ज़ेब्राफिश मॉडल में सीलोन ओलिव (एलियोकार्पस सेराटस) से लीफ एक्सट्रैक्ट और फाइटोकेमिकल्स के एंटीमेलानोजेनेसिस प्रभाव

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ची-या हुआंग 1, आई-हुआन लियू 2, जियांग-झे हुआंग 1, हुई-जेन चेन 1, शांग-त्ज़ेन चांग 1, मेई-लिंग चांग 3, यू-तुंग हो 1 और हुई-टिंग चांग 1,*

सार:मेलानोजेनेसिसजेब्राफिश (डैनियो रेरियो) में निषेध प्रभाव औरएंटीटाइरोसिनेसएथेनॉलिक की गतिविधिनिचोड़और इस अध्ययन में सीलोन जैतून (एलियोकार्पस सेराटस लिन।) के पत्तों से इसके फाइटोकेमिकल्स की जांच की गई। पत्ती के अर्क और चार घुलनशील अंशों में, एथिल एसीटेट घुलनशील अंश सबसे अच्छा एंटीटायरोसिनेस प्रदर्शित करता है औरएंटीमेलानोजेनेसिसगतिविधियां। एक फेनोलिक एसिड, गैलिक एसिड, और दो फ्लेवोनोइड्स, मायरिकेटिन, और मतलब टिन, बायोएसे-निर्देशित अलगाव के माध्यम से सक्रिय उप-अंशों से पृथक होते हैं; उनकी संरचनाओं को 1डी और 2डी एनएमआर, एफटीआईआर, यूवी, और एमएस स्पेक्ट्रोस्कोपिक विश्लेषणों के आधार पर स्पष्ट किया गया है। इन यौगिकों में महत्वपूर्ण हैएंटीटाइरोसिनेसगतिविधि चाहे सब्सट्रेट के रूप में एल-टायरोसिन या एल-डीओपीए का उपयोग कर रही हो; मोरसेंटिन इष्टतम गतिविधि दिखाता है। एंजाइमकिनेटिक जांच में, गैलिक एसिड और मेर्नसेटिन दोनों मशरूम टाइरोसिनेज के खिलाफ प्रतिस्पर्धी-प्रकार के अवरोधक हैं, और मायरिकेटिन मिश्रित-प्रकार के रूप में कार्य करता है।टायरोसिनेसअवरोधक। पत्तीनिचोड़और एथिल एसीटेट घुलनशील अंश जेब्राफिश भ्रूण में मेलेनिन गठन के निषेध में प्रभावी प्रदर्शन दिखाते हैं। Mearnsetin में एक आशाजनक एंटीमेलानोजेनेसिस प्रभाव भी होता है, जो सकारात्मक नियंत्रण से बेहतर होता है,अर्बुतिन. परिणामों से पता चलता है कि सीलोन जैतून का पत्ता निकालने और इसके फाइटोकेमिकल्स, विशेष रूप से मोरसेटिन, के रूप में उपयोग करने की क्षमता हैएंटीमेलानोजेनेसिसऔर त्वचा को गोरा करने वाले तत्व।

कीवर्ड: एंटीमेलानोजेनेसिस प्रभाव; एलियोकार्पस सेराटस; मेलेनिन; टायरोसिनेस अवरोधक; जेब्राफिश

हर्बा सिस्टैंचेसटायरोसिनेस गतिविधि को रोकता है।

1 परिचय

मेलेनिन कई जैव रासायनिक कार्यों में एक आवश्यक भूमिका निभाता है; यह पराबैंगनी (यूवी) क्षति, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस), और अन्य जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं के उन्मूलन से त्वचा के लिए सुरक्षा प्रदान करता है [1-3]। मेलेनिन का अत्यधिक संचय हाइपरपिग्मेंटेशन, मेलास्मा, उम्र के धब्बे, त्वचा का काला पड़ना आदि भी लाता है। [4,5]। पूर्वी दुनिया में, लोग त्वचा पर सफेदी के प्रभाव के मुद्दे में रुचि रखते हैं; कॉस्मेटिक उद्योग मेलानोजेनेसिस के खिलाफ त्वचा को गोरा करने वाले सौंदर्य प्रसाधन विकसित करने के लिए समर्पित है। कई तंत्र हैं, जिनमें शामिल हैंटायरोसिनेसनिरोधात्मक गतिविधि, मेलानोसाइट हटाने, और मेलेनिन संश्लेषण के साथ हस्तक्षेप मेलेनोजेनेसिस निरोधात्मक गतिविधि को प्रदर्शित करने के लिए। 1940 के दशक से मेलेनोजेनेसिस को बाधित करने वाले होनहार अभिकर्मकों की जांच की गई है [2,4,6,7]। हालांकि, भागमेलानोजेनेसिसअवरोधकों के कुछ दुष्प्रभाव होते हैं; उदाहरण के लिए, हाइड्रोक्विनोन बहिर्जात ओक्रोनोसिस और स्थायी हाइपोमेलानोसिस [5,8] का कारण बन सकता है। अत्यधिक कोजिक एसिड के परिणामस्वरूप एलर्जी और थायरॉयड ट्यूमर [9,10] हो सकते हैं।

हाल ही में, शोधकर्ताओं को पौधों के प्राकृतिक उत्पादों [11-13] से बिना / हल्के साइड इफेक्ट वाले होनहार मेलेनोजेनिक अभिकर्मकों को खोजने के लिए समर्पित किया गया है। प्राकृतिकटायरोसिनेससरल फिनोल, फेनोलिक एसिड, स्टिलबेन्स, फ्लेवोनोइड्स, लिग्नन्स, टेरपेनोइड्स, क्विनोइड्स आदि सहित पौधों के स्रोतों से अवरोधकों की सूचना मिली है। [2,14-16]। सोलानो एट अल। कहा गया है कि फेनोलिक यौगिकों और अन्य प्राकृतिक यौगिकों में मेलेनिन निषेध के लिए काफी संभावनाएं हैं, उदाहरण के लिए, अर्बुटिन (आर्कटोस्टाफिलोस यूवा-उर्सी में पाया जाने वाला एक फिनोल ग्लूकोसाइड), ग्रीन टी का अर्क, अल्फा हाइड्रॉक्सिल एसिड (एएचए), एस्कॉर्बिक एसिड, और इसी तरह [5] ].अर्बुतिनव्यापक रूप से बाजार में वाणिज्यिक वाइटनिंग उत्पादों के एक प्रमुख घटक के रूप में उपयोग किया जाता है [4,17]। गैलोकैटेचिन-3-ओ-गैलेट (जीसीजी), एपिगैलोकैटेचिन-3-ओ-गैलेट (ईजीसीजी), और एपिकेटचिन {{6 }}ग्रीन टी में ओ-गैलेट (ईसीजी) की पहचान की गईनिचोड़; इन यौगिकों में अच्छा टायरोसिनेस निरोधात्मक प्रभावकारिता [17] है। फ्रक्टस आर्कटिकसट्रेक्ट से पृथक एक लिग्नान, आर्कटिजेनिन, जेब्राफिश (डैनियो रेरियो) भ्रूण [18] में मेलेनिन की मात्रा को कम कर सकता है। ली एट अल ने बताया कि पैनाक्स जिनसेंग लीफ और बेरी से जिनसैनोसाइड्स को रोकते हैंमेलानोजेनेसिसजेब्राफिश भ्रूण का; सक्रिय जिनसैनोसाइड्स हैं जिनसैनोसाइड आरएच6, वीना-जिनसेनोसाइड आर4, वीना-जिनसेनोसाइड आर13, जिनसैनोसाइड आरएच23, और फ्लोरलजिनसेनोसाइड ए [19-21]।

एलियोकार्पस सेराटस लिनन। (टिलियासी), जिसे आमतौर पर सीलोन जैतून कहा जाता है, अफ्रीका, ऑस्ट्रेलिया और दक्षिण पूर्व एशिया में वितरित किया जाता है। श्रीलंका में सीलोन जैतून के खाने योग्य फल से बना अचार आम है [22]। यह परंपरागत रूप से श्रीलंका में सिर की जूँ और रूसी को रोकने के लिए प्रयोग किया जाता है। संबंधित अध्ययनों [22,23] में ई. सेराटस अर्क की जैव सक्रियता का मूल्यांकन किया गया। ई. सेराटस लीफ एक्सट्रेक्ट में प्लेसीओमोनास, साल्मोनेला टाइफी और प्रोटियस एसपीपी के खिलाफ जीवाणुरोधी गतिविधि होती है। प्लेट-छेद प्रसार परख [23] द्वारा 400 µ g/mL की सांद्रता पर। सेराटस लीफ एक्सट्रैक्ट में ब्राइन झींगा (आर्टेमिया सलीना) घातकता परख की साइटोटोक्सिसिटी जांच में एक एंटीट्यूमर, रोगाणुरोधी और कीटनाशक एजेंट होने की क्षमता थी; पत्ती का theLC50निचोड़नमकीन झींगा [23] के मुकाबले 40 माइक्रोग्राम/एमएल था। एंटीऑक्सिडेंट फ्लेवोनोलग्लाइकोसाइड्स, जिसमें मायरिसिट्रिन, मीरनसेटिन 3- ओ - - डी-ग्लूकोपाइरानोसाइड, मेरन्सिट्रिन, और टैमरीक्सेटिन 3- ओ - - एल-रमनोपाइरानोसाइड शामिल हैं, को अलग किया गया और ई सेराटसलीफ अर्क से पहचाना गया। [22]।

इस अध्ययन का उद्देश्य ई. सेराटस लीफ के प्रभावों का मूल्यांकन करना हैनिचोड़और इसके अंशएंटीटाइरोसिनेसगतिविधि (इन विट्रो में) औरमेलानोजेनेसिसनिषेध गतिविधि इंजेब्राफिश (विवो में)। संभावित एंटीमेलानोजेनेसिस अवयवों के रूप में आशाजनक यौगिकों को खोजने के लिए बायोसे-निर्देशित विभाजन और अलगाव तकनीकें की गईं। प्रभावी एंटीमेलानोजेनेसिस अवयवों का विकास दवा और कॉस्मेटिक उद्योगों में पौधों के प्राकृतिक उत्पादों के इष्टतम उपयोग को बढ़ा सकता है।

2। सामग्री और प्रणालियां

2.1. संयंत्र सामग्री और निष्कर्षण

सीलोन जैतून (एलाओकार्पस सेराटस), लगभग 50 साल पुराना, सितंबर में नेशनल ताइवान यूनिवर्सिटी, ताइपे, ताइवान से पत्तियां एकत्र की गईं। कमरे के तापमान पर 7 दिनों के लिए ताजा पत्तियों (3.95 किग्रा) को 95 प्रतिशत इथेनॉल के साथ निकाला गया। फ़िल्टर्डनिचोड़50 C [24] के स्नान तापमान के साथ एक रोटरी बाष्पीकरण द्वारा कम दबाव में सुखाया गया था। पत्ती के अर्क की उपज (0.32 किग्रा) 12.0 प्रतिशत (सूखे वजन का w/w) थी।

सिस्टैंचेनिचोड़

2.2. तरल-तरल विभाजन

निचोड़तरल-तरल विभाजन [24,25] द्वारा बढ़ते हुए ध्रुवीयता क्रम में क्रमिक कार्बनिक विलायक निष्कर्षण के अधीन था। पत्ती के अर्क को अंश-हेक्सेन घुलनशील अंश (HF, 9.1 प्रतिशत), एथिल एसीटेट घुलनशील अंश (EF, 11.3 प्रतिशत), n-butanolघुलनशील अंश (BF, 17.3 प्रतिशत), और पानी में घुलनशील अंश (WF, 31.{) में विभाजित किया गया था। {13}} प्रतिशत)।

2.3. कॉलम क्रोमैटोग्राफी और पतली परत क्रोमैटोग्राफी

बायोएक्टिव एथिल एसीटेट घुलनशील अंश को सिलिका जेल कॉलमक्रोमैटोग्राफी (सीसी) द्वारा और अलग किया गया था। ओपन-कॉलम क्रोमैटोग्राफी स्टेपवाइज एल्यूशन द्वारा एन-हेक्सेन और एथिल एसीटेट [26] के विभिन्न अनुपात के साथ की गई थी। पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) [27] द्वारा उन्नीस उप-अंश (ई1-ई19) प्राप्त किए गए थे। E1(1.05 प्रतिशत), E2 (8.21 प्रतिशत), E3 (1.64 प्रतिशत), E4 (0.74 प्रतिशत), E5 (1.52 प्रतिशत), E6 ({ {59}}.86 प्रतिशत), E7 (1.51 प्रतिशत), E8 (9.50 प्रतिशत), E9 (7.78 प्रतिशत), E10 (3.97 प्रतिशत), E11 (2.65 प्रतिशत), E12 (8.49 प्रतिशत), E13 (5.58 प्रतिशत), ई14 (4.43 प्रतिशत), ई15 (5.31 प्रतिशत), ई16 (1.14 प्रतिशत), ई17 (1.87 प्रतिशत), ई18 (0.76 प्रतिशत), और ई19 (2.96 प्रतिशत)।

2.4. उच्च उत्पादन द्रव्य वर्णलेखन

एथिल एसीटेट घुलनशील अंश के सक्रिय अंशों का विश्लेषण किया गया और उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी, एल -2130, हिताची, टोक्यो, जापान) द्वारा पृथक किया गया, जो एक प्रारंभिक आरपी -18 कॉलम (पुरोस्फेर®, स्टार आरपी {{ 3}} एंड-कैप्ड, 250 × 10 मिमी, 5 माइक्रोन)। ढाल मोबाइल चरण में पानी (ए) और एसीटोनिट्राइल (बी) शामिल थे। प्रवाह दर 3 एमएल / मिनट थी। रेफरेंस प्रोग्राम में ए में 0-15 मिनट के लिए 30 से 35 प्रतिशत बी, 15-25 मिनट तक ए में 35 से 100 प्रतिशत बी, और 100 प्रतिशत बी के साथ 5 मिनट के संतुलन के बाद एक रैखिक ढाल शामिल था। eluted चोटियों का पता चला था 254 एनएम [25,28] पर एक यूवी डिटेक्टर द्वारा।

2.5. पृथक यौगिकों की पहचान

अलग-अलग यौगिकों की संरचनाओं को पराबैंगनी-दृश्यमान स्पेक्ट्रोस्कोपी (यूवी / विज़, वी -550, जैस्को, टोक्यो, जापान), फूरियर ट्रांसफॉर्म इंफ्रारेड स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफटीआईआर, एफटीएस {{2} सहित वर्णक्रमीय विश्लेषण के माध्यम से निर्धारित और विशेषता दी गई थी। }, बायो-रेड, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए), और मास स्पेक्ट्रोस्कोपी (एमएस, एमएटी -958, फिनिगन, एमए, यूएसए)। परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (NMR), जिसमें 1D (1H-NMR, 500 MHz; 13C-NMR, 125 MHz) और 2D NMR (HSQC और HMBC) शामिल हैं, को ब्रूकर AVIII NMR स्पेक्ट्रोमीटर (ब्रूकर एवेंस, रेनस्टेटेन, जर्मनी) के साथ रिकॉर्ड किया गया था। 29-32]।

2.6. Antityrosinase परख और एंजाइम काइनेटिक अध्ययन

कृत्रिम परिवेशीयएंटीटाइरोसिनेसपरख एक स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विश्लेषण था जो पहले वर्णित विधियों पर आधारित था [33-35]। L-DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine) और L-tyrosine को क्रमशः सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल किया गया था। 96-वेल माइक्रोप्लेट्स में, 40 नमूना समाधान के μL और पोटेशियम फॉस्फेट बफर के 70 μL (0.1 एम, पीएच 6.8) मिश्रित किए गए थे, जिसके बाद 200 यूनिट / एमएल मशरूम टायरोसिनेस के 50 μL को जोड़ा गया था। EC1.14.18.1) 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के बाद। फिर, हमने 40 µ l को 2.5 mM सब्सट्रेट (L-tyrosine/L-DOPA) को कुएं में जोड़ा, और मिश्रण 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। ऊष्मायन के बाद, प्रत्येक कुएं में 475 एनएम के अवशोषण को एलिसा (एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख) रीडर (स्पेक्ट्रोस्टार नैनो, बीएमजी लैबटेक, ऑफेनबर्ग, जर्मनी) द्वारा मापा गया था। सकारात्मक नियंत्रण थाअर्बुतिन, और प्रतिकृतियों की संख्या तीन थी। का प्रतिशत निषेधटायरोसिनेसगतिविधि की गणना निम्नलिखित समीकरण द्वारा की गई: निषेध (प्रतिशत)=[(Acontrol-Acontrol's रिक्त)-(Asample-Asample's रिक्त)/(Acontrol-Acontrol's रिक्त)] × 100। फिर, अर्ध-अधिकतम निरोधात्मक एकाग्रता ( नमूने के IC50) की गणना एकाग्रता-प्रतिक्रिया वक्र से की गई थी।

एंजाइम गतिज अध्ययन का विश्लेषण प्रतिक्रिया दर के लाइनवीवर-बर्क पारस्परिक भूखंड और सब्सट्रेट और एंजाइम की आत्मीयता पर नमूने के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए सब्सट्रेट की एकाग्रता द्वारा किया जाता है। की एकाग्रताटायरोसिनेस200 इकाई/एमएल को स्थिर रखा गया था, जबकि सब्सट्रेट (एल-टायरोसिन/एल-डीओपीए) की सांद्रता 0.5, 0.75,1.0 पर भिन्न थी। , 1.25, और 1.5 मिमी। प्रतिक्रिया ऊपर वर्णित एंटीटायरोसिनेस परख के समान थी; नमूना समाधान के 40 μL और पोटेशियम फॉस्फेट बफर (0.1 एम, पीएच 6.8) के 70 μL मिश्रित थे, जिसके बाद 25 पर ऊष्मायन के बाद 200 यूनिट / एमएल टायरोसिनेस के 50 μL जोड़कर किया गया था। सी 10 मिनट के लिए। फिर, हमने सब्सट्रेट के 40 µ एल को कुएं में जोड़ा और इसे अच्छी तरह से मिलाया, और समाधान के गतिज मापों को तुरंत 3 मिनट की अवधि के लिए ज्ञात तरंग दैर्ध्य (475 एनएम) की अवधि के लिए मापा गया। दोनों गतिज पैरामीटर, माइकलिस-मेंटेन स्थिरांक (किमी) और अधिकतम वेग (Vmax), की गणना लाइनविवर-बर्क रैखिक समीकरण [36-38] से की गई थी।

2.7. Zebrafish में एंटीमेलानोजेनेसिस प्रभाव का मूल्यांकन

जंगली प्रकार के एबी स्ट्रेन के ज़ेब्राफिश (डैनियो रेरियो) को 14:10 घंटे के प्रकाश-अंधेरे चक्र के साथ 26-30 डिग्री सेल्सियस पर एक स्वस्थ जलीय वातावरण में बनाए रखा गया था। 9 घंटे के बाद निषेचन (एचपीएफ) के बाद, भ्रूणों को एक 24-वेल प्लेट (प्रति कुएं में 3 भ्रूण) में रखा गया, 1 प्रतिशत डीएमएसओ में भंग नमूनों के विभिन्न अंतिम सांद्रता के साथ इलाज किया गया, और 48 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया। (57 एचपीएफ पर)। एक जीवित जेब्राफिश भ्रूण की डिजिटल छवि को 40 × के कुल आवर्धन पर एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (ओलिंप SZ61, टोक्यो, जापान) के माध्यम से लिया गया था; फिर, इमेजजे सॉफ्टवेयर द्वारा जेब्राफिश भ्रूण की मेलेनिन सामग्री का विश्लेषण किया गया। सकारात्मक नियंत्रण थेअर्बुतिन(व्यावसायिक त्वचा को गोरा करने वाला घटक) और 1-फिनाइल-2-थियोरिया (पीटीयू, एक मेलेनिन संश्लेषण अवरोधक)। प्रतिकृतियों की संख्या छह [21,39,40] थी।

2.8. सांख्यिकीय विश्लेषण

अध्ययन में प्राप्त आंकड़ों का विश्लेषण सांख्यिकीय विश्लेषण प्रणाली (एसएएस) वी 9.2 (कैरी, एनसी, यूएसए) द्वारा शेफ़ के परीक्षण के साथ किया गया था, जो एक पोस्ट हॉक मल्टीपल तुलना पद्धति है। आत्मविश्वास अंतराल 95 प्रतिशत पर सेट किया गया था।

डॉ वीटा ओपीसी मेंत्वचा को सफ़ेदी प्रदान करने वाला

3) परिणाम और चर्चा

3.1. ई. सेराटस लीफ एक्सट्रेक्ट और उसके अंशों की एंटीटायरोसिनेस गतिविधि

निष्कर्षण, अलगाव, पहचान का योजनाबद्ध आरेख,एंटीटाइरोसिनेसगतिविधि औरएंटीमेलानोजेनेसिसई. सेराटस लीफ का प्रभावनिचोड़चित्र 1 में दिखाया गया है। पत्ती निकालने को आगे n-हेक्सेन घुलनशील अंश (HF), एथिल एसीटेट घुलनशील अंश (EF), n-butanol घुलनशील अंश (BF), और तरल द्वारा पानी में घुलनशील अंश (WF) में विभाजित किया गया था। -तरल विभाजन।

मेलानोसाइट कोशिकाओं द्वारा निर्मित टायरोसिनेज, जटिल मेलेनिन संश्लेषण को उत्प्रेरित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है; की खोजटायरोसिनेसअवरोधक मंदबुद्धि के प्रमुख तरीकों में से एक हैमेलानोजेनेसिस[2,5,41]। पत्ती की टायरोसिनेस निषेध गतिविधियाँनिचोड़और चार अंश चित्र 2 में दिखाए गए हैं। सब्सट्रेट के रूप में एल-टायरोसिन का उपयोग करते समय, केवल एथिल एसीटेट घुलनशील अंश में 400 ug/mL की एकाग्रता पर टायरोसिनेस के खिलाफ निषेध प्रभाव होता है। सब्सट्रेट के रूप में एल-डोपा को बदलते समय लीफ एक्सट्रैक्ट, एथिल एसीटेट घुलनशील अंश, और एन-ब्यूटानॉल घुलनशील अंश ने एंटीट्रोसिनेज गतिविधि का प्रदर्शन किया। पत्ती निकालने और चार अंशों में, एथिल एसीटेट घुलनशील अंश ने सबसे अच्छा प्रदर्शन कियाएंटीटाइरोसिनेससब्सट्रेट के रूप में एल-टायरोसिन और एल-डोपा का उपयोग करते समय क्रमशः 279.38 और 166.95 कुरूप/एमएल के आईसी50 मूल्यों के साथ गतिविधि (तालिका 1)।

तालिका 1. मशरूम tyrosinase के खिलाफ सक्रिय सबफ़्रेक्शन के IC50 मान।

एथिल एसीटेट घुलनशील अंश को प्रारंभिक स्तंभ क्रोमैटोग्राफिक और पतली परत क्रोमैटोग्राफिक तकनीकों का उपयोग करके बायोसे-निर्देशित विभाजन के अधीन किया गया था, और उन्नीस उप-अंश (E1-E19) प्राप्त किए गए थे। इन सबफ्रैक्शंस के बीच, E7-E10 सबफ्रैक्शंस ने सब्सट्रेट एसेज़ (L-tyrosineand L-DOPA) दोनों में उच्च टायरोसिनेस निरोधात्मक प्रभाव दिखाया। अर्ध-अधिकतम निरोधात्मक सांद्रता (IC50) के विरुद्ध सक्रिय उप-अंशों का मानटायरोसिनेसतालिका 1 में दिए गए हैं। सभी E7-E10 सबफ़्रेक्शन के IC50 मान 200 माइक्रोग्राम / एमएल से नीचे थे; E7 और E9 सबफ़्रैक्शन ने भी तुलना में बेहतर प्रदर्शन दिखायाअर्बुतिन, जो एक वाणिज्यिक श्वेत करने वाला घटक है।

3.2. बायोएक्टिव सबफ्रैक्शंस से यौगिकों का अलगाव और पहचान

उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा तीन यौगिकों (ES1–3) को बायोएक्टिव सबफ़्रेक्शन (E7–E1 0) से अलग किया गया था। गैलिक एसिड (ES1): सफेद पाउडर; एमपी 257 डिग्री; यूवी (मेओएच) मैक्स (लॉग ε) 215.5 (3.94), 268. 0 (3.46) एनएम; आईआर (केबीआर) अधिकतम 3495, 3416, 3285, 1647, 1542, और 1220 सेमी−1; ईआई-एमएस एम/जेड 171 [एम प्लस एच] प्लस, आणविक सूत्र C7H6O5 के साथ समझौता। माइरिकेटिन (ES2): पीली सुई; एमपी 358 डिग्री; यूवी (मेओएच) मैक्स (लॉग ε) 252.5 (4.43) और 374.0 (4.50) एनएम; आईआर (केबीआर) अधिकतम 3421, 1663, 1596, 1520, 1229, 1202, और 1171 सेमी−1; ईआई-एमएस एम/जेड 319.36 [एम प्लस एच] प्लस, आणविक सूत्र C15H10O8। Mearnsetin (4′-O-मिथाइल मायरिकेटिन, ES3): पीला पाउडर; एमपी 184 डिग्री; यूवी (मेओएच) मैक्स (लॉग ε) 259.5 (4.21) और 364.5 (4.26) एनएम; आईआर (केबीआर) अधिकतम 3409, 2960, 2927, 2853, 1661, 1599, 1507, 1208, और 1163 सेमी−1; ईआई-एमएस एम/जेड 333.0 [एम प्लस एच] प्लस, आणविक सूत्र C16H12O8। इन यौगिकों के एनएमआर डेटा को तालिका 2 में संक्षेपित किया गया है। पहचाने गए यौगिकों की रासायनिक संरचना चित्र 3 में दिखाई गई है।

तालिका 2. 1H, 13C, और यौगिकों का HMBC NMR डेटा।

इन यौगिकों में, गैलिक एसिड एक फेनोलिक एसिड है; मायरिकेटिन और मयर्नसेटिन फ्लेवोनोइड्स से संबंधित हैं। एथिल एसीटेट घुलनशील अंश और E7-E10 सबफ़्रेक्शन में प्रत्येक यौगिक की सामग्री तालिका 3 में सूचीबद्ध है। E7 सबफ़्रेक्शन मेर्नसेटिन (433.38 मिलीग्राम / जी) में समृद्ध था; E8 सबफ़्रेक्शन प्राइमरी में गैलिक एसिड (417.64 mg/g) होता है। सबफ्रैक्शंस E9 और E10 का प्रमुख घटक माइरिकेटिन (क्रमशः 406.41 और 336.41 mg/g) था। एथिल एसीटेट घुलनशील अंश में तीन यौगिकों की सामग्री 59.72 mg/g (गैलिक एसिड), 45.21 mg/g (myricetin), और 22.66 मिलीग्राम/जी (मार्नसेटिन)।

3.3. पृथक यौगिकों का एंटीटायरोसिनेस गतिविधि और एंजाइम काइनेटिक अध्ययन

एंटीटायरोसिनेससक्रिय उप-अंशों से इन यौगिकों की गतिविधि का प्रतिनिधित्व तालिका 4 में किया गया था। सब्सट्रेट के रूप में एल-टायरोसिन का उपयोग करते समय, जांच किए गए यौगिकों की एंटीट्रोसिनेज गतिविधि का क्रम मेर्नसेटिन> मायरिकेटिन> गैलिक एसिड> अर्बुटिन था; mearnsetin में IC5 0 के 56.57 माइक्रोग्राम प्रति एमएल (0.17 मिमी) के मूल्य के साथ सबसे अच्छा निषेध प्रभाव था। सब्सट्रेट के रूप में उपयोग किए जाने वाले एल-डोपा में इसी तरह के परिणाम देखे गए थे; तीन फाइटोकेमिकल्स की प्रभावकारिता की तुलना में बेहतर थाअर्बुतिन.

एक सच्चे एंजाइम अवरोधक में प्रतिस्पर्धी, अप्रतिस्पर्धी, मिश्रित प्रकार (प्रतिस्पर्धी और अप्रतिस्पर्धी दोनों), और गैर-प्रतिस्पर्धी [12] सहित निषेध के चार तरीके होते हैं। काइनेटिक स्थिरांक, किमी और वीएमएक्स, विभिन्न सब्सट्रेट पर एंजाइम प्रारंभिक दर द्वारा निर्धारित किए जाते हैं। लाइनविवर-बर्क प्लॉट में सांद्रता; वे y-अक्ष पर प्रतिच्छेद करते हैं जो 1/Vmax के बराबर है, और वे x-अक्ष पर −1/Km प्रतिच्छेद करते हैं। साइट्रस के छिलके के आवश्यक तेल से टेरपेनॉइड यौगिकों के एंजाइम कैनेटीक्स अध्ययन मेंटायरोसिनेस, एक गैर-प्रतिस्पर्धी अवरोधक के रूप में साइट्रलैक्टेड, और मायसीन एक प्रतिस्पर्धी अवरोधक [36] था। 3,7-मशरूम टायरोसिनेस के खिलाफ डाइऑयल क्वेरसेटिन का निषेध तंत्र मेलेनिन के उत्पादन को दबाने के लिए प्रतिस्पर्धी निषेध मॉडल के माध्यम से था [42]।

तालिका 4. मशरूम tyrosinase के खिलाफ यौगिकों के IC50 मूल्य

तीन फाइटोकेमिकल्स के टायरोसिनेस पर अवरोध प्रकार को इन विट्रोएंजाइम काइनेटिक अध्ययन द्वारा स्पष्ट किया गया था। चित्र 4 ने मीनसेटिन के लाइनवीवर-बर्क प्लॉट (डबल पारस्परिक प्लॉट) को दिखाया। दोनों सबस्ट्रेट्स, एल-टायरोसिन और एल-डोपा के विश्लेषण में, मेर्नसेटिन के विभिन्न सांद्रता की रैखिक प्रतिगमन रेखा का वाई-अक्ष और बढ़ती ढलान पर एक ही अवरोध था। गैलिक एसिड, मायरिकेटिन, और मेरनेसेटिन के गतिज मापदंडों को तालिका 5 में संक्षेपित किया गया है। गैलिक एसिड या मीरसेटिन की उपस्थिति में, किमी में वृद्धि हुई है और Vmax में एक स्थिरांक देखा गया है, जो दर्शाता है कि गैलिक एसिड और मेर्नसेटिन दोनों टायरोसिनेस के प्रतिस्पर्धी अवरोधक थे। इसने संकेत दिया कि गैलिक एसिड और मोरसेटिन मुक्त करने के लिए बाध्य हो सकते हैंटायरोसिनेसउच्च आत्मीयता के साथ और सब्सट्रेट (L-tyrosine या L-DOPA) को tyrosinase की सक्रिय साइट पर बाध्य करने से रोकें। Myricetin एक मिश्रित प्रकार का अवरोधक पाया गया, जिसमें Km बढ़ाए जाने और Vmax को कम करने के बाद से प्रतिस्पर्धी और अप्रतिस्पर्धी अवरोध शामिल थे। अप्रतिस्पर्धी निषेध ने प्रदर्शित किया कि यौगिक tyrosinase-substratecomplex से बंधते हैं लेकिन मुक्त tyrosinase से नहीं।

3.4. अर्क, अंश, और पृथक फाइटोकेमिकल्स के एंटीमेलानोजेनेसिस प्रभाव

Zebrafish (डैनियो रेरियो) हाल के अध्ययनों में मेलानोजेनेसिस शोध के लिए एक उपन्यास और मान्य मॉडल जीव है [18-21,40]।एंटीमेलानोजेनेसिसविवो zebrafish परख में पत्ती निकालने और चार अंशों के प्रभाव चित्र 5 में दिखाए गए हैं। पत्तीनिचोड़और एथिल एसीटेट घुलनशील अंश ने मेलेनिन गठन इंजेब्राफिश भ्रूण के निषेध में अच्छा प्रदर्शन किया। 200 माइक्रोग्राम/एमएल की सांद्रता पर, पत्ती निकालने और एथिल एसीटेट घुलनशील अंश ने जेब्राफिश भ्रूण के क्रमशः 27.72 प्रतिशत और 35.60 प्रतिशत मेलेनिन उत्पादन को रोक दिया। सभी उपचारों ने 100 प्रतिशत जीवित रहने की दर के साथ जेब्राफिश भ्रूण के विकास को प्रभावित नहीं किया।

चित्रा 6 ने यौगिकों और सकारात्मक नियंत्रण, पीटीयू और अर्बुटिन के प्रभावों को प्रस्तुत कियामेलानोजेनेसिस50 µ मीटर की एकाग्रता पर zebrafish की । पीटीयू एक मजबूतटायरोसिनेसमेलेनिन उत्पादन को रोकने के लिए अवरोधक, जबकिअर्बुतिनएक वाणिज्यिक त्वचा-सफेदी एजेंट है; दोनों सकारात्मक नियंत्रण zebrafish में मेलेनिन गठन को कम कर सकते हैं। थ्रीफाइटोकेमिकल्स के बीच, मायरिकेटिन ने थोड़ा मेलेनिन निषेध प्रभाव दिखाया, जबकि मेर्नसेटिन में ज़ेब्राफिश में बेहतर मेलानोजेनेसिस निषेध गतिविधि थी।

की प्रभावी सांद्रतामेलानोजेनेसिस inhibition activity in zebrafish of compounds are listed in Table 6. IC50 values of PTU and arbutin were 26.29 µM and 323.69 µM, respectively. The order of antimelanogenesis activity of examined compounds was PTU >मोरसेटिन >अर्बुतिनऔर मायरिकेटिन> गैलिक एसिड। Mearnsetin ने जांच किए गए फाइटोकेमिकल्स के बीच 121.01 µM के IC50 मान के साथ सर्वोत्तम प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया।

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4। निष्कर्ष

मेलानोजेनेसिसनिषेध प्रभाव औरएंटीटाइरोसिनेसइस अध्ययन में सीलोन जैतून (ई। सेराटस) से पत्ती निकालने की गतिविधि का मूल्यांकन किया गया। पत्तों के बीचनिचोड़और इसके चार अंश, एथिल एसीटेट घुलनशील अंश का सबसे अच्छा थाएंटीटाइरोसिनेसगतिविधि। बायोएसे-निर्देशित क्रोमैटोग्राफी और वर्णक्रमीय विश्लेषणों द्वारा गैलिक एसिड, मायरिकेटिन और मेर्नसेटिन सहित फाइटोकेमिकल्स को अलग किया गया और सक्रिय उप-अंशों से पहचाना गया। इन यौगिकों की एंटीटाइरोसिनेस गतिविधि का क्रम मेर्नसेटिन> मायरिकेटिन> गैलिक एसिड था। इन विट्रो एंजाइम काइनेटिक अध्ययन से पता चलता है कि गैलिक एसिड और मीरसेटिन टायरोसिनेस के प्रतिस्पर्धी अवरोधक थे, और मायरिकेटिन एक मिश्रित प्रकार का अवरोधक था। विवो परख में जेब्राफिश के परिणामों से पता चला कि एक एथिल एसीटेट घुलनशील अंश और तीन फाइटोकेमिकल्स में महत्वपूर्णमेलानोजेनेसिसनिषेध प्रभाव। मोरसेटिन का एंटीमेलानोजेनेसिस प्रभाव सकारात्मक नियंत्रण से बेहतर था,अर्बुतिन, जेब्राफिश में।