तीव्र रीनल इस्केमिया-रीपरफ्यूजन चोट में ग्लूटामाइन हस्तक्षेप के बाद माइक्रोआरएनए अभिव्यक्ति का विश्लेषण

पृष्ठभूमि।इस्केमिया-रीपरफ्यूजनतीक्ष्ण गुर्दे की चोट(आई/आर एकेआई) एक हैगुर्दे की गंभीर बीमारीउच्च मृत्यु दर और रुग्णता के साथ। इस अध्ययन का उद्देश्य यह पता लगाना थाग्लूटामाइन का सुरक्षात्मक तंत्र(जीएलएन) आई/आर एकेआई के विरुद्ध।तरीके. वांई I/R AKI चूहा मॉडल स्थापित किया गया था, और HEगुर्दे के ऊतकों और सीरम क्रिएटिनिन का धुंधला होना(एससीआर) और रक्त यूरिया नाइट्रोजन (बीयूएन) का पता लगाया गया। miRNAs को उच्च थ्रूपुट द्वारा अनुक्रमित किया गया थाचूहे के गुर्दे के ऊतक के नमूने. I/R समूह और I/R + GLN समूह के बीच विभेदित रूप से व्यक्त miRNAs (DEmiRs) की जांच की गई, और DEmiRs के लक्ष्य जीन के लिए संवर्धन विश्लेषण किया गया। इस बीच, मानव एचके -2 कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया गया, और DEmiRs की अभिव्यक्ति को सत्यापित करने के लिए एक I/R मॉडल स्थापित किया गया।परिणाम।I/R समूह की तुलना में, I/R + GLN समूह में प्रत्येक समय बिंदु पर SCr और BUN का स्तर कम था। I/R + GLN समूह में वृक्क नलिकाओं का रिक्तिका अध:पतन काफी कम हो गया था। 104 DEmiRs में, हमने कुंजी miRNAs के रूप में miR-132-5p, miR- 205, और miR-615 का चयन किया। KEGG विश्लेषण से पता चला कि Notch सिग्नलिंग पाथवे, PI3K-Akt सिग्नलिंग पाथवे और cGMP सिग्नलिंग पाथवे मुख्य रूप से I/R के विरुद्ध GLN से संबंधित थे। क्यूआरटी-पीसीआर ने दिखावे और आई/आर जीएलएन समूह की तुलना में आई/आर समूह में एमआईआर -205 के डाउनरेगुलेशन को सत्यापित किया। I/R मॉडल HK-2 कोशिकाओं के साथ स्थापित किया गया था, और miR- 132-5p और miR-205 की अभिव्यक्ति कम कर दी गई थी।

निष्कर्ष।जीएलएन ने I/R-प्रेरित AKI को कम कर दिया। जीएलएन उपचार के बाद I/R में miRNA अभिव्यक्ति के बीच महत्वपूर्ण अंतर थे। I/R-प्रेरित AKI के विरुद्ध GLN की प्रक्रिया Notch और PI3K-Akt सिग्नलिंग मार्ग से संबंधित हो सकती है।

किडनी के लिए 25% इचिनाकोसाइड और 9% एक्टीओसाइड के साथ सिस्टैंच अर्क

1 परिचय

तीक्ष्ण गुर्दे की चोट(AKI) की विशेषता हैतीव्र गुर्दे का कार्यहानि होती है और प्रत्येक वर्ष 13.3 मिलियन लोग प्रभावित होते हैं [1]। विभिन्न कारकों में, वृक्कइस्केमिया-रीपरफ्यूजन चोट(आई/आर) एकेआई के अंतर्निहित कारणों में से एक है और एक अपरिहार्य समस्या हैकिडनी प्रत्यारोपण[2,3]। आई/आर-संबद्ध एकेआई उच्च रुग्णता और मृत्यु दर से जुड़ा है और वर्तमान में इसका कोई प्रभावी उपचार नहीं है [4]।

नैदानिक ​​​​अभ्यास में, AKI नाइट्रोजन चयापचय के अंतिम उत्पादों (यूरिया और क्रिएटिनिन) के संचय और मूत्र उत्पादन में कमी से प्रकट होता है [5]। इसके अलावा, वृक्क ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं और रक्त वाहिकाओं को सहवर्ती क्षति हुई और एक मजबूत सूजन प्रतिक्रिया हुई [6, 7]। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि ग्लूटामाइन, एकेआई के लिए पारंपरिक पोषण चिकित्सा के रूप में इस्तेमाल की जाने वाली दवा, ऑक्सीडेटिव तनाव को कम करके किडनी की रक्षा कर सकती है [8, 9]। कुछ शारीरिक परिस्थितियों में, ग्लूटामाइन का व्यापक रूप से गुर्दे और प्रतिरक्षा प्रणाली के लिए एक प्रमुख चयापचय ईंधन के रूप में उपयोग किया जाता है [10, 11]। हालाँकि, इसके विशिष्ट सुरक्षात्मक तंत्र का अभी भी अध्ययन चल रहा है।

माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए), 21-25 न्यूक्लियोटाइड्स का एक अत्यधिक संरक्षित छोटा अणु, गुर्दे आई/आर और एकेआई [12, 13] से जुड़ा हुआ बताया गया है। miRNAs क्षीण करके वृक्क I/R में एक सुरक्षात्मक भूमिका निभा सकते हैंज्वलनशील उत्तर[14]. यद्यपि वृक्क आईआरआई पर कुछ miRNAs के सुरक्षात्मक प्रभावों की खोज की गई है, लेकिन सुरक्षात्मक तंत्र अस्पष्ट बना हुआ है।

अब तक, इसके तंत्र पर बहुत कम अध्ययन हुए हैंग्लूटामाइन-मध्यस्थता गुर्दे की सुरक्षाmiRNA स्तर पर. इस अध्ययन में, हमने ग्लूटामाइन हस्तक्षेप के बाद गुर्दे I/R में miRNAs की विभेदक अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण तकनीक लागू की। हमने आगे miRNA स्तर पर गुर्दे I/R के विरुद्ध ग्लूटामाइन के सुरक्षात्मक तंत्र का पता लगाया।

2। सामग्री और विधि

2.1. प्रायोगिक पशु.

झिंजियांग मेडिकल यूनिवर्सिटी के पहले संबद्ध अस्पताल के प्रायोगिक पशु केंद्र द्वारा कुल 72 एसपीएफ़ नर स्प्रैग डावले (एसडी) चूहे, जिनका वजन 180-260 ग्राम और उम्र 90-120 दिन थी, उपलब्ध कराए गए थे। चूहों को पानी के सेवन को नियंत्रित किए बिना एक मानकीकृत प्रयोगात्मक दैनिक राशन के साथ स्थिर तापमान वाले वातावरण में रखा गया था। +ey को समान रूप से तीन समूहों में यादृच्छिक किया गया: शम समूह, I/R समूह, और I/R + GLN समूह। +ई प्रायोगिक प्रोटोकॉल को झिंजियांग मेडिकल यूनिवर्सिटी के +ई प्रथम संबद्ध अस्पताल में पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

2.2. पशु मॉडल की स्थापना.

एसडी चूहों को 2% सोडियम पेंटोबार्बिटल (40 मिलीग्राम/किग्रा) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा संवेदनाहारी किया गया था। आई/आर समूह: पेट के मध्य भाग में चीरा लगाया गया और दोनों किडनी को बाहर निकाला गया, दाहिनी किडनी को अलग किया गया और बायीं किडनी की धमनी को दबाया गया। 45 मिनट के बाद, संवहनी क्लैंप हटा दिया गया। +ई गुर्दे का रंग गहरे लाल से चमकीले लाल में बदल गया, जिसका अर्थ है कि किंडर एक आई/आर पैथोफिजियोलॉजिकल प्रक्रिया से गुजरा, पेट की गुहा को बंद करने के बाद चूहों को 2 घंटे तक देखा गया। मॉडलिंग पूरा होने के बाद क्रमशः एनएस और ग्लूटामाइन ({{7%).75 ग्राम/किग्रा) को पुच्छ शिरा से माइक्रोपंप का उपयोग करके 0.5 मिली/मिनट की दर से इंजेक्ट किया गया। शम समूह: दाहिनी किडनी को उसी तरह से काट दिया गया था, और बाईं किडनी के पेडिकल को क्लैंप नहीं किया गया था। मॉडलिंग पूरा होने के बाद 0.5 मिली/मिनट की दर से पुच्छीय शिरा से एक माइक्रोपंप का उपयोग करके सामान्य सेलाइन (एनएस) इंजेक्ट किया गया।

2.3. नमूना संग्रह और परीक्षण.

प्रत्येक समूह से छह चूहों को प्रत्येक समय बिंदु पर यादृच्छिक रूप से चुना गया (मॉडलिंग के बाद 1 घंटे, 5 घंटे, 12 घंटे और 24 घंटे), और फिर, चूहों को संज्ञाहरण के तहत मार दिया गया। +ई उदर महाधमनी को उजागर किया गया, और एक सिरिंज के साथ शिरापरक रक्त एकत्र किया गया। सीरम को नियमित रूप से अलग किया जाता था और रेफ्रिजरेटर में -80 डिग्री पर संग्रहित किया जाता था। +ई किडनी को जल्दी से अलग कर दिया गया, और फिर, द्विपक्षीय किडनी से ऊतक का एक टुकड़ा लिया गया जिसे 10% तटस्थ फॉर्मेल्डिहाइड में रखा गया और रात भर 4 डिग्री पर स्थिर किया गया। बेकमैन स्वचालित बायोकेमिकल विश्लेषक के साथ सीरम क्रिएटिनिन (एससीआर) और रक्त यूरिया नाइट्रोजन (बीयूएन) का परीक्षण किया गया। पैराफिन ब्लॉक को निर्जलीकरण, पारदर्शिता, मोम संसेचन और एम्बेडिंग निर्जलीकरण की प्रक्रिया द्वारा स्थिर किडनी ऊतक से तैयार किया गया था। फिर पैराफिन ब्लॉकों को खंडों में काट दिया गया, और धुंधलापन का प्रदर्शन किया गया।

2.4. उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण विश्लेषण।

आई/आर समूह और आई/आर + जीएलएन समूह से चूहे के गुर्दे के ऊतक के नमूनों का कुल आरएनए निकाला गया और गुणवत्ता का मूल्यांकन किया गया। लघु-आरएनए अनुक्रमण पुस्तकालय निर्माण प्रक्रिया के अनुसार, शुद्ध कुल वृक्क ऊतक आरएनए को सीडीएनए में रिवर्स-ट्रांसक्राइब किया गया था। +एन, अनुक्रमण नमूना लाइब्रेरी के निर्माण को पूरा करने के लिए पीसीआर प्रवर्धन, शुद्धि और सीडीएनए लाइब्रेरी गुणवत्ता का पता लगाया गया। फिर, हमने मूल FASTQ फ़ाइल डेटा प्राप्त किया।

2.5. जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण.

Clean reads were classified and annotated from the FASTQ file. +e Rfam database, species reference transcripts, and repetitive sequence database were used to analyze the known miRNA annotations, miRNA prediction, and miRNA quantification. +e differentially expressed miRNAs (DEmiRs) were analyzed using the DESeq R package with |log2FoldChange|>2 और पी < 0.05. +ई लक्ष्य जीन भविष्यवाणी क्रमशः RAID और miRanda डेटाबेस का उपयोग करके की गई थी। क्लस्टरप्रोफाइलर आर पैकेज का उपयोग करके लक्ष्य जीन के लिए जीन ओन्टोलॉजी (जीओ) और केईजीजी मार्गों का संवर्धन विश्लेषण भी किया गया था। पी <0.05 को महत्वपूर्ण संवर्धन माना गया।

2.6. मात्रात्मक वास्तविक समय पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर)।

से नमूने एकत्र किये गयेचूहे के गुर्दे के ऊतकमॉडलिंग के 24 घंटे बाद. कुल आरएनए निकाला गया, और सभी miRNAs के सीडीएनए उत्पाद miRNA प्रथम स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण किट (शेंगगोंग, शंघाई, चीन) का उपयोग करके प्राप्त किए गए। प्रतिदीप्ति मात्रात्मक पहचान 3 miRNA-विशिष्ट प्राइमरों (तालिका 1) के साथ miRNA प्रतिदीप्ति मात्रात्मक पीसीआर किट (शेंगगोंग, शंघाई, चीन) का उपयोग करके की गई थी। नमूनों के प्रत्येक समूह में लक्ष्य miRNA की सापेक्ष अभिव्यक्ति की गणना करने के लिए +e सापेक्ष मात्रात्मक विश्लेषण विधि (2−ΔΔCt) का उपयोग किया गया था। +e प्रत्येक समूह में miRNA की सापेक्ष अभिव्यक्ति की गणना संदर्भ के रूप में प्रत्येक समूह में प्रत्येक नमूने में U6 की अभिव्यक्ति का उपयोग करके की गई थी।

2.7. सांख्यिकीय विश्लेषण।

डेटा का विश्लेषण SPSS19 द्वारा किया गया। सभी डेटा को माध्य ± मानक विचलन (माध्य ± एसडी) के रूप में व्यक्त किया गया था। समूहों के बीच जोड़ीवार तुलना के लिए +ई टी-परीक्षण का उपयोग किया गया था। पी <{4}}.05 ने संकेत दिया कि अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था।

3। परिणाम

3.1. इस्केमिया-रीपरफ्यूजन के बाद चूहों के गुर्दे के कार्य पर ग्लूटामाइन का प्रभाव।

एससीआर और बीयूएन स्तर की जांच सबसे पहले चूहों के तीन समूहों में की गई (आंकड़े 1(ए) और 1(बी))। +ई एससीआर और बीयूएन 1 से 24 घंटे तक बढ़ते रहे, आई/आर समूह में 24 घंटे के शिखर पर पहुंच गए, जो कि दिखावटी समूह (पी <{6}}) की तुलना में काफी अधिक था।{{11} }5). I/R + GLN समूह में, SCr और BUN का स्तर 1 घंटे से बढ़ाकर 12 घंटे कर दिया गया, लेकिन बढ़ती प्रवृत्ति I/R समूह की तुलना में धीमी थी। प्रत्येक समय बिंदु पर एससीआर और बीयूएन का स्तर आई/आर समूह (पी <0.05) की तुलना में कम था।

3.2. चूहे की किडनी में हिस्टोलॉजिकल परिवर्तन।

दिखावटी समूह में, सर्जरी के 24 घंटों के बाद, सूक्ष्म अवलोकन से पता चला कि कॉर्टेक्स क्षेत्र में कुछ वृक्क नलिकाएं फैली हुई थीं, और कुछ वृक्क नलिका उपकला में एडिमा और वेक्यूलर अध: पतन दिखाई दिया, और ग्लोमेरुली में कोई स्पष्ट असामान्यता नहीं थी (चित्र 2(ए) )). आई/आर समूह में, कॉर्टिकल क्षेत्र और कॉर्टेक्स-मेडुलरी संक्रमणकालीन क्षेत्र में वृक्क नलिकाओं की ब्रश सीमाएं गायब हो गईं, बड़ी संख्या में वृक्क ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं में एडिमा और वेक्यूलर अध: पतन दिखाई दिया, जबकि उनमें से कुछ में कैरियोपाइकनोसिस, साइटोप्लाज्म लाल दाग, जमावट परिगलन, विच्छेदन, और कास्ट गठन

चित्र 1: प्रत्येक समूह में अलग-अलग समय बिंदुओं पर चूहों के स्क्र (ए) और बीयूएन (बी) स्तरों में परिवर्तन। ∗P < 0.05 दिखावटी समूह के साथ तुलना में; #P <0.05 I/R समूह की तुलना में

चित्र 2: एचई स्टेनिंग द्वारा चूहे की किडनी के हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तनों का पता लगाया गया। (ए) शाम समूह, (बी) आई/आर समूह, और (सी) आई/आर + जीएलएन समूह। बार: 200×.

(चित्र 2(बी)). इंटरस्टिटियम में सूजन का कोई संकेत नहीं था, और ग्लोमेरुली में कोई स्पष्ट असामान्यता नहीं देखी गई थी। आई/आर + जीएलएन समूह में, माइक्रोस्कोप के तहत ग्लोमेरुलस संरचना सामान्य थी, कुछ ट्यूबलर उपकला कोशिकाएं सूजी हुई थीं और गुब्बारा अध: पतन दिखा रहा था, कुछ ट्यूबलर उपकला कोशिकाएं अनुपस्थित थीं, कुछ नलिकाएं फैली हुई थीं, और थोड़ी मात्रा में प्रोटीन कास्ट पाया गया था (चित्र 2(सी)).

3.3. विभेदित रूप से व्यक्त miRNAs की पहचान।

I/R समूह और I/R + GLN समूह से अलग-अलग व्यक्त miRNAs पर सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया था। I/R + GLN समूह की तुलना में, I/R समूह में कुल 104 उल्लेखनीय रूप से भिन्न रूप से व्यक्त miRNAs की जांच की गई (चित्र 3(a))। उनमें से, 76 ने अपग्रेडित miRNA व्यक्त किया, और 28 ने डाउनरेगुलेटेड miRNA व्यक्त किया (चित्र 3(बी))। इसके अलावा, RAID और मिरांडा का उपयोग महत्वपूर्ण रूप से भिन्न रूप से व्यक्त miRNAs के लिए लक्ष्य जीन भविष्यवाणी करने के लिए किया गया था। हमें 436 प्रतिच्छेदन लक्ष्य जीन मिले (चित्र 3(सी))। +एन, हमने miRNA लक्ष्य जीन के नियामक नेटवर्क का निर्माण किया (चित्र S1)। महत्वपूर्ण बात यह है कि, हमने आगे के अध्ययन के लिए प्रमुख miRNAs के रूप में I/R समूह में डाउनरेगुलेटेड miR {{11} इसके अलावा, इन तीन miRNAs के लिए 65 लक्ष्य जीन थे (चित्र 3(डी))। वृक्क ऊतक में क्यूआरटी-पीसीआर का पता लगाने के परिणामों के अनुसार, आई/आर समूह में एमआईआर -132-5पी, एमआईआर-205, और एमआईआर{19}} के अभिव्यक्ति स्तर में कमी आई थी (चित्र 4) ).

3.4. लक्ष्य जीन के जैविक कार्य.

जीएलएन के चिकित्सीय प्रभावों के अंतर्निहित आणविक तंत्र की पहचान करने के लिए, हमने लक्ष्य जीन के लिए एक संवर्धन विश्लेषण किया। जीओ (चित्रा 5 (ए)) के परिणामों में, इंट्रासेल्युलर सिग्नल ट्रांसडक्शन, स्टेम सेल प्रसार का विनियमन, और जैविक प्रक्रियाओं (बीपी) के हाइपोक्सिया के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया को लक्ष्य जीन द्वारा समृद्ध किया गया था। इसके अलावा, नॉच सिग्नलिंग पाथवे, पीआई3के-एक्ट सिग्नलिंग पाथवे और केईजीजी पाथवे के सीजीएमपी पीकेजी सिग्नलिंग पाथवे को काफी समृद्ध किया गया था (चित्र 5(बी))। दिलचस्प बात यह है कि rno-miR-132-5p Mylk को लक्ष्य करके cGMP-PKG मार्ग में भाग लेता है।

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