पिस्ता एटलांटिका सबस्प के एंटी-मेलानोजेनेसिस और एंटी-टायरोसिनेज गुण। B16F10 murine मेलेनोमा कोशिकाओं पर म्यूटिका अर्क

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समीरा एघबली-फ़रीज़1, अकरम तलेघानी2, हादी अल-नज्जर3, सैयद अहमद इमामी1, होमा रहीमी4, जावद असिली1, समीरा हसनज़ादेह1, और ज़हरा तयरानी-नज़रान5,*

सार:पिस्ता एटलांटिका (पी। एटलांटिका) सबस्प। म्यूटिका का उपयोग पारंपरिक चिकित्सा में किया गया है और यह अपने औषधीय गुणों के लिए प्रसिद्ध है। इस अध्ययन का उद्देश्य मेथनॉल (MeOH), n-hexane, dichloromethane (CH2Cl2), n-butanol (BuOH), एथिल एसीटेट (EtOAc), पानी के अर्क और पी. एटलांटिका सबस्प के आवश्यक तेल के प्रभाव का मूल्यांकन करना था। B16F1 0 मेलेनोमा सेल लाइन में मेलेनिन संश्लेषण और ऑक्सीडेटिव तनाव पर म्यूटिका। पौधे के विभिन्न अर्क (0.2-200 माइक्रोग्राम/एमएल) की बढ़ती सांद्रता के साथ उपचार के बाद B16F10 कोशिकाओं की व्यवहार्यता को रेसज़ुरिन का उपयोग करके मापा गया था। आवश्यक तेल संरचना की पहचान गैस-क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-एमएस) विश्लेषण और मेलेनिन, मशरूम के संश्लेषण पर निरोधात्मक प्रभाव द्वारा की गई थी।टायरोसिनेसगतिविधि, सेलुलर टायरोसिनेस और ऑक्सीडेटिव तनाव का मूल्यांकन वर्णमिति और फ्लोरोमेट्रिक विधियों द्वारा किया गया था। डेटा ने सांद्रता पर अर्क दिखाया 0। 2-200 माइक्रोग्राम / एमएल, मेलेनोमा कोशिकाओं पर महत्वपूर्ण विषाक्तता नहीं दिखा, लेकिन आवश्यक तेल के 200 माइक्रोग्राम / एमएल की सांद्रता में साइटोटोक्सिक प्रभाव था। पिस्ता एटलांटिका सबस्प। म्यूटिका मशरूम को रोक सकती हैटायरोसिनेसगतिविधि। साथ ही, B16F10 कोशिकाओं में मेलेनिन की मात्रा में गिरावट आई। इसके अलावा, पी। अटलांटिका सबस्प की क्षमता। मेलेनोमा कोशिकाओं में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की मात्रा को कम करने में म्यूटिका के अर्क ने उल्लेखनीय खुलासा कियाएंटीऑक्सिडेंटगतिविधि। इसके अलावा, इस अध्ययन में आवश्यक तेल की सभी सांद्रता का कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ा।मेलानोजेनेसिसनिरोधात्मक औरएंटीऑक्सिडेंटपी। एटलांटिका सबस्प के प्रभाव। B16F10 कोशिकाओं पर म्यूटिका त्वचा संबंधी त्वचा देखभाल उत्पादों में उपयोग करने और कॉस्मेटिक उद्योग में त्वचा की उम्र बढ़ने की रोकथाम के लिए संयंत्र की संभावित सफेदी गतिविधि का सुझाव दे सकती है।कीवर्ड:विरोधीटायरोसिनेस; मेलानोजेनेसिस; पी. अटलांटिका सबस्प। म्यूटिका

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परिचय

मेलेनिन एक त्वचा वर्णक है जिसे मेलेनोसोम में संश्लेषित किया जाता है और शारीरिक प्रक्रिया के दौरान केराटिनोसाइट्स में स्थानांतरित किया जाता है जिसे कहा जाता हैमेलानोजेनेसिस. मेलेनिन यूवी क्षति से सुरक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और त्वचा, बालों और आंखों के रंग को निर्धारित करता है। मेलेनिन का अत्यधिक उत्पादन मेलेनोमा और त्वचा के असामान्य रंजकता (1-3) के लिए जिम्मेदार है। मेलेनिन जैवसंश्लेषण में प्रमुख एंजाइम टाइरोसिनेज है जो दो अलग-अलग प्रतिक्रियाओं को उत्प्रेरित करता है, 3 का ऑक्सीकरण, डोपाक्विनोन के लिए डाइहाइड्रॉक्सी-फेनिलएलनिन (डीओपीए) और डीओपीए (4) को एल-टायरोसिन का हाइड्रॉक्सिलेशन।टायरोसिनेसया पॉलीफेनोल ऑक्सीडेज एक तांबा युक्त मिश्रित-कार्य एंजाइम है जो सूक्ष्मजीवों, जानवरों और पौधों (5) में पाया जाता है। फलों और सब्जियों के भूरे होने के लिए टायरोसिनेस सबसे अधिक प्रभावित करने वाला कारक है। मेलेनिन के अधिक उत्पादन और संचय के परिणामस्वरूप बड़ी संख्या में त्वचा विकार हो सकते हैं जिनमें मेलास्मा, झाईयां, सौर मेलेनोसिस और उम्र के धब्बे शामिल हैं (6)। इसलिए,टायरोसिनेसअवरोधकों ने खाद्य और कॉस्मेटिक उद्योगों में बहुत रुचि आकर्षित की है। कई जीवित जीवों में, जैविक प्रक्रियाओं को बढ़ावा देने के लिए ऊर्जा के उत्पादन के लिए ऑक्सीकरण आवश्यक है।

हालांकि, हाइड्रोजन पेरोक्साइड (H2O2) और अन्य प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) - मेलेनोजेनेसिस प्रक्रिया के दौरान यूवी विकिरण के बाद आरओएस वृद्धि सहित कई शारीरिक और रोग संबंधी घटनाओं में कोशिका मृत्यु और ऊतक क्षति का कारण बनती हैं। इसके अलावा, यह सर्वविदित है कि आरओएस का यूवी-प्रेरित उत्पादन उम्र बढ़ने, झुर्रियों, प्रकाश संवेदनशीलता और दुर्दमता (7) सहित कई त्वचा स्थितियों के रोगजनन में शामिल है। इस प्रकार, के प्राकृतिक स्रोतों का पता लगानाएंटीऑक्सीडेंटएक विरोधी के साथटायरोसिनेसगतिविधि अतिरिक्त से संबंधित त्वचा के नुकसान को संशोधित करने में मदद करती हैमेलानोजेनेसिस (4).

जीनस पिस्तासिया एनाकार्डियासी परिवार का एक सदस्य है जिसमें लगभग 9 प्रजातियां शामिल हैं और ज्यादातर भूमध्यसागरीय क्षेत्र, यूरोप और एशिया के कुछ हिस्सों (8,9) में वितरित की जाती हैं। पिस्ता एटलांटिका (पी। अटलांटिका) Desf। इसकी 3 उप-प्रजातियां हैं: पी. एटलांटिकासब्सप। कुर्दिका (ज़ोहरी) रेच। एफ।, पी। अटलांटिकसब्सप। म्यूटिका (फिशर और सीए मेयर) रेच। एफ। और पी. अटलांटिका सबस्प। काबुलिका (स्टॉक) रीच। एफ। P. atlantica, P. khinjuk Stocks, और P. Vera L. की तीन उल्लिखित उप-प्रजातियां ईरान में उगाई जाती हैं (10)। पी. एटलांटिकासब्सप के फल। म्यूटिका अर्थात् बनह 0.5-0.7 सेमी व्यास के साथ गोल से अंडाकार होता है। पी. एटलांटिका के पतवार की एंटीऑक्सीडेंट और कैंसर विरोधी गतिविधि पौधे की उच्च कुल फेनोलिक सामग्री से संबंधित है। पी. एटलांटिका का पारंपरिक रूप से ऊपरी पेट की परेशानी और दर्द, अपच, और पेप्टिक अल्सर (11-13) ​​से राहत के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, पी. एटलांटिका सबस्प की मेलानोजेनेसिस निरोधात्मक गतिविधि पर कोई अध्ययन नहीं किया गया है। म्यूटिका इसलिए, इस परियोजना में, हम पी. एटलांटिका सबस्प के एंटीऑक्सीडेंट और एंटी-मेलेनोजेनिक गुणों का अध्ययन करने के लिए B16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं का चयन करते हैं। म्यूटिका अर्क। इस अध्ययन का उद्देश्य मेथनॉल (MeOH), n-hexane, dichloromethane (CH2Cl2), n-butanol (BuOH), एथिल एसीटेट (EtOAc), पानी (H2O) के अर्क और P के आवश्यक तेल के निरोधात्मक प्रभाव की जांच करना था। अटलांटिकसब्सप। म्यूटिका फ्रूट ऑनमेलानोजेनेसिसऔर क्षमता का मूल्यांकन करने के लिएएंटीऑक्सिडेंटB16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं पर संयंत्र की क्षमता।

सामग्री और तरीके

रसायन

मशरूमटायरोसिनेसAgaricus bisporus, kojic acid, resazurin, L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), dichloro dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA), egtazic acid (EGTA), dimethyl sulfoxide (DMSO) से ), फेनिलमेथाइलसल्फोनील फ्लोराइड, ग्लिसरॉफॉस्फेट, -मर्कैप्टोएथेनॉल, फॉस्फेट-बफर सलाइन (पीबीएस), सोडियम ऑर्थोवनाडेट, सिग्मा (यूएसए) से खरीदे गए ट्रिस-बफर सेलाइन ट्वीन 20 (टीबीएसटी)। भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), पेनिसिलिन, स्ट्रेप्टोमाइसिन और ट्रिप्सिन-ईडीटीए गिब्कोबीआरएल (ग्रैंड आइलैंड, यूएसए) से प्राप्त किए गए थे। मेलानोमा सेल लाइन (B16F10, Cat. No C540) ईरान के पाश्चर इंस्टीट्यूट (तेहरान, IR ईरान) से खरीदी गई थी। अन्य सभी रसायन और विलायक मर्क (जर्मनी) के थे।

अर्क की तैयारी

पी. अटलांटिका सबस्प। म्यूटिका को मई 2014 में ईरान के उत्तर-पूर्व के खुरासान रज़ावी प्रांत के बर्दस्कन ​​पहाड़ों से एकत्र किया गया था और श्रीमती एम सूज़ानी द्वारा पहचाना गया था। एक वाउचर नमूना (नंबर: 13069) स्कूल ऑफ फार्मेसी, मशहद यूनिवर्सिटी ऑफ मेडिकल साइंसेज, मशहद, आईआर ईरान के हर्बेरियम में जमा किया गया था। पी. एटलांटिका सबस्प का कच्चा फल। म्यूटिका (200 ग्राम) को एक ब्लेंडर (Toos chekan Co, IR ईरान) द्वारा ग्राउंड किया गया और फिर पहले बताए गए प्रोटोकॉल (14) के अनुसार 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर MeOH के साथ मिलाया गया। निष्कर्षण के बाद, रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग करके विलायक को वाष्पित किया गया और फिर फ्रीज में सुखाया गया। MeOH, n-hexane, CH2Cl2, BuOH, EtOAc, और H2O सहित पांच अलग-अलग अंश देने के लिए विलायक-विलायक विभाजन द्वारा मेथनॉल निकालने (94 ग्राम) को और अधिक विभाजित किया गया था।

आवश्यक तेल का अलगाव

P. atlantica subsp.mutica (150 g) के कच्चे फल को 3 घंटे के लिए क्लीवेंजर-प्रकार के उपकरण का उपयोग करके हाइड्रोडिस्टीलेशन के अधीन किया गया था। बेरंग तेल 0.8 प्रतिशत (v/w) की उपज के साथ प्राप्त किया गया था। प्राप्त आवश्यक तेल को निर्जल सोडियम सल्फेट पर सुखाया गया और अगले परीक्षण तक 4 डिग्री अंधेरे में संग्रहीत किया गया।

गैस-क्रोमैटोग्राफी और गैस-क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री

गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी) विश्लेषण एक एफआईडी डिटेक्टर से लैस एक वेरियन सीपी {0}} का उपयोग करके किया गया था, जिसे फ्यूज्ड-सिलिका कॉलम (सीपी-सिल 8सीबी, 5 0 मीटर × 0.25 के साथ जोड़ा गया था। मिमी, फिल्म की मोटाई 0.12 माइक्रोन) निम्न शर्त के तहत: ओवन तापमान 50-250 डिग्री 3 डिग्री / मिनट की दर के साथ; इंजेक्टर तापमान 260 डिग्री, विभाजन अनुपात 1:5, वाहक गैस के साथ, एन2 प्रवाह दर 2 एमएल/मिनट; डिटेक्टर तापमान 280 डिग्री।

गैस-क्रोमैटोग्राफी-मास (GC-MS) विश्लेषण एक HP -5 MS कॉलम (30 m × 0.25 mm id, {{ से लैस Agilent 5975 उपकरण का उपयोग करके किया गया था। 14}}.25 माइक्रोन फिल्म मोटाई) चौगुनी मास डिटेक्टर और विले 7n.L पुस्तकालय से लैस एक कंप्यूटर के साथ इंटरफेस। ओवन तापमान 50-250 डिग्री 3 डिग्री / मिनट की दर से, इंजेक्टर तापमान 250 डिग्री, इंजेक्शन मात्रा: 0.1 μL, 1:50 के विभाजन अनुपात के साथ विभाजित इंजेक्शन, वाहक गैस (हीलियम) प्रवाह दर 1 एमएल / के साथ मिनट, आयन स्रोत: 70 eV, आयनीकरण धारा: 150 µA, और स्कैन रेंज: 35-465। आवश्यक तेल के घटकों की पहचान एचपी -5 एमएस कॉलम पर एन-अल्केन्स श्रृंखला (सी 6- सी 20) के संदर्भ में प्राप्त प्रतिधारण गैस क्रोमैटोग्राफी पर आधारित थी, उनके द्रव्यमान स्पेक्ट्रा और विखंडन पैटर्न की तुलना की रिपोर्ट की गई साहित्य में, और कंप्यूटर विली 7n.L पुस्तकालय (15) के साथ मेल खाता है। कच्चे फल के अलग-अलग घटकों की सापेक्ष मात्रा का परिमाणीकरण क्षेत्र प्रतिशत विधि के अनुसार अंशांकन कारक पर विचार किए बिना किया गया था।

कोश पालन

मेलानोमा कोशिका रेखा, B16F10, 5 प्रतिशत CO2 युक्त आर्द्र वातावरण (90 प्रतिशत) में 37 डिग्री पर बनी रहती है। कोशिकाओं को RPMI -1640 (बायोइडिया, ईरान) में 10 प्रतिशत (v/v) FBS, 100 IU/mL पेनिसिलिन, और 100 µg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ संवर्धित किया गया। पी. अटलांटिका सबस्प का स्टॉक समाधान। म्यूटिका को डीएमएसओ में 50 माइक्रोग्राम/एमएल पर तैयार किया गया और -40 डिग्री पर रखा गया। सभी प्रयोगों में सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कोजिक एसिड (2 और 4 मिमी) का उपयोग किया गया था। कोशिकाओं को 105 कोशिकाओं/एमएल के घनत्व में 96-अच्छी तरह से प्लेटों में सुसंस्कृत किया गया था। प्रत्येक प्रयोग में अर्क की गतिविधि की गणना निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके की गई:

݁percent of activity=Absorbance of the sample/नियंत्रण का अवशोषण * 100

सेल व्यवहार्यता परख

Resazurin एक सेल स्वास्थ्य संकेतक है जो जीवित कोशिका की कम करने की शक्ति का उपयोग करता है और resorufin में परिवर्तित हो जाता है। Resazurin एक नीला, गैर-विषाक्त, गैर-फ्लोरोसेंट और सेल-पारगम्य यौगिक है जो जीवित कोशिकाओं (16) में लाल रंग और अत्यधिक फ्लोरोसेंट रेसोरुफिन में परिवर्तित हो जाता है। लगभग 104 B16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं को 96-माइक्रोवेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में डाला गया और पी. एटलांटिका सबस्प के अर्क और आवश्यक तेल के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया। म्यूटिका (0.2-200 माइक्रोग्राम/एमएल)। 4 घंटे के ऊष्मायन के बाद, एच 4 हाइब्रिड मल्टी-मोड माइक्रोप्लेट रीडर (बायोटेक, वीनोस्की, यूएसए) का उपयोग करके रेसज़ुरिन और रेसोरुफिन के अवशोषण को 570 एनएम और 600 एनएम पर मापा गया था। प्रत्येक प्रयोग तीन प्रतियों में किया गया था। अर्ध-अधिकतम निरोधात्मक एकाग्रता (IC50) की गणना एकाग्रता-प्रभाव वक्र से ग्राफपैड सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके की गई थी: लॉग एकाग्रता बनाम प्रतिक्रिया।

मशरूम टायरोसिनेस गतिविधि परख

मशरूम की गतिविधिटायरोसिनेसएल-डीओपीए के ऑक्सीकरण में कुछ संशोधनों के साथ पहले (17) वर्णित के रूप में स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रूप से मापा गया था। संक्षेप में, 5 एमएम एल-डोपा (100 एमएम सोडियम फॉस्फेट बफर पीएच 6.8 में) के 160 µ एल और पी. atlanticasubsp के साथ और बिना एक ही बफर के 20 µ एल। म्यूटिका के अर्क और आवश्यक तेल (10-1000 माइक्रोग्राम / एमएल) को मशरूम टायरोसिनेस (200 यूनिट / एमएल) के 20 μL के साथ मिलाया गया और फिर 30 मिनट के लिए 37 डिग्री पर ऊष्मायन किया गया। सिनर्जी H4 हाइब्रिड मल्टी-मोड माइक्रोप्लेट रीडर (बायोटेक, वीनोस्की, यूएसए) के साथ अवशोषण को 475 एनएम पर मापा गया था।

मेलेनोमा कोशिकाओं में मेलेनिन सामग्री का निर्धारण

मेलानोमा कोशिकाओं, B16F1 0, को 96-वेल कल्चर प्लेट्स में प्रति कुएं 105 कोशिकाओं के घनत्व पर बोया गया और 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। फिर उन्हें पी. एटलांटिका सबस्प के विभिन्न सांद्रणों (0.2-200 माइक्रोग्राम/एमएल) के साथ इनक्यूबेट किया गया। 24 घंटे के लिए म्यूटिका अर्क और आवश्यक तेल। मेलेनिन सामग्री को पहले वर्णित (18) के रूप में मापा गया था। उपचार के बाद, कोशिकाओं को ट्रिप्सिन का उपयोग करके एकत्र किया गया था। उन्होंने पीबीएस से धोया। सेल छर्रों को 60 डिग्री पर 60 मिनट के लिए सोडियम हाइड्रोक्साइड (2 एम) के 50 µ एल समाधान में घुलनशील किया गया था। मेलेनिन सामग्री को सिनर्जी H4 हाइब्रिड मल्टी-मोड माइक्रोप्लेट रीडर (बायोटेक, वीनोस्की, यूएसए) के साथ 405 एनएम पर अवशोषण को मापकर मापा गया था।

सेलुलर टायरोसिनेस गतिविधि परख

डीओपीए से डीओपीए क्रोम के ऑक्सीकरण का विश्लेषण स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा के संकेतक के रूप में किया गया थाटायरोसिनेसगतिविधि (18)। 10B16F10 मेलेनोमा की 6 कोशिकाओं को 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में रात भर चढ़ाया गया। पी. एटलांटिका सबस्प के विभिन्न सांद्रता (0.2-200 माइक्रोग्राम/एमएल) के साथ सेल के उपचार के बाद। 24 घंटे के लिए म्यूटिका अर्क और आवश्यक तेल, कोशिकाओं को ट्रिप्सिन का उपयोग करके अलग किया गया था; पीबीएस के साथ धोया, और 50 µ एल सोडियम फॉस्फेट बफर (पीएच 6.8, 100 मिमी) के साथ lysed जिसमें 1 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100 और 0.1 मिमी फेनिलमेथाइलसल्फोनील फ्लोराइड होता है। lysates को 10, 000 rpm पर 20 मिनट के लिए 4 डिग्री पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। प्रत्येक lysate के 100 µ l (प्रत्येक में 100 मिलीग्राम प्रोटीन होता है) को 96 वेल प्लेट में 5 mM DOPA के 30 µ l के साथ मिलाया गया और 2 घंटे के लिए 37 डिग्री पर इनक्यूबेट किया गया, सिनर्जी H4 हाइब्रिड मल्टी-मोड माइक्रोप्लेट रीडर के साथ अवशोषण को 475 एनएम पर मापा गया। (बायोटेक, विनोस्की, यूएसए)।

सेलुलर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के स्तर का निर्धारण

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के स्तर को पहले मामूली संशोधनों (19) के साथ वर्णित के रूप में मापा गया था। मेलानोमा कोशिकाओं, B16F1 0, (2 × 104) को रात भर 96-अच्छी तरह से प्लेटों में रखा गया और फिर पी. एटलांटिका सबस्प के विभिन्न सांद्रता (0.2-200 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ इलाज किया गया। . 24 घंटे के लिए म्यूटिका अर्क और आवश्यक तेल। फिर कोशिकाओं को 50 µ एल एच2ओ2 (24 एमएम) के साथ 37 डिग्री पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। तब DCFH-DA के 50 µL को कोशिकाओं में जोड़ा गया और DCF की प्रतिदीप्ति तीव्रता को 504 एनएम उत्सर्जन और 524 एनएम उत्तेजना पर एक सिनर्जी H4 माइक्रोप्लेट रीडर (बायोटेक, यूएसए) का उपयोग करके मापा गया।

पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण

मेलानोमा कोशिकाएं, B16F1 0, 24 घंटे के लिए मेथनॉल अर्क (0। 5-100 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ और बिना 75 सेमी 3 फ्लास्क में सुसंस्कृत थीं। कोशिकाओं को तब एक बफर (5 0 मिमी ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.4, 2 मिमी ईजीटीए, 1 मिमी फेनिलमेथाइलसल्फ़ोनिल फ्लोराइड, 10 मिमी ग्लिसरॉफ़ॉस्फेट, 10 मिमी -मर्कैप्टोएथेनॉल, 1 मिमी सोडियम ऑर्थोवनाडेट, 0.1 प्रतिशत डीऑक्सीकोलिक एसिड में lysed किया गया था। सोडियम लवण)। 12 प्रतिशत सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) -पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन पर समान मात्रा में प्रोटीन (50 माइक्रोग्राम) लोड किया गया और पॉलीविनाइलिडिन डिफ़्लुओराइड झिल्ली में स्थानांतरित किया गया। कमरे के तापमान पर टीबीएसटी (20 मिमी ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.4, 100 मिमी NaCl, और 0.1 प्रतिशत ट्वीन 20) बफर में 10 प्रतिशत स्किम दूध में झिल्ली को 2 घंटे के लिए अवरुद्ध किया गया था। टीबीएसटी बफर के साथ धोने के बाद, झिल्ली को प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ रातोंरात ऊष्मायन किया गया: 1:300 (खरगोश विरोधी-टायरोसिनेसएंटीबॉडी (सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी, सीए))। टीबीएसटी बफर के साथ 3 बार धोने के बाद, झिल्ली को 2 घंटे के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी (सेल सिग्नलिंग) के रूप में एंटी-खरगोश आईजीजी (1:2000) के साथ ऊष्मायन किया गया था। टीबीएसटी बफर के साथ 3 बार रिंसिंग को दोहराया गया था और प्रोटीन बैंड को एन्हांस्ड केमिलुमिनसेंट (ईसीएल) प्राइम वेस्टर्न ब्लॉटिंग डिटेक्शन सिस्टम (बायोरैड, यूएसए) (20) का उपयोग करके पाया गया था। लोडिंग नियंत्रण के रूप में एंटी - -एक्टिन एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था।

सांख्यिकीय विश्लेषण

प्रयोगों के सापेक्ष परिणाम तीन स्वतंत्र मापों के औसत ± एसडी के रूप में प्रस्तुत किए गए थे। विचरण का विश्लेषण और IC5 0 गणना ग्राफपैड प्रिज्म 6.0 के साथ एकतरफा एनोवा परीक्षण का उपयोग करके की गई थी और साधनों की तुलना डननेट परीक्षणों द्वारा की गई थी। पी <0.05 अर्क-उपचारित="" कोशिकाओं="" और="" नियंत्रण="" के="" बीच="" सांख्यिकीय="" रूप="" से="" महत्वपूर्ण="" अंतर="" को="" दर्शाता="" है।="" प्रत्येक="" परख="" में="" विभिन्न="" अर्क="" के="" प्रभाव="" की="" तुलना="" करने="" के="" लिए="" दो-तरफ़ा="" एनोवा="" परीक्षण="" और="" बोनफेरोनी="" तुलना="" पोस्ट-टेस्ट="" का="" उपयोग="" किया="" गया="">

परिणाम

आवश्यक तेल संरचना

यौगिकों की पहचान के लिए गैस-क्रोमैटोग्राफी का उपयोग परिमाणीकरण और जीसी-मास के लिए किया गया है। जीसी और जीसी-एमएस विश्लेषण दोनों के परिणाम यौगिकों की मात्रात्मक और गुणात्मक पहचान तालिका में प्रस्तुत किए जाते हैं। पी. एटलांटिकासब्सप के मामले में। म्यूटिका, आवश्यक तेल में 68 घटकों की पहचान की गई थी और कुल तेल संरचना का 99.8 प्रतिशत हिस्सा था (तालिका 1)। आवश्यक तेल के समूहबद्ध यौगिकों को मोनोटेरपीन हाइड्रोकार्बन 86.5 प्रतिशत, ऑक्सीजन युक्त मोनोटेरपीन 3.7 प्रतिशत, सेस्क्यूटरपीन हाइड्रोकार्बन 8.7 प्रतिशत, ऑक्सीजन युक्त सेस्क्यूटरपेन्स 0.1 प्रतिशत, और विविध 0 के रूप में निर्धारित किया गया था। .8 प्रतिशत। आवश्यक तेल के प्रमुख घटक थे -ई-ओसिमीन 29.7 प्रतिशत, मायरसीन 17.1 प्रतिशत, -जेड-ओसिमीन 17.0 प्रतिशत, -पिनीन 10.2 प्रतिशत, और ई-कैरियोफिलीन 7.1 प्रतिशत।

कोशिका के अस्तित्व पर अर्क का प्रभाव

कोशिकाओं की व्यवहार्यता की निगरानी रेसज़ुरिन से की गई। मेलानोमा कोशिकाओं, B16F1 0, को एक 96-वेल प्लेट में रखा गया था। 24 घंटे के बाद कोशिकाओं को पी. एटलांटिका सबस्प के विभिन्न सांद्रता (0। 2-200 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ इलाज किया गया। म्यूटिका अर्क, परिणामों से पता चला कि अर्क का इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली सांद्रता (छवि 1) में B16F10 कोशिकाओं पर कोई महत्वपूर्ण साइटोटोक्सिक प्रभाव नहीं था। सकारात्मक नियंत्रण के रूप में डॉक्सोरूबिसिन ने कोशिका मृत्यु को महत्वपूर्ण रूप से प्रेरित किया (पी <>

मशरूम टायरोसिनेस गतिविधि पर अर्क का प्रभाव

एल-डोपा के ऑक्सीकरण में मशरूम टायरोसिनेस के निषेध पर पी. एटलांटिका के प्रभाव का आकलन किया गया था। परिणामों ने संकेत दिया कि मशरूमटायरोसिनेसगतिविधि को सभी अलग-अलग अर्क द्वारा बाधित किया गया था, लेकिन 1 0 n-हेक्सेन अर्क के 00 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता का इस परीक्षण में कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं था। कोजिक एसिड (2 और 4 मिमी) का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण (पी <0.05) (छवि="" 2)="" के="" रूप="" में="" किया="" गया="">

मेलेनिन के संश्लेषण पर अर्क और आवश्यक तेल का प्रभाव

पी. एटलांटिका सबस्प के विभिन्न अर्क और आवश्यक तेल के प्रभाव का अध्ययन करना। म्यूटिका मेलेनिन संश्लेषण पर, अर्क-उपचारित B16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं की मेलेनिन सामग्री का मूल्यांकन किया गया था। सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कोजिक एसिड (2 और 4 मिमी) का उपयोग किया गया था।

परिणामों से पता चला कि MeOH, CH2Cl2, और EtOAc अर्क (0। 2-200 माइक्रोग्राम / एमएल), एन-हेक्सेन (2-200 माइक्रोग्राम / एमएल), और एच 2 ओ अर्क (2 {{9 }} और 200 माइक्रोग्राम/एमएल) का मेलेनिन संश्लेषण पर निरोधात्मक प्रभाव पड़ा (पी <0.05) (चित्र="" 3)।="" हालांकि,="" आवश्यक="" तेल="" और="" buoh="" निकालने="" के="" सभी="" सांद्रता="" मेलेनिन="" संश्लेषण="" पर="" कोई="" महत्वपूर्ण="" निरोधात्मक="" प्रभाव="" नहीं="" था।="" आवश्यक="" तेल="" के="" परिणाम="" आंकड़ों="" में="" नहीं="" दिखाए="" गए="">

सेलुलर टायरोसिनेस गतिविधि पर अर्क का प्रभाव

पी। एटलांटिका सबस्प के निरोधात्मक प्रभाव के तंत्र का मूल्यांकन करने के लिए। म्यूटिका निकालने परमेलानोजेनेसिसविशेष रूप से, हमने इंट्रासेल्युलर का मूल्यांकन कियाटायरोसिनेसB16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं में गतिविधि। परिणामों ने संकेत दिया कि MeOH, EtOAc, और BuOH अर्क (0। 2-200 µg/mL), n-hexane (0.2 µg/mL), और CH2Cl2 (20 और 200) µg/mL) पी. एटलांटिका सबस्प के अर्क। म्यूटिका सेलुलर टायरोसिनेस गतिविधि (पी <0.05) (छवि="" 4)="" को="" महत्वपूर्ण="" रूप="" से="" बाधित="" कर="" सकता="" है,="" लेकिन="" पानी="" के="" अर्क="" का="" सेलुलर="" टायरोसिनेस="" गतिविधि="" पर="" कोई="" निरोधात्मक="" प्रभाव="" नहीं="">

सेलुलर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के स्तर पर अर्क का प्रभाव

के संकेत के रूप में इंट्रासेल्युलर आरओएस स्तरएंटीऑक्सिडेंटP. atlantica subsp.mutica की क्षमता को अकेले 24 mM H2O2 या B16F1 0 मेलेनोमा कोशिकाओं में अलग-अलग अर्क के साथ उपचारित कोशिकाओं में मापा गया था। परिणामों ने संकेत दिया कि पी. एटलांटिकासब्सप के सभी अर्क सांद्रता। म्यूटिका 0.2 माइक्रोग्राम/एमएल CH2Cl2 अर्क को छोड़कर H2O2 (P <0.05) (चित्र="" 5)="" से="" प्रेरित="" ऑक्सीडेटिव="" तनाव="" को="" काफी="" हद="" तक="" दबा="" सकता="">

सेलुलर टायरोसिनेस प्रोटीन स्तर पर अर्क का प्रभाव

पी। एटलांटिकासब्सप का इंट्रासेल्युलर प्रभाव। मेलेनोजेनिक संबंधित प्रोटीन जैसे टायरोसिनेस पर म्यूटिका के संकेतक के रूप मेंमेलानोजेनेसिसपश्चिमी धब्बा द्वारा मूल्यांकन किया गया था। जैसा कि चित्र 6 में दिखाया गया है,टायरोसिनेसपी। एटलांटिका सबस्प द्वारा प्रोटीन के स्तर में काफी कमी आई थी। म्यूटिका निकालने का उपचार {0}}.5 और 10 माइक्रोग्राम/एमएल (पी <0.05) की="" सांद्रता="" पर="" करें।="" -एक्टिन="" का="" उपयोग="" आंतरिक="" नियंत्रण="" के="" रूप="" में="" किया="" गया="">

विभिन्न मापदंडों पर आवश्यक तेल के प्रभाव

आवश्यक तेल 0.2-200 माइक्रोग्राम/एमएल ने उपरोक्त सभी मापदंडों पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं दिखाया, सिवाय 200 माइक्रोग्राम/एमएल, जो मेलेनोमा कोशिकाओं पर साइटोटोक्सिक प्रभाव प्रदर्शित करता है। इसलिए, आवश्यक तेल के परिणाम परिणाम खंड में शामिल नहीं हैं क्योंकि कोई निरोधात्मक प्रभाव नहीं देखा गया था।

बहस

प्राकृतिक-आधारित कॉस्मेटिक उत्पादों को वाणिज्यिक एजेंसियों द्वारा उनकी सुरक्षा और बहु-कार्यात्मक गतिविधि के लिए व्यापक रूप से विज्ञापित किया जाता है। के साथ नए एंटी-मेलेनोजेनिक एजेंट ढूँढनाएंटीऑक्सिडेंटप्राकृतिक स्रोतों से गतिविधि हाइपरपिग्मेंटेशन विकारों के लिए उपयोग किए जाने वाले उत्पादों के निर्माण में रुचियों में से एक है। त्वचा को गोरा करने वाले एजेंटों के रूप में उपयोग किए जाने वाले औषधीय और कॉस्मेटिक उत्पादों में, मेलेनिन के गठन का निषेध, मुक्त कणों की सफाई औरटायरोसिनेसगतिविधि जो संबंधित त्वचा विकारों के इलाज के लिए महत्वपूर्ण है (21)।

इस अध्ययन में पी। एटलांटिका सबस्प के विभिन्न अर्क की एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि। म्यूटिका का मूल्यांकन किया गया और टायरोसिनेस गतिविधि और मेलेनिन संश्लेषण पर उनके प्रभावों का विश्लेषण किया गया। MeOH और EtOAc P का अर्क। अटलांटिका सबस्प। म्यूटिका ने महत्वपूर्ण दिखायाएंटीऑक्सिडेंट2, 20 माइक्रोग्राम / एमएल और 20, 200 माइक्रोग्राम / एमएल पर गतिविधि जो पॉलीफेनोल्स और प्लांट में व्यापक रूप से पाए जाने वाले फ्लेवोनोइड के लिए जिम्मेदार हो सकती है। परिणामों से पता चला कि सभी अर्क विशेष रूप से MeOH, EtOAc, और H2O अर्क मशरूम को महत्वपूर्ण रूप से बाधित कर सकते हैंटायरोसिनेसगतिविधि। इसके अलावा, MeOH, EtOAc, और BuOH के अर्क सेलुलर टायरोसिनेस गतिविधि को कम करने में सक्षम थे जो कोशिकाओं में मेलेनिन उत्पादन में कमी के अनुसार था। इस अध्ययन में, आवश्यक तेल की सभी सांद्रता का सेलुलर टायरोसिनेस, मेलेनिन संश्लेषण, और के खिलाफ कोई महत्वपूर्ण निरोधात्मक प्रभाव नहीं था।एंटीऑक्सिडेंटगतिविधि। अन्य अर्क की तुलना में विभिन्न प्रयोगों में MeOH अर्क की अधिक गतिविधि के कारण हमने पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए उल्लिखित अर्क को चुना है। योग करने के लिए, इस अर्क के एंटी-मेलेनोजेनिक प्रभाव की पुष्टि B16F10 कोशिकाओं में सभी assays में की गई थी, जो कि सकारात्मक नियंत्रण कोजिक एसिड (तालिका 2) के बराबर है।

MeOH, CH2Cl2, और EtOAc के अर्क ने सेल्युलर को कम कर दिया हैटायरोसिनेसगतिविधि, मेलेनिन सामग्री और आरओएस। सेमीपोलर नेचर फ्रैक्शंस फाइटोकेमिकल्स निकाल सकते हैं जो एंटीमेलेनोजेनिक गतिविधि जैसे पॉलीफेनोल्स और फ्लेवोनोइड्स के लिए जिम्मेदार होते हैं। एन-हेक्सेन अंश और आवश्यक तेल कम सक्रिय थे, यह दर्शाता है कि गैर-ध्रुवीय और अस्थिर प्रकृति वाले पौधे फाइटोकेमिकल्स का शरीर पर महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं है।मेलानोजेनेसिसप्रक्रिया (22,23)।

पॉलीफेनोल्स और फ्लेवोनोइड्स आरओएस उत्पादन के अवरोधक के रूप में कार्य करते हैं और पौधों के अर्क (24-27) के एंटी-मेलेनोजेनिक गुणों के लिए जिम्मेदार हो सकते हैं। पी। एटलांटिका सबस्प के अर्क में प्रमुख यौगिक। म्यूटिका क्वेरसेटिन, ल्यूटोलिन, आइसोक्वेरसेटिन, रुटिन, ल्यूटोलिन 7-लैक्टेट, और फेनोलिक यौगिक जैसे पी-कौमरिक एसिड, कैफिक एसिड और गैलिक एसिड हैं जो इसके लिए जिम्मेदार हैंएंटीऑक्सिडेंटगतिविधि (28)। रुटिन को टायरोसिनेस की गतिविधि को बाधित करने के लिए सूचित किया गया है और हाइड्रॉक्सिल समूहों (29) की उपस्थिति के कारण एक शक्तिशाली रंगद्रव्य एजेंट है। दिलचस्प बात यह है कि क्वेरसेटिन, ल्यूटोलिन और आइसोक्वेरसेटिन में भी उनकी संरचना में कई हाइड्रॉक्सिल समूह होते हैं जो उन्हें टायरोसिनेस के साथ बातचीत के लिए उपयुक्त बनाते हैं जिसके परिणामस्वरूप एंटी-टाइरोसिनेस गतिविधि (21,30) होती है। हाल ही में यह दिखाया गया है कि ल्यूटोलिन और क्वेरसेटिन जैसे फ्लेवोनोइड्स के प्रभाव को मुख्य रूप से ट्रांसक्रिप्शनल फैक्टर के मॉड्यूलेशन के माध्यम से मध्यस्थ किया जाता हैमेलानोजेनेसिस-संबद्ध प्रतिलेखन कारक (MITF) और/या मेलेनोजेनेसिस एंजाइमटायरोसिनेस, DCT या tyrosinase- संबंधित प्रोटीन 1 (TYRP-1) (31)। पी-कौमरिक एसिड और कैफिक एसिड ने मशरूम टायरोसिनेस गतिविधि को रोक दिया और 10- और 3-कोजिक एसिड (32) की तुलना में अधिक शक्तिशाली थे।

गैलिक एसिड टायरोसिनेस निरोधात्मक गतिविधि को प्रदर्शित करता है और एस्कॉर्बिक एसिड (33) के समान रेडॉक्स साइकिलिंग के माध्यम से डोपाक्विनोन को वापस एल-डीओपीए में कम कर देता है। इसी तरह, वर्तमान अध्ययन में पी। अटलांटिका सबस्प। म्यूटिका ने कोशिकाओं में टायरोसिनेस प्रोटीन के स्तर को कम कर दिया जो पौधे में क्वेरसेटिन, ल्यूटोलिन, आइसोक्वेरसेटिन, रुटिन और अन्य पॉलीफेनोल्स की उपस्थिति के साथ दृढ़ता से सहसंबद्ध है।

पौधों के बारे में कई रिपोर्टें हैं जिनमें एंटी-मेलेनोजेनिक और एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि होती है जो ऑक्सीडेटिव तनाव को कम करती है, जिसमें त्वचा विकारों के इलाज के लिए उच्च क्षमता हो सकती है। उदाहरण के लिए, पी। एटलांटिका के हवाई भागों के विभिन्न अर्क ने ऑक्सीडेटिव तनाव को कम किया, जिसका श्रेय पौधे में व्यापक रूप से पाए जाने वाले पॉलीफेनोल्स, फ्लेवोनोइड्स और एंथोसायनिन को दिया जा सकता है (34)। एक अन्य अध्ययन में, पी। वेरा के मेओएच अर्क ने मेलेनिन स्राव को कम कर दिया, जिसे कुछ के लिए जिम्मेदार ठहराया गया थाएंटीऑक्सिडेंटइस संयंत्र में यौगिक। इस अध्ययन ने संकेत दिया कि कोजिक एसिड, एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, 0.05 मिलीग्राम / एमएल का आईसी 5 0 मान दिखाता है और पी। वेरा की उच्च सांद्रता मेलेनोमा कैंसर (35) जैसे त्वचा विकारों के उपचार के लिए एक प्रभावी एजेंट के रूप में उपयोग की जा सकती है। ) गौरीन, एट अल। ने दिखाया कि पी। अटलांटिका के हवाई भागों में शक्तिशाली एंटीऑक्सीडेंट गुण (36) हैं। इसके अलावा, Nepeta satureioides के MeOH और CH2Cl2 अंशों ने B16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं में मेलेनिन उत्पादन के खिलाफ संभावित प्रभावों का संकेत दिया और त्वचा देखभाल उत्पादों (37) के कॉस्मेटिक फॉर्मूलेशन में योगदान कर सकते हैं। कोजिक एसिड के डेरिवेटिव में निरोधात्मक गतिविधि थीटायरोसिनेस. ऐसा लगता है कि इस यौगिक में मुक्त हाइड्रॉक्सिल समूह और मिथाइल विकल्प की उपस्थिति ने निरोधात्मक गतिविधि की पुष्टि की। इस अध्ययन में कोजिक एसिड (सकारात्मक नियंत्रण) ने IC50 का मान 0.28 mM (38) दर्शाया। फेनिलप्रोपेनाइड ग्लाइकोसाइड्स और फ्लेवोनोइड्स को ट्यूक्रियम पोलियम एल। वर से अलग किया गया। gnaphalodes ने एंटीऑक्सिडेंट और टायरोसिनेस निरोधात्मक गतिविधियों को दिखाया। जारानोल का प्रदर्शन करने वाले लेखकों ने उच्चतम टायरोसिनेस अवरोधक गतिविधि (आईसी 50 0 .041 मिमी) दिखाया और पोलियमोसाइड परीक्षण किए गए यौगिकों में सबसे अच्छा एंटीऑक्सीडेंट था। कोजिक एसिड ने 0.02 मिमी (39) का IC50 मान दिखाया।

के प्रोटीन स्तर में कमीटायरोसिनेसपी. अटलांटिका सबस्प द्वारा। म्यूटिका औरएंटीऑक्सिडेंटगुण और घटे हुए ROS ने इस एजेंट के एंटी-मेलानोजेनेसिस एजेंट के रूप में उपयोग की पुष्टि की है। इस अध्ययन ने पहली बार P. atlanticasubsp के निरोधात्मक प्रभाव को निर्धारित किया है। म्यूटिका ऑनमेलानोजेनेसिसB16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं में। त्वचा में मेलेनिन के संचय और अधिक उत्पादन को रोकने के लिए, का निषेधटायरोसिनेसमहत्वपूर्ण भूमिका होती है। इसलिए, पी. एटलांटिका सबस्प.म्यूटिका के रिपोर्ट किए गए एंटी-ऑक्सीडेंट प्रभाव के संबंध में, फ्लेवोनोइड और फेनोलिक यौगिक पौधे के महत्वपूर्ण घटक हैं जो पी. एटलांटिका सबस्प के एंटी-मेलानोजेनेसिस और एंटीटायरोसिनेस गतिविधियों के लिए जिम्मेदार हैं। म्यूटिका पी। एटलांटिका सबस्प की एंटीऑक्सिडेंट और एंटी-मेलेनोजेनिक गतिविधि दोनों। म्यूटिका त्वचा को गोरा करने वाले योगों के लिए एक उपयुक्त एजेंट की पेशकश कर सकती है और इसे त्वचा देखभाल योगों के लिए कॉस्मेटिक उत्पादों में शामिल किया जा सकता है।

निष्कर्ष

निष्कर्ष में, इस अध्ययन ने पहली बार दिखाया कि MeOH और EtOAc पी. एटलांटिका सबस्प के अर्क हैं। म्यूटिका मजबूत हैटायरोसिनेसनिरोधात्मक गतिविधि जो मेलेनिन की कमी के अनुसार है। इसके अलावा, पी। अटलांटिकसब्सप। म्यूटिका ने भी उच्च मैला ढोने की गतिविधि का प्रदर्शन किया औरएंटीऑक्सिडेंटगुण, जिसे मुख्य रूप से इसके उच्च स्तर के फ्लेवोनोइड्स और कुल पॉलीफेनोल्स के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। परिणामों ने सुझाव दिया कि P. atlanticasubsp की क्षमता। म्यूटिका मेलेनिन उत्पादन को कम करने के लिए सेलुलर आरओएस की कमी और सिग्नलिंग मार्ग विनियमन पर इसकी निरोधात्मक कार्रवाई से संबंधित हो सकता हैटायरोसिनेसगतिविधि। चूंकि अर्धध्रुवीय अर्क में महत्वपूर्ण एंटी-टायरोसिनेज और एंटी-मेलेनोजेनिकप्रभाव, इसलिए, हम निष्कर्ष निकालते हैं कि इन प्रभावों के लिए जिम्मेदार यौगिक अर्क में जमा होते हैं, आवश्यक तेलों में नहीं।