मानव OCT2/MATE में एपिकल शीयर स्ट्रेस एन्हांस्ड ऑर्गेनिक केशन ट्रांसपोर्ट1-ट्रांसफ़ेक्टेड मैडिन-डार्बी कैनाइन किडनी सेल में सिलिअरी सेंसिंग शामिल है

अधिक जानकारी के लिए:emily.li@wecistanche.com

ऐश्वर्या जयगोपाल, पॉल आर. ब्रैकमैन, पीटर सोलर, निकोलस फेरेल, विलियम फिसेल, डीना एल. क्रोएट्ज़, और शुवो रॉय

बायोइंजीनियरिंग और चिकित्सीय विज्ञान विभाग (एजे, पीएस, डीएलके, एसआर) और बाल रोग (पीआरबी),

कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय सैन फ्रांसिस्को (यूसीएसएफ), सैन फ्रांसिस्को, कैलिफोर्निया;

और मेडिसिन विभाग, नेफ्रोलॉजी विभाग, वेंडरबिल्ट यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर, नैशविले, टेनेसी (एनएफ, डब्ल्यूएफ)

सार

द्वारा सक्रिय परिवहनगुर्देसमीपस्थ नलिकाएं औषधि वितरण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। दवा विकास के दौरान, का अनुमानगुर्देखुराक निर्धारण के लिए उत्सर्जन आवश्यक है। किडनी बायोरिएक्टर जो किडनी के फिजियोलॉजिकल चचेरे भाई को पुन: उत्पन्न करते हैं, जैसे कि प्रवाह-प्रेरित कतरनी तनाव, इन विट्रो मॉडल में वर्तमान की तुलना में विवो ड्रग व्यवहार में बेहतर भविष्यवाणी कर सकते हैं। इस अध्ययन में, हमने मैडिन-डार्बी कैनाइन द्वारा 4- (4- (डाइमिथाइलैमिनो) -स्टाइरिल) -एन-मिथाइल पाइरिडिनियम आयोडाइड (एएसपी प्लस) के सक्रिय परिवहन पर कतरनी तनाव की भूमिका की जांच की।गुर्दाप्रकोष्ठोंबहिर्जात रूप से मानव कार्बनिक कटियन ट्रांसपोर्टर कार्बनिक कटियन ट्रांसपोर्टर 2 (OCT2) और मल्टीड्रग और टॉक्सिन एक्सट्रूज़न प्रोटीन 1 (MATE1) व्यक्त करते हैं। निरंतर मीडिया छिड़काव के तहत एक समानांतर प्लेट में सुसंस्कृत कोशिकाओं ने इनुलिन के लिए एक उच्च अवरोध के साथ एक तंग मोनोलेयर का गठन किया। अपरूपण प्रतिबल (0.2-2 dynes/cm) के बढ़ते स्तर की प्रतिक्रिया में, कोशिकाओं ने ASP प्लस के परिवहन में एक समान वृद्धि दिखाई, जो अधिकतम 4 तक पहुंच गई।2-2 पर गुना वृद्धि स्थिर परिस्थितियों में सुसंस्कृत कोशिकाओं की तुलना में dynes/cm²। यह परिवहन इमीप्रामाइन से बाधित था, यह दर्शाता है कि कतरनी तनाव की स्थिति में सक्रिय परिवहन मौजूद था। 2 dynes/cm² के अपरूपण तनाव के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं ने भी ट्रांसफ़ेक्ट मनुष्यों और अंतर्जात OCT2 (3. 7- और 2. 0- गुना, क्रमशः) दोनों की RNA अभिव्यक्ति में वृद्धि दिखाई। अमोनियम सल्फेट द्वारा सिलिया को हटाने से एएसपी प्लस ट्रांसपोर्ट पर 0.5 डायन्स/सेमी² पर अपरूपण के प्रभाव को समाप्त कर दिया गया और स्थिर परिस्थितियों में एएसपी प्लस परिवहन पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि कतरनी तनाव कार्बनिक धनायनों के सक्रिय परिवहन को प्रभावित करता हैगुर्देट्यूबलरसिलिया-निर्भर तरीके से उपकला कोशिकाएं।

गुर्दे के कार्य के लिए सिस्टैन्च अच्छा है

परिचय

इष्टतम दवा उम्मीदवारों के चयन के लिए प्रीक्लिनिकल विधियों में प्रमुख प्रगति के बावजूद, दवा विकास एक लंबी और महंगी प्रक्रिया बनी हुई है जिसमें विपणन की गई नई आणविक संस्थाओं (वाटकिंस, 2011) की बहुत कम उपज है। प्रीक्लिनिकल मॉडल की एक बड़ी कमी मनुष्यों में निकासी और विषाक्तता की भविष्यवाणी करने में असमर्थता है। लगभग 30 प्रतिशत दवाएं जो प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में सफल होती हैं, वे अप्रत्याशित निकासी मूल्यों या विषाक्तता (कोला और लैंडिस, 2004) के परिणामस्वरूप मनुष्यों में विफल हो जाती हैं।

इन विट्रो सेल कल्चर मॉडलिंग के लिए किडनी एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण लक्ष्य है क्योंकि यह सभी दवाओं और अधिकांश मेटाबोलाइट्स (मॉरिसी एट अल।, 2013) के एक तिहाई से अधिक के उन्मूलन के लिए जिम्मेदार है।गुर्देविकास के दौरान दवा परीक्षण के लिए समीपस्थ नलिका महत्वपूर्ण है क्योंकि यह दवा उम्मीदवारों के अधिकांश सक्रिय परिवहन का प्रदर्शन करती है और विशेष रूप से विषाक्त चोट (जियाकोमिनेट अल।, 2010) के प्रति संवेदनशील है।गुर्देछोटी नलीएपिथेलियल कोशिकाओं का एक मोनोलेयर है जिसमें छानना शीर्ष सतह पर बहता है। एक तहखाने की झिल्ली ट्यूबलर एपिथेलियम के नीचे होती है, और आसन्न पेरिटुबुलर केशिकाएं पानी और सलामी के पुन: अवशोषण की अनुमति देती हैं। समीपस्थ ट्यूब्यूल माइक्रोएन्वायरमेंट, विशेष रूप से द्रव कतरनी तनाव और एपिकोबैसल ऑन्कोटिक ग्रेडिएंट, पारंपरिक सेल संस्कृति तकनीकों द्वारा अपूर्ण रूप से पुन: पेश किया जाता है। एपिथेलियल सेल बायोरिएक्टर जो विवो फिजियोलॉजी में मुख्य रूप से कब्जा करते हैं, इन विट्रो एसेज़ (पफलर और गस्ट्रौंथलर, 1998; अस्तशकिना एट अल।, 2012) से प्राप्त निकासी और विषाक्तता की भविष्यवाणियों की सटीकता में सुधार कर सकते हैं।

बढ़ते साक्ष्य इंगित करते हैं कि समीपस्थ नलिका कोशिका आकृति विज्ञान और कार्यक्षमता विकास के वातावरण के साथ भिन्न हो सकती है, जैसे कि विकास सतह सरंध्रता, दोनों तरफ तरल पदार्थ के संपर्क में, और/या द्रव कतरनी तनाव। Essig और Friedlander (2003) के साथ-साथ हमारी प्रयोगशाला (Ferrell et al.2010) के पिछले काम ने प्रदर्शित किया है कि समीपस्थ नलिका कोशिकाओं (Ferrell et al।, 2010) के एपिकल एक्टिन साइटोस्केलेटन में ट्यूबलर द्रव प्रवाह-प्रेरित पुनर्व्यवस्था। . इसके बाद, कई अध्ययनों से पता चला है कि कतरनी तनाव सोडियम-हाइड्रोजन एंटीपोर्टर 3 सहित कई अपटेक और इफ्लक्स ट्रांसपोर्टर्स के अभिव्यक्ति स्तर और स्थानीयकरण को प्रभावित करता है। Na/K-ATPase, ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर, एपिथेलियल सोडियम चैनल, और एंडोसाइटोसिस रिसेप्टर्स, मेगालिन और ट्यूबुलिन (डुआन एट अल।, 2010; राघवन एट अल। 2014; जेन्सन एट अल ..2016; अर्नान्डेज़ एट अल।, 2018)। अन्य काम ने प्रदर्शित किया है कि एक ट्यूबलर बायोरिएक्टर सिस्टम में अपरूपण प्रवाह ओरिएंट और एलॉन्गेट्सगुर्देट्यूबलरप्रवाह पथ के साथ कोशिकाएं (वेन्ज़ैक एट अल। 2018)। इन विट्रो साक्ष्य इंगित करता है कि साइटोस्केलेटल संरचना और परिवहन कार्य में कुछ परिवर्तन संभवतः सिलिया के यांत्रिकी कार्य से संबंधित हैं (ओवरगार्ड एट अल.. 2009; राघवन एट अल..2014); हालांकि, कुछ अध्ययनों ने वृक्क कोशिकाओं में ड्रग ट्रांसपोर्टरों पर अपरूपण तनाव के प्रभाव पर विचार किया है। इसके अलावा, सेल कार्यक्षमता पर विभिन्न कतरनी दरों के प्रभाव के बारे में बहुत कम जानकारी है, विशेष रूप से कतरनी तनाव के निरंतर संपर्क के साथ। अधिकांश अध्ययनों ने एकल अपरूपण प्रतिबल दर पर विचार किया है और केवल अल्पकालिक प्रयोग (1-6 घंटे) किए हैं, जिससे अपरूपण के वास्तविक प्रभावों और सूक्ष्म पर्यावरण में अचानक परिवर्तन के लिए कोशिकीय तनाव प्रतिक्रिया के बीच अंतर करना मुश्किल हो गया है (डुआन) एट अल.2010; जंग एट अल2013: मैगिओरानी एट अल.2015)।

यहां, एक माइक्रोफ्लुइडिक बायोरिएक्टर का उपयोग कतरनी तनाव के श्रेणीबद्ध स्तरों के प्रभाव की जांच करने के लिए किया गया थागुर्देप्रॉक्सिमल ट्यूब्यूल सेल ड्रग ट्रांसपोर्टर ऑर्गेनिक केशन ट्रांसपोर्टर 2 (OCT2) और मल्टीड्रग एंड टॉक्सिन एक्सट्रूज़न प्रोटीन 1 (MATE1)। हम प्रदर्शित करते हैं कि बढ़ते हुए अपरूपण तनाव से कार्बनिक धनायन परिवहन और ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति में वृद्धि होती है और यह कि सिलिया कतरनी तनाव के लिए इस सेलुलर प्रतिक्रिया में शामिल हैं।

सामग्री और तरीके

डिवाइस निर्माण और असेंबली। हमने पहले एक समानांतर प्लेट बायोरिएक्टर के लिए अपना डिज़ाइन प्रकाशित किया है जो कोशिकाओं के शीर्ष भाग में समायोज्य ऊंचाई का द्रव प्रवाह पथ प्रदान करता है और बेसल पक्ष पर एक स्थिर जलाशय (ब्रेकमैन एट अल।, 2016)। यहां प्रस्तुत कार्य के लिए, हमने एक साथ चार जैविक स्थितियों का परीक्षण करने की अनुमति देने के लिए चार अलग-अलग प्रवाह पथों के साथ एक मल्टीप्लेक्स डिवाइस बनाने के लिए अपने पिछले डिज़ाइन को अनुकूलित किया (चित्र 1)। प्रत्येक उपकरण तीन परतों से बना होता है: एक 5-मिलीलीटर शीर्ष जलाशय के साथ एक आधार, स्नैपवेल डालने के लिए एक मध्य प्लेट (कोस्टार, कॉर्निंग, कॉर्निंग, एनवाई) 1.12 सेमी² सेल क्षेत्र के साथ, और एक शीर्ष प्लेट जिसमें एक 1-से 2-मिलीलीटर बेसोलैटरल जलाशय। थाली

ऑटोक्लेविंग द्वारा नसबंदी की अनुमति देने के लिए पॉलीसल्फोन से मशीनीकृत किया गया था। तरल डिब्बों को सील करने के लिए और चैनल की ऊंचाई को परिभाषित करने के लिए शीर्ष पर 500- से 1000- उम ऊंचाई के लेजर-कट सिलिकॉन गास्केट को प्लेटों के प्रत्येक सेट के बीच सैंडविच किया गया था। बायोरिएक्टर को स्क्रू का उपयोग करके इकट्ठा किया गया था। मीडिया जलाशय और बबल ट्रैप बिल्ट-इन कॉलम था। इनलेट्स और आउटलेट्स को मास्टरफ्लेक्स LS14 सिलिकॉन टयूबिंग के साथ 1.6-मिमी इनर डायमीटर (कोल पारमेर लैब सप्लाई, वर्नोन हिल्स, आईएल) के साथ कांटेदार कनेक्टर का उपयोग करके जोड़ा गया था। द्रव प्रवाह और इस प्रकार शिखर कतरनी तनाव एक क्रमाकुंचन पंप (कोल परमेर) द्वारा निर्धारित और नियंत्रित किया गया था।

सेल संस्कृति और प्रवाह। MDCK कोशिकाओं को या तो एक खाली वेक्टर या अपटेक और इफ्लक्स ट्रांसपोर्टर्स (hOCT2/hMATE1) (कोनिग एट अल..2 0 11) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था, जो डॉ। मार्टिन फ्रॉम (एरलांगेन, जर्मनी) द्वारा प्रदान किए गए थे और सुसंस्कृत थे। 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम (गिब्को, थर्मो फिशर साइंटिफिक, वॉलथम, एमए) और 1 प्रतिशत पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (यूसीएसएफ सेल कल्चर फैसिलिटी) के साथ अर्ल के संतुलित नमक समाधान (यूसीएसएफ सेल कल्चर सुविधा) के साथ न्यूनतम आवश्यक माध्यम। पांच सौ माइक्रोग्राम प्रति मिली लीटर हाइग्रोमाइसिन (यूसीएसएफ सेल कल्चर फैसिलिटी) और 100 मिलीग्राम/एच एमएल जेनेटिकिन (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ) को डबल ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के लिए मीडिया में जोड़ा गया था। प्रवाह प्रयोगों के लिए, hOCT2/hMATE1 MDCK सेल स्नैपवेल इंसर्ट (कॉर्निंग) के नीचे 300, 000 कोशिकाओं/कुओं (250, 000 कोशिकाओं/सेमी”) के घनत्व पर चढ़ाया गया, संगम तक स्थिर परिस्थितियों में उगाया गया। और फिर अंदर रखा गया बायोरिएक्टर। एपिकल मीडिया प्रवाह को 0.1 से 1-6 एमएल मिनट तक बढ़ा दिया गया था जब तक कि वांछित कतरनी तनाव प्राप्त नहीं हो गया था और फिर प्रयोग से पहले 72 घंटे के लिए स्थिर छोड़ दिया गया था। कोशिकाओं को स्थिर परिस्थितियों में नियंत्रण के समान समय के लिए उगाया गया था .

इम्यूनोफ्लोरेसेंस। कोशिकाओं को 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड (थर्मो फिशर साइंटिफिक) के साथ तय किया गया था, जिसे 0.1 प्रतिशत ट्राइटन-शिन पीबीएस (सिग्मा-एल्ड्रिच) के साथ पारगम्य किया गया था, और गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (सिग्मा-एल्ड्रिच) के साथ अवरुद्ध किया गया था। बाद में उन्हें एलेक्सा 488 लेबल वाले ज़ोनुला ऑग्लुडेंस -1 माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (लाइफ टेक्नोलॉजीज, कार्ल्सबैड, सीए) या एक प्राथमिक एसिटिलेटेड-ट्यूबुलिन माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (लाइफ टेक्नोलॉजीज) के 60 मिनट के लिए 1:50 कमजोर पड़ने के साथ जोड़ा गया। ए-ट्यूबुलिन एंटीबॉडी के साथ इलाज किए गए कोशिकाओं को तब एफ-एक्टिन धुंधला के लिए एक माध्यमिक 561 एंटी-माउस बकरी एंटीबॉडी (लाइफ टेक्नोलॉजीज) और फैलोलाइडिन (थर्मो फिशर साइंटिफिक) के साथ जोड़ा गया था। 40x तेल उद्देश्य के साथ निकॉन (टोक्यो, जापान) वर्णक्रमीय कन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इमेजिंग किया गया था।

बाधा प्रदर्शन। इनुलिन, एक 5000 Da बहुलक, ग्लोमेरुलर निस्पंदन दर का एक प्रसिद्ध मार्कर है और विवो में समीपस्थ नलिका के रिसाव का एक मार्कर है (सोहटेल एट अल, 1983):

FITC- लेबल वाले इनुलिन (सिग्मा-एल्ड्रिच) को एपिकल मीडिया में जोड़ा गया और उपकरणों के माध्यम से प्रवाहित होने दिया गया। नमूने हर 24 घंटे में बेसल जलाशय से एकत्र किए गए थे और जीनियस प्रो फ्लोरोसेंस प्लेट रीडर (टेकन, मैनडॉर्फ, स्विट्जरलैंड) का उपयोग करके इनुलिन सामग्री के लिए विश्लेषण किया गया था। सेल मोनोलेयर के बैरियर फंक्शन की गणना एपिकल और बेसल डिब्बों में मापे गए इनुलिन स्तरों से की गई थी, जैसा कि eq.1 द्वारा वर्णित है। यहां, कैपिटल एपिकल कंपार्टमेंट में इनुलिन की एकाग्रता है, और सी मल बेसल कम्पार्टमेंट में एकाग्रता है। Inulinleak की गणना 24 घंटे के बाद कोशिका क्षेत्र द्वारा विभाजित बेसल (दाता) डिब्बे में एकाग्रता के रूप में की गई थी।

एएसपी प्लस ट्रांसपोर्ट। ट्रांसड्यूस्ड ट्रांसपोर्टर जीन को परिवहन प्रयोग से 24 घंटे पहले 10 मिमी Na-ब्यूटाइरेट (सिग्मा-एल्ड्रिच) से प्रेरित किया गया था, जैसा कि पहले बताया गया था (कोनिग एट अल, 2011)। जब उपयुक्त हो, कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए बेसल पक्ष पर एक अवरोधक 500μM इमीप्रैमीन या 1 मिमी सिमेटिडाइन (सिग्मा-एल्ड्रिच)) के साथ ऊष्मायन किया गया था, इसके बाद 25μM 4-（4-डाइमिथाइलैमिनो）- स्टायरिल-एन-मिथाइल पाइरिडिनियम (एएसपी प्लस) (लाइफ टेक्नोलॉजीज) और 1 घंटे के लिए ऊष्मायन। एपिकल और बेसल मीडिया से नमूने एकत्र किए गए थे। कोशिकाओं को तब तीन बार बर्फ-ठंडे फॉस्फेट-बफर खारा से धोया गया था और एएसपी प्लस संचय और परिवहन के मापन के लिए लाइस किया गया था। परिवहन प्रयोगों को एक साथ कतरनी तनाव के तहत कोशिकाओं पर किया गया और स्थिर परिस्थितियों में सुसंस्कृत किया गया। ASP प्लस सांद्रता को Genios Pro प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर (Tecan) पर 485 एनएम के उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और 590 एनएम के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर निर्धारित किया गया था।

प्रोटीन मात्रा का ठहराव। कोशिकाओं को 1 प्रतिशत एसडीएस -10 M NaOH lysis बफर के साथ रात भर मिलाते हुए lysed किया गया था। प्रोटीन सामग्री को एक मानक पियर्स बीसीए प्रोटीन परख किट (थर्मो फिशर) का उपयोग करके मापा गया था। जहां उपयुक्त हो, कोशिका वृद्धि क्षेत्र में प्रोटीन सामग्री को सामान्य किया गया।

आरएनए अभिव्यक्ति। आरएनए को आरएनएसी आरएनए एक्सट्रैक्शन किट (क्यूजेन, हिल्डेन, जर्मनी) का उपयोग करके कोशिकाओं से निकाला गया था, और सीडीएनए को एक स्क्रिप्ट किट (बायो-रेड, हरक्यूलिस, सीए) का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था। सीडीएनए का उपयोग मानव और कुत्ते OCT2 और MATE1 का पता लगाने के लिए किया गया था। डॉग पी-ग्लाइकोप्रोटीन (पी-जीपी) क्वांटिटेटिव रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन द्वारा एक टैगमैन एसे और प्रोब (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) का उपयोग करके फास्ट रीयलटाइम पीसीआर इंस्ट्रूमेंट (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) पर। राइबोसोमल प्रोटीन S18 (RS-18) का उपयोग हाउसकीपिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था। ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति पर कतरनी तनाव के प्रभाव का विश्लेषण आरएस -18 (पीटर्स एट अल। 2007; श्मिटजेन और लिवाक, 2008) के सापेक्ष व्यक्त ट्रांसपोर्टर स्तरों का उपयोग करके 4ACt पद्धति का उपयोग करके किया गया था। पी-जीपी का उपयोग ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति पर कतरनी तनाव के वैश्विक प्रभावों के एक उपाय के रूप में किया गया था।

डिसीलिएशन। कोशिकाओं को संगम तक उगाया गया और फिर एएसपी प्लस ट्रांसपोर्ट (ऑक्सगार्ड एट अल 2009) के मापन से पहले 24 घंटे के लिए 30 मिमी अमोनियम सल्फेट (फ्लुका एजी) की अनुपस्थिति या उपस्थिति में ऊष्मायन किया गया। सिलिया की उपस्थिति एक ट्यूबुलिन की इमेजिंग द्वारा निर्धारित की गई थी जैसा कि यहां पहले से ही वर्णित है।

सांख्यिकी। प्रत्येक प्रयोग के भीतर न्यूनतम दो तकनीकी प्रतिकृति के साथ सभी प्रयोग तीन प्रतियों में किए गए थे। डेटा को माध्य ± एसडी के रूप में व्यक्त किया जाता है और बॉक्स और व्हिस्कर प्लॉट के रूप में रेखांकन किया जाता है। सांख्यिकीय विश्लेषण विचरण के एकतरफा या दो-तरफ़ा विश्लेषण द्वारा किए गए थे, और का पी-मूल्य<0.05 was="" considered="" significant.="" data="" were="" analyzed="" using="" prism="" version="" 6.0="" (graphpad,="" san="" diego,="">

परिणाम

सेल मॉर्फोलॉजी और बैरियर फंक्शन। इम्युनोफ्लुओ के हाल ही में अंडरफ्लो रखी गई कोशिकाओं के विश्लेषण से टाइट-जंक्शन प्रोटीन के साथ एकसमान मोनोलेयर गठन का पता चला, ज़ोनुला ओग्लुडेंस -1, स्थिर और प्रवाह स्थितियों (छवि 2, ए-सी) दोनों के तहत कोशिकाओं के बीच तंग जंक्शनों के लिए स्थानीयकृत। अपरूपण तनाव (चित्र 2डी) के जवाब में मोनोलेयर के प्रति वर्ग सेंटीमीटर में प्रोटीन सामग्री में 1.6- गुना वृद्धि तक कुल प्रोटीन सामग्री की मात्रा का प्रदर्शन किया गया। इसके बाद, हमने मोनोलेयर के पार, समीपस्थ नलिका रिसाव के एक मार्कर, इनुलिन की पारगम्यता को मापा। उपकरणों ने 7 दिनों के कल्चर में 97.9 प्रतिशत 6 1.42 प्रतिशत की बाधा प्रदर्शन दर को बरकरार रखा है, जो कि अपरूपण तनाव (छवि 2ई) के 2 डायन/सेमी2 तक है, जिसके परिणामस्वरूप { के दिन 6 में अंतिम इनुलिन रिसाव दर है। {15}}.13–0.69 मिलीग्राम/सेमी2 प्रति दिन।

कार्बनिक धनायन परिवहन पर अपरूपण तनाव का प्रभाव। एएसपी प्लस का परिवहन, OCT2 और MATE1 का एक ऑटो-फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट, कतरनी तनाव के विभिन्न स्तरों पर 1 घंटे के लिए मापा गया था। 0। 2-2 dynes/cm²）। MDCK कोशिकाओं ने hOCT2 और hMATE1 को बहिर्जात रूप से व्यक्त करते हुए 4 दिखाया 2- एएसपी प्लस ट्रांसपोर्ट में 2 डायन्स / सेमी² के कतरनी तनाव के जवाब में गुना वृद्धि, जैसा कि सेलुलर संचय (छवि 3 ए) और ट्रांससेलुलर ट्रांसपोर्ट (छवि) दोनों के उपायों में परिलक्षित होता है। 3बी)। एएसपी प्लस संचय या ट्रांससेलुलर परिवहन पर कतरनी तनाव का प्रभाव 0.5 और 2 डायन/सेमी² के कतरनी तनाव के समान था। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या सक्रिय एएसपी प्लस परिवहन बढ़ाया गया था, एएसपी प्लस का ट्रांस-पोर्ट 0 के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं द्वारा। कतरनी तनाव के 2 डायन / सेमी को 500 यूएम इमीप्रामाइन, एक ओसीटी {{20} के साथ या बिना दिखावा के साथ मापा गया था। } और मेट1-विशिष्ट अवरोधक। एएसपी प्लस ट्रांसपोर्ट को शीयर स्ट्रेस परिस्थितियों में इमीप्रैमीन 60.3 प्रतिशत ± 15.8 प्रतिशत द्वारा बाधित किया गया था, जबकि स्थिर परिस्थितियों में 47.6 प्रतिशत ± 19.7 प्रतिशत की तुलना में (चित्र 3सी)।

इस अवलोकन को और समझने के लिए, मानव OCT2 (ट्रांसफ़ेक्ट), कैनाइन OCT2 (अंतर्जात), और कैनाइन P-GP (अंतर्जात) की अभिव्यक्ति पर कतरनी तनाव के प्रभाव को 72 घंटे के बाद कतरनी के विभिन्न स्तरों के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं में मापा गया। 7 दिनों में कतरनी का धीमा रैंप-अप (चित्र 4)। स्थिर परिस्थितियों में सुसंस्कृत कोशिकाओं की तुलना में, कतरनी के संपर्क में आने वाली एमडीसीके कोशिकाओं ने ट्रांसफ़ेक्ट मानव और अंतर्जात ओसीटी 2 (क्रमशः 3. 7- और 2. 0- गुना, क्रमशः) की अभिव्यक्ति में कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं दिखाया। ट्रांसफ़ेक्ट MATE1 या अंतर्जात P-GP की अभिव्यक्ति पर।

कतरनी के जवाब में सिलिया की भूमिका। इमेजिंग से पता चला है कि डबल-ट्रांसफ़ेक्ट एमडीसीके कोशिकाएं स्थिर और प्रवाह स्थितियों (छवि 5, ए और ई) दोनों के तहत सिलिया को व्यक्त करती हैं। 24 घंटे के लिए कोशिकाओं के 3 0 मिमी अमोनियम सल्फेट के संपर्क में आने से सिलिया (चित्र 5, सी और जी) का पूर्ण नुकसान हुआ। महत्वपूर्ण रूप से, सेल-मेम्ब्रेन जंक्शनों पर डीसिलिएशन का कोई सकल प्रभाव नहीं था, जैसा कि एफ-एक्टिन की इमेजिंग द्वारा मापा जाता है, जो एपिथेलियल कोशिकाओं में सेल-मेम्ब्रेन जंक्शनों पर टाइट-जंक्शन प्रोटीन को लंगर डालता है (चित्र। 5.डी और एचडी (स्टीवेन्सन और बेग।) 1994)। हालांकि इन छवियों में एफ-एक्टिन धुंधला का कुछ मोटा होना है, यह एक सुसंगत खोज नहीं थी, और इस प्रकार हमने इस प्रभाव की मात्रा निर्धारित नहीं की। स्थिर परिस्थितियों में सुसंस्कृत कोशिकाओं द्वारा परिवहन पर विघटन का कोई प्रभाव नहीं पड़ा। लेकिन यह पूरी तरह से कतरनी के 0.5 डायन्स/सेमी² के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं में एएसपी प्लस परिवहन पर कतरनी तनाव के प्रभावों को समाप्त कर दिया।

बहस

मानव शरीर में दवाओं को खत्म करने में किडनी केंद्रीय भूमिका निभाती है। विशेष रूप से द्रव प्रवाह के संबंध में, इन विट्रो दवा परीक्षण के लिए गुर्दे की शरीर क्रिया विज्ञान की जटिलता की सटीक नकल करना महत्वपूर्ण है। द्रव प्रवाह से कतरनी तनाव को इन विट्रो में कोशिका आकृति विज्ञान और आयन ट्रांसपोर्टरों को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है, लेकिन दवा ट्रांसपोर्टरों पर प्रभाव के बारे में बहुत कम जानकारी है (डुआन एट अल।, 2010; फेरेल एट अल।, 2012; जेन्सन एट अल।, 2016) . इसके अतिरिक्त, अधिकांश पिछले अध्ययनों ने केवल अल्पकालिक कतरनी (1-6 घंटे) के प्रभाव को मापा है, जो अन्य सेलुलर तनाव प्रतिक्रियाओं से कतरनी तनाव प्रभावों को पूरी तरह से अलग करने की संभावना नहीं है (डुआन एट अल..2010; जंग एट अल। 2013; मैगीओरानी एट अल..2015)। इन अध्ययनों में, हमने दवा परिवहन पर द्रव प्रवाह से निरंतर (7 दिन) कतरनी तनाव के प्रभावों पर ध्यान केंद्रित किया है ताकि निरंतर कतरनी तनाव का अनुभव किया जा सके।गुर्देट्यूबलरविवो में कोशिकाएं।

यह समझना कि ड्रग ट्रांसपोर्टर निरंतर कतरनी तनाव का जवाब कैसे देते हैं, गुर्दे द्वारा इन विवो ड्रग हैंडलिंग की इन विट्रो भविष्यवाणियों में सुधार कर सकते हैं। गुर्दे के इन विट्रो मॉडल में सटीक रूप से डिज़ाइन किए गए प्रीक्लिनिकल परीक्षण को मानकीकृत कर सकते हैं और दवा की विफलता दर को कम कर सकते हैं।

इस कार्य में, OCT2 और MATE1 द्वारा कार्बनिक धनायन परिवहन पर निरंतर अपरूपण तनाव के प्रभावों को निर्धारित करने के लिए एक समानांतर प्लेट माइक्रोफ्लुइडिक बायोरिएक्टर का उपयोग किया गया था।गुर्देछोटी नलीकोशिका की परत। इन अध्ययनों के लिए कई सेल लाइनों पर विचार किया गया था, जिसमें मानव कोशिका रेखाएं शामिल हैं, जैसे कि होफ़र समूह से मानव समीपस्थ नलिका कोशिकाएं (ओरोज़ एट अल, 2004) और आरपीटीईसी (सीआरएल -4031: अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन, मानस, वीए) ( Wieser et al।, 2008), लेकिन कई कारणों से इस अध्ययन के लिए डबल-ट्रांसफ़ेक्ट hOCT2 / hMATE1 MDCK कोशिकाओं को सबसे उपयुक्त विकल्प माना गया। सबसे पहले, एमडीसीके कोशिकाएं लगातार ट्रांसवेल आवेषण के लिए मजबूत लगाव प्रदर्शित करती हैं, जो उन्हें द्रव प्रवाह के प्रारंभिक तनाव का सामना करने की अनुमति देती है। दूसरा, ये कोशिकाएं तंग मोनोलयर्स बनाती हैं, जो रिसाव को रोकती हैं और मार्कर सबस्ट्रेट्स के ट्रांससेलुलर ट्रांसपोर्ट के अध्ययन के लिए आवश्यक हैं। अंत में, ट्रांसपोर्टरों की बहिर्जात अभिव्यक्ति सक्रिय परिवहन की बेहतर पहचान और गड़बड़ी के प्रभाव की अनुमति देती है।

अंडरफ्लो रखी गई कोशिकाओं ने एक मिला हुआ मोनोलेयर बनाया और सेल की परिधि में एक टाइट-जंक्शन प्रोटीन को स्थानीयकृत किया। उन्होंने इनुलिन पारगम्यता द्वारा मापा गया एक उच्च बाधा कार्य भी बनाए रखा। उपकला कोशिकाओं की एक मोनोलेयर बनाने की क्षमता जो द्रव और प्रोटीन के रिसाव को रोकती है, नलिका के उचित कार्य के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है। यहां, एमडीसीके कोशिकाओं के माध्यम से रिसाव कम से कम 1 कुरूप/सेमी² प्रति दिन था और मानव कोशिकाओं के माध्यम से काफी कम था। हमने पहले दिखाया है कि मानव गुर्दा कोशिका मोनोलयर्स में एक 10-20 कुरूप/सेमी² प्रति दिन इंसुलिन रिसाव（ब्रेकमैन एट अल।, 2016) है, जो इस निष्कर्ष का समर्थन करता है कि hOCT2/hMATE1 MDCK कोशिकाओं ने एक मजबूत मोनोलेयर का गठन किया।

स्थिर नियंत्रण की तुलना में 72 घंटे के लिए कतरनी तनाव के विभिन्न स्तरों के संपर्क में आने वाले hOCT2 / hMATE1 MDCK कोशिकाओं में ASP प्लस के परिवहन में काफी वृद्धि हुई थी। ASP प्लस को OCT2 (SLC22A2) द्वारा लिया जाता है और MATE1 (SLC47A1) द्वारा प्रवाहित किया जाता है, दो ऑर्गेनिक कटियन ट्रांसपोर्टर जो कि सुविधा के लिए कंसर्ट में काम करते हैंगुर्देआमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली दवाओं का स्राव, जैसे मेटफॉर्मिन और सिस्प्लैटिन (Biermann et al.2006; Wittwer et al.2013)। समीपस्थ नलिका आयन ट्रांसपोर्टरों के लिए कतरनी तनाव के समान प्रभावों की सूचना दी गई है। बढ़े हुए कतरनी तनाव (ओवरगार्ड एट अल..2009; डुआन एट अल.2010: फेरेल एट अल..2012: राघवन एट अल।) 2014)। इसका संसर्गगुर्देतनाव को कम करने के लिए समीपस्थ नलिका कोशिकाएं भी कम एपोप्टोसिस और तीव्र सिस्प्लैटिन विषाक्तता से तेजी से वसूली और कार्बनिक आयनों के परिवहन के बढ़े हुए निषेध के साथ जुड़ी हुई हैं (जंग एट अल। 2 0 13)। चूंकि द्रव प्रवाह से कतरनी तनाव समीपस्थ नलिका में लगातार मौजूद होता है, ये निष्कर्ष सामूहिक रूप से गुर्दे की दवा के स्वभाव और विषाक्तता की भविष्यवाणी करने के लिए इन विट्रो मॉडल सिस्टम में अधिक शारीरिक उपयोग का समर्थन करते हैं। यह उल्लेखनीय है कि अपरूपण प्रतिबल के 0.5 और 2.0 dynes/cm² के बीच ट्रांसपोर्टर फ़ंक्शन में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है। Essig और Friedlander (2003) द्वारा किए गए पूर्व अध्ययनों में पाया गया था कि कोशिका आकृति विज्ञान में परिवर्तन लाने के लिए 0.17 dynes/cm2 के न्यूनतम स्तर के कतरनी की आवश्यकता होती है, और अन्य अध्ययनों ने इस पर प्रभाव को मापा है। 1 dyne/cm²（Duan et al.,2010） तक फिजियोलॉजी। वृक्क दवा ट्रांसपोर्टरों की कार्यक्षमता पर उच्च और निरंतर कतरनी तनाव स्तरों की एक श्रृंखला के प्रभावों का पता लगाने के लिए यह पहला अध्ययन है, और यह संभव है कि कतरनी तनाव के 0.5 और 2.0 डायन / सेमी² के बीच जैविक अंतर की परिमाण है कि हम मूल्यांकन हमारे assays में कतरनी तनाव के इन स्तरों के बीच अंतर की पहचान करने की अनुमति देने के लिए पर्याप्त बड़ा नहीं था। यद्यपि आगे की जांच की आवश्यकता है, हमारे परिणाम शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल के लिए आवश्यक शर्तों और गुर्दे की दवा से निपटने पर रोग के कारण बढ़े हुए कतरनी तनाव के स्तर पर प्रकाश डालते हैं।

हमारे प्रायोगिक तरीकों की सीमाओं में से एक यह है कि हमने केवल hOCT2/hMATE1 MDCK कोशिकाओं (कोनिग एट अल..2011) के लिए पहले वर्णित प्रयोगात्मक विधियों की नकल करते हुए पीएच 7.4 के साथ मीडिया का उपयोग करते हुए पीएच 7.4 पर परिवहन को संबोधित किया। बेसल पीएच ग्रेडिएंट के लिए एक एपिकल OCT2 और MATE1 फ़ंक्शन को प्रभावित कर सकता है, और आमतौर पर शारीरिक स्थितियों (मुलर एट अल।, 2013) के तहत एक पीएच ग्रेडिएंट होता है। इसलिए, हमारे तरीकों ने OCT2 और MATE1 फ़ंक्शन पर एक एपिकल से बेसल पीएच ग्रेडिएंट और कतरनी तनाव के बीच बातचीत का मूल्यांकन करने की हमारी क्षमता को सीमित कर दिया। चूंकि हमने सभी प्रायोगिक स्थितियों में एक सुसंगत pHof7.4 का उपयोग किया है, इसलिए pH ग्रेडिएंट की कमी ने हमारे निष्कर्षों को प्रभावित करने की संभावना नहीं है, लेकिन संभावित रूप से बेसल पीएच ग्रेडिएंट के लिए एक एपिकल की उपस्थिति में OCT2 और MATE1 परिवहन के लिए हमारे निष्कर्षों की प्रयोज्यता को सीमित करता है।

आश्चर्यजनक रूप से, ट्रांसफ़ेक्ट मानव और अंतर्जात OCT2 की mRNA अभिव्यक्ति स्थिर नियंत्रणों की तुलना में कतरनी तनाव के सभी स्तरों के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं में बढ़ गई थी। ट्रांसपोर्टर एक्सप्रेशन का यह अपग्रेडेशन विशिष्ट था, जिसका अंतर्जात पी-जीपी एक्सप्रेशन या ट्रांसफ़ेक्टेड MATE1 पर कोई औसत दर्जे का प्रभाव नहीं था। ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति का अपगमन बढ़े हुए परिवहन के पीछे के तंत्र में अंतर्दृष्टि देता है और यह बढ़ी हुई mRNA स्थिरता या बढ़े हुए mRNA प्रतिलेखन का परिणाम हो सकता है। यह ध्यान रखना दिलचस्प है कि ट्रांसफ़ेक्ट और अंतर्जात दोनों ट्रांसपोर्टरों को अपग्रेड किया गया था, जो कि अप्रत्याशित है क्योंकि ट्रांसफ़ेक्ट OCT2 को साइटोमेगालोवायरस प्रमोटर के तहत व्यक्त किया गया था और अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति नियामक तंत्र के अधीन नहीं होना चाहिए। हालांकि आश्चर्य की बात है, यह अवलोकन अभूतपूर्व नहीं है। छिड़काव के संपर्क में आने वाले OAT1 ट्रांसफ़ेक्ट समीपस्थ नलिका कोशिकाओं पर एक समान प्रभाव की सूचना दी गई है, लेकिन बढ़ी हुई अभिव्यक्ति के लिए तंत्र स्पष्ट नहीं है (जानसेन एट अल।, 2016)। एक अन्य अध्ययन में, एनआरएफएक्सएनएक्स सिग्नलिंग को कतरनी तनाव (फुकुडा एट अल।, 2017) के जवाब में अंतर्जात मेट 2- के अभिव्यक्ति को बढ़ाने में भूमिका निभाने के लिए पाया गया था। इसमें आगे का अध्ययन वारंट है और भविष्य की जांच का विषय होगा।

हमने यह भी पहचाना कि एपिकल शीयर फ्लो की शुरूआत से प्रति वर्ग सेंटीमीटर कोशिकाओं में प्रोटीन की मात्रा में वृद्धि हुई है। यह प्रभाव कतरनी के 0.5 और 2dynes/cm² दोनों के लिए समान परिमाण था, mRNA अभिव्यक्ति और ASP प्लस परिवहन के लिए देखे गए प्रभाव के समान। कुछ सबूत हैं कि कतरनी तनाव लम्बे को प्रेरित करता हैगुर्देउपकला कोशिकाएं, जिसके परिणामस्वरूप प्रति वर्ग सेंटीमीटर बड़ी मात्रा में कोशिकाएं होंगी और इस प्रकार प्रति वर्ग सेंटीमीटर प्रोटीन में संभावित वृद्धि होगी; हालाँकि, यह पहले से प्रकाशित घटना डेटा के एक बड़े निकाय में केवल एक मामूली अवलोकन थी और परिमाणित नहीं थी (लॉन्ग एट अल।, 2017)। शिखर कतरनी प्रवाह की उपस्थिति में विकसित कोशिकाओं में कुल प्रोटीन में वृद्धि स्वस्थ के लिए सामान्य प्रोटीन सामग्री का प्रतिनिधित्व कर सकती हैगुर्देट्यूबलरउपकला कोशिकाएं जो केवल कोशिकाओं के शिखर कतरनी प्रवाह के संपर्क में आने से प्राप्त की जा सकती हैं। इसलिए, स्थैतिक संस्कृति में विकसित कोशिकाओं में प्रोटीन सामग्री का निम्न स्तर एक असामान्य कोशिकीय अवस्था का प्रतिनिधित्व कर सकता है, जैसा कि तीव्र गुर्दे की चोट जैसे कम शिखर छानना प्रवाह की स्थितियों में चिकित्सकीय रूप से हो सकता है। यह घटना आगे के अध्ययन के योग्य है।

सिलिया को समीपस्थ नलिका (राघवन और वीज़, 2 016) में यांत्रिक भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है। इसलिए, यह निर्धारित करने के लिए कि क्या वे बढ़े हुए OCT2 और MATE 1- की मध्यस्थता वाले परिवहन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, ट्रांसपोर्टर फ़ंक्शन पर सिलिया हटाने के प्रभाव को मापा गया। हमारे अध्ययन में सिलिया को हटाकर एएसपी प्लस परिवहन में कतरनी-निर्भर वृद्धि की पूर्ण नाकाबंदी राघवन एट अल द्वारा अध्ययन में पाए गए प्रभाव के समान है। (2 0 14), जिन्होंने द्रव प्रवाह के जवाब में एंडोसाइटोसिस में सिलिया-आश्रित अपचयन का प्रदर्शन किया। अमोनियम सल्फेट के सेल व्यवहार और कार्यक्षमता पर अन्य अप्राप्य प्रभाव होने की संभावना है जो अप्रत्यक्ष रूप से विलेय परिवहन को प्रभावित कर सकते हैं। संभावित ऑफ-टारगेट प्रभावों के बावजूद, विघटन की यह विधि कार्बनिक विलेय के ट्रांसपोर्टर-मध्यस्थता आंदोलन पर सिलिअरी सेंसिंग की भूमिका का परीक्षण करती है। सिलिया और ट्रांसपोर्टर में मैकेनो-संवेदी प्रोटीन के बीच सिग्नलिंग का तंत्र वर्तमान में अज्ञात है। एक परिकल्पना यह है कि परिवर्तित आयन परिवहन द्वारा कार्बनिक धनायन ट्रांसपोर्टरों के कार्य को बदल दिया जाता है। सिलिया को हटाने से समीपस्थ नलिका कोशिकाओं में विलेय गतिशीलता को बदलने के लिए जाना जाता है, विशेष रूप से नेट/के प्लस को कम करके। ATPase झिल्ली स्थानीयकरण और पैरासेलुलर परिवहन को संशोधित करना (ओवरगार्ड एट अल.., 2009)। यह संभव है कि इसका परिणाम MATE1 फ़ंक्शन में परिवर्तन हो, जो H ग्रेडिएंट पर निर्भर एक एंटीपोर्टर है। एक अन्य परिकल्पना यह है कि अपरूपण तनाव का संवेदन कार्बनिक धनायन ट्रांसपोर्टरों की अभिव्यक्ति को प्रभावित करता है। कतरनी तनाव Nrf2 सिग्नलिंग (फुकुडा एट अल।, 2017) के माध्यम से MATE2-K फ़ंक्शन को नियंत्रित करता है। अन्य कार्बनिक कटियन ट्रांसपोर्टर कतरनी तनाव के समान प्रतिक्रिया दे सकते हैं, जो कि मेकोनोसेंसरी सिलिया को हटा दिए जाने पर समाप्त हो जाएगा। इसमें से बहुत कुछ अज्ञात है और आगे के अध्ययन की आवश्यकता है। दिलचस्प बात यह है कि सिलिया हटाने से एएसपी प्लस ट्रांसपोर्ट पर 0.2 डायन्स/सेमी² कतरनी तनाव के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ा, लेकिन एक मजबूत प्रभाव तब देखा गया जब कतरनी तनाव को 0.5 डायन्स/सेमी 2 तक बढ़ा दिया गया। इससे पता चलता है कि सिलिया एक दहलीज कतरनी तनाव स्तर को समझती है; बदले में, परिवहन पर औसत दर्जे का प्रभाव अपेक्षित होने से पहले ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति और कार्य में सिलिया संकेत परिवर्तन अपेक्षित हैं। कुल मिलाकर, कतरनी तनाव के सिलिअरी सेंसिंग पर कार्बनिक कटियन परिवहन की निर्भरता शामिल मेकोनोसेंसरी सिग्नलिंग मार्ग और तनाव के न्यूनतम स्तर की अंतर्दृष्टि प्रदान करती है जो कतरनी के लिए एक मजबूत प्रतिक्रिया को ट्रिगर करने के लिए आवश्यक हो सकती है।

सारांश में, इन आंकड़ों से पता चलता है कि द्रव प्रवाह से कतरनी तनाव का एमडीसीके कोशिकाओं में कार्बनिक कटियन ट्रांसपोर्टर फ़ंक्शन और अभिव्यक्ति पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। इसके अलावा, ऑर्गेनिक कटियन ट्रांसपोर्ट का अपग्रेडेशन सिलिया की उपस्थिति पर निर्भर था। हम प्रस्ताव करते हैं कि एपिकल शीयर स्ट्रेस किसी भी इन विट्रो मॉडलिंग का एक महत्वपूर्ण घटक हैगुर्देट्यूबलरकोशिकाओं और वृक्क स्रावी निकासी और दवाओं के नेफ्रोटॉक्सिसिटी के मॉडलिंग का एक महत्वपूर्ण घटक होने की संभावना है। विशिष्ट तंत्र जिसके द्वारा यांत्रिक तनाव संकेत ट्रांसपोर्टर गतिविधि और अभिव्यक्ति को बढ़ाते हैं, अभी भी स्पष्ट नहीं है और इसके लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है।

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