उचित व्यायाम स्तर चूहों में सर्जरी के बाद न्यूरोप्लास्टिसिटी और संज्ञानात्मक कार्य में सुधार करने के लिए आंत डिस्बिओसिस और वैलेरिक एसिड में वृद्धि को कम करता है भाग 4

आंत माइक्रोबायोटा प्रोफाइलिंग

आंत माइक्रोबायोटा प्रोफाइलिंग के लिए चूहों से ताजा मल एकत्र किया गया। चूहों को मल एकत्र करने के लिए एक ऑटोक्लेव्ड पिंजरे में अलग-अलग रखा गया और उन्हें स्वतंत्र रूप से शौच करने की अनुमति दी गई। मल को तुरंत सूखी बर्फ पर बाँझ एपेनडॉर्फ ट्यूबों में एकत्र किया गया और फिर आगे की प्रक्रिया तक -80 डिग्री पर संग्रहीत किया गया। हमारे पिछले प्रोटोकॉल [11] के अनुसार पावर लाइज़र पावर सॉइल डीएनए आइसोलेशन किट के साथ बैक्टीरिया डीएनए निकाला गया।

हाल ही में हुए शोध से पता चलता है कि आंत के माइक्रोबायोम का हमारी याददाश्त पर बहुत महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। वास्तव में, आंत के माइक्रोबायोटा में मौजूद बैक्टीरिया मानव मस्तिष्क के तंत्रिका तंत्र को प्रभावित कर सकते हैं, जिससे उसकी याददाश्त की कार्यप्रणाली में बदलाव आ सकता है। यह एक आश्चर्यजनक खोज है क्योंकि इसका मतलब है कि हम अपने आंत के माइक्रोबायोम को बदलकर अपनी याददाश्त को बढ़ा सकते हैं।

तो, अगर कोई व्यक्ति अपनी याददाश्त को बेहतर बनाने की कोशिश कर रहा है, तो आप अपने आंत माइक्रोबायोम को बेहतर बनाने के लिए क्या कर सकते हैं? इसका उत्तर सरल है: संतुलित आहार पर ध्यान दें। संतुलित आहार न केवल आपके आंत माइक्रोबायोटा के संतुलन को विनियमित करने में मदद करता है, बल्कि शरीर के सभी कार्यों में भी सुधार करता है।

सबसे पहले, हमें ऐसे विविध आहार पर ध्यान केंद्रित करने की आवश्यकता है जो आहार फाइबर से भरपूर हो। उच्च फाइबर वाला आहार आपके आंत माइक्रोबायोम की विविधता को बनाए रखने में मदद कर सकता है, जो अच्छे स्वास्थ्य को बढ़ावा देने में एक महत्वपूर्ण कारक है। साथ ही, हमें यह भी सुनिश्चित करने की आवश्यकता है कि हम अपने भोजन में पर्याप्त उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन और स्वस्थ वसा का सेवन करें। ये पोषक तत्व स्मृति कार्य और तंत्रिका चालन को बढ़ावा दे सकते हैं।

इसके अलावा, नियमित व्यायाम और तनाव में कमी भी आंत के माइक्रोबायोम में संतुलन और विविधता को बढ़ावा दे सकती है। चाहे वह गहरी साँस लेना हो, ध्यान लगाना हो या योग का अभ्यास करना हो, ये सभी तनाव को कम करने के प्रभावी तरीके हैं। व्यायाम आंतों की सिकुड़न में सुधार कर सकता है, आंतों की जीवन शक्ति को बढ़ा सकता है और चक्रीय विषहरण को बढ़ावा दे सकता है, जिससे आंतों के माइक्रोबायोटा के संतुलन और विविधता को बढ़ावा देने में मदद मिलती है।

कुल मिलाकर, हमें न केवल अपने आहार और शारीरिक स्वास्थ्य पर ध्यान देना चाहिए, बल्कि अपने आंत माइक्रोबायोटा पर भी ध्यान देना चाहिए। अपने खाने की आदतों को बदलने और तनाव को कम करने से हमारे आंत माइक्रोबायोटा में संतुलन और विविधता को बढ़ावा मिल सकता है, जो हमें याददाश्त और तंत्रिका तंत्र के कामकाज को बेहतर बनाने में मदद कर सकता है। तो, आइए हम सब मिलकर अपने पेट के स्वास्थ्य पर ध्यान दें और अपनी याददाश्त और शारीरिक फिटनेस को बेहतर बनाएँ!

यह देखा जा सकता है कि हमें याददाश्त में सुधार करने की आवश्यकता है, और सिस्टांचे डेजर्टीकोला याददाश्त में काफी सुधार कर सकता है क्योंकि सिस्टांचे डेजर्टीकोला एक पारंपरिक चीनी औषधीय सामग्री है जिसके कई अनोखे प्रभाव हैं, जिनमें से एक याददाश्त में सुधार करना है। सिस्टांचे डेजर्टीकोला की प्रभावकारिता इसमें मौजूद कई सक्रिय तत्वों से आती है, जिसमें टैनिक एसिड, पॉलीसेकेराइड, फ्लेवोनोइड ग्लाइकोसाइड आदि शामिल हैं। ये तत्व कई तरह से मस्तिष्क के स्वास्थ्य को बढ़ावा दे सकते हैं।

मस्तिष्क की कार्यप्रणाली सुधारने के तरीके जानने के लिए क्लिक करें

हाइपरवेरिएबल V3–V4 क्षेत्र की अनुक्रमण लाइब्रेरी इल्युमिना मिसेक सिस्टम निर्देशों के अनुसार तैयार की गई थी। संक्षेप में, पहले 16 एस आरआरएनए पीसीआर के लिए डीएनए टेम्पलेट के रूप में 12.5 एनजी डीएनए का उपयोग किया गया था। उपयोग किए गए प्राइमर इस प्रकार थे: F: 5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3′और R: 5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′।
एम्प्लीकॉन्स को फिर AMPure XPmagnetic बीड्स से साफ किया गया और फिर नेक्स्टेरा XTIndex किट का उपयोग करके इंडेक्स PCR के लिए इस्तेमाल किया गया। PCR उत्पादों की सांद्रता को मापने और लाइब्रेरी तैयार करने के लिए मात्रा को सामान्य करने के लिए क्यूबिट dsDNA HS परख किट और टेपस्टेशन उच्च संवेदनशीलता D1000 स्क्रीनटेप (एगिलेंट, ब्लैक्सबर्ग, VA, USA) का उपयोग किया गया।

अनुक्रमण को Illumina MiSeq उपकरण पर MiSeq अभिकर्मक किट v2 (500 चक्र) द्वारा संचालित किया गया था। डेटा का विश्लेषण MiSeqReporter सॉफ़्टवेयर मेटाजीनोमिक्स वर्कफ़्लो v2.5.1.3 (इलुमिना, सैन डिएगो, सीए, यूएसए) के साथ किया गया था। डबल-टर्मिनल अनुक्रमण द्वारा प्राप्त युग्मित रीड्स को पांडासेक सॉफ़्टवेयर के माध्यम से एक अनुक्रम में विभाजित किया गया था। उच्च परिवर्तनशील क्षेत्रों के साथ लंबे रीड्स प्राप्त किए गए थे।

वे रीड जिनका विंडो में औसत फ़्रेड स्कोर (आकार में 5 बीपी, 1 बीपी चरण लंबाई) 20 से कम था, उन्हें ट्रिम किया गया। अस्पष्ट "एन" या लंबाई < 220 बीपी वाले रीड को त्याग दिया गया। मूल डेटा के गुणवत्ता नियंत्रण के बाद, चिमेरा के बिना उच्च गुणवत्ता वाले अनुक्रमों को बड़े से छोटे तक बहुतायत के अनुसार व्यवस्थित किया गया और फिर ऑपरेशनल टैक्सोनोमिक यूनिट्स (ओटीयू) में 97% समानता के साथ क्लस्टर किया गया। प्रत्येक OTU को एक प्रजाति का प्रतिनिधित्व करने वाला माना जाता था। नमूना अनुक्रमण डेटा के विभिन्न आकारों के कारण विश्लेषण के विचलन से बचने के लिए, OTU में रीड की संख्या OTU से मेल खाने वाली न्यूनतम अनुक्रम संख्या के अनुसार दर्ज की गई थी जब अनुक्रमण गहराई पर्याप्त थी। अल्फा विविधता का विश्लेषण यादृच्छिक समतलन द्वारा किया गया था।

प्रत्येक OTU से प्रतिनिधि अनुक्रम के रूप में ARead निकाला गया। प्रतिनिधि अनुक्रम की तुलना राइबोसोमल डेटाबेस प्रोजेक्ट डेटाबेस से की गई। प्रत्येक OTU के लिए प्रजातियों को वर्गीकृत किया गया, और बाद के विश्लेषण के लिए प्रजातियों की बहुतायत तालिकाएँ प्राप्त की गईं। OTU पिकिंग को सॉफ़्टवेयर प्लेटफ़ॉर्म QIIME v1.9.1 पर Uclust का उपयोग करके निष्पादित किया गया था।

नमूने में प्रजातियों की विविधता के विश्लेषण के लिए चाओ1 सूचकांक और माल कवरेज सूचकांक सहित अल्फा विविधता का उपयोग किया गया था। नमूनों के बीच प्रजातियों की विविधता में अंतर की तुलना करने के लिए बीटा विविधता विश्लेषण का उपयोग किया गया था और ब्रे-कर्टिस दूरी के आधार पर प्रमुख समन्वय विश्लेषण (पीसीओए) द्वारा विशेषता दी गई थी। समूहों के बीच अंतरों का परीक्षण समानता के विश्लेषण (एएनओएसआईएम) द्वारा किया गया था।

प्लाज्मा एससीएफए प्रोफाइलिंग

प्लाज्मा एससीएफए सांद्रता को 7890–5977 गैसक्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-एमएस, एजिलेंट, ब्लैक्सबर्ग, वीए, यूएसए) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। प्लाज्मा के नमूने चूहों से ऊपर वर्णित समय बिंदुओं पर एकत्र किए गए थे, जल्दी से -8{{20}} डिग्री पर संग्रहीत किए गए थे, और फिर प्रसंस्करण के लिए कमरे के तापमान पर पिघलाए गए थे। संक्षेप में, 100 ul प्लाज्मा नमूने को 900 यूलेथेनॉल (0.5% HCl, V/V युक्त) के साथ भंवर-मिश्रित किया गया था। 40 मिनट के लिए अल्ट्रासोनिक उपचार लागू किया गया और फिर नमूनों को 10 मिनट के लिए 14,000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। नमूनों के सुपरनेटेंट को इलेक्ट्रॉन प्रभाव आयनीकरण और एक डीबी-एफएफएपी केशिका स्तंभ (30 मीटर × 0.25 मिमी × 0.25 माइक्रोन) के साथ एजिलेंट 7890-5977 जीसी-एमएस पर जीसी-एमएस विश्लेषण द्वारा मापा गया था।

कॉर्टिकल वैलेरिक एसिड परिमाणीकरण

वैलेरिक एसिड के अंतिम इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के 24 घंटे बाद सेरेब्रल कॉर्टेक्स में वैलेरिक एसिड की मात्रा का निर्धारण उसी तरह की विधि द्वारा किया गया था जैसा कि पहले रिपोर्ट किया गया था [51, 52]। संक्षेप में, 0.1 ग्राम सेरेब्रल कॉर्टेक्स को 500 µl जलीय एसिटोनिट्राइल में होमोजेनाइज़ किया गया। सतह पर तैरनेवाला 8 मिली निष्कर्षण बफर (हेक्सेन: डायथाइल ईथर=1:1) के साथ निकाला गया और 5 मिनट के लिए 1800 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। 7.5 मिली सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया, मेथनॉल में 93 µl 20 mMKOH के साथ मिलाया गया, और नाइट्रोजन गैस के तहत 40 डिग्री पर सुखाया गया। सूखे अवशेष को एसिटोनाइट्राइल में 50 µl 2.5% क्राउन में पुनर्गठित किया गया तथा टेट्रामेथिलैमोनियम हाइड्रॉक्साइड के योग के साथ एसिटोनाइट्राइल में क्लोरोमेथिल एन्थ्रेसीन के साथ आगे व्युत्पन्न किया गया।

अंत में, 30 µl व्युत्पन्न समाधान को Acclaim C18 कॉलम (3 µm, 4.6 × 100 mm, थर्मो साइंटिफिक) में लोड किया गया और UV-दृश्य डिटेक्टर से सुसज्जित अल्टीमेट 3000 उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC, थर्मो साइंटिफिक) में अलग किया गया। व्युत्पन्न वैलेरिक एसिड का शिखर 254 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर पता लगाया गया था।2-एथिलब्यूटिरिक एसिड (2-EA) को आंतरिक संदर्भ नियंत्रण के रूप में जोड़ा गया था। वैलेरिक एसिड के शिखर क्षेत्र को mAU*min के रूप में मापा गया था और प्रत्येक नमूने के शिखर क्षेत्र को नमूने में 2-EA के साथ सामान्यीकृत किया गया था। अंतिम परिणाम वैलेरिक एसिड समूह और NS समूह के अनुपात के रूप में प्रस्तुत किए गए थे।

मस्तिष्क ऊतक संग्रहण

सर्जरी के बाद 6 घंटे, 24 घंटे, 48 घंटे, 72 घंटे, 96 घंटे और 7 दिन पर चूहों का वजन किया गया और उन्हें आइसोफ्लुरेन से बेहोश किया गया और मस्तिष्क ऊतक कटाई के लिए 4 डिग्री एनएस के साथ छिड़काव किया गया। इन हिप्पोकैम्पस का उपयोग एलिसा विश्लेषण या आरएनए परख के लिए किया गया था। ब्रेग्मा -3 से -6 मिमी पर पूरे मस्तिष्क का उपयोग इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग के लिए किया गया था। सभी विच्छेदन प्रक्रियाएं बर्फ पर की गईं।

mRNA लाइब्रेरी की तैयारी और इल्युमिना हिसेक अनुक्रमण

The hippocampi harvested at 24 h after surgery from the control group, surgery group, and Exe+Sur group in the first experiment were placed in liquid nitrogen for 1 h and then stored in a −80 °C freezer quickly for no >1 सप्ताह। निर्माता के निर्देशों (इलुमिना) के अनुसार शंघाई में वूशी नेक्स्टकोड में आरएनए शुद्धिकरण, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन, लाइब्रेरी निर्माण और अनुक्रमण किया गया।

कुल आरएनए से mRNA-केंद्रित अनुक्रमण लाइब्रेरी को Illumina TruSeq® RNA नमूना तैयारी किट का उपयोग करके तैयार किया गया था। पॉलीए mRNA को ऑलिगो-डीटी संलग्न चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके कुल आरएनए से शुद्ध किया गया और फिर विखंडन बफर द्वारा विखंडित किया गया। इन छोटे टुकड़ों को टेम्पलेट के रूप में लेते हुए, रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और रैंडम प्राइमर का उपयोग करके पहले स्ट्रैंड cDNA को संश्लेषित किया गया, उसके बाद दूसरे स्ट्रैंड cDNA संश्लेषण किया गया। फिर संश्लेषित cDNA को Illumina के लाइब्रेरी निर्माण प्रोटोकॉल के अनुसार एंड-रिपेयर, फॉस्फोराइलेशन और 'A' बेस एडिशन के अधीन किया गया।

इलुमिना सीक्वेंसिंग एडेप्टर को cDNA अंशों में जोड़ा गया। डीएनए संवर्धन के लिए पीसीआर प्रवर्धन के बाद, 200–300 bp के लक्ष्य अंशों को साफ करने के लिए AMPure XPBeads (बेकमैन) का उपयोग किया गया। लाइब्रेरी निर्माण के बाद, परिणामी सीक्वेंसिंग लाइब्रेरी की सांद्रता को मापने के लिए क्यूबिट 3.0 फ्लोरोमीटर dsDNA HS परख (थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग किया गया, जबकि आकार वितरण का विश्लेषण एगिलेंट बायोएनालाइजर 2100 (एगिलेंट) का उपयोग करके किया गया। शंघाई, चीन में वूक्सी नेक्स्टकोड में 2 × 150 पेयर-एंड सीक्वेंसिंग के लिए इलुमिना द्वारा प्रदान किए गए प्रोटोकॉल का पालन करते हुए इलुमिना सिस्टम का उपयोग करके सीक्वेंसिंग की गई।

मात्रात्मक पॉलीमरेजचेन प्रतिक्रिया (क्यू-पीसीआर) द्वारा हिप्पोकैम्पल mRNA अभिव्यक्ति

सर्जरी के 24 घंटे बाद कंट्रोल ग्रुप, एक्सरसाइज ग्रुप, सर्जरी ग्रुप, Exe+Sur ग्रुप, ट्रांस-कंट्रोल+Sur ग्रुप, ट्रांस-Exe+Sur ग्रुप, Exe+Sur+NS ग्रुप और Exe+Sur+Val ग्रुप से निकाले गए हिप्पोकैम्पस को 1 घंटे के लिए लिक्विड नाइट्रोजन में रखा गया और फिर 3 दिनों से ज़्यादा समय तक -80 डिग्री फ़्रीज़र में स्टोर किया गया। RNA एक्सट्रैक्शन, RNA-टू-cDNA रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और q-PCR को पहले बताए गए तरीके से किया गया [49, 53]। संक्षेप में, RNA को RNeasy माइक्रो किट द्वारा निकाला गया। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन को 5X ऑल-इन-वन मास्टरमिक्स का उपयोग करके पूरा किया गया। अंत में, मात्रात्मक मात्रा निर्धारण के लिए CFX कनेक्ट रियल-टाइम सिस्टम (बायो-रेड) का उपयोग किया गया। क्यूपीसीआर के लिए प्राइमर थे: C3ar1-F:TGGGCTGGTGCTGTGGGTAG और C3ar1-R: GATGGCGAAGGCGGTTCTCAC. C3ar1 के लिए सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति की गणना तुलनात्मक थ्रेशोल्ड चक्र ΔΔCt और जीन अभिव्यक्ति के सामान्यीकरण के लिए हाउसकीपिंग जीन -एक्टिन का उपयोग करके की गई थी। लक्ष्य जीन के लिए mRNA स्तर क्रमशः संबंधित समूह के सापेक्ष गुना वृद्धि के रूप में व्यक्त किए जाते हैं।

हिप्पोकैम्पस में साइटोकाइन्स और जीडीएनएफ निर्धारण

हिप्पोकैम्पस में IL{{0}}, IL-6, C3, और GDNF का पता ELISA किट का उपयोग करके लगाया गया। IL-1, IL,-6, और GDNF के परीक्षण के लिए, मस्तिष्क के ऊतकों को RIPA बफर में बर्फ पर होमोजेनाइज़ किया गया जिसमें pH 7.6 के साथ 25 mM ट्रिस-HCl, 150 mMNaCl, 1% सोडियम डिऑक्सीकोलेट, 0.1% SDS और 10 mg/ml एप्रोटीनिन, 5 mg/ml पेपस्टैटिन, 5 mg/ml ल्यूपेप्टिन और 1 mM फेनिलमीथेन सल्फोनिल फ्लोराइड युक्त प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल शामिल थे।

C3 परीक्षण के लिए, मस्तिष्क के ऊतकों को PTR बफर (किट में आपूर्ति की गई) में बर्फ पर होमोजीनाइज़ किया गया। होमोजीनट को 4 डिग्री पर 20 मिनट के लिए 13,000 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करने के बाद एलिसा जांच के लिए सुपरनेटेंट एकत्र किया गया और प्रोटीन सांद्रता को BCA प्रोटीन परख (बायो-रेड, हेमल हेम्पस्टेड, हर्ट्स, यूके) द्वारा निर्धारित किया गया। मस्तिष्क के सुपरनेटेंट में IL-1, IL6, C3, और GDNF का पता एलिसा के लिए निर्माता के निर्देश के अनुसार लगाया गया, और मस्तिष्क में प्रत्येक नमूने में उनकी मात्रा को इसकी कुल प्रोटीन सामग्री द्वारा सामान्यीकृत किया गया और इसे pg/mg प्रोटीन के रूप में व्यक्त किया गया।

पश्चिमी सोख्ता

वेस्टर्न ब्लॉटिंग को पहले बताए गए तरीके से किया गया [49]। संक्षेप में, BCA प्रोटीन परख का उपयोग करके नमूनों की प्रोटीन सांद्रता निर्धारित की गई। प्रत्येक नमूने के बीस माइक्रोग्राम को निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके वेस्टर्न ब्लॉटिंग विश्लेषण के अधीन किया गया: खरगोश पॉलीक्लोनल एंटी-पोस्टसिनेप्टिक घनत्व प्रोटीन 95 (PSD95) 1:1000 कमजोर पड़ने पर, खरगोश पॉलीक्लोनल एंटी-सिनैप्सिन 1 1:1000 कमजोर पड़ने पर और खरगोश एंटीट्यूबुलिन एंटीबॉडी 1:1000 कमजोर पड़ने पर। छवियों को इमेज मास्टर II स्कैनर (जीई हेल्थकेयर, मिल्वौकी, WI, यूएसए) द्वारा स्कैन किया गया और इमेजक्वांट टीएल सॉफ्टवेयर v2003.03 (जीई हेल्थकेयर) का उपयोग करके विश्लेषण किया गया। रुचि रखने वाले प्रोटीन के बैंड सिग्नल को संबंधित ट्यूबुलिन के लिए सामान्यीकृत किया गया और उसी जैल से नियंत्रण नमूने के अंशों के रूप में व्यक्त किया गया।

इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधलापन

धुंधलापन की इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग और मात्रा का निर्धारण उसी तरह किया गया जैसा कि हमने पहले बताया है [6, 54]। संक्षेप में, मस्तिष्क को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में 24 घंटे के लिए 4 डिग्री पर स्थिर किया गया और फिर इष्टतम कटिंग तापमान यौगिक में जमने से पहले 4 डिग्री पर 30% सुक्रोज में रात भर रखा गया। कोरोनल 20- µm मोटे खंडों को क्रायोस्टेट का उपयोग करके ब्रेग्मा −3 से −6 मिमी तक क्रमिक रूप से काटा गया और माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखा गया।

ट्रिस-बफर सलाइन (टीबीएस) में धोने के बाद, खंडों को 0.3% ट्राइटन-एक्स100 युक्त टीबीएस में 1% गधा सीरम और 1% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) में 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर ब्लॉक किया गया और फिर निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री पर रात भर इनक्यूबेट किया गया: खरगोश मोनोक्लोनल एंटी-सी3 एंटीबॉडी (1:50), बकरी मोनोक्लोनल एंटी-जीएफएपी एंटीबॉडी (1:200), चूहा मोनोक्लोनल एंटी-सी3एआर एंटीबॉडी (1:50) और खरगोश मोनोक्लोनल एंटी-आईबा एंटीबॉडी (1:200)।

वर्गों को 0.1% ट्राइटॉन-एक्स 100 के साथ टीबीएस में धोया गया था। एलेक्सा फ्लोराइड 594 (1:200) के साथ संयुग्मित गधा खरगोश विरोधी आईजीजी एंटीबॉडी, एलेक्सा फ्लोराइड 488 (1:200) के साथ संयुग्मित गधा बकरी विरोधी आईजीजी एंटीबॉडी, एलेक्सा फ्लोराइड 594 (1:200) के साथ संयुग्मित गधा चूहा आईजीजी एंटीबॉडी या एलेक्सा फ्लोराइड 647 (1:200) के साथ संयुग्मित गधा खरगोश विरोधी आईजीजी एंटीबॉडी को अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए वर्गों के साथ संवर्धित किया गया था।

सेक्शन को TBS में धोया गया, न्यूक्लियर स्टेनिंग के लिए होचस्ट 33342 (1:1000) के साथ इनक्यूबेट किया गया, धोया गया, और वेक्टाशील्ड माउंटिंग मीडियम (H-1000; वेक्टर लैब्स, बर्लिंगेम, CA) के साथ माउंट किया गया। इम्यूनोस्टेनिंग की छवियों को LSM710 माइक्रोस्कोपी सिस्टम (ZEISS) के साथ z-स्टैक द्वारा प्राप्त किया गया था, और प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन को छोड़कर एक नकारात्मक नियंत्रण सभी प्रयोगों में शामिल किया गया था।

परिमाणीकरण पहले बताए गए तरीके से किया गया [6, 54]। संक्षेप में, एक माउस के छह अनुक्रमिक हिप्पोकैम्पस खंडों में से प्रत्येक से 2-3 गैर-अतिव्यापी क्षेत्रों द्वारा कवर किए गए पूरे डेंटेट गाइरस (DG) क्षेत्र की छवि बनाई गई थी। पूर्व निर्धारित सीमा स्तर से ऊपर की तीव्रता के साथ प्रति छवि पिक्सेल की संख्या को एक इच्छुक मार्कर के लिए सकारात्मक रूप से दाग वाले क्षेत्र के रूप में माना जाता था और इमेज-प्रो प्लस 6.0 (मीडिया साइबरनेटिक्स, इंक., रॉकविले, एमडी, यूएसए) का उपयोग करके परिमाणित किया गया और कुल क्षेत्र में सकारात्मक क्षेत्र के प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत किया गया। फिर सकारात्मक धुंधलापन के स्तर को दर्शाने के लिए प्रति माउस छह मापों का औसत निकाला गया। सभी मात्रात्मक विश्लेषण एक अंधे तरीके से किए गए थे।

BrdU प्रशासन और इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधलापन

सर्जरी के सात दिन बाद, चूहों को प्रतिदिन दोपहर में एक बार 80 mg/kg 5′-ब्रोमो-2′-डीऑक्सीयूरिडीन (BrdU) के लगातार 7 इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन दिए गए, जैसा कि पहले बताया गया है [14]। हिप्पोकैम्पस को काटने के लिए 5 दिन बाद चूहों की बलि दी गई। हिप्पोकैम्पस को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड 0.1 M फॉस्फेट-बफर सलाइन में 4 डिग्री पर 24 घंटे के लिए स्थिर किया गया और पैराफिन में एम्बेड किया गया। पांच-माइक्रोन मोटे कोरोनल ब्रेन सेक्शन को ब्रेग्मा −2 से −4 मिमी तक क्रमिक रूप से काटा गया। 10 mM सोडियम साइट्रेट, 0.05% ट्वीन 20 (pH 6.0) युक्त सोडियम साइट्रेट बफर के साथ सेक्शन को 95-100 डिग्री पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करके एंटीजन रिट्रीवल किया गया।

1 एन एचसीएल को 3 मिनट के लिए बर्फ पर, 2 एन एचसीएल को 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर और 37 डिग्री पर 6 मिनट के लिए इनक्यूबेट करके डीएनए विकृतीकरण किया गया। अनुभागों को कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए 0.5% ट्राइटन-एक्स 100 युक्त फॉस्फेट-बफर सलाइन (पीबीएस) में 5% गधा सीरम के साथ ब्लॉक किया गया था। फिर अनुभागों को निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री पर रात भर इनक्यूबेट किया गया: चूहे मोनोक्लोनल एंटी-बीआरडीयू एंटीबॉडी (1:100), और बकरी मोनोक्लोनल एंटी-जीएफएपी एंटीबॉडी (1:200)। अनुभागों को एलेक्सा फ्लुओर 594 (1:200) के साथ संयुग्मित गधे एंटी-चूहा आईजीजी एंटीबॉडी या एलेक्सा फ्लुओर 488 (1:200) के साथ संयुग्मित गधे एंटी-बकरी आईजीजी एंटीबॉडी के साथ एक अंधेरे कमरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। पीबीएस में धोने के बाद, खंडों को होचस्ट 33342 (1:1000) के साथ काउंटरस्टेन किया गया, धोया गया, और वेक्टाशील्ड माउंटिंग माध्यम (वेक्टर लैब्स) के साथ माउंट किया गया।

छवियों को एक चार्ज-युग्मित डिवाइस कैमरा (हाई मैगओलंपस BX51) और एक LSM710 कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी सिस्टम (ZEISS) के साथ एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप से प्राप्त किया गया था। प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन को छोड़कर एक नकारात्मक नियंत्रण सभी प्रयोगों में शामिल किया गया था। प्रत्येक माउस मस्तिष्क के लिए, सेल गिनती के लिए छह अनुक्रमिक हिप्पोकैम्पल वर्गों का उपयोग किया गया था। एक इच्छुक मार्कर या प्रत्येक अनुभाग के डीजी के उप-दानेदार क्षेत्र में दो मार्करों के संयोजन के लिए सकारात्मक रूप से दागी गई सभी कोशिकाओं की संख्या की गणना की गई। मात्रात्मक विश्लेषण एक अंधे तरीके से किया गया था।

गॉल्जी दाग

गोल्गी स्टेनिंग को FD रैपिड गोल्गीस्टेनTM किट का उपयोग करके किया गया। सर्जरी के उन्नीस दिन बाद, प्रत्येक समूह में 6 चूहों के मस्तिष्क को 2 सप्ताह के लिए संसेचन समाधान (समाधान A और B: 1:1) में डुबोया गया और फिर 3 दिनों के लिए समाधान C में स्थानांतरित कर दिया गया। 100 μm की मोटाई और ब्रेग्मा से लगभग -2.7 मिमी की दूरी पर कोरोनल मस्तिष्क खंडों को वाइब्रेटोम (माइक्रोस्लाइसर® 10110, टेड पेला, इंक. कैलिफोर्निया, यूएसए) पर काटा गया।

जैसा कि पहले बताया गया है[55, 56], हिप्पोकैम्पस के डीजी क्षेत्र में 10 से अधिक अच्छी तरह से व्यक्तिगत न्यूरॉन्स को प्रत्येक माउस से यादृच्छिक रूप से चुना गया था, और अनुक्रमिक ऑप्टिकल मल्टीपल-लेयर स्कैनिंग इमेज को 20 ×ऑब्जेक्टिव के साथ z अक्ष (3DHISTECH, पैनोरमिक MIDI, हंगरी) के साथ 2.0 μma अंतराल पर लिया गया था। मल्टीपल-लेयर स्कैनिंग फ़ाइलों को एक स्पष्ट स्कैनिंग फ़ाइल बनने के लिए सुपरपोज़ किया गया था जिसे कंप्यूटर पर केसव्यूअर (3DHISTECH, हंगरी) के साथ देखा जा सकता है। कुल शाखा संख्या और डेंड्रिटिक लंबाई को फिजी सॉफ्टवेयर (फिजी-विन 64, NIH, USA) द्वारा मापा गया था। शोल विश्लेषण का उपयोग करके कुल डेंड्रिटिक पेड़ों (चौराहों) की जटिलता का अनुमान लगाया गया था। रीढ़ की हड्डी के घनत्व को मापने के लिए, प्रत्येक जानवर से 5 न्यूरॉन्स चुने गए।

स्कैनिंग फ़ाइलों से शीर्षस्थ या आधारीय डेनड्राइट्स पर पाँच यादृच्छिक रूप से चयनित सूक्ष्म क्षेत्रों की तस्वीरें ली गईं। 40 μms खंडों में स्पाइन संख्याओं की गणना एक पर्यवेक्षक द्वारा की गई जो समूह असाइनमेंट के प्रति अंधा था। परिणामों को स्पाइन/10 μms खंडों की संख्या के रूप में व्यक्त किया गया था। एक माउस से डेंड्राइटिक शाखा संख्या, लंबाई और प्रतिच्छेदन के साथ-साथ स्पाइन घनत्व के डेटा को माउस के स्तर को दर्शाने के लिए औसत किया गया था।

सांख्यिकीय विश्लेषण

प्रत्येक प्रयोग के लिए नमूना आकार की गणना नहीं की गई थी। नमूना आकार का निर्धारण ज्यादातर हमारे अनुभव पर आधारित था: सीखने और स्मृति का परीक्षण करने वाले प्रयोगों के लिए बड़े आकार के नमूने का उपयोग जैव रासायनिक अध्ययनों के लिए किया गया था। एकत्र किए गए सभी डेटा को विश्लेषण में शामिल किया गया था। लापता डेटा में वे जानवर शामिल थे जो व्यायाम प्रशिक्षण के लिए पूर्व निर्धारित बहिष्करण मानदंडों को पूरा करते थे और वे जानवर जो इच्छित अवलोकन अवधि से पहले मर गए थे। प्रत्येक प्रायोगिक स्थिति के लिए विश्लेषण के लिए डेटा का योगदान करने वाले जानवरों की संख्या चित्र किंवदंतियों में बताई गई है।

परिणामों को माध्य ± SD (सामान्य वितरण डेटा) या माध्य ± इंटरक्वार्टराइल रेंज (सामान्य वितरण डेटा नहीं) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, जिसमें बार ग्राफ में व्यक्तिगत पशु डेटा और लाइन प्लॉट में माध्य ± SD प्रस्तुत किया जाता है। बार्न्समेज़ के प्रशिक्षण सत्रों से प्राप्त डेटा का विश्लेषण टू-वे रिपीटेड एनालिसिस ऑफ़ वेरिएंस (ANOVA) द्वारा किया गया, जिसके बाद टुकी टेस्ट किया गया।

आंत माइक्रोबायोटा डेटा का विश्लेषण आंत माइक्रोबायोटा प्रोफाइलिंग अनुभाग में वर्णित अनुसार किया गया था। अन्य डेटा का विश्लेषण एक-तरफ़ा एनोवा द्वारा किया गया था, जिसके बाद यदि डेटा सामान्य रूप से वितरित था, तो तुकी परीक्षण किया गया था, रैंक पर एक-तरफ़ा एनोवा द्वारा तुकी परीक्षण या स्टूडेंट-न्यूमैन-केल्स विधि द्वारा विश्लेषण किया गया था, यदि डेटा सामान्य रूप से वितरित नहीं था, तो दो-तरफ़ा एनोवा द्वारा, टी-टेस्ट या रैंक योग परीक्षण द्वारा। दो-पूंछ वाले परिकल्पना परीक्षण के आधार पर एक महत्वपूर्ण अंतर को P < 0.05 के रूप में परिभाषित किया गया था।

कई तुलनाओं के लिए समायोजन नहीं किया गया। सभी सांख्यिकीय विश्लेषण सिग्मास्टेट (सिस्टैट सॉफ्टवेयर, इंक., पॉइंट रिचमंड, सीए, यूएसए) के साथ किए गए थे।

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