कैसिया फिस्टुला फूल ब्यूटानोलिक अर्क भाग 1 के एंटी-एजिंग और टायरोसिनेस निषेध प्रभाव

अमूर्त

पृष्ठभूमि: पौधों के स्रोतों से बने प्राकृतिक उत्पादों का उपयोग पोषण के स्रोत और सफ़ेद करने वाले एजेंट के रूप में विभिन्न कॉस्मेटिक अनुप्रयोगों में किया गया है। फैबेसी परिवार के कैसिया फिस्टुला एल के फूलों का उपयोग त्वचा रोगों और घाव भरने के लिए एक पारंपरिक दवा के रूप में किया जाता है और बताया गया है कि इसमें एंटी-ऑक्सीडेंट गुण होते हैं। मानव त्वचा फ़ाइब्रोब्लास्ट पर सी. फ़िस्टुला फूल के अर्क के बुढ़ापे-विरोधी प्रभाव की जांच की गई।

सिस्टैंच का ग्लाइकोसाइड हृदय और यकृत के ऊतकों में एसओडी की गतिविधि को भी बढ़ा सकता है, और प्रत्येक ऊतक में लिपोफसिन और एमडीए की सामग्री को काफी कम कर सकता है, विभिन्न प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन रेडिकल्स (ओएच-, एच₂ओ₂, आदि) को प्रभावी ढंग से हटा सकता है और डीएनए क्षति से बचा सकता है। ओएच-रेडिकल्स द्वारा। सिस्टैंच फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स में मुक्त कणों की एक मजबूत सफाई क्षमता होती है, विटामिन सी की तुलना में उच्च कम करने की क्षमता होती है, शुक्राणु निलंबन में एसओडी की गतिविधि में सुधार होता है, एमडीए की सामग्री कम होती है, और शुक्राणु झिल्ली समारोह पर एक निश्चित सुरक्षात्मक प्रभाव पड़ता है। सिस्टैंच पॉलीसेकेराइड डी-गैलेक्टोज के कारण प्रयोगात्मक रूप से वृद्ध चूहों के एरिथ्रोसाइट्स और फेफड़ों के ऊतकों में एसओडी और जीएसएच-पीएक्स की गतिविधि को बढ़ा सकते हैं, साथ ही फेफड़ों और प्लाज्मा में एमडीए और कोलेजन की सामग्री को कम कर सकते हैं और इलास्टिन की सामग्री को बढ़ा सकते हैं। डीपीपीएच पर एक अच्छा सफाई प्रभाव, वृद्ध चूहों में हाइपोक्सिया का समय बढ़ाना, सीरम में एसओडी की गतिविधि में सुधार करना, और प्रयोगात्मक रूप से वृद्ध चूहों में फेफड़ों के शारीरिक अध: पतन में देरी करना, सेलुलर रूपात्मक अध: पतन के साथ, प्रयोगों से पता चला है कि सिस्टैंच में अच्छी एंटीऑक्सीडेंट क्षमता है और त्वचा की उम्र बढ़ने वाली बीमारियों को रोकने और उनका इलाज करने के लिए एक दवा बनने की क्षमता रखती है। साथ ही, सिस्टैंच में इचिनाकोसाइड में डीपीपीएच मुक्त कणों को साफ़ करने की एक महत्वपूर्ण क्षमता है और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों को साफ़ कर सकता है, मुक्त कट्टरपंथी प्रेरित कोलेजन गिरावट को रोक सकता है, और थाइमिन मुक्त कट्टरपंथी आयनों की क्षति पर भी अच्छा मरम्मत प्रभाव पड़ता है।

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तरीकों: सी. फिस्टुला फूलों का ब्यूटेनॉल निष्कर्षण पूरा हो गया और सक्रिय यौगिकों को वर्गीकृत किया गया। आगे के प्रयोगों के लिए गैर विषैले खुराक का चयन करने के लिए एसआरबी परख द्वारा फ़ाइब्रोब्लास्ट की साइटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन किया गया था। कोलेजन और हायल्यूरोनिक एसिड (एचए) संश्लेषण को क्रमशः कोलेजन किट और एलिसा का उपयोग करके मापा गया था। इसके अलावा, कोलेजनेज़, मैट्रिक्समेलोप्रोटीनेज़ -2 (एमएमपी -2), और टायरोसिनेज़ सहित एंजाइम गतिविधि का भी मूल्यांकन किया गया था।

परिणाम: यह पाया गया कि फूल के अर्क ने त्वचा की फ़ाइब्रोब्लास्ट कोशिका वृद्धि (IC50 > 200 ug/mL) को प्रभावित नहीं किया। परिणामों से पता चला कि फूल के अर्क ने खुराक पर निर्भर तरीके से कोलेजन और एचए संश्लेषण में उल्लेखनीय वृद्धि की। फूल का अर्क (50-200 ug/mL) कोलेजनेज़ और MMP-2 गतिविधि को भी महत्वपूर्ण रूप से बाधित करता है। इसके अलावा, यह फूल का अर्क टायरोसिनेस गतिविधि को रोक सकता है जो हाइपरपिग्मेंटेशन का कारण बनता है, जो त्वचा की उम्र बढ़ने को प्रेरित करता है।

निष्कर्ष: जब मानव त्वचा के फ़ाइब्रोब्लास्ट में बुढ़ापा रोधी प्रयोजनों के लिए उपयोग किया जाता है तो सी. फिस्टुला फूल के अर्क ने एक निवारक प्रभाव प्रदर्शित किया है और यह उन कॉस्मेटिक उत्पादों के लिए एक उपयुक्त विकल्प हो सकता है जिनका उद्देश्य सफ़ेद प्रभाव प्रदान करना है, और जिन्हें बुढ़ापा रोधी चेहरे की त्वचा देखभाल उत्पादों के रूप में नामित किया गया है .

कीवर्ड: कोलेजनेज, कोलेजन संश्लेषण, ग्लाइकोसामिनोग्लाइकन, हायल्यूरोनिक एसिड, मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनेज

पृष्ठभूमि

त्वचा की उम्र बढ़ना एक जटिल जैव रासायनिक प्रगति है जो कई व्यक्तिगत आंतरिक और बाहरी कारकों जैसे कि उम्र, हार्मोन और यूवी प्रकाश के संपर्क से उत्पन्न होती है [1]। प्रगति एपिडर्मल और त्वचीय परतों में होती है और मुख्य रूप से बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) गिरावट से संबंधित है [2]। ईसीएम क्षरण में शामिल एंजाइम मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनिस (एमएमपी) हैं जैसे कि जिलेटिनेज (एमएमपी-2) और कोलेजनेज़ [3]। एमएमपी द्वारा ईसीएम क्षरण के प्रभाव के कारण त्वचा अपनी तन्य शक्ति खो देती है। इस प्रक्रिया में, त्वचा पर झुर्रियाँ पड़ने लगती हैं और हाइपो- या हाइपरपिग्मेंटेशन जैसी कुछ वर्णक असामान्यताओं के साथ-साथ खुरदरापन और सूखापन भी स्पष्ट रूप से उत्पन्न होता है [2, 4]। हाइपरपिग्मेंटेशन के उपचार के लिए, टायरोसिनेस अवरोधकों की जांच की गई है। टायरोसिनेज़ एक दर-सीमित एंजाइम है जो टायरोसिन को मेलेनिन में परिवर्तित करता है [5]। इस प्रकार टायरोसिन अवरोधक त्वचा को चमकाने वाले एजेंटों के रूप में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं [6] जबकि हयालूरोनिक एसिड (एचए) संश्लेषण त्वचा के जलयोजन और झुर्रियों की घटना को नियंत्रित करता है। एचए, एक गैर-सल्फेटेड ग्लाइकोसामिनोग्लाइकन (जीएजी), डी-ग्लुकुरोनिक एसिड और एन-एसिटाइल-डीग्लूकोसामाइन [7] सहित डिसैकराइड की दोहराई जाने वाली इकाइयों से बना है। एचए ऊतकों की मरम्मत को भी नियंत्रित करता है, जिसमें सूजन वाली कोशिकाओं को सक्रिय करके और फ़ाइब्रोब्लास्ट की चोट के जवाब में प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रतिक्रिया को बढ़ाना शामिल है [8-10]।

ग्लाइसीराइजा ग्लबरा [11] या हरी चाय [12] जैसे पौधों के स्रोतों से बने प्राकृतिक उत्पादों का उपयोग कॉस्मेटिक अनुप्रयोगों में पोषण के स्रोत और सफेद करने वाले एजेंट के रूप में किया गया है। साक्ष्यों की एक महत्वपूर्ण मात्रा ने पौधों के अर्क से मौखिक रूप से या शीर्ष रूप से प्रशासित फाइटोकेमिकल्स के लाभकारी प्रभावों की ओर इशारा किया है, विशेष रूप से त्वचा की स्थिति में सुधार में। लाभकारी प्रभावों के कुछ उदाहरण हैं कि त्वचा की उम्र बढ़ने और त्वचा की सूजन को कम किया जा सकता है। सी. फिस्टुला (गोल्डन शावर), फैबेसी परिवार, थाईलैंड, चीन, म्यांमार और भारत जैसे कई एशियाई देशों में पाया जाता है। पिछले अध्ययनों में, सी. फिस्टुला फूल के अर्क में एंटीऑक्सिडेंट, कैंसर विरोधी, जीवाणुरोधी, एंटिफंगल और मधुमेह विरोधी गुण पाए गए थे [13, 14]। आयुर्वेदिक चिकित्सा में सी. फिस्टुला के प्रभाव को त्वचा रोग, कुष्ठ रोग, रक्तगुल्म, खुजली और मधुमेह [15, 16] सहित विभिन्न विकारों के इलाज में शामिल माना जाता है। सी. फिस्टुला के विभिन्न भागों ने औषधीय गुण प्रदर्शित किए हैं [17]। फूल, बीज, फल और गूदे का उपयोग कुष्ठ रोग सहित त्वचा रोगों के इलाज के लिए किया गया है [18]। गूदे को इसके मधुमेहरोधी गुणों के लिए पहचाना गया है [15] और इसका उपयोग एक टॉनिक में किया गया है जिसका उपयोग गठिया और गठिया के उपचार में किया गया है [19]। पत्तियों और पकी फलियों का उपयोग पारंपरिक रूप से रेचक के रूप में किया जाता रहा है [20, 21]। सी. फिस्टुला के फेनोलिक्स और फ्लेवोनोइड फाइटोकेमिकल्स को त्वचा रोगों के इलाज में भी उपयोगी बताया गया है [14]। इसलिए, इस अध्ययन में, हम कॉस्मीस्यूटिकल अनुप्रयोगों में सी. फिस्टुला फूल के अर्क की भूमिका में रुचि रखते हैं। त्वचा की उम्र बढ़ने वाले एंजाइमों के साथ-साथ ईसीएम क्षरण के निवारक प्रभावों की जांच की गई है जिसमें कोलेजनेज़ और एमएमपी -2 गतिविधियां, साथ ही टायरोसिनेज़ शामिल हैं। इसके अलावा, कोलेजन और एचए संश्लेषण निर्धारित किया गया है।

तरीकों

रसायन और अभिकर्मक

डुलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम), डीक्यू जिलेटिन और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन की आपूर्ति गिब्को (ग्रैंड आइलैंड, एनवाई, यूएसए) से की गई थी। भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) की आपूर्ति थर्मो साइंटिफिक (यूएसए) से की गई थी। सीरियस रेड/फास्ट ग्रीन कोलेजन स्टेनिंग किट चोंड्रेक्स, इंक. (रेडमंड, डब्ल्यूए, यूएसए) से खरीदी गई थी। सल्फ़ोर्होडामाइन बी अभिकर्मक, हायल्यूरोनिक एसिड और मशरूम टायरोसिनेज़ सिग्मा-एल्ड्रिच (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से प्राप्त किए गए थे।

संयंत्र सामग्री

सी. फिस्टुला फूल लैंपांग हर्ब कंजर्वेशन, लैंपांग प्रांत, थाईलैंड से प्राप्त किए गए थे। एक वाउचर नमूना संख्या (023197) को थाईलैंड के फ्लोरा के हर्बेरियम, फार्मेसी संकाय, चियांग माई विश्वविद्यालय, थाईलैंड के वनस्पतिशास्त्री वानारी चारोएनसुप द्वारा प्रमाणित किया गया था।

कैसिया फिस्टुला फूल का अर्क तैयार करना

सी. फिस्टुला के फूलों को एक हवादार कमरे में सुखाया गया और फिर 500 ग्राम सूखे फूलों को बारीक पीसकर पाउडर बना लिया गया। उसके बाद, पाउडर को 50 प्रतिशत इथेनॉल में भिगोया गया और फिर 24 घंटे के लिए 70 आरपीएम पर हिलाया गया। 24 घंटे के बाद, अवशेषों को अलग करने के लिए नमूनों को फिल्टर पेपर के माध्यम से फ़िल्टर किया गया। अवशेषों को 50 प्रतिशत इथेनॉल में भिगोया गया और 24 घंटे के लिए 70 आरपीएम पर हिलाया गया और इस चरण को 2 बार दोहराया गया। फ़िल्टर किए गए नमूनों को एक साथ एकत्र किया गया और पानी के अंश प्राप्त करने के लिए एक रोटरी वैक्यूम बाष्पीकरणकर्ता (बुची, स्विट्जरलैंड) द्वारा वाष्पित किया गया। हेक्सेन को हेक्सेन 2:1 के अनुपात में जल अंश में जोड़ा गया था। नमूनों को हिलाया गया और 30 मिनट तक अलग रहने दिया गया। नमूनों को दो अंशों में विभाजित किया गया, जो हेक्सेन और पानी के अंश थे। फिर, पानी का अंश एकत्र किया गया और कमरे के तापमान पर हल्के सरगर्मी के साथ 30 मिनट की अवधि के लिए 10 प्रतिशत लकड़ी का कोयला जोड़ा गया। चारकोल को अलग करने के लिए नमूनों को फिल्टर पेपर और सेलाइट के माध्यम से फ़िल्टर किया गया था। नमूनों को संतृप्त ब्यूटेनॉल 2:1 के अनुपात में संतृप्त ब्यूटेनॉल के साथ मिलाया गया और नमूनों को 12 घंटे की अवधि में अलग होने दिया गया और इस चरण को 3 बार दोहराया गया। नमूनों को दो अंशों में विभाजित किया गया, जिसमें पानी और ब्यूटेनॉल अंश शामिल थे। पानी को ब्यूटेनॉल अंशों में समान मात्रा में जोड़ा गया और इन अंशों को एक रोटरी वैक्यूम बाष्पीकरणकर्ता के उपयोग के माध्यम से वाष्पित होने दिया गया। सी. फिस्टुला फूल अर्क पाउडर प्राप्त करने के लिए वाष्पित नमूनों को फ्रीज में सुखाया गया।

यूवी-विज़िबल स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके सी. फिस्टुला फूल के अर्क में कुल फेनोलिक सामग्री की मात्रा का निर्धारण

सी. फिस्टुला फूल के अर्क में कुल फेनोलिक सामग्री फोलिन-सियोकाल्टु परख का उपयोग करके निर्धारित की गई थी। संक्षेप में, सी. फिस्टुला फूल के अर्क के 0.4 एमएल को 1{8}} प्रतिशत फोलिन-सियोकाल्टो अभिकर्मक के 0.3 एमएल के साथ मिलाया गया और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए अंधेरे में रखा गया। . फिर, 0.3 एमएल सोडियम कार्बोनेट घोल मिलाया गया और घोल को 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में रखा गया। यूवी-दृश्यमान स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 765 एनएम पर अवशोषण का मूल्यांकन किया गया था। कुल फेनोलिक सामग्री की सांद्रता की गणना की गई और गैलिक एसिड (जीए) के लिए 0-20 यूजी/एमएल पर मानक वक्र के साथ तुलना की गई। कुल फेनोलिक सामग्री को सी. फिस्टुला के प्रति ग्राम जीए समकक्ष के मिलीग्राम के रूप में रिपोर्ट किया गया था। फूल का अर्क (मिलीग्राम जीएई/जी अर्क)।

एचपीएलसी विश्लेषण का उपयोग करके सी. फिस्टुला फूल के अर्क में फेनोलिक यौगिकों की मात्रा का निर्धारण

सी. फिस्टुला फूल के अर्क में विभिन्न प्रकार के फेनोलिक यौगिकों का एचपीएलसी विश्लेषण का उपयोग करके विश्लेषण किया गया और फिर मानक गैलिक एसिड, कैटेचिन, प्रोटोकैटेचिक एसिड, वैनिलिक एसिड, क्लोरोजेनिक एसिड, फेरुलिक एसिड और कौमारिक एसिड के साथ तुलना की गई। फूलों के अर्क को 50 प्रतिशत इथेनॉल में घोल दिया गया था और रिवर्स-चरण C18 कॉलम (वाटर, एमए, यूएसए) का उपयोग करके एचपीएलसी (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज, सीए, यूएसए) द्वारा आगे मूल्यांकन किया गया था। मोबाइल चरण में धीरे-धीरे स्थितियों के साथ पानी (बी) में मेथनॉल (ए) और 0.1 प्रतिशत ट्राइफ्लूरोएसेटिक एसिड (टीएफए) शामिल थे। प्रवाह दर 1.0 एमएल/मिनट पर सेट की गई थी और यूवी डिटेक्टर के साथ डिटेक्शन तरंग दैर्ध्य 280 पर दर्ज किया गया था। फेनोलिक यौगिकों के सांद्रता स्तर की गणना की गई और मानक सांद्रता और चरम क्षेत्रों (मिलीग्राम/जी अर्क) पर विचार करते हुए मानक वक्र के साथ तुलना की गई।

वर्णमिति परख का उपयोग करके सी. फिस्टुला फूल के अर्क में कुल फ्लेवोनोइड सामग्री की मात्रा का निर्धारण

कुल फ्लेवोनोइड सामग्री संशोधित एल्यूमीनियम क्लोराइड (AlCl3) वर्णमिति परख द्वारा निर्धारित की गई थी जैसा कि पहले वर्णित था [22]। संक्षेप में, फूलों के अर्क के 0.25 एमएल को 5 प्रतिशत सोडियम नाइट्राइट (NaNO2) के 0.125 एमएल के साथ मिलाया गया और घोल को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए रखा गया। फिर, मिश्रण में 0.125 एमएल 10 प्रतिशत AlCl3 मिलाया गया और इसे 5 मिनट के लिए अंधेरे में रखा गया। जिसके बाद, 1 एमएल सोडियम हाइड्रॉक्साइड (NaOH) मिलाया गया और घोल को अंधेरे में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए रखा गया। यूवी-दृश्य स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके अवशोषण को 510 एनएम पर मापा गया था। कुल फ्लेवोनोइड सामग्री की गणना की गई और मानक कैटेचिन मूल्यों के साथ तुलना की गई और प्रति ग्राम अर्क (मिलीग्राम सीई/जी अर्क) के बराबर मिलीग्राम कैटेचिन के रूप में व्यक्त किया गया।

कोशिका संवर्धन

सीएम महाराज अस्पताल, चियांग माई विश्वविद्यालय (चियांग माई, थाईलैंड) के सर्जिकल वार्ड में सिजेरियन डिलीवरी से जुड़ी एक शल्य प्रक्रिया के बाद प्राथमिक मानव त्वचा फ़ाइब्रोब्लास्ट को पेट के निशान से सड़न रोकनेवाला रूप से अलग किया गया था (अध्ययन कोड: BIO -2558-03549 मेडिकल द्वारा अनुमोदित अनुसंधान आचार समिति, चियांग माई विश्वविद्यालय)। प्रारंभिक सामग्री से वसा हटा दी गई और इसे एंटी-पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त डीएमईएम में भिगोया गया। उसके बाद, त्वचा को 4 डिग्री पर 48 घंटे के लिए 1 प्रतिशत प्रोटीज़ (डिस्पेज़, गिब्को, ग्रैंड आइलैंड, एनवाई, यूएसए) युक्त डीएमईएम में डुबोया गया। एपिडर्मल परतों को हटा दिया गया और सामान्य फ़ाइब्रोब्लास्ट को डर्मिस से अलग कर दिया गया। फ़ाइब्रोब्लास्ट को 10 प्रतिशत एफबीएस, 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 50 यू/एमएल पेनिसिलिन और 50 यूजी/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक डीएमईएम में संवर्धित किया गया था। कोशिकाओं को 37 डिग्री पर 5 प्रतिशत CO2 आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में बनाए रखा गया था।

सेल व्यवहार्यता परख

त्वचा फ़ाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं के विरुद्ध सी. फिस्टुला फूल के अर्क की कोशिका व्यवहार्यता परख को सल्फोरोडामाइन बी (एसआरबी) परख का उपयोग करके मापा गया था जैसा कि पहले बताया गया था [23]। संक्षेप में, कोशिकाओं (8x103 कोशिकाएं/कुआं) को एक 96-वेल प्लेट में डाला गया और 24 घंटे के लिए 37 डिग्री, 5 प्रतिशत सीओ2 पर ऊष्मायन किया गया। उसके बाद, कोशिकाओं को 48 घंटे तक सी. फिस्टुला फूल के अर्क के विभिन्न सांद्रता (0-200 ug/mL) के साथ या उसके बिना इलाज किया गया। 48 घंटे के बाद, कोशिकाओं में 10 प्रतिशत (w/v) ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड (TCA) मिलाया गया, और फिर कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए 4 डिग्री पर इनक्यूबेट किया गया। माध्यम को हटा दिया गया और कोशिकाओं को धीमी गति से चलने वाले नल के पानी से धोया गया। प्रत्येक कुएं में 0.057 प्रतिशत (w/v) एसआरबी समाधान (100 μL) जोड़ा गया और कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया। एसआरबी समाधान हटा दिया गया और फिर कोशिकाओं को 1 प्रतिशत (v/v) एसिटिक एसिड से 4 बार धोया गया और उन्हें कमरे के तापमान पर सूखने दिया गया। डाई को 10 एमएम ट्रिस बेस सॉल्यूशन (पीएच 10.5) के साथ भंग कर दिया गया था और माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके अवशोषण को 510 एनएम पर मापा गया था।

कोलेजन संश्लेषण परख

निर्माता के निर्देशों के अनुसार फ़ाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं में कुल इंट्रासेल्युलर कोलेजन सिरियस रेड/फास्ट ग्रीन कोलेजन स्टेनिंग किट (चोंड्रेक्स, इंक, रेडमंड, डब्ल्यूए, यूएसए) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। संक्षेप में, त्वचा फ़ाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं को 24 अच्छी प्लेटों में 24 घंटे के लिए 37 डिग्री, 5 प्रतिशत CO2 पर रखा गया था। उसके बाद, कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए सीरम मुक्त डीएमईएम माध्यम से पूर्व-उपचार किया गया। माध्यम को हटा दिया गया और कोशिकाओं को 48 घंटों के लिए सी. फिस्टुला फूल के अर्क (0-150 यूजी/एमएल) के साथ या उसके बिना इनक्यूबेट किया गया। 48 घंटे के बाद, सुसंस्कृत माध्यम को हटा दिया गया। फिर, कोशिकाओं को पीबीएस से धोया गया और 10 मिनट के लिए काहले फिक्सेटिव के साथ तय किया गया। फिक्सेटिव को हटा दिया गया और कोशिकाओं को पीबीएस से धोया गया। प्रत्येक कुएं में सीरियस रेड/फास्ट ग्रीन डाई घोल मिलाया गया और नमूनों को कमरे के तापमान पर 30 मिनट तक रखा गया। डाई हटा दी गई और कोशिकाओं को डीआई पानी से चार बार धोया गया या जब तक तरल पदार्थ रंगहीन न हो जाए। अंत में, निष्कर्षण बफर जोड़ा गया और यूवी-दृश्य स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके अवशोषण को 540 एनएम और 605 एनएम पर मापा गया।

कोलेजनेज़ गतिविधि परख

कोलेजनेज़ गतिविधि को एक संशोधित फ्लोरोजेनिक डीक्यू™-जिलेटिन परख का उपयोग करके मापा गया था जैसा कि पहले वर्णित किया गया है [24]। संक्षेप में, सी. फिस्टुला फूल के अर्क (0-200 ug/mL) की विभिन्न सांद्रता को 96 वेल प्लेटों में जोड़ा गया था। प्रत्येक कुएं (100 μL/वेल) में कोलेजनेज़ का एक यू/एमएल जोड़ा गया था। उसके बाद, 15 ug/mL जिलेटिन (DQ जिलेटिन) मिलाया गया और मिश्रण को 10 मिनट तक इनक्यूबेट किया गया। 485 एनएम की उत्तेजना तरंगदैर्घ्य और 528 एनएम की उत्सर्जन तरंगदैर्घ्य पर एक माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 20 मिनट के लिए 2 मिनट के अंतराल पर अवशोषण को मापकर प्रोटियोलिसिस की दर निर्धारित की गई थी। 2-6 मिनट की अवधि में समय और अवशोषण के बीच रैखिक प्रतिगमन की ढलान की जांच करके एंजाइम गतिविधि का अनुमान लगाया गया था।

एमएमपी-2 गतिविधि परख

जैसा कि पहले वर्णित किया गया था, एमएमपी {{0}} गतिविधि जिलेटिन ज्योग्राफी द्वारा निर्धारित की गई थी [25]। फ़ाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए DMEM सीरम-मुक्त माध्यम में संवर्धित किया गया। उसके बाद, संस्कृति सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था। कल्चर सतह पर तैरनेवाला को गैर-अपचायक परिस्थितियों में जिलेटिन के 0.1 प्रतिशत w/v युक्त 10 प्रतिशत पॉलीएक्रिलामाइड जैल के अधीन किया गया था। एसडीएस को हटाने के लिए जैल को कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ट्राइटन एक्स के 2.5 प्रतिशत वी/वी के साथ दो बार धोया गया। जेल स्लैब को गलियों के अनुरूप स्लाइस में काटा गया और फिर स्लाइस को अलग-अलग टैंकों में डाल दिया गया और एक सक्रिय बफर (50 मिमी ट्रिस-एचसीएल, 200 मिमी NaCl, 10 मिमी CaCl2, pH 7.4) के साथ इनक्यूबेट किया गया जिसमें C की विभिन्न सांद्रता थी। फिस्टुला फूल का अर्क (0-200 ug/mL) 18 घंटे के लिए 37 डिग्री पर। उसके बाद, जैल की एक पट्टी को धोया गया और कूमैसी ब्रिलेंट ब्लू आर (0.1 प्रतिशत w/v) से रंगा गया और फिर 30 प्रतिशत मेथनॉल और 10 प्रतिशत एसिटिक एसिड में मिलाया गया। एमएमपी-2 गतिविधि नीले रंग की पृष्ठभूमि पर एक स्पष्ट बैंड के रूप में दिखाई दी। इमेज जे प्रोग्राम द्वारा पाचन बैंड की मात्रा निर्धारित की गई थी।

एलिसा द्वारा हयालूरोनिक एसिड (एचए) संश्लेषण परख

एचए संश्लेषण पर सी. फिस्टुला फूल के अर्क का प्रभाव एलिसा किट का उपयोग करके निर्धारित किया गया था जैसा कि पहले बताया गया है [26]। फ़ाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं (5.0 × 104 कोशिकाएं/वेल) को 24 घंटे के लिए 37 डिग्री, 5 प्रतिशत CO2 पर 24-वेल प्लेटों में डाला गया। कोशिकाओं को 6 घंटे के लिए सीरम-मुक्त माध्यम में पूर्व-उपचार किया गया और फिर 48 घंटे के लिए सी. फिस्टुला फूल अर्क (0-200 ug/mL) की विभिन्न सांद्रता के साथ या उसके बिना इलाज किया गया। सुसंस्कृत माध्यम एकत्र किया गया और HA संश्लेषण को एलिसा द्वारा मापा गया। माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके अवशोषण को 450 और 570 एनएम पर मापा गया था। उपचारित फ़ाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं से प्राप्त सुसंस्कृत सतह पर तैरनेवाला में एचए एकाग्रता की गणना की गई और एचए के मानक वक्र के साथ तुलना की गई।

टायरोसिनेस निषेध परख

टायरोसिनेस निषेध परख का निर्धारण पहले बताए गए अनुसार किया गया था [27]। सी. फिस्टुला फूल के अर्क की विभिन्न सांद्रता को एक 96-वेल प्लेट में मिलाया गया। प्रतिक्रिया 100 यू/एमएल मशरूम टायरोसिनेस युक्त सोडियम बफर (पीएच 6.4) में की गई थी। एल-डीओपीए सब्सट्रेट (1 एमएम) को प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ा गया था और फिर इसे कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया था। 490 एनएम पर अवशोषण में परिवर्तन को माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 15 मिनट तक हर 1.5 मिनट में मापा गया था। टायरोसिनेस के प्रतिशत निषेध की गणना निम्नलिखित सूत्र द्वारा की गई थी:

एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि परख

सी. फिस्टुला फूल के अर्क की एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि 1, 1-डिफेनिल-2-पिक्रिलहाइड्राजाइल (डीपीपीएच) - मुक्त रेडिकल गतिविधि का उपयोग करके निर्धारित की गई थी, जैसा कि पहले वर्णित है [28]। मेथनॉल में फूलों के अर्क की विभिन्न सांद्रता (0–100 ug/mL) तैयार की गई थी। फूल के अर्क के 1 एमएल घोल में 0.002 प्रतिशत डीपीपीएच का 1 एमएल मिलाया गया और मिश्रण को 30 मिनट के लिए अंधेरे में रखा गया। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके अवशोषण को 517 एनएम पर मापा गया था। प्रतिशत अवरोध की गणना की गई और निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके मानक विटामिन ई (1-100 यूजी/एमएल) के साथ तुलना की गई:

सी. फिस्टुला फूल के अर्क की एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि की पुष्टि एबीटीएस परख का उपयोग करके की गई थी, जैसा कि पहले बताया गया था [29]। एबीटीएस [2, 2′- एज़िनो-बीआईएस (एथिलबेनज़थियाज़ोलिन-6-सल्फोनिक एसिड)] रेडिकल धनायन 7 मिमी एबीटीएस स्टॉक समाधान को 2.45 मिमी पोटेशियम परसल्फेट (K2S2O8) (1/1, वी/वी) के साथ मिलाकर तैयार किया गया था। प्रतिक्रिया पूरी होने तक मिश्रण को 12-16 घंटों के लिए अंधेरे में रखा गया था। परख 990 μL ABTS समाधान और 10 μL फूल अर्क (0–4 ug/mL) पर आयोजित की गई थी। 6 मिनट के बाद, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके अवशोषण तुरंत 734 एनएम दर्ज किया गया। फूल अर्क की एबीटीएस गतिविधि के प्रतिशत निषेध की गणना निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके की गई थी:

सांख्यिकीय विश्लेषण

सभी डेटा को माध्य ± मानक विचलन (एसडी) मान के रूप में प्रस्तुत किया गया है। सांख्यिकीय विश्लेषण का विश्लेषण प्रिज्म संस्करण 6 द्वारा किया गया था। डनेट के परीक्षण के साथ एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया गया था। सांख्यिकीय महत्व * p < {{3 }} पर निर्धारित किया गया था। <0.0001.

परिणाम

सी. फिस्टुला फूल के अर्क का फाइटोकेमिकल लक्षण वर्णन

नमूनों को फ्रीज में सुखाने से जुड़े चरण के बाद, सी. फिस्टुला फूल के अर्क को तौला गया और आगे फाइटोकेमिकल और जैविक अध्ययन के अधीन किया गया। 18. 5 ग्राम कच्चे माल से 8 ग्राम सी. फिस्टुला फूल का अर्क प्राप्त किया गया और फूल के अर्क की प्रतिशत उपज 3.62 थी। सी. फिस्टुला फूल के अर्क का एचपीएलसी फिंगरप्रिंट एचपीएलसी विश्लेषण (छवि 1) द्वारा निर्धारित किया गया था। एचपीएलसी प्रोफ़ाइल जिसने फेनोलिक यौगिकों के शिखर को दिखाया था, उसे प्रत्येक अवधारण समय पर व्यक्तिगत घटकों के संदर्भ में लेबल किया गया था। सी. फिस्टुला फूल के अर्क के फेनोलिक यौगिकों का लक्षण वर्णन तालिका 1 में दिखाया गया है। फूल के अर्क में कुल फेनोलिक सामग्री 275.32 ± 14.21 मिलीग्राम GAE/g अर्क थी। वैनिलिक एसिड और प्रोटोकैचुइक एसिड सहित हाइड्रॉक्सीबेन्जोइक एसिड डेरिवेटिव, {{20}}.95 ± 0.09 और 2.56 ± 0 पाए गए। क्रमशः 42 मिलीग्राम/जी अर्क, जबकि गैलिक एसिड {{30}}.6{34}} ± 0.02 मिलीग्राम/जी अर्क दर्ज किया गया था। क्यूमरिक एसिड, फेरुलिक एसिड और क्लोरोजेनिक एसिड सहित हाइड्रोक्सीसेनामिक एसिड डेरिवेटिव क्रमशः 0.39 ± 0.08, 0.80 ± 0.09, और 0.83 ± 0.03 मिलीग्राम/जी अर्क पर पाए गए। फ्लेवोनोइड सामग्री 27.62 ± 3.56 मिलीग्राम सीई/जी अर्क थी। फ्लेवोनोल व्युत्पन्न के रूप में कैटेचिन को 1.10 ± 0.00 मिलीग्राम/जी अर्क पर मापा गया था।

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