पूर्वकाल बेसोलेटरल एमिग्डाला न्यूरॉन्स एक रिमोट फियर मेमोरी एंग्राम भाग 1 का निर्माण करते हैं
Dec 22, 2023
परिचय:
खतरनाक पर्यावरणीय संकेत अक्सर स्थायी भय की यादें उत्पन्न करते हैं, लेकिन ये कैसे बनते और संग्रहीत होते हैं, इसकी सक्रिय रूप से जांच की जाती है।
डर की स्मृति हमारे मस्तिष्क में स्मृति का एक रूप है। यह स्मृति का एक बहुत ही विशेष रूप है जो अक्सर हमें डरा हुआ, भयभीत और घबराया हुआ महसूस कराता है। लेकिन डर की इस याद और हमारी याददाश्त के बीच का रिश्ता बहुत जटिल है।
सबसे पहले, डर की यादों का हमारी अल्पकालिक स्मृति से कोई लेना-देना नहीं है। अधिकांश डर की यादें हमारे दीर्घकालिक मेमोरी बैंकों में संग्रहीत होती हैं। यही कारण है कि कभी-कभी हमारे दिमाग में बहुत पहले की यादें तैरती रहती हैं।
दूसरा, डर की यादें जरूरी नहीं कि हमारी याददाश्त को प्रभावित करें। हालाँकि यह हमारे ध्यान और मनोदशा में बदलाव का कारण बन सकता है, लेकिन इसका कोई सबूत नहीं है कि यह स्मृति हानि का कारण बनता है। कई लोग कुछ भयानक चीज़ों का अनुभव करने के बाद भी बहुत मजबूत यादें प्रदर्शित कर सकते हैं।
अंततः, हमें डरावनी यादों को अपने जीवन का विषय नहीं बनने देना चाहिए। हमें इन यादों को संजोने और अधिक सकारात्मक दिशा में आगे बढ़ने के लिए सकारात्मक कार्रवाई करनी चाहिए। इसमें थेरेपी लेना, सामाजिक रूप से सक्रिय रहना, अपने शरीर और मस्तिष्क का व्यायाम करना और सकारात्मक मानसिकता और मानसिक स्वास्थ्य बनाए रखना शामिल है।
इसलिए, हालाँकि भयावह यादें हमें बहुत तनाव और परेशानी का कारण बन सकती हैं, हमें अपनी क्षमताओं और प्रयासों पर विश्वास रखना चाहिए। हम इन भयावह यादों का सामना कर सकते हैं, अपनी याददाश्त को मजबूत कर सकते हैं, विकसित हो सकते हैं और बेहतर, अधिक आत्मविश्वासी व्यक्ति बन सकते हैं। यह देखा जा सकता है कि हमें अपनी याददाश्त में सुधार करने की जरूरत है। सिस्टैंच डेजर्टिकोला याददाश्त में काफी सुधार कर सकता है क्योंकि सिस्टैन्चे डेजर्टिकोला एक पारंपरिक चीनी औषधीय सामग्री है जिसके कई अनूठे प्रभाव हैं, जिनमें से एक है याददाश्त में सुधार करना। कीमा बनाया हुआ मांस की प्रभावकारिता इसमें मौजूद विभिन्न सक्रिय तत्वों से आती है, जिनमें एसिड, पॉलीसेकेराइड, फ्लेवोनोइड आदि शामिल हैं। ये तत्व विभिन्न तरीकों से मस्तिष्क स्वास्थ्य को बढ़ावा दे सकते हैं।
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ऐसा माना जाता है कि हाल की भय स्मृति की याद स्मृति निर्माण के दौरान सक्रिय मस्तिष्क के कई क्षेत्रों में न्यूरॉन्स के पुनर्सक्रियन को दर्शाती है, जो दर्शाता है कि शारीरिक रूप से वितरित और परस्पर जुड़े न्यूरोनल समूह में भय स्मृति एनग्राम शामिल हैं।
हालाँकि, दीर्घकालिक भय स्मृति स्मरण के दौरान शारीरिक रूप से विशिष्ट सक्रियण पुनर्सक्रियन एनग्राम किस हद तक बने रहते हैं, यह काफी हद तक अज्ञात रहता है। हमने परिकल्पना की है कि पूर्वकाल बेसोलेटरल एमिग्डाला (बीएलए) में प्रमुख न्यूरॉन्स, जो नकारात्मक वैलेंस को एन्कोड करते हैं, डर व्यवहार को चलाने के लिए दूरस्थ भय मेमोरी रिकॉल के दौरान तीव्र रूप से सक्रिय होते हैं।
तरीके:
TRAP2 और Ai14 चूहों की वयस्क संतानों का उपयोग करते हुए, लगातार tdTomatoexpression का उपयोग aBLA न्यूरॉन्स को "TRAP" करने के लिए किया गया था, जो प्रासंगिक भय कंडीशनिंग (बिजली के झटके) या संदर्भ-केवल कंडीशनिंग (कोई झटका नहीं) (n=5 / समूह) के दौरान Fos-सक्रियण से गुजरते थे। . तीन सप्ताह बाद, चूहों को दूरस्थ मेमोरी रिकॉल के लिए उसी संदर्भ संकेतों के सामने फिर से रखा गया और फिर फॉसिममुनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए बलिदान दिया गया।
परिणाम:
TRAPed (tdTomato +), Fos +, और पुनः सक्रिय (डबल-लेबल) न्यूरोनल समूह संदर्भ-वातानुकूलित चूहों की तुलना में डर में बड़े थे, aBLA के मध्य उप-क्षेत्र और मध्य / पुच्छ डोरसोमेडियल क्वाड्रंट सभी तीन समूह आबादी की सबसे बड़ी घनत्व प्रदर्शित करते थे।
जबकि टमाटर + समूह संदर्भ और भय समूहों में प्रमुख रूप से ग्लूटामेटेरिक थे, रिमोट मेमोरी रिकॉल के दौरान फ्रीजिंग व्यवहार किसी भी समूह में समूह के आकार के साथ सहसंबद्ध नहीं था।
बहस:
हम यह निष्कर्ष निकालते हैं कि यद्यपि एबीएलए-समावेशी भय मेमोरीएंग्राम बनता है और एक दूरस्थ समय बिंदु पर बना रहता है, लेकिन एनग्राम न्यूरॉन्स की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करने वाली प्लास्टिसिटी, न कि उनकी जनसंख्या का आकार, भय स्मृति को एनकोड करती है और दीर्घकालिक भय स्मृति रिकॉल की व्यवहारिक अभिव्यक्तियों को संचालित करती है।
परिचय
डर पैदा करने वाली उत्तेजनाएं अक्सर मजबूत और स्थायी साहचर्य यादें बनाती हैं जो पर्यावरणीय संकेतों को खतरनाक जीवन की घटनाओं से जोड़ती हैं।
समान रूप से कथित खतरों के साथ बाद की मुठभेड़ों के परिणामस्वरूप अधिक मजबूत सुरक्षात्मक व्यवहार होते हैं, जो भय-स्मृति स्मरण को दर्शाते हैं। डर-एसोसिएशन प्रसंस्करण में त्रुटियां चिंता और पोस्ट-ट्रॉमेटिक स्ट्रेस डिसऑर्डर (पीटीएसडी) (टोवोट एट अल।, 2015) सहित नकारात्मक-वैलेंस मनोरोग परिणाम उत्पन्न कर सकती हैं।
डर की स्मृति में अंतर्निहित तंत्र की पूरी जटिलता को समझना कार्यात्मक सर्किट असामान्यताओं की पहचान करने के लिए आवश्यक है जो डर से संबंधित मानसिक रोगों को बढ़ावा देते हैं और सामान्य डर प्रसंस्करण को बहाल करने के लिए नए चिकित्सीय लक्ष्य सुझाते हैं।
पिछले कई दशकों में, भय स्मृति अनुसंधान ने बड़े पैमाने पर अल्पकालिक स्मृति निर्माण, भंडारण और स्मरण पर ध्यान केंद्रित किया है (किमंद जंग, 2006; किम और चो, 2020; ली एट अल।, 2021)।
अध्ययनों ने व्यापक रूप से वितरित इंटरकनेक्टेड सीएनएस न्यूरोनलेंसेबल्स को भय-स्मृति निर्माण और भंडारण के लिए जिम्मेदार माना है (रामिरेज़ एट अल., 2013; लियू एट अल., 2014; रॉय एट अल., 2022)। कथित खतरों द्वारा इन समूहों के सक्रिय होने से शक्तिशाली सिनैप्टिक ट्रांसमिशन होता है जो एक स्थायी भौतिक छाप का प्रतिनिधित्व करता है जिसे एमेमोरी एनग्राम (युआन एट अल।, 2011; मियावाकी और मिज़ुसेकी, 2022) के रूप में जाना जाता है।
ऐसा माना जाता है कि अल्पकालिक मेमोरी रिकॉल उन्हीं न्यूरोनल एनसेंबल के पुनर्सक्रियन को दर्शाता है जो मूल रूप से मेमोरी निर्माण के दौरान सक्रिय हुए थे, साक्ष्य से संकेत मिलता है कि एकल न्यूरोनल एसेम्बल का आंशिक सक्रियण भी भय-संबंधी व्यवहार पैदा कर सकता है, जो मेमोरी रिकॉल का संकेत है (रॉय एट अल।, 2022) ). जबकि शारीरिक रूप से स्थिर शक्तिशाली सर्किट एनग्राम अल्पकालिक भय स्मृति की व्याख्या कर सकते हैं, वे दीर्घकालिक भय स्मृति में किस हद तक भाग लेते हैं यह स्पष्ट नहीं है।
हालाँकि ऐसा माना जाता है कि दीर्घकालिक भय स्मृति समेकन अल्पकालिक स्मृति के प्रगतिशील या छिटपुट सुदृढीकरण पर निर्भर करता है, कई हालिया अध्ययनों से पता चलता है कि अल्पकालिक भय स्मृति न्यूरोनल समूह समय-निर्भर पुनर्गठन से गुजरते हैं, जिसके परिणामस्वरूप संग्रहीत स्मृति एक अलग न्यूरोनल समूह में स्थानांतरित हो जाती है। एक ही मस्तिष्क क्षेत्र (डेनार्डो एट अल., 2019) या पूरी तरह से अलग मस्तिष्क क्षेत्र (फ्रैंकलैंड और बोंटेम्पी, 2005; डू मोंटे एट अल., 2016)।
बेसोलैटरल अमिगडाला (बीएलए) एक मस्तिष्क क्षेत्र है जो डर की याददाश्त का अभिन्न अंग है और इसे हालिया और दूरस्थ डर मेमोरी रिकॉल (मारेन एट अल।, 1996; गेल एट अल।, 2004; कितामुरा एट अल।, 2017; लियू एट अल) दोनों में शामिल किया गया है। ., 2022).
विशेष रूप से, रिपोर्टों ने बीएलए में एक विशिष्ट अल्पकालिक भय-स्मृति एनग्राम का वर्णन किया है जो (1) स्मृति निर्माण के दौरान सक्रिय होता है, (2) स्मृति स्मरण के दौरान पुनः सक्रिय होता है, और (3) गैर-भय संदर्भों में भय जैसे व्यवहार को चलाने में सक्षम होता है ( रोयेट अल., 2022; जकी एट अल., 2022)। हालाँकि, मेमोरी निर्माण के दौरान सक्रिय aBLA न्यूरोनल एन्सेम्बल को रिमोट मेमोरी रिकॉल के दौरान किस हद तक पुनः सक्रिय किया जाता है, यह अनिश्चित रहता है।
इस अध्ययन में, हमने इस परिकल्पना का परीक्षण किया कि भय कंडीशनिंग के 3 सप्ताह बाद एक दूरस्थ समय बिंदु पर बीएलएफियर मेमोरी एन्सेम्बल का पुनर्सक्रियन देखा जाता है। विशेष महत्व का, बीएलए हाउससर्किट प्रतिकूल और इनाम-चाहने वाले व्यवहार (हू, 2016) दोनों में योगदान देता है, नकारात्मक-वैलेंस न्यूरॉन्स भय उत्तेजनाओं के प्रति उत्तरदायी होते हैं जो विशेष रूप से पूर्वकाल बीएलए (एबीएलए) (गूसेंसैंड मैरेन, 2001; किम एट अल) में स्थानीयकृत होते हैं। 2016, 2017; झांग एट अल., 2020)।
ABLA पर ध्यान केंद्रित करते हुए, हमने सक्रिय आबादी (TRAP2) ट्रांसजेनिक चूहों (DeNardo et al., 2019) में दूसरी पीढ़ी के TargetedRecombination को नियोजित किया, जिसमें Cre-recombinase गतिविधि एक बेहतर Cre के माध्यम से तत्काल प्रारंभिक जीन प्रमोटर बढ़ाने वाले तत्वों c-fos से जुड़ी हुई है। -एस्ट्रोजन रिसेप्टर (ईआर) कॉम्प्लेक्स। इस कॉम्प्लेक्स को व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स लगातार Cre पुनर्संयोजन से गुजर सकते हैं, यानी, ER एगोनिस्टटामॉक्सिफ़ेन या इसके छोटे-अभिनय एनालॉग 4-हाइड्रॉक्सीटामॉक्सिफ़ेन (4-OHT) के प्रशासन द्वारा "ट्रैप्ड" किया जा सकता है, जिससे Cre की लगातार अभिव्यक्ति की अनुमति मिलती है। -निर्भर प्रभावकारक या रिपोर्टर अणु।
यहां, हमने TRAP2 चूहों और Cre-निर्भर tdTomato रिपोर्टर लाइन Ai14 (Madisen et al., 2010) को पार किया और उस हद तक मात्रा निर्धारित की, जिस हद तक प्रासंगिक भय कंडीशनिंग के दौरान TRAPed aBLA न्यूरॉन्स (tdTomatopositive) को दूरस्थ मेमोरी रिकॉल के दौरान पुनः सक्रिय किया जाता है (एक्सप्रेस Fos इम्यूनोरिएक्टिव प्रोटीन)। 3 सप्ताह बाद.
अल्पकालिक भय स्मृति की तरह, हमारे निष्कर्ष एबीएलए में दीर्घकालिक ग्लूटामेटेरिक भय स्मृतिन्यूरोनल संयोजन की उपस्थिति का समर्थन करते हैं।
विशेष रूप से, हालांकि, एबीएलए न्यूरोनल एन्सेम्बल का आकार, चाहे कंडीशनिंग या रिमोट मेमोरी रिकॉल या दोनों के दौरान सक्रिय हो, भय व्यवहार से संबंधित नहीं था, यह दर्शाता है कि डर सीखने से जुड़ी प्लास्टिसिटी की प्रकृति और रिमोट डर मेमोरी रिकॉल पर इसके अंतिम प्रभाव, एन्सेम्बल न्यूरॉन्स की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रतिक्रियाएं , न कि समूह की आबादी का आकार, मुख्य रूप से दूरस्थ भय स्मृति व्यवहार को प्रेरित करता है।
सामग्री और तरीके
नैतिक स्वीकृति
प्रायोगिक प्रक्रियाओं को टेक्सास स्वास्थ्य सैन एंटोनियो विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद गाइड के अनुरूप बनाया गया था।
जानवरों
समयुग्मजी Fos2A−iCreER/2A−iCreER नॉकिन (TRAP2, #030323) और R26Ai14/+ (Ai14, #007914) चूहों (जैक्सन लेबोरेटरीज) के प्रजनन जोड़े को नर हेमिज़िगसTRAP2:Ai14 संतान पैदा करने के लिए पार किया गया (चित्र 1A)। दूध छुड़ाने के बाद, चूहों को समूहीकृत किया गया और उन्हें प्लास्टिक के पिंजरों (29 × 18 × 13 सेमी) में रखा गया, जिसमें कृंतक बिस्तर (सानी-चिप्स; हार्लन टेक्लाड, मैडिसन, WI, यूएसए) थे। मछली पालने का बाड़ा 14 के साथ तापमान-नियंत्रित (24◦C) था। :10 प्रकाश-अंधेरा चक्र (0600 बजे रोशनी चालू)। भोजन और पानी बिना तैयारी के उपलब्ध थे। जब चूहे 3 महीने के हो गए तो प्रयोग शुरू किए गए।
व्यवहारिक आदत
जैसा कि पहले प्रकाशित अध्ययनों (डेनार्डो एट अल।, 2019) में हुआ था, चूहों को प्रासंगिक डर कंडीशनिंग से ठीक पहले लगातार पांच दिनों के आदतन प्रशिक्षण से गुजरना पड़ा ताकि प्रयोगात्मक स्थितियों के जवाब में सीएफओ प्रेरण को कम किया जा सके (उदाहरण के लिए, हैंडलिंग, उपन्यास संदर्भ अन्वेषण इत्यादि) ( चित्र 1बी)।
प्रत्येक दैनिक अभ्यस्त सत्र 3 मिनट तक चलता है और इसमें कंडीशनिंग चैंबर (हैबिटेस्ट मॉड्यूलर सिस्टम, कूलबोर्न इंस्ट्रूमेंट्स) का प्रदर्शन शामिल होता है। चैंबर संवेदी संकेतों में (1) 70% इथेनॉल (घ्राण संकेत), (2) धातु ग्रिड फर्श (हैप्टिक क्यू), (3) पैटर्न वाली पृष्ठभूमि (दृश्य संकेत), और (4) दृश्य प्रकाश (दृश्य संकेत) शामिल हैं।
इसके अतिरिक्त, कंडीशनिंग कक्ष में रखे जाने से पहले सभी चूहों को एक मिनट के लिए हाथ से पकड़ा गया था और कक्ष से बाहर निकलने पर 10 सेकंड के लिए धीरे से "झुकाव" किया गया था। आदतन सत्रों को उस हैंडलिंग की नकल करने के लिए डिज़ाइन किया गया था जो चूहों को कंडीशनिंग के दिन अनुभव होगा, सिवाय इसके कि कोई इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन नहीं लगाया गया था।
प्रासंगिक भय कंडीशनिंग
इसके बाद चूहों को बेतरतीब ढंग से भय-वातानुकूलित (सदमे) और संदर्भ-वातानुकूलित (केवल-सदमे/संदर्भ-केवल) समूहों को सौंपा गया। कंडीशनिंग दिन 0 पर शुरू हुई और इसमें चूहों को कंडीशनिंग कक्ष में रखा गया और 2 के लिए अन्वेषण करने की अनुमति दी गई। मि. अगले 4 मिनट में, डर से ग्रस्त चूहों को 1 सेकंड की अवधि और 75 mA तीव्रता के पांच फुट के झटकों की एक श्रृंखला मिली।
चूहों को अप्रत्याशित अंतराल पर झटके दिए गए, फिर भी चूहों के बीच झटके लगातार दिए गए। संदर्भ-वातानुकूलित चूहों को पैर-झटके को छोड़कर एक समान प्रोटोकॉल से गुजरना पड़ा (चित्र 1सी)। कार्य समाप्ति पर, प्रत्येक चूहे को पहले बताए अनुसार तैयार सूरजमुखी और अरंडी के तेल के 4:1 कॉकटेल में घुले हुए 4-हाइड्रॉक्सीटामॉक्सिफ़ेन (4-OHT, 100 mg/kg, IP) का इंजेक्शन मिला (डेनार्डो एट अल., 2019).
फिर चूहों को उनके घर के पिंजरों में लौटा दिया गया जहां उन्हें सामान्य आवास फिर से शुरू करने से पहले कम से कम 72 घंटे के लिए व्यवहार सूट के बगल वाले कमरे में छोड़ दिया गया।
डर कंडीशनिंग (दिन 21) के तीन सप्ताह बाद, चूहों को अत्यधिक मेमोरी रिकॉल परीक्षण (चित्रा 1डी) से गुजरना पड़ा, जिसमें कंडीशनिंग के दौरान मौजूद संवेदी संकेतों के समान संवेदी संकेतों के साथ परीक्षण कक्ष में पुन: प्रदर्शन शामिल था। चूहों को 5 मिनट के लिए कक्ष का पता लगाने की अनुमति दी गई, जिसके दौरान फ़्रीज़फ़्रेम 4 वीडियो ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर (एक्टीमेट्रिक्स, विल्मेट आईएल, यूएसए) का उपयोग करके डर व्यवहार (पोस्टुरल फ्रीजिंग) का स्कोर किया गया।
मस्तिष्क निर्धारण और ऊतक विज्ञान
मेमोरी रिकॉल परीक्षण के नब्बे मिनट बाद, चूहों को आइसोफ्लुरेन (ऑक्सीजन में 5%) के साथ गहराई से एनेस्थेटाइज किया गया और फिर 3 0 एमएल हेपरिनाइज्ड (100 यू/एमएल) आइसोटोनिक सेलाइन के साथ ट्रांसकार्डियक छिड़काव किया गया, इसके बाद 100 एमएल 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड (पीएफए) दिया गया। )0.1 एम फॉस्फेट बफर में।
मस्तिष्क को हटा दिया गया, कमरे के तापमान (∼22◦C) पर 6 घंटे के लिए 4% पीएफए और कम से कम 2 दिनों के लिए क्रायोप्रोटेक्टेडिन 30% सुक्रोज -0.01 एम फॉस्फेट बफर सलाइन (पीबीएस) पोस्ट-फिक्स्ड किया गया।
फिर दिमागों को फ्रीजिंग माइक्रोटोम (लीका माइक्रोसिस्टम्स, वेट्ज़लर, जर्मनी) पर 30 माइक्रोन-मोटे कोरोनल खंडों में काटा गया और एबीएलए (पैक्सिनो और फ्रैंकलिन, 2019) वाले खंडों को -20◦C पर पॉलीविनाइलपाइरोलिडोन (पीवीपी) क्रायोप्रोटेक्टेंट में संग्रहीत किया गया।
इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री
इम्यूनोस्टेनिंग पहले बताए अनुसार किया गया था (मिशेल एट अल., 2018; मारुयामा एट अल., 2019)।
संक्षेप में, पीवीपी क्रायोप्रोटेक्टेंट को हटाने के लिए अनुभागों को पीबीएस में धोया गया और फिक्सेशन के दौरान उत्पन्न ऑटो-फ्लोरोसेंट एल्डिहाइड को हटाने के लिए सोडियम बोरोहाइड्राइड ({{5%).5%) युक्त पीबीएस में 3 0 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। अतिरिक्त पीबीएस वॉश के बाद, अनुभागों को ब्लॉकिंग बफर (पीबीएस में 3% बकरी सीरम, 0.05% ट्राइटन-एक्स -100) में 2 घंटे के लिए ∼22◦C पर इनक्यूबेट किया गया, इसके बाद एपॉलीक्लोनल खरगोश सी युक्त ब्लॉकिंग बफर में 4◦C पर इनक्यूबेशन किया गया। -फॉस प्राथमिक एंटीबॉडी (एबी) 72 घंटे के लिए (1:1,500, सिनैप्टिक सिस्टम #226 003) या मोनोक्लोनल माउस CaMKII प्राइमरीएबी 24 घंटे के लिए (1:500, एंज़ो लाइफ साइंसेज, #एडीआई-केएएम-सीए002)।
आगे की धुलाई के बाद, Fos और CaMKII अनुभागों को बायोटिनाइलेटेड बकरी एंटी-खरगोश आईजीजी सेकेंडरी एब (1:250 ईएमडी मिलिपोर #AP132B) में ∼22◦C पर 2 घंटे के लिए अलग से इनक्यूबेट किया गया, इसके बाद 0 में क्रमिक धुलाई की गई। 05 एम ट्रिस-बफर सलाइन (टीबीएस) और 0.1 एमसोडियम एसीटेट को फिर टीबीएस-आधारित अवरोधक समाधान में 1 घंटे के लिए स्ट्रेप्टाविडिन-एलेक्सा फ्लोर 488 (1: 250, इंविट्रोजन # एस 11223) के संपर्क में लाया गया।
अंत में, अनुभागों को ट्रिस बफर में धोया गया और फ़्लुओरोमाउंट-जी (इन्विट्रोजन, #00-4958-02) के साथ स्लाइड पर लगाया गया।
इमेजिंग और विश्लेषण
उपयुक्त लेजर लाइनों से सुसज्जित, Zeiss LSM710लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ इंटरफेस किया गया एक A{0}}बिट फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब का उपयोग 20× ऑब्जेक्टिव (NA 0.8) और एक स्कैन हेड पिनहोल आकार का उपयोग करके aBLA छवियों को कैप्चर करने के लिए किया गया था। 47.5 µm. प्रत्येक छवि के लिए, ImageJ सॉफ़्टवेयर (NIH, बेथेस्डा, MD) का उपयोग tdTomato (यानी, TRAPed, लाल) और Alexa -488 (Fos, हरा) प्रतिदीप्ति के अलग-अलग पिक्सेल मानचित्र बनाने के लिए किया गया था।
दोहरी लेबलिंग के लिए पिक्सेल थ्रेशोल्ड तीव्रता और तरंग दैर्ध्य ओवरलैप का पता लगाने का निर्धारण Fo के प्राथमिक एब के साथ और उसके बिना संसाधित ऊतक अनुभागों की तुलना करके किया गया था जैसा कि पहले वर्णित है (मिशेल एट अल।, 2018; मारुयामा एट अल।, 2019)। सेल-गिनती और सह-स्थानीयकरण डेटा का उपयोग करके प्राप्त किया गया था थेसेमी-ऑटोनॉमस इमेजजे प्लगइन ईज़कोलोकलाइज़ेशन (स्टॉफ़र एट अल.,2018)।
एबीएलए की छवियों को लगभग समान आकार के तीन रोस्ट्रो-कॉडल उपक्षेत्रों में विभाजित किया गया था, प्रत्येक उप-क्षेत्र को ब्रेग्मा के सापेक्ष रोस्ट्रल-कॉडल स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक की एक विशिष्ट सीमा द्वारा परिभाषित किया गया था: रोस्ट्रल, −0.8 से −1.1 मिमी; मध्य, −1.2 से −1.5 मिमी; एंडकॉडल, -1.6 से -1.9 मिमी (पैक्सिनो और फ्रैंकलिन, 2019)। इमेजजे में रीजनऑफ़ इंटरेस्ट (आरओआई) प्रबंधक का उपयोग तब एएबीएलए को उसके परिधि के सापेक्ष उसके पृष्ठीय-उदर और मध्य-पार्श्व चतुर्भुज के साथ विभाजित करने के लिए किया गया था। इस टेम्पलेट को बाद में प्रत्येक निर्दिष्ट रोस्ट्रल-कॉडल उप-क्षेत्र के भीतर सभी छवियों पर लागू किया गया था।
aBLAपरिधि सीमांकन का उपयोग ImageJ EzColocalizationplug-in के साथ प्रत्येक छवि में सभी न्यूरोनल गणनाओं का 2-D स्थानिक प्लॉट उत्पन्न करने के लिए किया गया था। फिर रोस्ट्रल, मध्य और दुम उपक्षेत्रों के भीतर स्थानिक भूखंडों को अलग से ओवरले किया गया। इसके परिणामस्वरूप रोस्ट्रल उप-क्षेत्र के लिए 10 भय और 10 संदर्भ भूखंड, मध्य उप-क्षेत्र के लिए 10 भय और 13 संदर्भ भूखंड, और दुम उप-क्षेत्र के लिए 12 भय और 13 संदर्भ भूखंड प्राप्त हुए।
संदर्भ समूह में उपक्षेत्र छवि प्लॉटों की अधिक संख्या को सही करने के लिए, 1.0(10/10), 0.77 (10/13), और 0.92 के सुधार कारक (12/13) क्रमशः संदर्भ समूह के रोस्ट्रल, मध्य और दुम उप-क्षेत्र भूखंडों पर लागू किए गए थे। संदर्भ डेटा में गिनती के स्थलाकृतिक वितरण को पूर्वाग्रह से बचाने के लिए, एमएस एक्सेल में एक यादृच्छिक संख्या जनरेटर का उपयोग यह पहचानने के लिए किया गया था कि प्रत्येक एबीएलए उप-क्षेत्र से कौन सी विशिष्ट गिनती को बाहर रखा जाए।
इसके बाद, हमने एबीएलए उप-क्षेत्रों को 1-4 नामित चतुर्भुजों में विभाजित किया है (चित्र 2डी देखें)। ऐसा करने के लिए, एमएस-एक्सेल में इंटरसेक्शनकोऑर्डिनेट (0,0) को डी प्लेन में उस बिंदु के रूप में निर्धारित किया गया था, जिस पर प्रत्येक चतुर्थांश का क्षेत्रफल लगभग एक-चौथाई के बराबर था। प्रत्येक रोस्ट्रल-कॉडल उपक्षेत्र के कुल क्षेत्रफल का। प्रत्येक गणना के चतुर्थांश अक्षों और xy निर्देशांकों को निर्धारित किया गया और 30◦घड़ी की दिशा में घुमाया गया, जिससे उन्हें aBLA के संरचनात्मक अक्ष के साथ संरेखित किया गया।
उप-क्षेत्रों और उनके चतुर्थांशों के आकार में छोटे बदलावों को ध्यान में रखते हुए, गणना डेटा को सतह क्षेत्र (गणना/मिमी2) के लिए सामान्यीकृत किया गया ताकि रिपोर्ट किए गए मान प्रति उप-क्षेत्र या चतुर्थांश की गणना के घनत्व का प्रतिनिधित्व कर सकें।
हमारे TRAP2 सिस्टम द्वारा कैप्चर किए गए न्यूरॉन्स के उत्तेजक फेनोटाइप का आकलन करने के लिए, ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स (मैकडॉनल्ड एट अल।, 2002) के एक स्थापित मार्कर, कैल्शियम-शांतोडुलिन-निर्भर प्रोटीन काइनेज II (CaMKII) के साथ कंडीशनिंग-ट्रैप्ड tdTomatoexpression का सह-स्थानीयकरण, मात्रा निर्धारित किया गया था। ImageJ सेल काउंटर प्लग-इन का उपयोग करके प्रति माउस कम से कम तीनaBLA अनुभागों की छवियां।
आंकड़े
सांख्यिकीय परीक्षण प्रिज्म 9.5.1 सॉफ्टवेयर (ग्राफपैड, सैन डिएगो, सीए, यूएसए) के साथ किया गया था और इसमें शापिरो-विल्क परीक्षण का उपयोग करके सभी डेटासेट के सामान्य वितरण के लिए परीक्षण शामिल था। निरंतर डेटा के लिए समूह तुलना दो-पूंछ वाले अयुग्मित छात्र के साथ की गई थी महत्वपूर्ण एनोवा इंटरैक्शन के बाद जोड़ी-वार तुलना के लिए टी-परीक्षण या दो- या तीन-तरफा एनोवा के बाद क्रमशः सिडाक और तुकी के एकाधिक तुलनात्मक परीक्षण।
पियर्सन के आर-गुणांक और संबंधित पी-मूल्य को निर्धारित करने के लिए समूह के भीतर सहसंबंध विश्लेषण किया गया था। फिशरज़ेड परिवर्तन (पूरक तालिका 1) का उपयोग करके समूहों में सहसंबंधों की तुलना की गई। समूह डेटा को माध्य ± SEM के रूप में व्यक्त किया जाता है। सांख्यिकीय महत्व P < 0.05 पर निर्धारित किया गया था।
परिणाम
डर कंडीशनिंग एक दूरस्थ भय-स्मृति एनग्राम को प्रेरित करती है
यह स्थापित करने के लिए कि भय स्मृति निर्माण के दौरान सक्रिय aBLA न्यूरॉन्स किस हद तक दूरस्थ मेमोरी रिकॉल के दौरान पुनः सक्रिय होते हैं, चूहों को भय (n=5), या संदर्भ (n=5) कंडीशनिंग से गुजरना पड़ा, जिसके बाद 4-OHT का इंजेक्शन लगाया गया। (आंकड़े 1ए-सी)।
डर की स्मृति गठन (यानी, डर सीखना) की जांच करते हुए, ठंडे व्यवहार पर उपचार (सदमे बनाम कोई झटका नहीं) और समय बिन (प्रत्येक झटके के बाद 3 {{17%) का अंतराल) की एक महत्वपूर्ण बातचीत देखी गई [दो-तरफा एनोवा, एफ (5, 40)=6.733, पी=0.0001]। डर से प्रेरित चूहों ने झटके के बाद बेसलाइन के सापेक्ष ठंड का समय बढ़ा दिया 3(275 ± 68% बीएल, पी {{12%).0203), 4 (486 ± 76% बीएल, पी <0.0001) और 5 (402 ± 26) बीएल का %, पी <0.0001), और सदमे के बाद संदर्भ वातानुकूलित चूहों के सापेक्ष 4 (251 ± 38% संदर्भ, पी < 0.0001) और 5 (375 ± 25% संदर्भ, पी < 0.0001)।
जैसा कि अपेक्षित था, कंडीशनिंग के बाद 21वें दिन रिमोट मेमोरी रिकॉल के लिए कंडीशनिंग चैंबर में पुनः एक्सपोज़र से पता चला कि भय-वातानुकूलित चूहों ने संदर्भ नियंत्रण की तुलना में ठंड में काफी अधिक समय बिताया है [346 ± 18%, अयुग्मित टी-परीक्षण, टी(8) {{7} }.16, पी <{9}}.0001] (चित्र 1डी)।
सामूहिक रूप से, चित्र 1 में डेटा से संकेत मिलता है कि हमारे डर कंडीशनिंग प्रोटोकॉल ने मजबूत भय स्मृति गठन और दूरस्थ भय स्मृति स्मरण का कारण बना।
भय सीखना समूह के लिए एक मजबूत उप-क्षेत्र-विशिष्ट aBLA को प्रेरित करता है
TRAPed (tdTomato +) गणना के विश्लेषण से संदर्भ-वातानुकूलित (77 ± 3.1) चूहों की तुलना में डर-वातानुकूलित (110 ± 6.2) में काफी बड़ी फोस-सक्रिय एबीएलए आबादी का पता चला [अयुग्मित टी-परीक्षण, टी(8)=4 .782, पी=0.0014] (तालिका 1)। जैसा कि अपेक्षित था, ∼70% संदर्भ- और ∼80% डर-ट्रैप्ड न्यूरॉन्स (एन {{21 }} एबीएलए अनुभाग/समूह) सीएएमकेआईआई + (पूरक आंकड़े 1 ए, बी) थे, यह दर्शाता है कि वे मुख्य रूप से ग्लूटामेटेरिक प्रक्षेपण न्यूरॉन्स थे।
पिछली रिपोर्टों (किम एट अल., 2016) के समान, हमने एबीएलए को तीन रोस्ट्रोकॉडल उप-क्षेत्रों में विभाजित किया है: रोस्ट्रल, मध्य और कॉडल (आंकड़े 2ए-सी) और भीतर उप-क्षेत्रों में ट्रैप्ड गिनती घनत्व (गणना/मिमी2) की तुलना की। उपचार समूहों के बीच (चित्र 2डी)। दो-तरफा एनोवा ने उप-क्षेत्र और उपचार [एफ(2,24)=7.7099,पी=0.0038] के बीच एक महत्वपूर्ण बातचीत का खुलासा किया।
समूह के भीतर के विश्लेषणों से पता चला कि ट्रैप्ड काउंटडेंसिटी डर (239 ± 9) और रोस्ट्रल (डर: 86 ± 6,पी < {) के सापेक्ष संदर्भ (144 ± 12) समूहों में मध्य एबीएलए उप-क्षेत्र में अधिक थी। {8}}.0001; संदर्भ: 81 ± 9, पी=0.0035) और दुम (डर:123 ± 15, पी <0.0001; संदर्भ: 90 ± 12, पी {{20) }}.0132) उप-क्षेत्र।
बीच-समूह विश्लेषण से पता चला कि डर-वातानुकूलित चूहों के मध्य उप-क्षेत्र में ट्रैप्ड गिनती घनत्व काफी अधिक था (पी <{3}}.0001)।
ट्रैप्ड न्यूरॉन्स के स्थान को और अधिक स्पष्ट करने के लिए, हमने रोस्ट्रल, मध्य और पुच्छीय एबीएलए उप-क्षेत्रों को प्रत्येक चार चतुर्भुजों में विभाजित किया है (चित्र 2ई)। मध्य उप-क्षेत्र में, गणना घनत्व पर मुख्य उपचार प्रभाव देखा गया [तीन-तरफ़ा एनोवा, एफ(1,32)=17.44, पी=0.0002] साथ में चतुर्थांश 3(218 ± 29 बनाम 107 ± 17, पी {{15 }}.0031), और 4 (240 ± 16 बनाम 101 ± 12, पी < 0.0001) में संदर्भ समूह की तुलना में डर में उच्च ट्रैपेडकाउंट घनत्व।
हमने एबीएलए उप-क्षेत्रों में समूह के भीतर और चतुर्थांश के भीतर ट्रैप्ड गणना घनत्वों का आगे मूल्यांकन किया (चित्र 2ई और अनुपूरक तालिका 2)। विशेष रूप से, जब रोस्ट्रल उप-क्षेत्र (59 ± 8) से तुलना की जाती है, तो भय समूह के चतुर्थांश 2 में मध्य (245 ± 21, पी < {{11 }}.0001) और दुम (172 ± 23) दोनों में उच्च ट्रैप घनत्व होता है। पी=0.0040) उप-क्षेत्र।
इसके बाद हमने पूरे एबीएलए में, इसके मध्य उप-क्षेत्र में, और मध्य और पुच्छीय उप-क्षेत्रों के चतुर्भुजों में फ्रीजिंग व्यवहार और ट्रैप्ड न्यूरोनल समूह के आकार के बीच संबंधों का मूल्यांकन किया, जहां संदर्भ और भय-वातानुकूलित समूहों के बीच संयोजन घनत्व भिन्न थे। डर या संदर्भ समूह (चित्रा 2एफ) में कोई महत्वपूर्ण सहसंबंध नहीं देखा गया, यह सुझाव देता है कि डर का व्यवहार एबीएलए उप-क्षेत्रों में डर-सीखने की संरचना के आकार को प्रतिबिंबित नहीं करता है।
सामूहिक रूप से, चित्र 2 में निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि डर कंडीशनिंग के परिणामस्वरूप संदर्भ कंडीशनिंग की तुलना में एबीएलए में एक बड़ा फोस संयोजन हुआ। एन्सेम्बल न्यूरॉन्स को मध्य एबीएलए उप-क्षेत्र में सबसे अधिक सघनता से स्थानीयकृत किया गया था, लेकिन डर का व्यवहार एन्सेम्बल जनसंख्या के आकार के साथ सहसंबंधित नहीं था।
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