त्वचा पर पॉलीऑक्सोमेटलेट्स के एंटी-एजिंग प्रभाव

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सार:सूजन और ग्लाइकेशन द्वारा अत्यधिक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का उत्पादन शरीर में उम्र बढ़ने से संबंधित विभिन्न परिवर्तनों में योगदान देता है। इसलिए, आरओएस उत्पादन को बाधित करने से त्वचा में झुर्रियाँ, मैक्युला, डलनेस और ढिलाई को रोका जा सकता है। त्वचा पर दो पॉलीऑक्सोमेटलेट्स (पीएम: वीबी2 और वीबी3) के एंटी-एजिंग प्रभावों का आकलन करने के लिए, इस अध्ययन ने जांच की कि क्या उन्होंने उन्नत ग्लाइकेशन एंड प्रोडक्ट्स (एजीई) के कारण ऑक्सीडेटिव तनाव के लिए सामान्य मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट (एनएचडीएफ) की एंटी-एजिंग प्रतिक्रियाओं को संशोधित किया है। ) या H2C 2 एक्सपोज़र। अकेले AGEE के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं में AGE रिसेप्टर्स के mRNA अभिव्यक्ति स्तरों की तुलना में, VB2 या VB3 के साथ अतिरिक्त उपचार ने FEEL -1, FEEL -2, और RAGE के अभिव्यक्ति स्तर में काफी वृद्धि की। एजीई-प्रेरित तनाव स्थितियों के तहत, वीबी उपचारों द्वारा पांच हीट-शॉक प्रोटीन के अभिव्यक्ति स्तर में उल्लेखनीय रूप से वृद्धि की गई थी। इसके विपरीत, वीबी ने कोशिका मृत्यु और इंट्रासेल्युलर आरओएस उत्पादन के प्रेरण को दबा दिया। वीबी ने तनाव की स्थिति में इन हानिकारक घटनाओं पर रोगनिरोधी प्रभाव भी डाला। इसके अलावा, VB उपचारों को AQP-1/AQP-3 अभिव्यक्ति के दमन और H2O2 जोखिम के माध्यम से प्रेरित हयालूरोनन और इलास्टिन उत्पादन के दमन दोनों को रोकने के लिए पाया गया। ये परिणाम एंटी-एजिंग एजेंट के रूप में VB2 और VB3 की क्षमता को दर्शाते हैं।

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कीवर्ड:पॉलीऑक्सोमेटलेट; ऑक्सीडेटिव तनाव; हायओ2; प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों; उन्नत ग्लाइकेशन अंत उत्पाद; सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज़; हयालूरोनन; एक्वापोरिन

1 परिचय

ग्लाइकेशन, ऑक्सीकरण, और पुरानी सूजन 3 प्रमुख उम्र बढ़ने से संबंधित प्रतिक्रियाएं हैं, और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस), जो इन प्रतिक्रियाओं के स्थलों पर उत्पन्न और जमा होती हैं, को विभिन्न उम्र बढ़ने की घटनाओं को प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है [1-5]। क्योंकि ये उम्र बढ़ने से संबंधित प्रतिक्रियाएं त्वचा में होती हैं, आरओएस की दबी हुई पीढ़ी को झुर्रियों, मैक्युला, सुस्ती और सुस्ती [6] को रोकने के लिए प्रभावी माना जाता है।

ग्लाइकेशन एक गैर-एंजाइमी रासायनिक प्रतिक्रिया है जिसके द्वारा चीनी अणु या ग्लूकोज चयापचय मध्यवर्ती (जैसे, ग्लिसराल्डिहाइड) विभिन्न प्रोटीनों में अमीनो एसिड अवशेषों का पालन करते हैं और अंततः उन्नत ग्लाइकेशन अंत उत्पाद (एजीई) उत्पन्न करते हैं [7]।प्यूरिटन विटामिन सीएजीई न केवल पूरे शरीर में उम्र बढ़ने की घटनाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, बल्कि विभिन्न प्रकार की बीमारियों में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। उदाहरण के लिए, त्वचा में कोलेजन स्वाभाविक रूप से ग्लाइकेटेड होता है और इस प्रकार, उम्र के साथ ग्लाइकेशन उत्पादों की मात्रा बढ़ जाती है। एजीई में वृद्धि को मधुमेह में एक प्रेरक भूमिका निभाने का सुझाव दिया गया है, जो इस निष्कर्ष पर आधारित है कि स्वस्थ आयु-मिलान वाले व्यक्तियों की तुलना में मधुमेह के रोगियों में त्वचीय कोला-जीन में उनकी सामग्री अधिक थी [8]। इसके अलावा, कोशिकाओं में एजीई के गठन और संचय को त्वचा की उम्र बढ़ने [8], अल्जाइमर रोग [9], उच्च रक्तचाप [10], धमनीकाठिन्य [1] और ऑस्टियोपोरोसिस [12] में फंसाया गया है।

सिस्टैन्च एंटी-एजिंग कर सकता है

AGEs विशिष्ट रोग स्थितियों के तहत उत्पन्न होते हैं, जैसे कि ऑक्सीडेटिव तनाव, और प्रिनफ्लेमेटरी मध्यस्थों के रूप में कार्य करते हैं। वे शरीर में लगभग हर प्रकार की कोशिका को प्रभावित करते हैं। एजीई के कई सेलुलर प्रभावों में दो अलग-अलग प्रकार के एजीई रिसेप्टर्स शामिल हैं; एक प्रकार को सूजन और आरओएस पीढ़ी में इंट्रासेल्युलर सिग्नल पाथवे के सक्रियण के माध्यम से फंसाया गया है, जबकि दूसरा प्रकार रिसेप्टर-मध्यस्थता के माध्यम से एजीई के क्षरण और उन्मूलन में शामिल है। एंडोसाइटोसिस और लाइसोसोम-आश्रित प्रोटियोलिसिस (चित्र 1)।प्यूरिटन विटामिन सीपूर्व एजीई रिसेप्टर्स के प्रभावों को दबाने की जरूरत है, जबकि बाद के लोगों को सेलुलर सिनसेंस को रोकने या देरी करने के लिए बढ़ावा देने की आवश्यकता है। पूर्व समूह में एजीई रिसेप्टर्स में उन्नत ग्लाइकेशन एंड प्रोडक्ट्स (रेज) और एजीई रिसेप्टर 2 (एजीई-आर 2) के लिए रिसेप्टर शामिल हैं, और बाद वाले समूह में फासीक्लिन ईजीएफ-जैसे, लैमिन-टाइप ईजीएफ-जैसे, लिंक डोमेन-युक्त शामिल हैं। मेहतर रिसेप्टर -1 (FEEL-1), FEEL-2,AGE-R1,AGE-R3, और CD36।

AGE रिसेप्टर्स के बीच AGE-R1,FEEL-1, FEEL-2, और CD-36 कोशिकाओं में बाह्य AGEs के एंडोसाइट-टोसिस और फागोसोम-लाइसोसोम फ्यूजन के माध्यम से उनके क्षरण में योगदान करते हैं। अन्य AGE रिसेप्टर्स, जैसे AGE-R2, AGE-R3, और RAGE, NADPH ऑक्सीडेज की सक्रियता के माध्यम से प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से इंट्रासेल्युलर ROS पीढ़ी को बढ़ाते हैं।

डीएनए, प्रोटीन और लिपिड को नुकसान, जो ऑक्सीडेटिव तनाव की स्थिति के तहत उत्पन्न आरओएस के कारण होता है, एक प्रमुख सेलुलर घटना है जिसे त्वरित उम्र बढ़ने और जराचिकित्सा रोगों के विकास और वृद्धि में दृढ़ता से फंसाया गया है [7,13]। इसलिए, उम्र बढ़ने की प्रक्रिया को नियंत्रित करने के लिए आरओएस के संचय को रोकना और सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज (एसओडी) जैसे एंटीऑक्सिडेंट के स्तर को बढ़ाना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, एक्वापोरिन (AQP)-1 और AQP-3, जो कोशिका झिल्ली में पानी के अणुओं की पारगम्यता को नियंत्रित करते हैं, साथ ही हाइलूरोनन और इलास्टिन त्वचा के मॉइस्चराइजेशन और एंटी-एजिंग में भाग लेते हैं। AQP-भूमि AQP-3 के अभिव्यक्ति स्तर को ऑक्सीडेटिव तनाव की स्थिति [15] के तहत घटते हुए दिखाया गया है।सिस्टैंचइलास्टिन का क्षरण, लोचदार फाइबर का एक मुख्य प्रोटीन, शिकन निर्माण का कारण माना जाता है, जबकि इसका स्थायी और पर्याप्त उत्पादन त्वचा के पुनर्जनन में निकटता से शामिल होता है [16,17]। इसलिए, त्वचा में उम्र बढ़ने की घटनाओं को दबाने के लिए इन अणुओं को तनाव की स्थिति में बनाए रखना महत्वपूर्ण है।

कई सौ पॉलीऑक्सोमेटलेट्स (पीएम), जो धातु ऑक्साइड हैं जो कई संरचनाएं बनाते हैं, को आज तक संश्लेषित किया गया है, और कुछ एंटी-नियोप्लास्टिक, एंटी-वायरल और एंटी-बैक्टीरियल गतिविधियों को प्रदर्शित करते हैं [18]। हमने पहले 2PM (VB2 और VB3) को मजबूत एंटी-बैक्टीरियल और एंटी-वायरल गतिविधियों के साथ पहचाना और प्रदर्शित किया कि उन्होंने वायरल कणों [19] से जुड़कर कोशिकाओं में वायरस के आसंजन और आक्रमण को रोक दिया। सामग्री में स्थिर और एंटी-माइक्रोबियल पीएम को शामिल करके उत्कृष्ट स्वास्थ्यकर गुणों वाले उत्पादों का विकास संभव हो सकता है [20]।

वर्तमान अध्ययन में, हमने AGEs और हाइड्रोजन पेरोक्साइड (H2O2) के लिए मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट की तनाव प्रतिक्रिया पर PMs (VB2 और VB3) के प्रभावों की जांच की और उनकी एंटी-एजिंग गतिविधियों का मूल्यांकन किया।

2। सामग्री और प्रणालियां

2.1.पीएम

VB2(K1H[(VO)(SbWgO3)2]27H-O) और VB3(Na[SbWg]-19H2O) के थोक पाउडर को हमारी पेटेंट विधि (अंतर्राष्ट्रीय पेटेंट प्रकाशन संख्या: WO2 {{11} का उपयोग करके संश्लेषित किया गया था। }19/230210)। प्रत्येक बल्क पाउडर को एक मोर्टार में पिसा गया था, जिसे अल्ट्राप्योर पानी में घोल दिया गया था, और घोल को 0.45-um फिल्टर से गुजरने के बाद प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया था। 2.2. सामग्री

DL-ग्लिसराल्डिहाइड और HzOg को वाको प्योर केमिकल इंडस्ट्रीज लिमिटेड (ओसाका, जापान) से खरीदा गया था। गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) (अंश V) सिग्मा (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से खरीदा गया था।

2.3.बीएसए का ग्लाइकेशन

AGE को पहले वर्णित [21] के रूप में तैयार किया गया था।लाभार्थीबीएसए (25 मिलीग्राम/एमएल) को 7 दिनों के लिए 37 डिग्री पर फॉस्फेट-बफर खारा, पीएच7.4 (पीबीएस) में 0.1 एम डीएल-ग्लिसराल्डिहाइड के साथ जोड़ा गया था, और प्रयोगों में एजीई के रूप में इस्तेमाल किया गया था। 2.4. सेल संस्कृतियां

किशोर चमड़ी (C-12300, PromoCell, Sickingenstr.63/65,69126 हीडलबर्ग, जर्मनी) से प्राप्त सामान्य मानव त्वचीय फ़ाइब्रोब्लास्ट (NHDF) को विशेष फ़ाइब्रोब्लास्ट विकास माध्यम (C-23010, PromoCell, Sickingenstr) का उपयोग करके सुसंस्कृत किया गया था। .63/65, 69126 हीडलबर्ग, जर्मनी) 5 प्रतिशत CO2 में 37 डिग्री पर।

2.5. AGE के साथ उपचारित कोशिकाओं में AIGE रिसेप्टर्स और हीट शॉक प्रोटीन (Hsps) की mRNA अभिव्यक्ति पर VB का प्रभाव

NHDF को AGE (100 ug/mL) के साथ 4 घंटे के लिए 37 डिग्री पर 10 ug/mL VBs की उपस्थिति या अनुपस्थिति में इलाज किया गया था और TRIzol अभिकर्मक (Am-bion) का उपयोग करके कोशिकाओं से कुल RNA निकाला गया था। AGE के mRNA अभिव्यक्ति स्तर रिसेप्टर्स और एचएसपीएस को मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर) विधि का उपयोग करके मापा गया था।

2.6.HZO2 से उपचारित कोशिकाओं में AQP-1 और AQP-3 की mRNA अभिव्यक्ति पर VB का प्रभाव

ऑक्सीडेटिव तनाव स्थितियों के तहत वीबी के चिकित्सीय प्रभावों का आकलन करने के लिए, एनएचडीएफ का इलाज {0}} .2 मिमी एचजेओ 2 के लिए 2 घंटे, पीबीएस से धोया गया, और फिर 4 घंटे के लिए 10 कुरूप / एमएल वीबी के साथ सुसंस्कृत किया गया। उनके रोगनिरोधी प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए, कोशिकाओं को 4 घंटे के लिए 10ug/mL VBs के साथ उपचारित किया गया, धोया गया, और 0.2 mM H-O2 for2h [22] के साथ सुसंस्कृत किया गया।एंटी एजिंग सिस्टैन्चकुल आरएनए को तब निकाला गया था, और qRT-PCR द्वारा mRNAs की अभिव्यक्ति की जांच की गई थी।

2.7.qRT-पीसीआर

AGE रिसेप्टर्स के mRNA स्तर, जिनमें RAGE, FEEL-1 (Stabilin-1),FEEL-2 (Stabilin-2),CD-36, AGE-R1 शामिल हैं ,AGE-R2, और AGE-R3, Hsps में से, जैसे Hsp104, gp96, Hsp90, Hsp70, Hsp60, और Hsp32, और AQP-1 और AQP-3 सहित AQP के, NHDF को एक-चरण qRT-PCR और विशिष्ट प्राइमर सेट (तालिका 1) का उपयोग करके मापा गया था। ग्लिसराल्डिहाइड के mRNA स्तर -3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज को भी आंतरिक नियंत्रण [23-28] के रूप में मापा गया था। वन-स्टेप आरटी-पीसीआर, जिसमें रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन रिएक्शन और क्यूपीसीआर द्वारा सीडीएनए संश्लेषण को पीसीआर के लिए टेम्पलेट के रूप में कुल आरएनए (500 एनजी) का उपयोग करके एकल टेस्ट ट्यूब में किया जा सकता है, लूना यूनिवर्सल वन-स्टेप qRT- का उपयोग करके आयोजित किया गया था। पीसीआर किट। इस्तेमाल किया गया पीसीआर सिस्टम तकारा थर्मल साइक्लर डाइस रियल टाइम सिस्टम था।सिस्टैंच क्या है?लूना यूनिवर्सल वन-स्टेप रिएक्शन मिक्स（2x）,10 μL, लूना वार्मस्टार्ट आरटी एंजाइम मिक्स （20×）,1 μL, एक फॉरवर्ड प्राइमर（10μM）,0.8μL, एक रिवर्स प्राइमर , 0.8μL, और टेम्प्लेट RNA को एकल प्रतिक्रिया प्रणाली में मिलाया गया था, और कुल मात्रा को न्यूक्लियस-मुक्त पानी के साथ 20 uL तक समायोजित किया गया था। प्रतिक्रिया में 30 के लिए 95 डिग्री पर 1 चक्र और 5 एस के लिए 95 डिग्री पर 50 चक्र और फिर 30 एस के लिए 60 डिग्री पर शामिल थे। एमआरएनए अभिव्यक्ति (पीसीआर के 2 चक्र) में एक 4-गुना या अधिक परिवर्तन महत्वपूर्ण माना गया था।

2.8.ऑक्सीडेटिव तनाव स्थितियों के तहत सेल व्यवहार्यता पर वीबी का प्रभाव

ऑक्सीडेटिव तनाव स्थितियों के तहत सेल व्यवहार्यता पर वीबी के प्रभावों की जांच करने के लिए, कोशिकाओं को सामग्री और विधियों की धारा 2.6 में वर्णित किया गया था और विशेष फाइब्रोब्लास्ट विकास माध्यम में एक और 18 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया गया था। सेल एकत्र किए गए और सेल काउंटिंग किट -8 (DOJINDO, Tokyo, Japan) का उपयोग करके व्यवहार्यता को मापा गया।

2.9. इंट्रासेल्युलर आरओएस उत्पादन का मापन

इंट्रासेल्युलर आरओएस को फ्लोरोमेट्री द्वारा डाइक्लोरोफ्लोरेसिन डायसेटेट (डीसीएफ-डीए; इंविट्रोजन, कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) का उपयोग करके मापा गया था। कोशिकाओं को सामग्री और विधियों की धारा 2.6 में वर्णित किया गया था, पीबीएस से धोया गया था, और 10 यूएम डीसीएफ-डीए के साथ ऊष्मायन किया गया था। 20 मिनट के लिए 37 डिग्री। इंट्रासेल्युलर आरओएस स्तरों का आकलन माइक्रोप्लेट रीडर (सिनर्जी / एचटी, बायोटेक, टोक्यो, जापान) का उपयोग करके 525 एनएम के उत्तेजना तरंग दैर्ध्य पर फ्लोरेस-सेंस की तीव्रता को मापकर किया गया था।

2.10.SOD उत्पादन का मापन

SOD को SOD परख किट (केमैन केमिकल, एन आर्बर, एमआई, यूएसए) का उपयोग करके मापा गया था। वीबी और एच 2 ओ 2 के साथ इलाज किए जाने के बाद, जैसा कि सामग्री और विधियों की धारा 2.6 में वर्णित है, कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए विशेष फाइब्रोब्लास्ट विकास माध्यम में सुसंस्कृत किया गया था और लसीका बफर को जोड़ने के बाद समरूप बनाया गया था। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, नमूने के 10 μL को कमरे के तापमान पर 200 uL xanthine ऑक्सीडेज के साथ मिलाया गया था, और 450 एनएम पर अवशोषण 30 मिनट के बाद मापा गया था।

2.11. Hyaluronan और Elastin के उत्पादन का मूल्यांकन

सामग्री और विधियों की धारा 2.6 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं को VBs और HzO2 के साथ इलाज किया गया था, संस्कृति सतह पर तैरनेवाला में hyaluronan की मात्रा का ठहराव Hyaluronan एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख किट (R & D sys-tems।, Inc., मिनियापोलिस) का उपयोग करके किया गया था। , एमएन, यूएसए)। इलास्टिन के उत्पादन को मापने के लिए, कोशिकाओं को lysed किया गया था, और एक स्पष्ट lysate तैयार किया गया था। मानव घुलनशील इलास्टिन एलिसा किट (एविसेरा बायोसाइंस इंक, एसके 00806-01, सांता क्लारा, सीए, यूएसए) का उपयोग करके लाइसेट में इलास्टिन की मात्रा निर्धारित की गई थी।

2.12.सांख्यिकीय विश्लेषण

सभी प्रयोगों को तीन प्रतियों में किया गया था। परिणाम औसत ± एसडी के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं। छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके मतभेदों के महत्व की जांच की गई, और अंतर को महत्वपूर्ण माना गया जब पी<0.05.>

3.1. आयु-प्रेरित तनाव वातावरण में वीबी के एंटी-एजिंग प्रभाव

3.1.1. आयु रिसेप्टर mRNAs की अभिव्यक्ति

हमने प्रदर्शित किया कि VB2 और VB3 दोनों ने विभिन्न मानव रोगजनकों के खिलाफ उच्च आत्मीयता के साथ सूक्ष्मजीवों को बांधकर और मेजबान कोशिकाओं के साथ बातचीत में हस्तक्षेप करके महत्वपूर्ण एंटी-माइक्रोबियल गतिविधियों का प्रदर्शन किया। कार्यात्मक बहुशक्ति के लिए वीबी की क्षमताओं को और स्पष्ट करने के लिए, हमने यहां त्वचा पर वीबी के एंटी-एजिंग प्रभावों की जांच करने का प्रयास किया। एनएचडीएफ को तनाव की स्थिति में वीबी के साथ सुसंस्कृत किया गया था और एंटी-एजिंग घटना से संबंधित विभिन्न मापदंडों के स्तर को मापा गया था। एनएचडीएफ महत्वपूर्ण कोशिकाएं हैं जो डर्मिस में मौजूद होती हैं और एपिडर्मल केराटिनोसाइट्स के साथ एपिडर्मिस की स्थिति को प्रभावित करती हैं। जब NHDF को केवल क्रमिक रूप से पतला VB2 या VB3 के साथ सुसंस्कृत किया गया था, तो AGE रिसेप्टर्स के mRNA अभिव्यक्ति स्तरों में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं देखा गया था। हालांकि, एजीई के साथ उपचार ने त्वचा के फाइब्रोब्लास्ट में अधिकांश एजीई रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति को प्रेरित किया। अकेले एजीई के जवाब में एजीई रिसेप्टर्स के एमआरएनए अभिव्यक्ति स्तरों की तुलना में, वीबी 2 या वीबी 3 के साथ एक अतिरिक्त उपचार ने उनके स्तर को स्पष्ट रूप से बढ़ा दिया। FEEL-1, FEEL-2, और RAGE के mRNA अभिव्यक्ति स्तर में उल्लेखनीय रूप से वृद्धि हुई (चित्र 2)।

3.1.2.Hsp mRNAs की अभिव्यक्ति

हमने AGE-उपचारित NHDF में Hsp mRNAs की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए VB2 और VB3 की क्षमताओं की जांच की। जब VB2 या VB3 को अकेले जोड़ा गया तो उनमें विभिन्न Hsp के RNA स्तरों में कोई परिवर्तन नहीं देखा गया। हालाँकि, Hsp90 को छोड़कर, सभी Hsps के mRNA स्तर में AGE को जोड़ने से काफी वृद्धि हुई थी, और इस प्रतिक्रिया को VB2 और VB3 (चित्र 3) के साथ अतिरिक्त उपचार द्वारा स्पष्ट रूप से संवर्धित किया गया था।

3.2. ऑक्सीडेटिव तनाव स्थितियों के तहत सेल व्यवहार्यता पर वीबी का प्रभाव

बाद के प्रयोगों में, हमने जांच की कि क्या वीबी ने एनएचडीएफ की प्रतिक्रिया को ऑक्सीडेटिव तनाव में बदल दिया है। जब NHDF 0.2 mM H2O2 के साथ ऑक्सीडेटिव तनाव के संपर्क में आया, तो कोशिका जीवित रहने की दर घटकर 59 प्रतिशत हो गई। जब VB2 या VB3 को समान तनाव स्थितियों के तहत इन कोशिकाओं में जोड़ा गया, तो सेल के जीवित रहने की दर VB एकाग्रता-निर्भर तरीके से काफी हद तक ठीक हो गई। वीबी के साथ उपचार के संबंध में, जीवित रहने की दर बढ़कर 76 प्रतिशत हो गई जिसमें वीबी2 300 यूजी/एमएल और 78 प्रतिशत वीबी3 के साथ 300 यूजी/एमएल हो गया। इसके अलावा, जब VB2 या VB3 के साथ उपचार के बाद NHDF को ऑक्सीडेटिव तनाव से अवगत कराया गया, तो कोशिकाओं के ऑक्सीडेटिव तनाव के प्रतिरोधी बनने की अधिक संभावना थी। यह प्रेरित प्रतिरोध पूरी तरह से एकाग्रता olf VBs पर निर्भर था और सेल व्यवहार्यता में उल्लेखनीय वृद्धि VB2 और VB3 के साथ उपचारित कोशिकाओं में 10 ug/mL (चित्र 4) जितनी कम सांद्रता में देखी गई थी।

3.3. इंट्रासेल्युलर आरओएस और एसओडी के उत्पादन पर वीबी का प्रभाव

एंटी-एजिंग एजेंटों के रूप में वीबी के प्रभावों की जांच करने के लिए, ऑक्सीडेटिव तनाव-प्रेरित इंट्रासेल्युलर आरओएस उत्पादन पर वीबी के प्रभाव का मूल्यांकन एक संकेतक (चित्रा 5 ए) के रूप में फ्लोरोसेंट डीसीएफ-डीए का उपयोग करके किया गया था। एच 2 ओ 2 के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति की तीव्रता में वृद्धि हुई है। 3.7-सामान्य कोशिकाओं से गुना। जब एच-ओ 2 के संपर्क में आने के बाद कोशिकाओं को वीबी के साथ इलाज किया गया था, तो इंट्रासेल्युलर आरओएस उत्पादन को एकाग्रता-निर्भर तरीके से वीबी के साथ उपचार द्वारा काफी दबा दिया गया था। इसके अलावा, H2O 2- प्रेरित ROSlevels को VBs के साथ कोशिकाओं के पिछले उपचार द्वारा स्पष्ट रूप से दबा दिया गया था।

ROS उत्पादन के विपरीत, H2O2 के संपर्क में आने के बाद SOD का स्तर नियंत्रण के 56 प्रतिशत तक कम हो गया और एकाग्रता-निर्भर तरीके से VB उपचार के साथ ठीक हो गया। इसके अलावा, वीबी के साथ एक पिछला उपचार एसओडी (चित्रा 5 बी) के उत्पादन में एच 2 ओ 2- प्रेरित कटौती के प्रतिरोध को प्रदान करता दिखाई दिया।

3.4.AQP-1 और AQP-3 की mRNA अभिव्यक्ति पर VB के प्रभाव और ऑक्सीडेटिव तनाव स्थितियों के तहत Hyaluronan और Elastin के उत्पादन पर

चित्र 6a,b AQP-1 और AQP-3 के mRNA स्तर को दर्शाता है, जो कोशिका की सतह के अणु हैं जो त्वचा को नमी प्रदान करने में योगदान करते हैं। AQP -1 और AQP -3 की mRNA अभिव्यक्ति में स्पष्ट रूप से कमी आई जब NHDF को H202 के संपर्क में लाया गया, लेकिन VB उपचारों द्वारा ऑक्सीडेटिव तनाव के बाद एकाग्रता-निर्भर तरीके से पुनर्प्राप्त किया गया। VBs के साथ कोशिकाओं के पिछले उपचार ने H2O 2- के प्रतिरोध को mRNA अभिव्यक्ति स्तरों में कमी को प्रेरित किया। कोशिकाओं में VBs का प्रभाव 1 ug/mL और अधिक की सांद्रता में देखा गया, और VB2 और VB3 के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया।

चित्रा 7ए, बी संस्कृति सतह पर तैरनेवाला में स्रावित हयालूरोनन की मात्रा और इंट्रासेल्युलर इलास्टिन की मात्रा को दर्शाता है। hyaluronan का स्तर H-O2 उपचार के बाद नियंत्रण के स्तर से लगभग 50 प्रतिशत तक कम हो गया और VB उपचारों द्वारा इस कमी को ठीक नहीं किया गया। दूसरी ओर, एच ओ 2- हाइलूरोनन प्रो-डक्शन में प्रेरित कमी उच्च सांद्रता (चित्रा 7 ए) पर वीबी के साथ कोशिकाओं के पिछले उपचार द्वारा कम से कम दिखाई दी।

हयालूरोनन के समान, इलास्टिन का उत्पादन H2O2 उपचार के बाद नियंत्रण के 56 प्रतिशत तक कम हो गया। यह कमी वीबी उपचारों द्वारा पुनर्प्राप्त नहीं की गई थी। दूसरी ओर, इलास्टिन उत्पादन में HzOz- प्रेरित कटौती ज्यादातर उच्च सांद्रता पर VBs ​​के साथ कोशिकाओं के पिछले उपचार द्वारा रद्द कर दी गई। इलास्टिन का उत्पादन नियंत्रण से ऊपर के स्तर तक बढ़ गया जब कोशिकाओं को VB2 के साथ 100 ug/mL या उससे अधिक और VB3 को 300 ug/mL (चित्र 7b）) पर उपचारित किया गया।

4। चर्चा

हमने पहले बताया था कि वीबी बहुत स्थिर अणु होते हैं जो मजबूत एंटी-वायरल और एंटी-बैक्टीरियल गतिविधियों को प्रदर्शित करते हैं [19]। उन निष्कर्षों के अलावा, वीबी को उनकी बेहद कम साइटोटोक्सिसिटी की विशेषता है। वास्तव में, यह पाया गया है कि इस अध्ययन में उपयोग की गई कोशिकाओं की तुलना में 300 गुना अधिक सांद्रता के साथ इलाज किए जाने पर भी वे कोई साइटोटोक्सिसिटी नहीं करते हैं। 2 PM (VB2 और VB3) की बहुमुखी प्रतिभा की जांच करने के लिए, हमने यहां त्वचा पर उनके एंटी-एजिंग प्रभावों के साथ-साथ AGE और H-Oz के संपर्क में NHDF में साइटोप्रोटेक्टिव प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने की क्षमता पर ध्यान केंद्रित किया। प्राप्त परिणामों ने स्पष्ट रूप से प्रदर्शित किया कि केवल सामान्य त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट के लिए वीबी के अलावा कोशिकाओं में चिह्नित परिवर्तन को प्रेरित नहीं किया, लेकिन साइटोप्रोटेक्टिव अणुओं की अभिव्यक्ति को विनियमित किया और तनाव के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं में प्रतिकूल प्रतिक्रियाओं को कम किया। विशेष रूप से, न तो वीबी 2 और न ही वीबी 3 ने प्रभावित किया। एनएचडीएफ में एजीई रिसेप्टर्स या एचएसपीएस की एमआरएनए अभिव्यक्ति जब अकेले इस्तेमाल की जाती है (आंकड़े 2 और 3) एनएचडीएफ में एजीई के संपर्क में, वीबी 2 और वीबी 3 ने एजीई रिसेप्टर्स के प्रतिलेखन में उल्लेखनीय रूप से वृद्धि की, विशेष रूप से एफईईएल -1, एफईईएल -2, और तेज़ी। एक पिछले अध्ययन ने बताया कि FEEL -1 और FEEL -2 ने कोशिकाओं में मुक्त AGEs के एंडोसाइटोसिस और लाइसोसोम [29] द्वारा उनके क्षरण में भाग लेकर साइटोप्रोटेक्शन में भूमिका निभाई। दूसरी ओर, आरएजीई को एनएडीपीएच ऑक्सीडेज को सक्रिय करके आरओएस की पीढ़ी में योगदान करने के लिए जाना जाता है। रेज के बढ़े हुए ट्रांसक्रिप्शन को बढ़े हुए आरओएस उत्पादन से जोड़ा जा सकता है। रोष के मामले में, प्रतिलेखन के दौरान ब्याह उत्परिवर्तन होता है, जिसके परिणामस्वरूप दो प्रकार होते हैं; एक रेज है जिसमें इंट्रासेल्युलर डोमेन (सी-टर्मिनली ट्रंकेटेड रेज: सी-रेज) का अभाव है, जो कोशिकाओं से निकलने वाला घुलनशील रेज प्रोटीन है, और दूसरा रेज है जिसमें एक बाह्य वी डोमेन (एन-टर्मली ट्रंकेटेड रेज: एन-रेज) का अभाव है। ) [30,31]। क्योंकि इन दोनों काटे गए RAGE ने AGE रिसेप्टर्स के रूप में कोई कार्य नहीं किया, RAGE का बढ़ा हुआ ट्रांसक्रिप्शन आवश्यक रूप से ROS के उत्पादन को बढ़ावा नहीं दे सकता है। यह मुद्दा आगे के अध्ययन का वारंट करता है।

हमने तब एचएसपीएस की एमआरएनए अभिव्यक्ति पर वीबी के प्रभावों की जांच की। एचएसपीएस की अभिव्यक्ति आम तौर पर पर्यावरणीय तनाव, जैसे गर्मी, पराबैंगनी प्रकाश और आरओएस द्वारा विनियमित होती है। Hsps नए संश्लेषित प्रोटीन को स्थिर करके सही तह सुनिश्चित करने या तनाव से क्षतिग्रस्त प्रोटीन को वापस करने में मदद करके चैपरोन कार्य करता है। Hsp104 को प्रोटीन के पृथक्करण में मध्यस्थता करने के लिए दिखाया गया है [32] और gp96 इंट्रासेल्युलर एंटीजन प्रस्तुति [33] में शामिल है। Hsp90 तनाव के संपर्क में आने पर प्रोटीन को ठीक से मोड़ने और स्थिर रहने में सहायता करता है और कड़ाई से चयनित प्रोटीन की परिपक्वता की सुविधा देता है [34]। Hsp70 को उनके तह, परिवहन और क्षरण को नियंत्रित करके प्रोटीन की गुणवत्ता को विनियमित करने के लिए दिखाया गया है [35,36]। Hsp60 माइटोकॉन्ड्रिया में प्रोटीन की तह को बनाए रखता है और माइटोकॉन्ड्रिया में प्रोटीन के झिल्ली प्रवेश में शामिल होता है [37]। Hsp32 हीम के क्षरण में शामिल है, जिसके उत्पाद एंटीऑक्सीडेंट गतिविधियों को प्रदर्शित करते हैं [38]। क्योंकि VB2 और VB3 दोनों समान रूप से AGE तनाव के अधीन कोशिकाओं में Hsps की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने में सक्षम हैं, VB तनाव की स्थिति में शक्तिशाली साइटोप्रोटेक्टिंग एजेंटों के रूप में कार्य करते दिखाई देते हैं।

H202 के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं की प्रतिक्रिया की जांच के लिए एक प्रयोग में, हमने सेल व्यवहार्यता में लगभग 40 प्रतिशत की कमी देखी। इसके विपरीत, वीबी उपचारों ने एकाग्रता-निर्भर तरीके से सेल व्यवहार्यता में उल्लेखनीय रूप से वृद्धि की। इसके अलावा, वीबी के साथ इलाज किए गए कोशिकाओं की प्रतिक्रिया और फिर एच 2 ओ 2 (वीबी के रोगनिरोधी प्रभाव) के साथ ऊष्मायन वीबी उपचार (वीबी के चिकित्सीय प्रभाव; चित्रा 4) से पहले एच 2 ओ 2 के साथ इनक्यूबेट की गई कोशिकाओं की तुलना में अधिक मजबूत था। अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट करने के लिए, हमने इंट्रासेल्युलर आरओएस और एसओडी उत्पादन स्तरों को स्वीकार किया। इंट्रासेल्युलर आरओएस स्तरों को एचजेओ 2 उपचार द्वारा स्पष्ट रूप से बढ़ाया गया था लेकिन वीबी 2 और वीबी 3 द्वारा एकाग्रता-निर्भर तरीके से दबा दिया गया था। आरओएस उत्पादन पर वीबी का यह रोगनिरोधी प्रभाव इसके चिकित्सीय प्रभाव (चित्रा 5 ए) से भी अधिक मजबूत था। दूसरी ओर, SOD का उत्पादन, ROS का एक शक्तिशाली मेहतर, H2O2 उपचार से काफी कम हो गया था; वीबी उपचार (चित्रा 5 बी) द्वारा एसओडी की मात्रा में थोड़ा सुधार किया गया था। इसलिए, H2O 2- प्रेरित कोशिका मृत्यु इंट्रासेल्युलर ROS स्तरों में वृद्धि से संबंधित प्रतीत होती है। क्योंकि एसओडी उत्पादन स्तर वीबी से स्पष्ट रूप से प्रभावित नहीं थे, वीबी उपचार के बाद आरओएस उत्पादन में देखी गई कमी आरओएस पीढ़ी के सेलुलर प्रतिक्रिया पर एक निरोधात्मक प्रभाव के कारण हो सकती है। अब तक, इस अध्ययन में प्रयुक्त डीसीएफ-डीए आरओएस का पता लगाने के लिए एक बहुमुखी जांच है और इसकी कोई विशिष्टता नहीं है, इसलिए यह स्पष्ट नहीं किया गया है कि आरओएस प्रजाति को वीबी के साथ उपचार द्वारा दबा दिया जाता है, या क्या प्रत्येक आरओएस प्रजाति का उत्पादन होता है। वीबी द्वारा दबा दिया गया। इस मुद्दे पर और स्पष्टीकरण की आवश्यकता है।

फाइब्रोब्लास्ट्स को एपिडर्मल मॉइस्चराइजेशन में भूमिका निभाते हुए दिखाया गया है, और AQP की कार्यात्मक भूमिका, विशेष रूप से AQP-1 और AQP-3, जो फ़ाइब्रोब्लास्ट में व्यक्त होते हैं और कोशिकाओं में पानी के अणुओं के प्रवाह में शामिल होते हैं, अधिक ध्यान आकर्षित कर रहा है। इसके अलावा, कोशिकाओं से स्रावित हयालूरोनन को त्वचा के मॉइस्चराइजेशन [39] में फंसाया गया है। वर्तमान अध्ययन में, AQP -1 और AQP -3 की mRNA अभिव्यक्ति और हयालूरो-नैन के स्राव दोनों को ऑक्सीडेटिव तनाव (Iigures 6a, b और 7a) द्वारा कम किया गया था, लेकिन इलाज के साथ कोशिकाओं में बरामद किया गया था। वीबी2 या वीबी3. पिछले परिणामों के समान, ऑक्सीडेटिव तनाव पर वीबी-प्रेरित सुधारकारी प्रभाव तब अधिक प्रभावी थे जब उन्होंने रोगनिरोधी कार्य किया (चित्र 7ए, बी)। मनुष्यों में, 50 प्रतिशत हयालूरोनन त्वचा में मौजूद होता है [40]। उम्र बढ़ने के साथ एपिडर्मिस में हयालूरोनन कम हो जाता है, जबकि यह डर्मिस में बना रहता है। यह परिवर्तन नमी के नुकसान, लोच में कमी और त्वचा के सिकुड़न [40] में योगदान देता है। इसके अलावा, ऑक्सीडेटिव तनाव को कोलेजन और इलास्टिन को कम करने के लिए दिखाया गया है, जिसके बाद झुर्रियों का निर्माण होता है और त्वचा के पुनर्जनन में गिरावट आती है |41]। वर्तमान अध्ययन में, वीबी के रोगनिरोधी उपयोग ने ऑक्सीडेटिव तनाव स्थितियों के तहत हयालूरोनन और इलास्टिन में कमी को दबा दिया, जिससे एंटी-एजिंग एजेंटों के रूप में वीबी2 और वीबी3 की क्षमता और एंटी-एजिंग गतिविधि को बढ़ाने के लिए उनके रोगनिरोधी उपयोग का सुझाव दिया गया। अब तक, हमने तनाव की स्थिति में मानव फाइब्रोब्लास्ट पर वीबी के प्रभावों का प्रदर्शन किया है, लेकिन त्वचा पर वीबी के सटीक एंटी-एजिंग प्रभावों को स्पष्ट करने के लिए, केराटिनोसाइट्स पर वीबी के प्रभाव को निर्धारित करना और विवो प्रयोगों में आचरण करना आवश्यक होगा। हम इन मुद्दों पर शुरुआती चरण में काम करने की कोशिश करते हैं और वीबी के प्रभावों को स्पष्ट करते हैं। इसके अलावा, यदि वीबी के लाभकारी तंत्र स्पष्ट हो जाते हैं, तो हम उच्च मूल्य वाले उत्पादों को विकसित करने के लिए स्वच्छता उत्पादों और सौंदर्य प्रसाधनों में वीबी को लागू करने का प्रयास करते हैं जो समाज में अधिक योगदान करते हैं।

5। निष्कर्ष

वर्तमान परिणामों के आधार पर वीबी के प्रभावों को चित्र 8 में संक्षेपित किया गया है। जब कोशिकाओं को अकेले VB2 या VB3 से उपचारित किया गया तो विभिन्न मापदंडों में कोई परिवर्तन नहीं देखा गया। हालाँकि, AGE और HzOz के कारण तनाव की स्थिति में, इंट्रासेल्युलर ROS उत्पादन को बढ़ाया गया था। VB2 और VB3 ने अधिमानतः साइटोप्रोटेक्टिंग अणुओं की अभिव्यक्ति को प्रेरित किया और ROS उत्पादन को दबा दिया, जो अंततः गंभीर बीमारियों, जैसे कि धमनीकाठिन्य और कैंसर, साथ ही उम्र बढ़ने से संबंधित घटनाओं का कारण बन सकता है। VB2 और VB3 ऐसे यौगिक हैं जो दोनों मजबूत एंटी-वायरल और एंटी-बैक्टीरियल गतिविधियों का प्रदर्शन करते हैं। वर्तमान परिणाम त्वचा के लिए एंटी-एजिंग एजेंट के रूप में VB2 और VB3 की क्षमता का सुझाव देते हैं।

तनाव के बिना एक सामान्य वातावरण में, एंटीऑक्सिडेंट होमोस्टैटिकली री-मूव आरओएस का उत्पादन करते हैं। दूसरी ओर, AGE और H2O2 से प्रेरित तनाव की स्थिति में ROS उत्पादन बढ़ता है, जिससे उम्र बढ़ने, सूजन और एथेरोस्क्लेरोसिस हो सकता है। वीबी में तनाव की स्थिति में एंटीऑक्सिडेंट के उत्पादन को बढ़ावा देने और कोशिकाओं की तनाव प्रतिक्रिया को बढ़ाने की क्षमता होती है।

यह लेख एपल से निकाला गया है। विज्ञान 2021, 11, 11948। https://doi.org/10.3390/app112411948 https://www.mdpi.com/journal/applsci