उचित व्यायाम स्तर चूहों में सर्जरी के बाद न्यूरोप्लास्टिसिटी और संज्ञानात्मक कार्य में सुधार करने के लिए आंत डिस्बिओसिस और वैलेरिक एसिड में वृद्धि को कम करता है भाग 3

सामग्री और तरीके

प्रायोगिक प्रोटोकॉल और प्रक्रियाओं को वर्जीनिया विश्वविद्यालय (चार्लोट्सविले, VA, USA; प्रोटोकॉल संख्या: 3114) की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

स्मृति उन क्षमताओं में से एक है जिसका हमें अक्सर अपने दैनिक जीवन में उपयोग करने की आवश्यकता होती है। यह लोगों को अधिक बुद्धिमान, अधिक संवेदनशील और करियर तथा पारस्परिक संबंधों के लिए अधिक अनुकूल बना सकता है। इसलिए, बहुत से लोग अपनी याददाश्त में सुधार करना चाहते हैं। प्रायोगिक प्रोटोकॉल और स्मृति के बीच एक संबंध है। आइए आगे इस मुद्दे का पता लगाते हैं।

सबसे पहले, प्रायोगिक प्रोटोकॉल लोगों को उनकी याददाश्त को बेहतर बनाने में मदद कर सकते हैं। प्रयोग में, लोगों को प्रयोगात्मक ऑपरेशन को पूरा करने के लिए कुछ चरणों का पालन करने की आवश्यकता होती है। यह चरण-दर-चरण गतिविधि मानव मस्तिष्क को उच्च ध्यान और एकाग्रता की स्थिति में ला सकती है, जिससे मस्तिष्क के कार्यों के प्रदर्शन को बढ़ावा मिलता है। साथ ही, आपको प्रयोग के दौरान कुछ प्रयोगात्मक डेटा और प्रयोगात्मक चरणों को याद रखने की आवश्यकता होती है, जो मस्तिष्क के मेमोरी फ़ंक्शन का भी अभ्यास करेगा। इस तरह से बार-बार अभ्यास करने से आपकी याददाश्त धीरे-धीरे बेहतर होगी।

दूसरे, स्मृति प्रक्रिया के दौरान संवेदी अनुभव भी प्रयोगात्मक योजना के डिजाइन से निकटता से संबंधित है। प्रयोगों में, डिजाइनर अक्सर प्रयोग के दौरान कुछ विशिष्ट कार्य निर्धारित करते हैं, ताकि प्रतिभागियों को एक ही ऑपरेशन को कई बार दोहराना पड़े, जैसे संख्याओं की स्मृति और लेखन, रंग ब्लॉकों की स्मृति और पहचान, आदि। यह दोहराव वाला अनुभव लोगों की ध्यान और स्मृति क्षमताओं को मजबूत कर सकता है, जिससे लोगों के लिए इस जानकारी को दीर्घकालिक स्मृति में संसाधित करना आसान हो जाता है।

इसके अलावा, प्रयोगों में, प्रतिनिधि उत्तेजना सामग्री (जैसे छवियाँ, ध्वनियाँ, गंध, आदि) का उपयोग भी अच्छे परिणाम दे सकता है। क्योंकि ये उत्तेजनाएँ मस्तिष्क की उत्तेजना और स्मृति प्रक्रियाओं को ट्रिगर कर सकती हैं, जिससे लोगों की स्मृति क्षमता में सुधार होता है। साथ ही, इन उत्तेजनाओं को पर्यावरण और जीवन की स्थितियों के साथ भी जोड़ा जा सकता है, जिससे वियोजन की घटना कम हो जाती है और जानकारी को याद रखना आसान और अधिक सुसंगत हो जाता है।

संक्षेप में, प्रायोगिक योजना मानव स्मृति को बेहतर बनाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। प्रयोगों का संचालन करके, लोग अपनी संज्ञानात्मक क्षमताओं का उपयोग कर सकते हैं, अपनी स्मृति के स्तर में सुधार कर सकते हैं, और साथ ही मस्तिष्क के कार्य को बढ़ावा दे सकते हैं। इसलिए, हमें अपने स्मृति स्तरों को बेहतर बनाने और अपने करियर, रिश्तों और स्वास्थ्य में अधिक योगदान देने के लिए नए प्रयोगात्मक तरीकों को सीखना जारी रखना चाहिए और अधिक प्रयोगों में भाग लेना चाहिए। यह देखा जा सकता है कि हमें याददाश्त में सुधार करने की आवश्यकता है, और सिस्टेन्चे डेज़र्टिकोला स्मृति में काफी सुधार कर सकता है, क्योंकि सिस्टेन्चे डेज़र्टिकोला में एंटीऑक्सिडेंट, एंटी-इंफ्लेमेटरी और एंटी-एजिंग प्रभाव होते हैं, जो मस्तिष्क में ऑक्सीकरण और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को कम करने में मदद कर सकते हैं, जिससे तंत्रिका तंत्र के स्वास्थ्य की रक्षा होती है। इसके अलावा, सिस्टेन्चे डेज़र्टिकोला तंत्रिका कोशिकाओं की वृद्धि और मरम्मत को भी बढ़ावा दे सकता है, इस प्रकार तंत्रिका नेटवर्क की कनेक्टिविटी और कार्य को बढ़ाता है। ये प्रभाव स्मृति, सीखने की क्षमता और सोचने की गति को बेहतर बनाने में मदद कर सकते हैं, और संज्ञानात्मक शिथिलता और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के विकास को भी रोक सकते हैं।

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सभी पशु प्रयोगों को प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान गाइड (एनआईएच प्रकाशन संख्या 80-23) द्वारा 2011 में संशोधित किया गया था। प्रमुख सामग्रियों के स्रोतों को पूरक सामग्रियों में प्रमुख संसाधन तालिका में सूचीबद्ध किया गया था।

पशु और प्रायोगिक डिजाइन

19-22 ग्राम वजन वाले आठ सप्ताह के नर C57BL/6 J चूहों को निरंतर पर्यावरणीय परिस्थितियों (तापमान 22-24 डिग्री, 12 घंटे का प्रकाश/अंधेरा चक्र, और 50 ± 10% आर्द्रता) के तहत बनाए गए कमरे में रखा गया था, जिसमें भोजन और पानी की मुफ्त पहुंच थी।

प्रयोगों से पहले सभी को एक सप्ताह के लिए अनुकूलन करने दिया गया। उन्हें पहले प्रयोग में यादृच्छिक रूप से निम्नलिखित समूहों में रखा गया: (1) नियंत्रण समूह (एनेस्थीसिया और सर्जरी के संपर्क में नहीं), (2) व्यायाम समूह (35-40% अधिकतम क्षमता पर व्यायाम किया गया, लेकिन एनेस्थीसिया और सर्जरी के संपर्क में नहीं), (3) सर्जरी समूह (आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया के तहत 2 घंटे के लिए 15 मिनट के लिए बाएं कैरोटिड धमनी का संपर्क), और (4) से (6) एक्स-एल+सुर, एक्स-एम+सुर और एक्स-एच+सुर समूह: क्रमशः 35-40%, 55-60% और 75-80% अधिकतम क्षमता पर व्यायाम किया गया, और एनेस्थीसिया और सर्जरी के अधीन किया गया।

जानवरों का उपयोग सर्जरी के 4 दिन बाद (n=20) सीखने और स्मृति परीक्षणों के लिए किया गया था या उनके मस्तिष्क को सर्जरी के 6 घंटे, 24 घंटे, 48 घंटे, 72 घंटे, 96 घंटे और 7 दिन बाद जैव रासायनिक परख के लिए एकत्र किया गया था (n=9 या 14), इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधलापन के लिए सर्जरी के 48 घंटे और 19 दिन बाद (n=6), और गॉल्जी धुंधलापन के लिए सर्जरी के 19 दिन बाद (n=8)।

सर्जरी के 7 दिन बाद (n=7) और 16 एस विश्लेषण के लिए सर्जरी के 3 और 7 दिन बाद (n=8) या 4- सप्ताह के व्यायाम प्रोटोकॉल के अंत में (n=8) ​​या पहले 2 समूहों में इसी समय (n=16) पहले 4 समूहों के चूहों से रक्त और मल एकत्र किया गया। ऊतक संग्रह के लिए चूहों के अलग-अलग समूह थे जिनका उपयोग सीखने और स्मृति परीक्षणों के लिए किया गया था। दूसरे प्रयोग में, चूहों को यादृच्छिक रूप से (1) ट्रांसकंट्रोल + सुर समूह और (2) ट्रांस-एक्सई + सुर समूह में सौंपा गया था।

पहले समूह के चूहों को एंटीबायोटिक उपचार के बाद लगातार 7 दिनों तक गैस्ट्रिक गैवेज द्वारा नियंत्रण समूह से 500 ul मल समाधान और दिन में एक बार एनीमा द्वारा 600 ul मल समाधान दिया गया ताकि प्राप्तकर्ताओं में मूल आंत माइक्रोबायोटा को समाप्त किया जा सके। दूसरे समूह के चूहों को एंटीबायोटिक उपचार के बाद लगातार 7 दिनों तक व्यायाम करने वाले चूहों से गैस्ट्रिक गैवेज द्वारा 500 ul मल समाधान और दिन में एक बार एनीमा द्वारा 600 ul मल समाधान दिया गया। 16 एस विश्लेषण के लिए मल प्रत्यारोपण के 14 दिन बाद प्राप्तकर्ताओं से मल एकत्र किया गया। फिर चूहों की सर्जरी की गई।

सर्जरी के 4 दिन बाद से सीखने और याददाश्त का मूल्यांकन किया गया (n=15)। पहले प्रयोग की तरह ही जैव रासायनिक अध्ययन के लिए मस्तिष्क को काटा गया (n=10)। तीसरे प्रयोग में, चूहों को बेतरतीब ढंग से (1) ट्रांसकंट्रोल समूह और (2) ट्रांस-कंट्रोल+सुर समूह में सौंपा गया। दोनों समूहों के चूहों को नियंत्रण चूहों से मल का प्रत्यारोपण प्राप्त हुआ। दूसरे समूह में मल प्रत्यारोपण के 14 दिन बाद सर्जरी हुई। GDNF (n=10) को मापने के लिए सर्जरी के 2 दिन बाद हिप्पोकैम्पस काटा गया। चौथे प्रयोग में, चूहों को बेतरतीब ढंग से (1) नियंत्रण समूह (भोले चूहे जिन्हें इस अध्ययन में वर्णित किसी भी प्रयोगात्मक स्थिति के संपर्क में नहीं लाया गया था), (2) एंटीबायोटिक समूह जिन्हें 7 दिनों के लिए एंटीबायोटिक प्राप्त हुए, और (3) ट्रांस-नियंत्रण समूह जिन्हें नियंत्रण चूहों से मल का प्रत्यारोपण प्राप्त हुआ, में सौंपा गया।

सीखने और स्मृति का मूल्यांकन मल प्रत्यारोपण के पूरा होने के 19 दिनों के बाद किया गया (एंटीबायोटिक समूह में एंटीबायोटिक उपचार के पूरा होने के 26 दिनों के बाद) (n=12)। पांचवें प्रयोग में, चूहों को यादृच्छिक रूप से (1) नियंत्रण समूह, (2) ट्रांस-नियंत्रण समूह, जिसे नियंत्रण चूहों से मल का प्रत्यारोपण प्राप्त हुआ, और (3) ट्रांस-सर्जरी समूह, जिसे सर्जरी चूहों से मल का प्रत्यारोपण प्राप्त हुआ, में सौंपा गया। 

मल प्रत्यारोपण दूसरे प्रयोग में बताए अनुसार किया गया। मल प्रत्यारोपण के 14 दिन बाद प्राप्तकर्ताओं से मल 16 एस विश्लेषण (एन=10) के लिए एकत्र किया गया। सीखने और स्मृति का मूल्यांकन मल के नमूने को इकट्ठा करने के 4 दिन बाद किया गया (n=17)। छठे प्रयोग में, चूहों को यादृच्छिक रूप से (1) सर्जरी प्लस सामान्य खारा समूह में सौंपा गया था, जिसे 4 सप्ताह के लिए सप्ताह में एक बार इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा 200 µl सामान्य खारा (एनएस) प्राप्त हुआ और फिर सर्जरी, (2) व्यायाम प्लस सामान्य खारा प्लस सर्जरी समूह जिसे 4- सप्ताह के दौरान सप्ताह में एक बार इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा 200 µl एनएस प्राप्त हुआ, 35-40% अधिकतम क्षमता पर व्यायाम और फिर सर्जरी, (3) व्यायाम प्लस वैलेरिक एसिड प्लस सर्जरी समूह जिसे 4- सप्ताह के दौरान सप्ताह में एक बार इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा वैलेरिक एसिड (200 मिलीग्राम / किग्रा 200 µl में) प्राप्त हुआ

इंजेक्शन सप्ताह के पहले व्यायाम दिवस की सुबह दिया गया था। सर्जरी के दिन एक अतिरिक्त इंजेक्शन लगाया गया था। व्यवहारिक (n=13) और जैव रासायनिक (n=10) परिणामों का मूल्यांकन दूसरे प्रयोग की तरह किया गया। सातवें प्रयोग में, 13- सप्ताह के (वजन 23-27 ग्राम) नर C57BL/6 J चूहों को यादृच्छिक रूप से (1) नियंत्रण समूह, (2) NS समूह में सौंपा गया था, जिसे लगातार 4 दिनों तक प्रतिदिन एक बार इंट्रासेरेब्रोवेंट्रिकुलर इंजेक्शन द्वारा 4 µl NS प्राप्त हुआ था, और (3) वैलेरिक एसिड समूह जिसे लगातार 4 दिनों तक प्रतिदिन एक बार इंट्रासेरेब्रोवेंट्रिकुलर इंजेक्शन द्वारा 4 µl में 4 mg/kg प्राप्त हुआ था। बाएं और दाएं सेरेब्रोवेंट्रिकल्स को एक वैकल्पिक शेड्यूल पर इंजेक्ट किया गया था। इंजेक्शन के 4 दिन बाद सीखने और याददाश्त का मूल्यांकन किया गया (n=15)।

आठवें प्रयोग में, चूहों को यादृच्छिक रूप से (1) सर्जरी प्लस डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (DMSO) समूह में रखा गया, जिन्हें सर्जरी के दिन से लगातार 4 दिनों तक प्रतिदिन एक बार इंट्रासेरेब्रोवेंट्रीकुलर इंजेक्शन द्वारा DMSO दिया गया, (2) सर्जरी प्लस C3ar प्रतिपक्षी समूह, जिन्हें सर्जरी के दिन से शुरू करके 4 दिनों तक प्रतिदिन एक बार इंट्रासेरेब्रोवेंट्रीकुलर इंजेक्शन द्वारा C3ar प्रतिपक्षी (SB290157) दिया गया, (3) व्यायाम प्लस DMSO प्लस सर्जरी समूह, जिन्हें 4- सप्ताह के व्यायाम के बाद सर्जरी के दिन से 35-40% अधिकतम क्षमता पर लगातार 4 दिनों तक प्रतिदिन एक बार इंट्रासेरेब्रोवेंट्रीकुलर इंजेक्शन द्वारा DMSO दिया गया, और (4) व्यायाम प्लस C3ar एगोनिस्ट प्लस सर्जरी समूह, जिन्हें 4- सप्ताह के व्यायाम के बाद सर्जरी के दिन से 35-40% अधिकतम क्षमता पर लगातार 4 दिनों तक प्रतिदिन एक बार इंट्रासेरेब्रोवेंट्रीकुलर इंजेक्शन द्वारा C3 प्रतिपक्षी दिया गया। जैसा कि ऊपर बताया गया है, व्यवहार परीक्षण सर्जरी के 4 दिन बाद शुरू किए गए (n=15)।

नौवें प्रयोग में, चूहों को यादृच्छिक रूप से (1) नियंत्रण समूह, (2) सर्जरी समूह, (3) सर्जरी प्लस जीडीएनएफ समूह में रखा गया था, जिन्हें सर्जरी के दौरान इंट्रासेरेब्रोवेंट्रिकुलर इंजेक्शन द्वारा जीडीएनएफ प्राप्त हुआ था, और (4) सर्जरी प्लस हीट-इनएक्टिवेटेड जीडीएनएफ समूह जिन्हें सर्जरी के दौरान इंट्रासेरेब्रोवेंट्रिकुलर इंजेक्शन द्वारा हीट-इनएक्टिवेटेड जीडीएनएफ प्राप्त हुआ था। एलिसा अध्ययन (एन=12) के लिए सर्जरी के 48 घंटे बाद हिप्पोकैम्पस को काटा गया। अनुकूलन के एक सप्ताह के बाद, 30-36 ग्राम वजन वाले पुराने चूहों (18- महीने के नर C57BL/6 Jचूहे) का उपयोग तीन अध्ययनों में किया गया। पहले प्रयोग में, बूढ़े चूहों को यादृच्छिक रूप से (1) नियंत्रण समूह, (2) व्यायाम समूह में रखा गया था जिसमें चूहों ने 35-40% अधिकतम क्षमता पर 4- सप्ताह व्यायाम किया था, (3) सर्जरी समूह, और (4) Exe+Sur समूह जिसमें चूहों ने सर्जरी से पहले 35-40% अधिकतम क्षमता पर 4- सप्ताह व्यायाम किया था। जानवरों को सर्जरी के 4 दिन बाद सीखने और स्मृति परीक्षणों के लिए इस्तेमाल किया गया था (n=12) या सर्जरी के 48 घंटे बाद जैव रासायनिक परख के लिए उनके दिमाग को काटा गया था (n=10 या 12), सर्जरी के 48 घंटे और 19 दिन बाद इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधलापन के लिए (n=6), और सर्जरी के 19 दिन बाद गॉल्जी धुंधलापन के लिए (n=8)।

4 समूहों के चूहों से रक्त और मल को सर्जरी के 7 दिन बाद (n=7) और 16 एस विश्लेषण के लिए सर्जरी के 3 और 7 दिन बाद (n=8) या 4- सप्ताह के व्यायाम प्रोटोकॉल के अंत में या पहले 2 समूहों में इसी समय (n=16) पर एससीएफए माप के लिए एकत्र किया गया था। ऊतक संग्रह के लिए चूहे अलग-अलग समूह थे जिनका उपयोग सीखने और स्मृति परीक्षणों के लिए किया गया था। दूसरे प्रयोग में, बूढ़े चूहों को यादृच्छिक रूप से (1) ट्रांस-ओल्ड कंट्रोल+सुर समूह और (2) ट्रांस-ओल्ड एक्सई+सुर समूह में सौंपा गया था। इन चूहों को युवा वयस्क चूहों के दूसरे प्रयोग में वर्णित अनुसार मल प्रत्यारोपण के 14 दिन बाद सर्जरी के अधीन किया गया था। सर्जरी के 4 दिन बाद से सीखने और स्मृति का मूल्यांकन किया गया (n =10)।

तीसरे प्रयोग में, बूढ़े चूहों को यादृच्छिक रूप से (1) सर्जरी प्लस एनएस समूह; (2) व्यायाम प्लस एनएस प्लस सर्जरी समूह; और (3) व्यायाम प्लस वैलेरिक एसिड प्लस सर्जरी समूह में सौंपा गया था। इन चूहों को युवा वयस्क चूहों के छठे प्रयोग में वर्णित व्यायाम कंडीशनिंग और वैलेरिक एसिड दिया गया। सर्जरी के 4 दिन बाद व्यवहारिक परिणामों का परीक्षण किया गया (n=11)। ऊपर वर्णित नमूना आकार (n) उन जानवरों की संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं जिन्हें प्रत्येक समूह/स्थिति में यादृच्छिक रूप से रखा गया था। जानवरों की ये संख्या प्रत्येक प्रयोग के कम से कम 3 प्रतिकृतियों का योग थी। प्रत्येक प्रयोग में जानवरों को कंप्यूटर द्वारा उत्पन्न यादृच्छिककरण तालिकाओं के आधार पर समूहों में यादृच्छिक रूप से वितरित किया गया था।

अधिकतम व्यायाम क्षमता निर्धारण और व्यायाम प्रशिक्षण

सर्जरी से पहले, {{0}} सप्ताह और 18- महीने के चूहों को प्रत्येक चूहे की अधिकतम व्यायाम क्षमता के निर्धारण के बाद 4- सप्ताह ट्रेडमिल एरोबिक व्यायाम के संपर्क में लाया गया। यह निर्धारण पहले वर्णित तरीकों के समान तरीके से किया गया था [47, 48]। संक्षेप में, चूहों को पहले दिन 25 V, 0.3mA, और 2 Hz पर शॉक ग्रिड की प्रारंभिक सेटिंग और 10 मिनट के लिए गति और झुकाव शून्य पर ट्रेडमिल के लिए अनुकूलित किया गया था। फिर ट्रेडमिल की गति को 10 सेमी/सेकंड तक बढ़ा दिया गया और झुकाव को 10 मिनट के लिए 50 पर सेट किया गया। इसके बाद, ट्रेडमिल की गति और झुकाव को 5 मिनट के लिए 15 सेमी/सैंड और 100 तक बढ़ाया गया।

The speed was then increased by 5 cm/s every 5 min to an average maximal speed of 70 cm/s in young mice and 60 cm/s in old mice (around 65–75 cm/s and 55–65 cm/s, respectively), as they reached the criteria for exercise-induced exhaustion. These criteria were: (1) 10 consecutive seconds on the electric grid; (2) spending >ग्रिड पर 50% समय; और/या (3) मैनुअल प्रोडिंग के लिए प्रेरणा की कमी। इनमें से एक या अधिक मानदंड पूरे होने पर माउस को संबंधित लेन से तुरंत हटा दिया गया। अगले दिन, चूहे उसी ट्रेडमिल पर औसत अधिकतम गति के आधे (युवा चूहों में 35 सेमी/सेकंड या बूढ़े चूहों में 30 सेमी/सेकंड) और 100 झुकाव पर तब तक दौड़े जब तक कि वे थकावट के मानदंडों में से एक पर नहीं पहुँच गए, और निरंतर व्यायाम की अवधि को प्रत्येक चूहे की अधिकतम व्यायाम क्षमता के रूप में दर्ज किया गया। इन दो प्रोटोकॉल के बाद, व्यायाम के बाद ध्यान देने योग्य आक्रामक व्यवहार से बचने के लिए चूहों को 30 मिनट के लिए अलग से रखा गया।

After resting for 2 days, mice assigned to exercise training groups were subjected to a 4-week protocol of forced treadmill running at 35–40%, 55–60%, or 75–80% of the maximal capacity, respectively, for 5 days a week. Mice that were shocked for >5% of the total daily exercise time in 2 consecutive days or >लगातार 3 दिनों के कुल समय का 3% बाहर रखा जाएगा।

व्यायाम समूहों के समान प्रयोगों के समूह में गैर-व्यायाम समूहों को प्रतिदिन लगभग 30-40 मिनट के लिए एक गैर-चलती ट्रेडमिल पर रखा गया था। उन्हें कुल 5 सेकंड के लिए 10 झटके मिले, जो कि व्यायाम समूह में चूहों को प्रतिदिन प्राप्त होने वाले झटकों की औसत मात्रा है, जो कि गैर-चलती ट्रेडमिल पर उनके रहने के दौरान होती है। यदि प्रयोगों के समूह में व्यायाम समूह नहीं था, तो प्रयोगों के समूह में किसी भी चूहे को झटके नहीं मिले।

एंटीबायोटिक उपचार

प्रत्यारोपित माइक्रोबायोटा के उपनिवेशण को सुविधाजनक बनाने के लिए, प्राप्तकर्ता चूहों को उनके मूल आंत माइक्रोबायोटा को खत्म करने के लिए लगातार 7 दिनों तक प्रतिदिन एक बार एंटीबायोटिक उपचार दिया गया, जैसा कि हमारे और अन्य लोगों द्वारा वर्णित किया गया है [11, 36]। संक्षेप में, पहले दिन गैस्ट्रिक गैवेज द्वारा 10% मैग्नीशियम सल्फेट (200 ul/10 ग्राम, दो बार 3 घंटे के अंतराल पर) के साथ विरेचन के बाद, C57BL/6 J चूहों को गैस्ट्रिक गैवेज द्वारा एमोक्सिसिलिन/क्लैवुलैनिक एसिड (200 मिलीग्राम/किग्रा), मेट्रोनिडाजोल (200 मिलीग्राम/किग्रा) और सेफाज़ोलिन (2 ग्राम/किग्रा) और सुबह में एनीमा (गैस्ट्रिक गैवेज के लिए 300 ul और एनीमा के लिए 400 ul NS) लगातार 7 दिनों तक दिन में एक बार दिया गया, और इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा प्रतिदिन 200 ul NS में एमोक्सिसिलिन/क्लैवुलैनिक एसिड (20 मिलीग्राम/किग्रा), मेट्रोनिडाजोल (20 मिलीग्राम/किग्रा) और सेफाज़ोलिन (300 मिलीग्राम/किग्रा) उन्हीं 7 दिनों तक (शाम 4 से 5 बजे तक) दिया गया। जीवाणुओं के बीच होने वाले संक्रमण को रोकने के लिए, चूहों को संभालना और प्रतिदिन पिंजरे और पानी की बोतल बदलना तकनीशियनों द्वारा हवादार हुड में साफ गाउन और दस्ताने पहनकर किया गया। प्रभाव का पता लगाने के लिए 16 एस विश्लेषण के लिए अंतिम उपचार के 24 घंटे बाद इन चूहों से मल एकत्र किया गया।

मल प्रत्यारोपण

नियंत्रण चूहों से मल त्याग के 30 मिनट के भीतर एकत्र किए गए ताजा मल के छर्रे, 4- सप्ताह के व्यायाम के तुरंत बाद के चूहे, या सर्जरी के 2 से 8 दिन बाद के चूहों को 100 मिलीग्राम/एमएल स्टेराइल सलाइन से पतला किया गया। प्रत्येक प्रायोगिक स्थिति के साथ 7-10 दाताओं के सभी मल के छर्रों को मिलाया गया और सलाइन में एक साथ फिर से लटका दिया गया। संक्षेप में, मल पदार्थ को 5 मिनट के लिए भंवर-मिश्रित किया गया और फिर अपचित भोजन और कण पदार्थों को हटाने के लिए 70 μm नायलॉन सेल छलनी से गुजारा गया। प्राप्तकर्ता चूहों को लगातार 7 दिनों तक एंटीबायोटिक दवाओं की अंतिम खुराक के 24 घंटे बाद सुबह गैस्ट्रिक गैवेज द्वारा 500 ul और दोपहर में एनीमा द्वारा 600 ul संबंधित मल समाधान प्राप्त हुआ। प्रत्यारोपित चूहों को मल प्रत्यारोपण के बाद 2 सप्ताह तक रखा गया, इससे पहले कि उन्हें 16 एस विश्लेषण और सर्जरी के लिए मल संग्रह के अधीन किया गया।

संज्ञाहरण और सर्जरी

सर्जरी में कैरोटिड धमनी को खुला छोड़ दिया गया था जैसा कि हमने पहले बताया था [6]। संक्षेप में, चूहों को 2% आइसोफ्लुरेन के साथ एनेस्थेटाइज किया गया और प्रक्रिया के दौरान 100% ऑक्सीजन से आपूर्ति किए गए फेसमास्क के साथ सहज श्वसन बनाए रखा गया। रेक्टल तापमान की निगरानी की गई और हीटिंग कंबल की सहायता से 37 डिग्री पर बनाए रखा गया। चूहे को कम से कम 20 मिनट के लिए आइसोफ्लुरेन द्वारा एनेस्थेटाइज करने के बाद वेगस तंत्रिका को किसी भी नुकसान के बिना 2- सेमी मिडलाइन गर्दन चीरा और 1- सेमी लंबी सामान्य धमनी एक्सपोजर के साथ नरम ऊतक विच्छेदन किया गया। फिर घाव को 4-0 सर्जिकल सिवनी का उपयोग करके सिंचित और बंद किया गया। सर्जिकल प्रक्रिया बाँझ परिस्थितियों में की गई और युवा चूहों में लगभग 15 मिनट और पुराने चूहों में 12 मिनट तक चली। सामान्य संज्ञाहरण की कुल अवधि 2 घंटे थी। सर्जरी के बाद, सभी जानवरों को 3 मिलीग्राम/किलोग्राम ब्यूपिवाकेन का एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन मिला। एनेस्थीसिया के दौरान पैर की उंगलियों में दर्द होने पर कोई प्रतिक्रिया नहीं देखी गई।

इंट्रासेरेब्रोवेंट्रीकुलर इंजेक्शन

जैसा कि ऊपर वर्णित है, चूहों के कुछ समूहों को इंट्रासेरेब्रोवेंट्रीकुलर इंजेक्शन दिया गया। संक्षेप में, इन चूहों को प्रोन पोजीशन में स्टीरियोटैक्टिक हेड फ्रेम में रखा गया था। इंजेक्शन साइट इस प्रकार स्थित थी: 1.00 मिमी मध्यपार्श्व,−0.3 मिमी ब्रेग्मा से आगे की ओर, और −2.5 मिमी पृष्ठीय-अधरीय गहराई। सर्जरी प्लस जीडीएनएफ समूह के चूहों को पिछले अध्ययनों [6, 26] में वर्णित अनुसार 3 ul फॉस्फेट-बफर सलाइन (पीबीएस) में 10 ug/kg पुनः संयोजक माउस जीडीएनएफ का इंट्रासेरेब्रोवेंट्रीकुलर इंजेक्शन दिया गया, और सर्जरी प्लस हीट-इनएक्टिवेटेड जीडीएनएफ समूह के चूहों को हीट-डिनेचर्ड (1000C पर 5 मिनट) जीडीएनएफ घोल का इंजेक्शन दिया गया। सर्जरी के बाद 0 घंटे, 24 घंटे, 48 घंटे और 72 घंटे पर सर्जरी के साथ-साथ C3ar विरोधी समूह के चूहों को 5% DMSO युक्त 3 ul PBS में 10 ug/kg SB290157 दिया गया। व्यायाम के साथ-साथ C3ar एगोनिस्ट और सर्जरी समूह के चूहों को SB290157 के समान ही 5% DMSO युक्त 3 ul PBS में 1 ug/kg C3ar एगोनिस्ट दिया गया। छठे प्रयोग के वैलेरिक एसिड समूह के चूहों को लगातार 4 दिनों तक 4 µl में 4 mg/kg वैलेरिक एसिड दिया गया।

व्यवहार परीक्षण

सीखने और स्मृति का मूल्यांकन नवीन वस्तु पहचान और बार्न्स भूलभुलैया परीक्षण द्वारा किया गया। सभी व्यवहार परीक्षण सुबह 10:00 बजे से शाम 5:00 बजे तक एक ध्वनि-पृथक कमरे में किए गए। सीखने और स्मृति परीक्षणों में इस्तेमाल किए गए चूहों का उपयोग इन परीक्षणों के प्रभावों से बचने के लिए किसी भी जैव रसायन विज्ञान अध्ययन के लिए नहीं किया गया था।

नवीन वस्तु पहचान परीक्षण

जैसा कि हमने और अन्य लोगों ने पहले बताया था [20, 49, 50], सर्जरी के 4 दिन बाद चूहों को आदत डालने के लिए 5 मिनट के लिए एक खुले मैदान के कक्ष में रखा गया था। परीक्षण निम्नलिखित तरीके से किया गया था। सीखने के दिन कक्ष के समीपवर्ती कोणों पर दो समान वस्तुएं रखी गईं। चूहों को वस्तुओं की ओर पीठ करके कक्ष में रखा गया और 5 मिनट तक कक्ष को स्वतंत्र रूप से तलाशने दिया गया। यदि दो वस्तुओं पर कुल अन्वेषण समय 1000 से अधिक था, तो जानवर को हटा दिया गया था।<5 s. One of the objects was replaced by a novel object 30 seconds or 24 hours later. The mouse was put into the chamber with their backs turned toward the objects and allowed to explore for 5 min. Animal behavior was recorded by ANY-maze behavioral tracking software (Stoelting Co., IL). Exploratory time of new (T2) and old (T1) objects within 5 min was recorded and the memorization ability of the mouse was quantified by discrimination index: DI = T2 / (T1 + T2). The DIs at 30 s and 24 hours after the training reflected the instant and long-term memory, respectively. The field was always provided with even light, and the objects and fields were cleaned with 70% ethanol after each test.

बार्न्स भूलभुलैया

सर्जरी के सात दिन बाद, जानवरों को उनके स्थानिक सीखने और स्मृति का परीक्षण करने के लिए बार्न्स भूलभुलैया के अधीन किया गया, जैसा कि हमने पहले वर्णित किया था [6, 49]। बार्न्स भूलभुलैया एक गोलाकार प्लेटफ़ॉर्म है जिसमें 20 समान रूप से दूरी वाले छेद हैं (एसडी इंस्ट्रूमेंट्स, सैन डिएगो, सीए)। छेदों में से एक को एक अंधेरे कक्ष से जोड़ा गया था जिसे लक्ष्य बॉक्स कहा जाता था। परीक्षण की शुरुआत जानवरों को बार्न्स भूलभुलैया के बीच में रखकर की गई। चूहों को इस बॉक्स को खोजने के लिए प्रोत्साहित करने के लिए प्लेटफ़ॉर्म पर डाले गए प्रतिकूल शोर (85 डीबी) और चमकदार रोशनी (200W) का इस्तेमाल किया गया। 4 दिनों के प्रशिक्षण के बाद, उनकी संदर्भ स्मृति का परीक्षण 5वें और 12वें दिन किया गया। 5वें दिन से 12वें दिन की अवधि के दौरान कोई परीक्षण नहीं किया गया। प्रत्येक परीक्षण के दौरान लक्ष्य बॉक्स में प्रवेश करने में विलंब को ANYMaze वीडियो ट्रैकिंग सिस्टम (एसडी इंस्ट्रूमेंट्स) द्वारा रिकॉर्ड किया गया था।

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