बहस

हमने एसएनसीए के सेल-टू-सेल ट्रांसमिशन के अध्ययन के लिए एक मात्रात्मक, रीयल-टाइम तकनीक विकसित की हैसी एलिगेंस. मॉडल एसएनसीए समुच्चय के प्रगतिशील संचय सहित सिन्यूक्लिनोपैथी की कई प्रमुख विशेषताएं प्रदर्शित करता है,तंत्रिका अध: पतन,व्यवहार की कमी, औरजीवन काल कम कर दिया. आनुवंशिक और दोनोंऔषधीय जोड़तोड़जानवरों के बीच मजबूत संबंध दिखाया हैउम्र बढ़ने की दर, ट्रांससेलुलर एसएनसीए ट्रांसमिशन, और न्यूरोडीजेनेरेटिव फेनोटाइप्स, और इसी तरह, विभिन्न जोड़तोड़ जुड़े हुए हैंबुढ़ापा विरोधी प्रभावइन घटनाओं की प्रगति को धीमा कर सकता है।सिन्यूक्लिनोपेथी की उम्र बढ़ने पर निर्भर प्रगतिप्रोटीन क्षरण में गिरावट के साथ है।बुढ़ापा रोधी उपचारप्रोटीन क्षरण की मध्यस्थता करने वाली प्रणालियों को पुनर्स्थापित कर सकता है। इसके अलावा, लाइसोसोमल फ़ंक्शन की बहाली ने इन उम्र बढ़ने के मॉडल में समुच्चय के प्रसार और साथ में न्यूरोडीजेनेरेशन को कम किया। BiFC व्यापक रूप से उपयोग किया जाता हैफ्लोरिडायूरेसेंस तकनीक जिसे जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन और प्रोटीन डिमराइजेशन और/या ओलिगोमेराइजेशन का आकलन करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया है।7 V1S-SV2 BiFC जोड़ी को दिखाया गया हैफ्लोरिडाजब ये प्रोटीन स्तनधारी कोशिकाओं में सह-अभिव्यक्त होते हैं तो एसएनसीए के डिमराइजेशन/ऑलिगोमेराइजेशन पर प्रभाव पड़ता है।7 पिछले अध्ययन में,17 V1S और SV2 में से किसी एक को व्यक्त करने वाली न्यूरोब्लास्टोमा सेल लाइनों को उत्पन्न करके, हमने दिखाया है कि SNCA प्रोटीन का सेल-टू-सेल ट्रांसफर और स्थानांतरित प्रोटीन का जमावअंतर्जात एसएनसीए को बीआईएफसी के साथ देखा जा सकता हैफ्लोरिडारोशनीइन कोशिकाओं के सहसंस्कृति के दौरान।

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BiFC प्रणाली के महत्वपूर्ण तकनीकी मुद्दों में से एक प्रत्येक प्रोटीन की कोशिका प्रकार-विशिष्ट अभिव्यक्ति को सत्यापित करना है।यद्यपि प्रत्येक कोशिका प्रकार में एसएनसीए ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति का मात्रात्मक विश्लेषण तकनीकी रूप से व्यवहार्य नहीं है, हमारे पास इस तर्क का समर्थन करने वाले डेटा की एक श्रृंखला है कि एसएनसीए विशेष रूप सेकेवल इच्छित सेल प्रकारों में व्यक्त किया गया। सबसे पहले, डीएसआरडविफलताएंकैंसर का पता केवल फ्लिप -21 में लगाया जाता है न्यूरॉन्स, ग्रसनी पेशी कोशिकाओं में बिल्कुल नहीं। दूसरा, एक अत्यधिक विशिष्ट और संवेदनशील एंटीबॉडी के साथ एसएनसीए के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना इस प्रोटीन की अभिव्यक्ति को विशेष रूप से इच्छित सेल में प्रदर्शित करता है।प्रकार। तीसरा, कृमियों में उसी BiFC जोड़ी की अभिव्यक्तिसाथडाइन-1उत्परिवर्तन सिग्नीफिफीआसानी से BiFC को कम कर दियाफ्लोरिडाप्रतिदीप्ति संकेत, यह दर्शाता है कि BiFC की पीढ़ीफ्लोरिडाuoresइसके लिए एंडोसाइटोसिस की आवश्यकता होती है। इससे पता चलता है कि BiFC संकेत एक ही प्रकार की कोशिकाओं में BiFC जोड़ी के सह-अभिव्यक्ति से नहीं आया था, बल्कि प्रोटीन के अंतरकोशिकीय संचरण से प्राप्त हुआ था।

उपन्यास आनुवंशिक न्यूनाधिक की पहचान के लिए प्रणाली। इसके अलावा, सी। एलिगेंस में ग्रसनी की विशिष्ट संरचना आनुवंशिक और छोटे-अणु संशोधक के लिए बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग में सिंक सिन्यूक्लिनोपैथी के संचरण में परिवर्तन की सुविधाजनक पहचान की अनुमति देगी।

उम्र बढ़ने के प्रभावएकत्रीकरण के बजाय "संचरण" पर प्रक्रियाएं, कागज का प्रमुख विषय है। अब, हम यह स्पष्ट करना चाहते हैं कि हम यह तर्क देने की कोशिश नहीं कर रहे हैं कि उम्र बढ़ने और लाइसोसोमल शिथिलता केवल कोशिका-स्वायत्त एकत्रीकरण को प्रभावित किए बिना समुच्चय के संचरण को प्रभावित करती है। हमारा BiFC सिस्टम ट्रांसमिशन इवेंट की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक उत्कृष्ट सिस्टम है, लेकिन इसे कॉल-ऑटोनॉमस एग्रीगेशन की निगरानी के लिए डिज़ाइन नहीं किया गया है। पिछले अध्ययन, 25-27 हमारे अपने सहित,28 कोशिका-स्वायत्त एसएनसीए एकत्रीकरण की निकासी में लाइसोसोमल डिसफंक्शन के प्रभावों को संबोधित करते हैं। हालाँकि, हम यह भी बताना चाहेंगे कि इस बात का कोई निश्चित प्रमाण नहीं है कि इन अध्ययनों ने केवल कोशिका-स्वायत्त एकत्रीकरण को देखा है, जो ट्रांससेलुलर एग्रीगेट ट्रांसमिशन और प्रवर्धन के प्रभावों को छोड़कर है। हम इस बात पर भी जोर देना चाहते हैं कि समग्र प्रसारण के लिए एकत्रीकरण आरंभ एक परम आवश्यकता है। वास्तव में, हम दिखाते हैं कि एकल ट्रांसजेनिक जानवरों (चित्र। 8F) में भी बेसल स्तर की कोशिका-स्वायत्त एकत्रीकरण अनायास होती है।

GlcNAc के बुढ़ापा रोधी प्रभावडीएएफ -16-स्वतंत्र होने के लिए वर्णित किया गया था। यह इंगित करता है कि जीएलसीएनएसी डीएएफ -16 फेनोटाइप को सीधे डीएएफ -16 मार्ग को प्रभावित करके नहीं, बल्कि स्वतंत्र उम्र बढ़ने के मार्गों के माध्यम से कार्य करके बचाता है। हमारे द्वारा पेश किए गए डेटा से पता चलता है कि एसएनसीए संचरण एक विशिष्ट उम्र बढ़ने के मार्ग के नियंत्रण में नहीं है, बल्कि सामान्य उम्र बढ़ने से नियंत्रित होता है।

हमारा वर्तमान अध्ययन पीडी और संबंधित सिन्यूक्लिनोपैथियों की प्रगति को रोकने या धीमा करने के लिए चिकित्सीय रणनीतियों के रूप में सामान्य एंटी-एजिंग दृष्टिकोणों के उपयोग पर विचार करने के लिए एक आधार प्रदान करता है। इसके अलावा, इन रोगों की प्रगति को रोकने या देरी करने के उद्देश्य से लाइसोसोमल फ़ंक्शन के एन्हांसर को उपचार के लिए उम्मीदवारों के रूप में माना जा सकता है। सिद्धांत रूप में यही दृष्टिकोण अन्य उम्र से संबंधित neurodegenerative रोगों पर लागू किया जा सकता है, जिनमें से कई विशिष्ट प्रोटीन समुच्चय के प्रसार के माध्यम से प्रगति करने के लिए सोचा जाता है। यह मानते हुए कि विभिन्न प्रोटीन समुच्चय का प्रसार एक ही मूल सिद्धांत को साझा करता है, हम सावधानी से अनुमान लगाते हैं कि बहुत से न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों की प्रगति को रोकने के लिए एंटी-एजिंग और प्रो-लाइसोसोम रणनीतियों को एक सामान्य चिकित्सा में विकसित किया जा सकता है। MAPT, पॉलीग्लुटामाइन प्रोटीन और TARDBP.1 से जुड़े अन्य ट्रांसमिशन मॉडल पर BiFC- आधारित पशु मॉडल को लागू करके इस परिकल्पना को संबोधित किया जा सकता है।

सामग्री और तरीके

नेमाटोड के स्ट्रेन और कल्चरिंग सभी स्ट्रेन को मानक प्रक्रियाओं का उपयोग करके नियंत्रित किया गया और नेमाटोड ग्रोथ मीडियम (एनजीएम) प्लेटों पर एस्चेरिचिया कोली (ई. कोलाई) स्ट्रेन OP50 के 20 C.29 वाइल्ड-टाइप ब्रिस्टल N2 और म्यूटेंट स्ट्रेन के लॉन युक्त प्लेटों पर उगाया गया। unc-119(ed3), dyn-1(ky51), और asp-4(ok2693) कैनोर्हाडाइटिस जेनेटिक्स सेंटर (CGC; मिनेसोटा विश्वविद्यालय, सेंट पॉल, MN से प्राप्त किए गए थे , अमेरीका)। म्यूटेंट स्ट्रेन asp-1(tm666) C. एलिगेंस नेशनल बायो रिसोर्स प्रोजेक्ट (NBRP; टोक्यो वीमेंस मेडिकल यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन, टोक्यो, जापान) द्वारा प्रदान किया गया था। म्यूटेंट स्ट्रेन डैफ-2(ई1370) और डैफ-16(म्यू86) प्रोफेसर क्यूह्युंग किम (डीजीआईएसटी, डेगू, कोरिया) के उदार उपहार थे।

सी एलिगेंस के लिए प्लास्मिड निर्माण

V1S और SV2 टेम्प्लेट प्लास्मिड डॉ पामेला मैकलीन (मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल, बोस्टन, एमए, यूएसए) से उदार उपहार थे। एक) Pmyo-2::EGFP The myo-2 प्रमोटर (Pmyo-2) वाइल्ड-टाइप N2 वर्म्स से प्राप्त जीनोमिक डीएनए से PCR-प्रवर्धित था।

एक HindIII साइट युक्त सेंस प्राइमर, 50 -GACAAGCTTGGGTTTTGTGCTGTG GACGTT-30, और एक BAMHI साइट युक्त एक एंटीसेन्स प्राइमर, 50 - GACGGATCCTTCTGTGTCTGACGATCGAGG-30 का उपयोग किया गया। Pmyo-2::Pfx_EGFPT vector.30 Two) Pmyo-2::SNCA(Myc) A sense के HindIII और BAMHI साइटों में PCR उत्पाद डालकर EGFP जनरेट किया गया सैलआई साइट वाला प्राइमर, 50 - AGCGTCGACGC CACCATGGATGTATTCATGAAAGGAC-30 और एक एंटीसेन्स प्राइमर जिसमें myc टैग सीक्वेंस और BglII साइट है, 50 - AGCA GATCTCTACAGATCCTCTTCAGAGATGAGTTTCTGCTCG GCTTCAGGTTCGTAGTCTTG -30 का उपयोग MYC- को बढ़ाने के लिए किया गया था। टैग किए गए मानव SNCA को PCDNA3.1 MycHis SNCA वेक्टर से प्राप्त किया गया। 28 Pmyo-2::EGFP के EGFP अंश को Pmyo-2::SNCA के निर्माण के लिए PCR-प्रवर्धित Myc-टैग किए गए मानव SNCA अंश द्वारा प्रतिस्थापित किया गया (माइसी)। तीन) Pmyo-2::V1S सैली साइट युक्त सेंस प्राइमर, 50 - AGCGTCGACGC CACCATGGTGAGCAAGGCCGAGG-30, और एंटीसेन्स प्राइमर जिसमें BglII साइट है, 50 -AGCAGATCTTTAGGCTT CAGGTTCGTAGTC{{ 25}} का उपयोग V1S को बढ़ाने के लिए किया गया था। इसके अलावा, Pmyo-2::EGFP के EGFP अंश को Pmyo-2::V1S के निर्माण के लिए PCR-प्रवर्धित V1S खंड द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था। चार) Pmyo-2::V1Q25 एक सेंस प्राइमर जिसमें क्ले साइट है, 50 - TAAGCAATCGA TATGGCGACCCTGGAAAAGCTG-30, और एंटीसेन्स प्राइमर जिसमें क्ले साइट है, 50 -TGCTTAATCGATAGGTCGGTGCA GAGGCTCCTC{{ 38}} का उपयोग Q25 को बढ़ाने के लिए किया गया था। फिर, Pmyo-2::V1S के मानव SNCA अंश को Pmyo-2::V1Q25 के निर्माण के लिए PCR-प्रवर्धित Q25 खंड द्वारा प्रतिस्थापित किया गया। चार) Pflflp-21::SV2 pFX _ के EGFP अंश को SV2 वेक्टर बनाने के लिए PCR-प्रवर्धित SV2 खंड द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था।

SpeI साइट युक्त सेंस प्राइमर, 50 -AGCACTAGTGCCACCATGGATG TATTCATGAAAGG-30, और BglII साइट युक्त एंटीसेंस प्राइमर, 50 -AGCAGATCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC -30 का उपयोग किया गया। फ्लिप -21 प्रमोटर (Pflflp -21) को N2 जीनोमिक डीएनए से PCR-प्रवर्धित किया गया था और Pflflp -21::SV2 उत्पन्न करने के लिए SV2 वेक्टर के KpnI और SALI साइटों में सबक्लोन किया गया था। एक KpnI साइट युक्त सेंस प्राइमर, 50 - AGCGGTACCAACTAGGTCCAGTGACCGAAAG-30 और एक एंटीसेंस प्राइमर जिसमें एक SalI साइट है, 50 -AGCGTCGACGCCAC CATGGATGTATTCATGAAAGGAC-30 का उपयोग flflp {{15} को बढ़ाने के लिए किया गया था } प्रमोटर। पाँच) Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed एक SV2 वेक्टर सह-अभिव्यक्त DsRed को ग्रसनी न्यूरोनल मार्कर के रूप में बनाने के लिए, Pflflp-21 को pFX के KpnI और SalI साइटों में सबक्लोन किया गया था{ {21}}DsRedxT vector30 और नाम Pflflp-21::DsRed. flflp -21 प्रमोटर के तहत SV2 और DsRed का सह-अभिव्यक्ति SV2 और DsRed के बीच एक इंटर सिस्ट्रोनिक क्षेत्र (ICR) रखकर प्राप्त किया गया था, जिसे N2.31 से PCR-प्रवर्धित किया गया था। SV2 टुकड़ा संलयन द्वारा ICR क्षेत्र के साथ जुड़ा हुआ था PCR32 और Pflflp-21::DsRed में Pflflp-21::SV2-ICR DsRed बनाने के लिए सबक्लोन किया गया। सेंस प्राइमर जिसमें साल I साइट है, 50 -AGCGTC GACGCCACCATGGATGTATTCATGAAAGGAC-30, और एक एंटीसेन्स प्राइमर जिसमें एक ICR, 50 -CGATCATTTTGGAGATTACTTGTACAGCTTGTCC-30 के साथ ओवरलैपिंग क्षेत्र है, का उपयोग PCR रिएक्शन में किया गया था SV2 के लिए। ICR क्षेत्र को SV2, 50 -GGACGAGCTGTACAAGTAATCTCCAAAAT CATCG-30 के साथ एक ओवरलैपिंग क्षेत्र वाले सेंस प्राइमर के साथ प्रवर्धित किया गया था, और एक एंटीसेन्स प्राइमर जिसमें एक SpeI साइट 50 - AGCACTAGTTACCCTGTAATAATAATATTAAAC-3

BiFC ट्रांसजेनिक कीड़े की स्थापना

Pmyo-2::V1S और Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed प्लाज्मिड्स देर से L4-स्टेज N2 वर्म्स के गोनाडों में सिलेक्शन मार्कर, pRF4 के साथ सम्मिलित किए गए जो एक उत्परिवर्ती कोलेजन जीन, रोल - 6(su1006), 33 को द्वि-ट्रांसजेनिक रेखा बनाने के लिए BiFC जोड़ी को व्यक्त करता है। BiFC के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, Pmyo-2::V1S अकेले pRF4 के साथ N2 वर्म्स में इंजेक्ट किया गया था, और Pflflp-21::SV2-ICR DsRed अकेले unc{{18) में इंजेक्ट किया गया था }}(ed3) म्यूटेंट वर्म विथ सिलेक्शन मार्कर, pCFJ151, जो unc-119(C) जीन को अभिव्यक्त करता है। 34 प्लाज्मिड Pmyo-2::V1 को केवल BiFC आंशिक अनुक्रम को व्यक्त करने के लिए उत्पन्न किया गया था Pmyo-2::V1S में क्विक चेंज साइट-डायरेक्टेड म्यूटाजेनेसिस किट (स्ट्रैटेजीन, 200521) का उपयोग करते हुए SNCA कोडिंग अनुक्रम से ठीक पहले स्टॉप कोडन। Pmyo-2::V1 और Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed प्लाज्मिड्स को pRF4 के साथ N2 में संयोगित किया गया। प्लाज्मिड Pmyo-2::V1Q25, Pmyo-2:: V1S में SNCA को Q25 अंश के साथ बदलकर 25 ग्लूटामाइन खिंचाव के साथ हंटिंगटिन एक्सॉन 1 को व्यक्त करने के लिए उत्पन्न किया गया था। Pmyo-2::V1Q25 और Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed प्लाज्मिड्स को pRF4 के साथ N2 में संयोगित किया गया। इसके अलावा, Pflflp-21::DsRed को न्यूरॉन्स में सामान्य प्रोटीन ओवरएक्प्रेशन के प्रभावों के नियंत्रण के रूप में pRF4 के साथ N2 में इंजेक्ट किया गया था। पेश किए गए प्लास्मिड के क्रोमोसोमल एकीकरण के लिए, इंजेक्शन वाली लाइनें यूवी विकिरण के संपर्क में थीं। यूवी विकिरण के बाद, प्रत्येक एकीकृत लाइन को N2 के साथ 4 बार आउट-क्रॉस किया गया था। Pmyo-2::V1S और Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed को ले जाने वाली डबल ट्रांसजेनिक लाइनें एक एकीकृत Pmyo-2::V1S लाइन को एक एकीकृत के साथ जोड़कर उत्पन्न की गईं Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed लाइन। इन सभी ट्रांसजेनिक कृमियों ने एक रोलर फेनोटाइप और DsRed की अभिव्यक्ति दिखाई

ग्रसनी न्यूरॉन्स में प्रतिदीप्ति।

टैग न किए गए एसएनसीए मॉडलों का सृजन पीमायो-2::एसएनसीए और पीएफएलएफपी-21::एसएनसीए प्लाज्मिड एसएनसीए को अभिव्यक्त करने के लिए एसएनसीए कोडिंग अनुक्रम के ठीक बाद एक क्विकचेंज साइट-डायरेक्टेड म्यूटाजेनेसिस का उपयोग करके स्टॉप कोडन शुरू करके डिजाइन किए गए थे। किट। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, Pmyo-2::SNCA अकेले pRF4 के साथ N2 वर्म्स में इंजेक्ट किया गया था। Pmyo-2::SNCA और Pflflp-21:: SNCA प्लास्मिड को PRF4 के साथ देर से L4-स्टेज N2 वर्म्स के गोनाड में डाला गया। इन सभी कृमियों ने एक रोलर फेनोटाइप दिखाया और प्रयोगों के लिए प्रत्येक जीनोटाइप की 3 प्रतिनिधि पंक्तियों का उपयोग किया गया। उम्र बढ़ने से संबंधित BiFC मॉडल की पीढ़ी Pmyo-2::V1S और Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed प्लाज्मिड देर से L4-चरण daf के गोनाडों में संयोगित किए गए थे -2(e1370) और daf-16 (mu86) pRF4 के साथ उत्परिवर्ती कीड़े। उम्र बढ़ने से संबंधित BiFC मॉडल के नियंत्रण के रूप में, Pmyo-2::V1S or Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed को अकेले L{{30} के गोनाड में इंजेक्ट किया गया था }N2 और daf का चरण -16(mu86) pRF4 के साथ उत्परिवर्ती कीड़े। पेश किए गए प्लास्मिड युक्त कई ट्रांसजेनिक लाइनें प्राप्त करने के बाद, प्रत्येक उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में 3 प्रतिनिधि लाइनों का प्रयोग प्रयोगों के लिए किया गया था।

hlh-30p::hlh-30 ट्रांसजेनिक लाइनों का निर्माण

hlh-30p::hlh-30::gfp व्यक्त करने वाला प्लाज्मिड डॉ. मैलेन हैनसेन (सैनफोर्ड-बर्नहैम मेडिकल रिसर्च इंस्टीट्यूट, सीए, यूएसए) का एक उदार उपहार था। प्लाज्मिड hlh-30p::hlh-30 को GFP अभिव्यक्ति को बाधित करने के लिए QuikChange साइट-डायरेक्टेड म्यूटाजेनेसिस किट का उपयोग करके GFP कोडिंग अनुक्रम से पहले स्टॉप कोडन पेश करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। एक नियंत्रण के रूप में, प्रत्येक Pmyo-2::V1S or Pflflp-21::SV2-ICRDsRed और hlh-30p::hlh-30 को एक साथ इंजेक्ट किया गया बाद के एल4-चरण के गोनाड पीआरएफ4 के साथ एन2 कीड़े। Pmyo-2::V1S, Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed और hlh-30p::hlh-30 को अभिव्यक्त करने वाले प्लाज्मिड्स को सह-इंजेक्ट किया गया देर से L4-चरण daf-16(mu86) के गोनाड pRF4 के साथ उत्परिवर्ती कीड़े। लाइसोसोमल डिसफंक्शन का विश्लेषण करने के लिए, asp-4(ok2693) और asp-1(tm666) उत्परिवर्ती कीड़े, जिसमें लाइसोसोमल एंजाइम कैथेप्सिन जीन निष्क्रिय होता है, का उपयोग किया गया था। Pmyo-2::V1S और Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed प्लाज्मिड्स को pRF4 के साथ लेट L4-स्टेज म्यूटेंट वर्म्स के गोनाड में डाला गया। पेश किए गए प्लास्मिड युक्त ट्रांसजेनिक लाइनों को प्राप्त करने के बाद, प्रयोगों के लिए प्रत्येक जीनोटाइप की 3 प्रतिनिधि लाइनों का उपयोग किया गया था।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी

कीड़े के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने के लिए, जंगली प्रकार के N2 और ट्रांसजेनिक कीड़े एकत्र किए गए, M9 बफर (22 मिमी KH2PO4, 22 मिमी Na2HPO4, 85 मिमी NaCl, 1 मिमी MgSO4) के साथ धोया गया, और फिर MRWB में 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ पूर्व-निर्धारित किया गया। 8 0 एमएम केसीएल, 2 0 एमएम NaCl, 1 {{6 0}} एमएम ईजीटीए, 5 एमएम स्पर्मिडाइन [सिग्मा-एल्ड्रिच, एस 0 266], 50 प्रतिशत मेथनॉल)। पैठ के लिए छल्ली परत की कठोरता को कम करने के लिए, कीड़े तरल नाइट्रोजन का उपयोग करके कई फ्रीज / पिघलना चक्रों के अधीन थे, और 2 घंटे के लिए 4 सी पर आंदोलन के साथ ऊष्मायन किया गया था। क्योंकि कमी और ऑक्सीकरण कदम कृमि की पारगम्यता को बढ़ाते हैं, कृमि को ट्रिस-ट्राइटन बफर (100 मिमी ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.4, 1 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100 [बायो-रेड लेबोरेटरीज इंक, 161-) से धोया गया था। 0407], 1 एमएम ईडीटीए), और 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर ट्रिस-ट्राइटन बफर में 1 प्रतिशत बी-मर्कैप्टोएथेनॉल (सिग्मा-एल्ड्रिच, एम7522) के साथ इनक्यूबेट किया गया। इसके बाद, कीड़ों को कोलेजेनेज़ समाधान (100 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.4, 1 एमएम सीएसीएल 2, 0.1 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100) में कोलेजनेज़ टाइप IV [वर्थिंगटन बायोकेमिकल कंपनी, एलएस004188] की 100 इकाइयों को रोटेशन के साथ डाला गया था। आरटी पर 4 घंटे के लिए। फिर आरटी पर 15 मिनट के लिए 0.3 प्रतिशत H2O2 (सिग्मा-एल्ड्रिच, H1009) के साथ पूरक ट्रिस-ट्राइटन बफर में कीड़े लगाए गए। अवरुद्ध बफर में ऊष्मायन के बाद (0.1 प्रतिशत गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन [बीएसए; सिग्मा-एल्ड्रिच, ए7906], 0.5 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100, फॉस्फेट-बफर खारा में 1 मिमी ईडीटीए [पीबीएस; जेनडेपोट, सीएपी 08-050 ]), प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान (1 प्रतिशत बीएसए, 0.5 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100, पीबीएस में 1 मिमी ईडीटीए) में 4 सी पर रातोंरात मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 274 एमएबी 10 के साथ कीड़े लगाए गए थे। अगले दिन, कृमियों को अवरुद्ध बफर से धोया गया और 2 घंटे के लिए रोडियामाइन लाल एक्स-संयुग्मित बकरी विरोधी माउस आईजीजी (1: 100; जैक्सन इम्यूनोसर्च लैबोरेटरीज, 115-295-166) के साथ ऊष्मायन किया गया। कीड़े तब एक अवरुद्ध बफर से धोए गए थे और एक एंटीफेड अभिकर्मक (इनविट्रोजन, P36930) में लगाए गए थे। एक ओलिंप FV1000 कन्फोकल लेजर-स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (ओलंपस, टोक्यो, जापान) का उपयोग करके नमूनों का विश्लेषण किया गया।

जीवित कृमियों की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

M9 बफर में 10 मिमी सोडियम एजाइड के साथ कीड़े को स्थिर किया गया था, और एक कवरस्लिप के साथ कवर किया गया था। ओलंपस FV1000 कन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कीड़े की छवियां हासिल की गईं।

पश्चिमी सोख्ता

वयस्क कृमियों को M9 बफर और बाद में 1 प्रतिशत ट्राइटन X -100 वाले पीबीएस से धोया गया। वर्म पेलेट को पीबीएस में 1 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100, 1 प्रतिशत (वॉल्यूम/वॉल्यूम) प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल (सिग्मा-एल्ड्रिच, पी 834 0) से युक्त किया गया था और ट्राइटन-घुलनशील (सतह पर तैरनेवाला) प्राप्त करने के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया था। ) और -अघुलनशील (गोली) अंश। बीसीए प्रोटीन परख (पियर्स बायोटेक्नोलॉजी, 23223 और 23224) का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता को मापा गया था। प्रोटीन के नमूने (एसएनसीए अभिव्यक्ति परीक्षण के लिए 3 मिलीग्राम, पॉलीयूबिकिटिन प्रोटीन का पता लगाने के लिए 50 मिलीग्राम, और 20 मिलीग्राम (वी1एस, वी1एससीएसवी2 लाइनें) और 40 मिलीग्राम (एसवी2 लाइनें) एसएनसीए की अंतर घुलनशीलता के लिए) 12 प्रतिशत एसडीएस-पेज जैल पर लोड किए गए थे। वेस्टर्न ब्लॉटिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी मोनोक्लोनल एंटी-एसएनसीए एंटीबॉडी, 274 एमएबी (1:1,500) और सिन -1 (1:1,500; बीडी बायोसाइंस, 610787), और एंटी-यूबिकिटिन एंटीबॉडी (1:3,{ {35}}; एबीकैम, एबी7254)। LAS -3000 ल्यूमिनेसेंस इमेज एनालाइज़र (Fujifilm, Tokyo, Japan) और Amersham इमेजर 600 (Ge Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA, USA) और मल्टी गेज (v3.0) सॉफ़्टवेयर (Fujifilm) का उपयोग करके रसायन संदीप्ति का पता लगाया गया , टोक्यो, जापान)।

डॉट ब्लॉटिंग

प्रत्येक स्ट्रेन के वयस्क कृमियों को M9 बफर और बाद में 1 प्रतिशत ट्राइटन X -100 वाले पीबीएस से धोया गया। वर्म पेलेट को पीबीएस में 1 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100 और 1 प्रतिशत (वॉल्यूम/वॉल्यूम) प्रोटीज इनहिबिटर कॉकटेल से युक्त किया गया था। प्रोटीन के नमूने (5 0 0 एनजी) नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्लियों पर लोड किए गए थे, जो तब सूख गए थे और एक अवरुद्ध समाधान में ऊष्मायन किए गए थे। डॉट ब्लोटिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी मोनोक्लोनल एंटी-एसएनसीए एंटीबॉडी 274 एमएबी और सिन-ओ2,13 थे, जिनमें से उत्तरार्द्ध एसएनसीए समुच्चय के लिए विशिष्ट है। LAS -3000 ल्यूमिनेसेंस इमेज एनालाइज़र और एमर्सहम इमेजर 600, और मल्टी गेज (v3.0) सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके केमिलुमिनेसेंस डिटेक्शन किया गया था।

एंटी-एजिंग एजेंट उपचार

N-acetylglucosamine (GlcNAc) (सिग्मा-एल्ड्रिच, A 8625) आसुत जल में स्टॉक समाधान के रूप में 1 M तक भंग कर दिया गया था। स्टॉक समाधान एलबी तरल माध्यम (सिग्मा-एल्ड्रिच, एल3 022) के साथ पतला था। प्रत्येक ट्रांसजेनिक लाइन के L 4- स्टेज वर्म्स को 1 0 mM GlcNAc की अंतिम सांद्रता वाली NGM प्लेटों में स्थानांतरित किया गया। सिंगल-वर्म पीसीआर प्रत्येक लाइन से एक ग्रेविड सिंगल वर्म लिसीज़ बफर (5 0 एमएम केसीएल, 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.3, 2.5 एमएम एमजीसीएल 2, 0.45 प्रतिशत एनपी -40 [आईजीईपीएएल; सिग्मा-एल्ड्रिच, I3021], 0.45 प्रतिशत ट्वीन 20 [सिग्मा-एल्ड्रिच, P1379]) 0.1 mg/ml प्रोटीनएज़ K (सिग्मा एल्ड्रिच, P4850) के साथ। बफर में एकल कृमि को तरल नाइट्रोजन का उपयोग करके कई फ्रीज-पिघलना चक्रों के अधीन किया गया था, जीनोमिक डीएनए को छोड़ने के लिए 1 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया था, और फिर प्रोटीनएज़ के को निष्क्रिय करने के लिए 15 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गरम किया गया था। सिंगल-वर्म पीसीआर विश्लेषण था Bio-Rad MyCycler PCR थर्मल साइक्लर सिस्टम (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) में Ex TaqTM पोलीमरेज़ (Takara Biotechnology, RR001A) का उपयोग करके प्रदर्शन किया।

पीसीआर-प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता जीनोटाइपिंग

प्रत्येक पंक्ति से Gravid 5 कीड़े 0 के साथ lysis बफर में lysed थे। 1 mg / ml प्रोटीनएज़ K. बफर में कीड़े तरल नाइट्रोजन का उपयोग करके कई फ्रीज-पिघलना चक्रों के अधीन थे, 65 C पर 1 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया था। जीनोमिक डीएनए जारी करें, और फिर प्रोटीनेज के को निष्क्रिय करने के लिए 15 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें। पीसीआर प्रदर्शन करने के बाद, पीसीआर उत्पादों को एनसीओआई एंजाइम (न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स इंक, आर3193एस) के साथ रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर पचाया गया और प्रतिबंध का पता लगाने के लिए इलेक्ट्रोफोरेस किया गया। टुकड़ा लंबाई बहुरूपता।

मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर)

M9 बफर में वयस्क ट्रांसजेनिक कीड़े एकत्र किए गए और धोए गए। बफर में कीड़े sonicated थे और नमूने तरल नाइट्रोजन का उपयोग कर कई फ्रीज-गल चक्रों के अधीन थे। RNA को Trizol Reagent (Invitrogen, 15596-026) के साथ निकाला गया और RNeasy मिनी किट (Qiagen, 74106) का उपयोग करके शुद्ध किया गया। प्रत्येक सीडीएनए को आईस्क्रिप्ट सीडीएनए सिंथेसिस किट (बायो-रेड लेबोरेटरीज इंक, 170-8891) का उपयोग करके कुल आरएनए के 500 एनजी से संश्लेषित किया गया था। रीयल-टाइम PCR के लिए, लक्ष्य जीन और विशिष्ट प्राइमरों को SYBR Premix Ex Taq II (Takara Biotechnology, RR081A) के साथ 96-वेल प्लेट में मिलाया गया था। पहले अन्य समूहों द्वारा डिजाइन किए गए विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग किया गया था। 14 डीएनए उत्पादों का विश्लेषण 7500 रीयल-टाइम पीसीआर सिस्टम (एप्लाइड बायोसिस्टम्स, फोस्टर सिटी, सीए, यूएसए) का उपयोग करके किया गया था। लक्ष्य जीन के सापेक्ष mRNA स्तर को कार्य करने के लिए सामान्यीकृत किया गया -1।

डायन -1 म्यूटेंट का हीट-शॉक उपचार

द्वि-ट्रांसजेनिक कृमि (Pmyo-2::V1S C Pflflp-21::SV2-ICR DsRed) dyn-1(ky51) उत्परिवर्ती कृमियों के साथ संगमित थे।20 वयस्क डाइन -1(ky51) म्यूटेशन के साथ या उसके बिना डबल-ट्रांसजेनिक लाइन के मदर वर्म, अंडे देने के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए ई. कोलाई ओपी50 वाली एनजीएम प्लेटों पर सुसंस्कृत किए गए और फिर हटा दिए गए। एल 4- चरण में प्रत्येक नस्ल के सिंक्रोनाइज़्ड संतति कृमि अवलोकन के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सुसंस्कृत किए गए।

ग्रसनी पंपिंग विश्लेषण

एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके आरटी पर ग्रसनी पंपिंग को 1 मिनट के लिए गिना गया था। जंगली प्रकार N2, म्यूटेंट और ट्रांसजेनिक कीड़े का विश्लेषण किया गया। डेटा को पीपीएम (पंप प्रति मिनट) के रूप में व्यक्त किया गया था।

जीवन काल परख

वयस्क मातृ कृमियों द्वारा दिए गए अंडे समकालिक रूप से 20 डिग्री सेल्सियस पर ई. कोलाई ओपी50 के बीज वाली एनजीएम प्लेटों पर एल4 लार्वा चरण तक उगाए गए थे। flfluoro-20 -deoxyuridine (सिग्मा-एल्ड्रिच, F0503) उन्हें संतान पैदा करने से रोकने के लिए। जीवित या मृत कीड़ों की संख्या हर एक या 2 डी दर्ज की गई थी। कीड़े जो टूट गए, दफन हो गए, या प्लेटों से रेंग गए, उन्हें सेंसर कर दिया गया लेकिन सेंसर किए गए जानवरों के रूप में जीवन-काल के विश्लेषण में शामिल किया गया। उत्तरजीविता डेटा का विश्लेषण OASIS (जीवन-काल के उत्तरजीविता विश्लेषण के लिए एक ऑनलाइन आवेदन) का उपयोग करके किया गया था।

सांख्यिकीय विश्लेषण

सभी प्रयोग ब्लाइंड-कोडेड किए गए और कम से कम 3 बार दोहराए गए। आंकड़ों में मूल्यों को माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है यदि P मान §

लघुरूप

एसीटीबी एक्टिन, बी

एडी अल्जाइमर रोग

एब एमिलॉयड बी

एएलएस एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस

BiFC द्विआण्विक प्रतिदीप्ति पूरकता

GlcNAc एन-एसिटाइलग्लूकोसामाइन

पीडी पार्किंसंस रोग

हितों के संभावित टकराव का प्रकटीकरण

कोई संभावित हित - असंगति का खुलासा नहीं किया गया।

अनुदान

इस कार्य को कोरियाई सरकार (MEST) (NRF-2015R1A2A1A10052540, NRF-2015R1A2A1A15053661), और कोरिया स्वास्थ्य प्रौद्योगिकी अनुसंधान एवं विकास परियोजना, स्वास्थ्य मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (NRF) अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। एंड वेलफेयर, कोरिया गणराज्य (HI14C0093), साथ ही कोंकुक विश्वविद्यालय का 2014 KU ब्रेन पूल प्रोग्राम।

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