभेदों के K48-Ub एसोसिएशन स्तर की तुलना में 2.{7}} और 3.{9}}गुना अधिक थे। या तो ΔbgaA और ΔbgaA: क्रमशः pHysA या ΔpspA उपभेद (चित्र 2H)।

ΔbgaA:pHysADegron-BgaA और ΔpspA:pHysADegron-PspA उपभेदों की K48-Ub के साथ बढ़ी हुई सजावट ने SPN को ΔbgaA और ΔbgaA: pHysA या ΔpspA (छवि 2I) में डिग्रोन की अनुपस्थिति द्वारा प्रदान किए गए उत्तरजीविता लाभ को छीन लिया। सभी इंजीनियर एसपीएन उपभेदों ने छिद्र बनाने वाले विष न्यूमोलिसिन (प्लाई) (छवि 2, बी और जी) के समान स्तर का उत्पादन किया, जो एंडोमेम्ब्रेन क्षति और बाद में सर्वव्यापीकरण (25) के लिए एक शर्त है। यह उत्परिवर्ती एसपीएन उपभेदों में सर्वव्यापी स्तर के एक उल्लेखनीय परिवर्तन को बढ़ावा देने वाले कम या व्यापक झिल्ली क्षति के संभावित योगदान को समाप्त कर देता है। सामूहिक रूप से, ये सुझाव देते हैं कि डिग्रॉन अनुक्रम का कृत्रिम जोड़ सर्वव्यापी-मध्यस्थता का पता लगाने और रोगजनकों के उन्मूलन को बढ़ावा देता है। विशेष रूप से, BgaA में डिग्रॉन अनुक्रम विभिन्न न्यूमोकोकल सीरोटाइप (चित्र। S5A) में अत्यधिक संरक्षित था।

हालाँकि, सीरोटाइप 19एफ में जो अक्सर बैक्टेरेमिक निमोनिया और सेप्सिस (29-31) से मृत्यु के बढ़ते जोखिम से जुड़ा होता है, प्राथमिक डिग्रोन को उत्परिवर्तित (पी104क्यू) पाया गया। हमने देखा कि BgaA (चित्र S5B) में इस उत्परिवर्तन की नकल करने से ΔbgaA:pBgaA-T (चित्र S5, C और D) की तुलना में ΔbgaA:pBgaA-TP104Q में खराब सर्वव्यापकता और जीवित रहने की क्षमता में सुधार हुआ। यह मेजबान द्वारा खुद को गंभीर जीवाणु संक्रमण से बचाने के लिए उपयोग की जाने वाली रणनीति के रूप में डीग्रोन पहचान पर प्रकाश डालता है।

SCFFBW7 एक रोगाणुरोधी E3 यूबिकिटिन लिगेज है

चयनित यूबिकिटिन सब्सट्रेट्स में मौजूद विहित डिग्रॉन अनुक्रम को SCFFBW7 E3 यूबिकिटिन लिगेज कॉम्प्लेक्स (24) द्वारा पहचाने जाने की भविष्यवाणी की गई है, जो कोशिका चक्र और विकास (32) के नियमन में शामिल है। यह दो संरक्षित प्रोटीन, एस-फेज किनेज़-एसोसिएटेड प्रोटीन 1 (एसकेपी1) और कलिन प्रोटीन परिवार के एक सदस्य के साथ-साथ एक चर एफ-बॉक्स प्रोटीन से बना है जो सब्सट्रेट विशिष्टता (33) प्रदान करता है। एसपीएन सर्वव्यापीकरण में एससीएफएफबीडब्ल्यू7 की भागीदारी को सत्यापित करने के लिए, हमने पहले एसपीएन के साथ एफबीएक्सडब्ल्यू7 के जुड़ाव का आकलन किया। हमने इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण (छवि 3 ए और छवि एस 6 ए) पर ~ 31 प्रतिशत इंट्रासेल्युलर एसपीएन को एफबीएक्सडब्ल्यू 7 से जुड़ा हुआ पाया। अपेक्षित रूप से, FBXW7-सकारात्मक SPN भी K48 ubiquitin (चित्र S6B) के साथ सहस्थानीकृत है। SCFFBW7 की भागीदारी को साबित करने के लिए, लक्षित छोटे हस्तक्षेप करने वाले RNAs (siRNAs; अंजीर) का उपयोग करके Cullin1, SKP1, और FBXW7 जीन की अभिव्यक्ति के डाउन-रेगुलेशन के बाद, K 48-Ub श्रृंखलाओं के साथ बैक्टीरिया की लेबलिंग की इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा जांच की गई। एस7, ए से सी)।

विशेष रूप से, FBXW7 साइलेंसिंग को siFBXW उपचारित कोशिकाओं (चित्र S7F) में साइक्लिन E1 संचय स्तर द्वारा मान्य किया गया था। हमने Culin1, SKP1, और FBXW7 नॉकडाउन सेल (छवि 3B) में K 48-Ub के साथ SPN एसोसिएशन में ~ 45 से 60 प्रतिशत की कमी देखी, जिसके परिणामस्वरूप ~ 1 हो गया। 1.75-मेजबान कोशिकाओं के भीतर एसपीएन दृढ़ता में गुना वृद्धि (चित्र 3ई)। SCFFBW7 द्वारा डिग्रोन मोटिफ का विशिष्ट लक्ष्यीकरण siFBXW उपचारित कोशिकाओं में K48-Ub कोलोकलाइज़ेशन और ΔpspAΔbgaA और ΔbgaA:pBgaA-TΔDegron उपभेदों में अपरिवर्तित अंतर से सिद्ध हुआ (चित्र S8, A से) डी)। इन निष्कर्षों की पुष्टि FBXW7 (चित्र 3C) के नष्ट होने के बाद मेजबान कोशिकाओं में BgaA-T के K48 सर्वव्यापकता में उल्लेखनीय कमी से हुई।

इसके अलावा, इन विट्रो में, शुद्ध BgaA-T (अंजीर S9, A से D) और SCF जटिल घटकों के साथ सर्वव्यापीकरण स्पष्ट रूप से SCFFBW7 को BgaA के सर्वव्यापीकरण के लिए जिम्मेदार E3 लिगेज के रूप में दर्शाता है। पुनः संयोजक SCFFBW7 शुद्ध BgaA-T को सर्वव्यापी बनाने में सक्षम था, लेकिन डिग्रोन-हटाए गए वैरिएंट BgaA-TΔDegron या लाइसिन-टू-आर्जिनिन प्रतिस्थापन वैरिएंट BgaA-TK97R (छवि 3D) को सर्वव्यापी करने में विफल रहा। इसके अलावा, FBXW7R505C वैरिएंट को व्यक्त करने वाली मेजबान कोशिकाएं, जो साइक्लिन E1 (FBXW7 का एक सब्सट्रेट) (अंजीर S7E) के लिए खराब पहचान क्षमता प्रदर्शित करती हैं, ने SPN की K48 सर्वव्यापकता को कम (~50 प्रतिशत) दिखाया, साथ ही ~2-गुना डब्ल्यूटी कोशिकाओं की तुलना में एसपीएन की उच्च उत्तरजीविता (चित्र 3, एफ और जी)। ये प्रयोग साइटोसोल में रहने वाले रोगजनकों का पता लगाने और उन्हें मारने के रास्ते को लक्षित करने में SCFFBW7 E3 लिगेज की महत्वपूर्ण भूमिका साबित करते हैं।

जीएसके3 -डिग्रोन मोटिफ का मध्यस्थ फॉस्फोराइलेशन SCFFBW7 की रोगाणुरोधी गतिविधि को प्रबल करता है

सामान्य तौर पर, एफ-बॉक्स प्रोटीन अपने सर्वव्यापीकरण को बढ़ावा देने के लिए फॉस्फोराइलेटेड सब्सट्रेट्स को पहचानते हैं (34)। इसलिए, हमने रोगज़नक़ के K 48-Ub कोटिंग पर जीवाणु सब्सट्रेट के फॉस्फोराइलेशन की संभावना और प्रभाव की जांच की। जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण से BgaA में डिग्रॉन अनुक्रम के भीतर एक अनुमानित फॉस्फोराइलेबल थ्रेओनीन अवशेष (102VT*PKEE107) की उपस्थिति का पता चला। हमने देखा कि एसपीएन स्ट्रेन में BgaA-TT103A उत्परिवर्तन (ΔbgaA:pBgaA-TT103A) (चित्र 4A) है, जो WT (चित्र 4B) की तुलना में K 48-Ub के साथ 71 प्रतिशत कम कोलोकलाइज़ेशन दिखाता है, जिससे इसकी प्रासंगिकता का पता चलता है। एससीएफ कॉम्प्लेक्स द्वारा सब्सट्रेट पहचान में फॉस्फोराइलेशन।

गंभीर रूप से, ΔbgaA:pBgaA-TT103A में BgaA फॉस्फोराइलेशन की घटी हुई प्रवृत्ति ने मेजबान की इंट्रासेल्युलर बैक्टीरियल लोड (~1.8-गुना) को खत्म करने की क्षमता को निरस्त कर दिया (चित्र 4C)। BgaA के समानांतर, एक PspA डिग्रोन वेरिएंट (ΔpspA:pPspAT329A) ने भी K 48-Ub कोलोकलाइज़ेशन में 51 प्रतिशत की गिरावट देखी जो लंबे समय तक इंट्रासेल्युलर दृढ़ता (चित्र S10, A से C) से जुड़ा था। सामान्य तौर पर, SCFFBW7 लक्ष्य सब्सट्रेट में प्रोलाइन अवशेष के बगल में थ्रेओनीन/सेरीन (टी/एस*) होता है, जो प्रोलाइन-निर्देशित प्रोटीन काइनेज, जीएसके3 (35-37) द्वारा फॉस्फोराइलेट किया जाता है। इसलिए, हमने सब्सट्रेट पहचान को बढ़ाने में जीएसके3 की भागीदारी को उजागर करने का प्रयास किया।

हमने पहली बार प्रदर्शित किया कि जीएसके3 सर्वव्यापी एसपीएन के साथ निकटता से जुड़ा हुआ है, जिसे एफबीएक्सडब्ल्यू7 (चित्र 4, डी और ई) के साथ चिह्नित किया गया है। इसके बाद, इन विट्रो किनेसे परख करके, हमने देखा कि जीएसके3 पुनः संयोजक BgaA-T को फॉस्फोराइलेट कर सकता है। उसी समय, BgaA-TT103A वैरिएंट नॉनफॉस्फोराइलेटेड रहा (चित्र 4F)। इसने जीएसके3 -मध्यस्थ फास्फारिलीकरण के लक्ष्य के रूप में BgaA-T के डिग्रोन अनुक्रम के भीतर थ्रेओनीन अवशेषों की पहचान को मान्य किया। siRNA (चित्र S7D) द्वारा GSK3 के लक्षित नॉकडाउन के कारण SPN के K48 सर्वव्यापीकरण में ~58 प्रतिशत की कमी आई (चित्र 4G)। जीएसके3 अभिव्यक्ति के डाउन-रेगुलेशन के बाद, इससे सर्वव्यापकता कम हो गई, जिसके परिणामस्वरूप मेजबान की कोशिका-आक्रमित रोगज़नक़ों को साफ़ करने की क्षमता कम हो गई (~1.5-गुना) (चित्र 4H) लेकिन ΔbgaA पर कोई प्रभाव नहीं दिखा। : pBgaA-TT103A (चित्र S8, E, और F)। सामूहिक रूप से, यह मेजबान काइनेज का पहला साक्ष्य प्रदान करता है, विशेष रूप से जीएसके3, जो रोगज़नक़ों की कुशल निकासी के लिए जीवाणु सतह प्रोटीन के सर्वव्यापकता को नियंत्रित करता है (चित्र 4आई)।

साइटोसोलिक रोगजनकों का सर्वव्यापीकरण उनके उन्मूलन के लिए अलग-अलग नियति प्रदान करता है। विशेष रूप से, K48 सर्वव्यापीकरण प्रोटीसोम्स (22) की ओर सब्सट्रेट्स के लक्ष्यीकरण को बढ़ावा देता है। इसी तरह, हमारे परिणाम प्रोटीसोमल सबयूनिट, 7 (चित्र। एस11, ए, और सी) के साथ सर्वव्यापी एसपीएन के जुड़ाव का सुझाव देते हैं। इसके अलावा, MG132 उपचार द्वारा प्रोटीसोमल निषेध WT SPN की दृढ़ता में सुधार करता है लेकिन ΔpspAΔbgaA की जीवित रहने की क्षमता में कोई बदलाव नहीं करता है। एसटीएम और ΔrlpA उत्परिवर्ती (चित्र। S11, B, और D) के मामले में समान फेनोटाइप देखे गए।

डिग्रोन द्वारा निर्देशित रोगज़नक़ निगरानी मेजबान को सेप्सिस से बचाती है

फिर हमने संक्रमण के परिणामों पर सेलुलर सर्वव्यापक मशीनरी के माध्यम से एसपीएन मान्यता के प्रभाव को निर्धारित करने की कोशिश की। एसपीएन सेप्सिस (38) के एक स्थापित मॉडल का उपयोग करते हुए, हमने ΔbgaA उत्परिवर्ती की उग्रता की तुलना डब्ल्यूटी एसपीएन के साथ-साथ BgaA-T (ΔbgaA:pBgaA-T) या डिग्रोन अनुक्रम की कमी वाले संस्करण के साथ पूरक उपभेदों से की है। ΔbgaA:pBgaA-TΔDegron). पिछली रिपोर्टों (39) के अनुरूप, bgaA विलोपन तनाव में क्षीण विषाणु दिखाई दिया, जबकि WT, ΔbgaA:pBgaA-T, या ΔbgaA: BgaA-TΔDegron से संक्रमित चूहों ने संक्रमण का शिकार हो गए (चित्र 5ए और चित्र। S12, A से D) . हालाँकि, एसपीएन स्ट्रेन से संक्रमित चूहों के समूह में डीग्रोन अनुक्रम की कमी के कारण मौतों का अनुपात अधिक था, लेकिन ΔbgaA:pBgaA-T-संक्रमित समूह (पी=0.0492, लॉग-रैंक परीक्षण) की तुलना में मृत्यु दर में देरी हुई। (चित्र 5ए)। रक्त में बैक्टीरिया के बोझ की तुलना (चित्र 5बी) और प्लीहा (चित्र 5सी) और संक्रमित चूहों में दिखाई देने वाले रोग के संकेतों का समय (चित्र 5डी) ने ΔbgaA:pBgaATΔडीग्रोन स्ट्रेन में बढ़ती विषाक्तता की प्रवृत्ति की पुष्टि की।

पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एसपीएन सेप्सिस प्लीहा (38) में बैक्टीरिया के भंडार से स्थापित होता है। जबकि परिसंचरण में हमलावर बैक्टीरिया की पहली लहर मेजबान जन्मजात प्रतिरक्षा तंत्र द्वारा तेजी से साफ हो जाती है, एसपीएन का एक अनुपात रक्त में फिर से प्रवेश करने से पहले, स्प्लेनिक मैक्रोफेज के भीतर जीवित रहता है और फैलता है। हमने अनुमान लगाया कि ΔbgaA:pBgaA-TΔDegron से संक्रमित चूहों में गंभीर बीमारी की देरी से शुरुआत, मेजबान सर्वव्यापक मशीनरी द्वारा बैक्टीरिया की कम इंट्रासेल्युलर पहचान के कारण, स्प्लेनिक मैक्रोफेज के भीतर एसपीएन के लंबे समय तक जीवित रहने का परिणाम हो सकता है। इसके समर्थन में, हमने प्रारंभिक निकासी चरण (चित्र 5ई) के बाद, ΔbgaA:pBgaA-T (24 घंटे बनाम 12 घंटे) की तुलना में ΔbgaA:pBgaA TΔDegron स्ट्रेन से संक्रमित चूहों में बैक्टरेरिया की दूसरी लहर की शुरुआत में देरी देखी।

हालाँकि, ग्रहण चरण में, जिसके दौरान रक्त से बैक्टीरिया साफ हो जाते हैं, ΔbgaA: pBgaA-TΔDegron-संक्रमित चूहों में स्प्लेनिक बैक्टीरिया की संख्या लगातार अधिक थी (चित्र 5F)। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि सर्वव्यापी मशीनरी के माध्यम से संक्रमण की इंट्रासेल्युलर पहचान की अनुपस्थिति में स्प्लेनिक मैक्रोफेज के भीतर एसपीएन प्रसार का चरण बढ़ाया जाता है। परिणामस्वरूप, बढ़ी हुई जीवाणु घनत्व प्लीहा में जमा हो सकती है (चित्र 5F), बाद में अधिक संख्या में रक्त में प्रवेश कर सकती है, जो ΔbgaA:pBgaA-TΔDegron-संक्रमित चूहों की विलंबित लेकिन बढ़ी हुई मृत्यु दर के लिए जिम्मेदार हो सकती है। साथ में, ये डेटा दर्शाते हैं कि इंट्रासेल्युलर एसपीएन की पहचान और सर्वव्यापकता सेप्सिस के दौरान रोगजनकों के नियंत्रण में योगदान करती है।

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