बैक्टीरियल बाहरी झिल्ली पुटिकाएं एराबिडोप्सिस में प्रतिरक्षा प्रणाली सक्रियण की ओर एक ट्रांसक्रिप्शनल बदलाव को प्रेरित करती हैं, जिससे प्लांटा में रोगज़नक़ वृद्धि का दमन होता है।

अमूर्त

ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया अपनी कोशिका परिधि पर गोलाकार ब्लब्स बनाते हैं, जो बाद में जीवाणु कोशिका दीवार से अलग होकर बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं का निर्माण करते हैं। ये नैनो-स्केल संरचनाएं, जिन्हें बाहरी झिल्ली पुटिकाओं (ओएमवी) के रूप में जाना जाता है, को संक्रमण और बीमारी को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है और स्तनपायी और पौधों दोनों में विशिष्ट प्रतिरक्षा आउटपुट उत्पन्न कर सकते हैं। ओएमवी के संपर्क में आने के बाद पौधों में होने वाले व्यापक ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तन को बेहतर ढंग से समझने के लिए, हमने ग्राम-नकारात्मक पौधे रोगजनक जीवाणु ज़ैंथोमोनस कैम्पेस्ट्रिस पीवी से शुद्ध किए गए ओएमवी के साथ अरेबिडोप्सिस थालियाना (अरेबिडोप्सिस) पौधों का इलाज किया। कैंपेस्ट्रिस और चुनौती के बाद 2, 6 और 24 घंटे में ओएमवी और मॉक-ट्रीटेड पौधों पर आरएनए-सीक्यू विश्लेषण किया। सबसे स्पष्ट ट्रांसक्रिप्शनल बदलाव परीक्षण किए गए पहले दो समय बिंदुओं पर हुआ, जैसा कि विभेदित रूप से व्यक्त जीन की संख्या और औसत गुना परिवर्तन से परिलक्षित होता है। ओएमवी विभिन्न प्रकार के प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स सहित प्रतिरक्षा-संबंधित मार्गों की एक बड़ी संख्या को अपग्रेड करते हुए, प्रतिरक्षा प्रणाली सक्रियण की दिशा में एक प्रमुख ट्रांसक्रिप्शनल बदलाव को प्रेरित करते हैं। एराबिडोप्सिस की प्रतिक्रिया की तुलना ओएमवी और शुद्ध एलिसिटर से करने पर पता चला कि ओएमवी जीन और पथों के एक समान सूट को एकल एलिसिटर के रूप में प्रेरित करता है, हालांकि, ओएमवी द्वारा सक्रिय पथ का पता लगाया गया था, न कि अन्य एलिसिटर द्वारा। ओएमवी के साथ एराबिडोप्सिस पौधों का पूर्व उपचार करने और बाद में उन्हें जीवाणु रोगज़नक़ से संक्रमित करने से रोगज़नक़ वृद्धि में महत्वपूर्ण कमी आई। प्लांट इलोंगेशन फैक्टर रिसेप्टर (ईएफआर), फ्लैगेलिन रिसेप्टर (एफएलएस2), या ब्रैसिनोस्टेरॉइड-असंवेदनशील 1-संबंधित किनेज़ (बीएके1) सह-रिसेप्टर में उत्परिवर्तन, ओएमवी के प्रतिरक्षा प्राइमिंग प्रभाव को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं करता है। साथ में इन परिणामों से पता चलता है कि ओएमवी एराबिडोप्सिस में एक व्यापक ट्रांसक्रिप्शनल बदलाव को प्रेरित करता है जिससे कई प्रतिरक्षा मार्गों का विनियमन होता है, और यह ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तन बैक्टीरिया संक्रमण के प्रतिरोध की सुविधा प्रदान कर सकता है।

कीवर्ड

एराबिडोप्सिस थालियाना, जीवाणु संक्रमण, बाह्यकोशिकीय पुटिकाएं, ओएमवी, बाहरी झिल्ली पुटिकाएं, पौधों की प्रतिरक्षा, आरएनए-सीक, ज़ैंथोमोनस कैम्पेस्ट्रिस पीवी। कैम्पेस्ट्रिस

पुरुषों के लिए सिस्टैंच के फायदे - प्रतिरक्षा प्रणाली को मजबूत करें

1 परिचय

पौधों को लगातार हानिकारक रोगाणुओं का सामना करना पड़ता है जो उनके ऊतकों पर पनपते हैं और सामान्य विकास में बाधा डालते हैं। एक कुशल रक्षा प्रतिक्रिया हमलावर सूक्ष्म जीव की तीव्र और सटीक पहचान और पहचान पर बहुत निर्भर करती है। इस उद्देश्य के लिए, पौधे रोगज़नक़ों के आक्रमण की निगरानी के लिए व्यापक निगरानी प्रणालियों का उपयोग करते हैं (कुक एट अल., 2015)। यह अनुमान लगाया गया है कि पौधे की निगरानी प्रणाली की पहली पंक्ति, या पहला सेलुलर इंटरफ़ेस जहां पौधे और सूक्ष्मजीव बातचीत करते हैं, अंतरकोशिकीय स्थान, एपोप्लास्ट है। वहां, हमलावर रोगाणुओं की पहचान झिल्ली-बद्ध, बाह्यकोशिकीय रूप से उजागर पैटर्न पहचान रिसेप्टर्स (पीआरआर) (बुट्रोट और जिपफेल, 2017; कूटो और जिपफेल, 2016) द्वारा की जाती है। पीआरआर माइक्रोबियल निर्धारकों को पहचानते हैं जो कई रोगाणुओं के बीच व्यापक रूप से मौजूद और संरक्षित होते हैं और इन्हें माइक्रोब- या रोगज़नक़-संबंधित आणविक पैटर्न (एमएएमपी) (रैनफ एट अल।, 2016) के रूप में जाना जाता है। चूंकि रोगाणुओं में तीव्र गति से उत्परिवर्तन होता है, इसलिए विकासवादी उपयोगी प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स को महत्वपूर्ण माइक्रोबियल घटकों के अत्यधिक संरक्षित क्षेत्रों का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जाता है जिन्हें गंभीर फिटनेस लागत के कारण आसानी से त्यागा या उत्परिवर्तित नहीं किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, बैक्टीरियल फ्लैगेलिन रोगजनकों सहित कई रोगाणुओं के शरीर विज्ञान में एक महत्वपूर्ण तत्व है, और वर्तमान में सबसे अच्छे अध्ययन किए गए एमएएमपी (फेलिक्स एट अल।, 1999; जिपफेल एट अल।, 2004) में से एक है। कॉग्नेट प्लांट इम्यून रिसेप्टर फ्लैगेलिन सेंसिंग 2 (FLS2) द्वारा फ्लैगेलिन, या सिंथेटिक एपिटोप flg22 (फ्लैगेलम बिल्डिंग ब्लॉक, फ्लैगेलिन के एन-टर्मिनस पर अत्यधिक संरक्षित 22 अमीनो एसिड से युक्त) की धारणा, एक प्रमुख ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तन की ओर ले जाती है। , इसके बाद एक प्रभावी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया होती है जो संक्रमण को रोकती है (चिंचिला एट अल., 2007; गोमेज़-गोमेज़ और बोलर, 2000)। कई ज्ञात एमएएमपी सूक्ष्म जीव की कोशिका दीवार से जुड़े हुए हैं। उदाहरण के लिए, फंगल चिटिन (फेसेल और ज़ुकेरो, 2016), बैक्टीरियल पेप्टिडोग्लाइकन (पीजी) (एर्ब्स एट अल., 2008; गस्ट एट अल., 2007), बैक्टीरियल लिपोपॉलीसेकेराइड्स (एलपीएस) (डॉव एट अल., 2000; सिलिपो एट अल) ., 2005), फ़्लैगेलिन (बुट्रोट और जिपफेल, 2017; फ़ेलिक्स एट अल., 1999), और बहुत कुछ। फिर भी, यह बिल्कुल स्पष्ट नहीं है कि ये कोशिका-दीवार से जुड़े घटक प्लांटा में अपने संज्ञानात्मक प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स के साथ कैसे बातचीत करते हैं। क्या यह कोशिका मृत्यु और/या कोशिका दीवार के क्षरण के कारण होता है, या फ्लैगेलम जैसे घटकों की सक्रिय रिहाई के कारण होता है, यह आगे की जांच की आवश्यकता वाला विषय है (बहार, 2020)।

ग्राम-नेगेटिव बैक्टीरिया द्वारा कोशिका-दीवार के टुकड़ों की सक्रिय रिहाई का एक उदाहरण बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं (ईवी) का पृथक्करण है जो बाहरी झिल्ली से आसपास के वातावरण में फुसफुसाता और चुटकी बजाता है (कुलप और कुहेन 2010; थेरी एट अल।, 2018) ). इन जीवाणु ईवी को आमतौर पर बाहरी झिल्ली पुटिका (ओएमवी) कहा जाता है, और हम अब से इस नामकरण (श्वेचाइमर और कुएन, 2015) का पालन करेंगे। ओएमवी रिलीज की प्रक्रिया लगातार और विभिन्न पर्यावरणीय परिस्थितियों में होती है, जिसमें मेजबान उपनिवेशीकरण (गुरुंग एट अल., 2011; इओनेस्कु एट अल., 2014; जिन एट अल., 2011) शामिल है। बाहरी झिल्ली (ओएम) प्रोटीन, एलपीएस और लिपिड जैसे अभिन्न बाहरी झिल्ली अणुओं के अलावा, ओएमवी पेरिप्लास्मिक तरल पदार्थों को घेरता है, जिसमें प्रोटीन, कोशिका दीवार को नष्ट करने वाले एंजाइम, पॉलीसेकेराइड और न्यूक्लिक एसिड (कुहेन और) जैसे अणुओं की एक विविध श्रृंखला शामिल होती है। केस्टी, 2005)। चूंकि ओएमवी मेजबान उपनिवेशण के दौरान जारी किए जाते हैं, और चूंकि उनके कार्गो में एमएएमपी होते हैं, इसलिए यह अनुमान लगाना आकर्षक है कि वे प्रतिरक्षा एलिसिटर के वाहक के रूप में कार्य करते हैं जो कि उनके संज्ञानात्मक प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स (बहार, 2020; कात्सिर और बहार) के करीब अणुओं को वितरित करते हैं। 2017). वास्तव में, जब ओएमवी को उनके मेज़बानों के सामने प्रस्तुत किया जाता है तो वे स्तनधारी और पौधे दोनों की प्रतिरक्षा प्रणाली को प्रेरित करते हैं (बहार एट अल., 2016; एलिस एंड कुहेन, 2010; जांडा एट अल., 2021; मैकमिलन एट अल., 2021)। जबकि स्तनधारी कोशिकाओं में ओएमवी के एलपीएस और प्रोटीन दोनों घटक प्रतिरक्षा एलिसिटर (एलिस एट अल।, 2010) के रूप में कार्य करते हैं, पौधों में, यह अभी तक स्पष्ट नहीं है कि कौन से ओएमवी अणु प्रमुख प्रतिरक्षा एलिसिटर हैं।

मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को संशोधित करने के अलावा, ओएमवी को विषैले कारकों को ले जाने और कई प्रक्रियाओं में शामिल होने के लिए भी दिखाया गया था। इसमें कोशिका-कोशिका संचार (डेथेरेजिया और कुकसोना, 2012; मैशबर्न और व्हाइटली, 2005; रैपोसो और स्टाल, 2019), लक्षित कोशिकाओं तक विषाक्त पदार्थों की डिलीवरी (एलिस और कुहेन, 2010; कडुरुगामुवा और बेवरिज, 1996), बायोफिल्म निर्माण (स्कूली शिक्षा) शामिल हैं। और बेवरिज, 2006), रोगाणुरोधी यौगिकों का शमन (मैनिंग और कुह्न, 2011), तनाव की प्रतिक्रिया (मैकडोनाल्ड और कुह्न, 2013), क्षैतिज जीन स्थानांतरण (फुलसुंदर एट अल।, 2014; वेलिमीरोव और रैनफ्टलर, 2018) और विषाणु (एलिस) और कुह्न, 2010; कुन्समैन एट अल., 2015)। जबकि इनमें से अधिकांश उदाहरण स्तनधारी जीवाणु रोगजनकों के अध्ययन से आते हैं, पादप रोगजनक जीवाणुओं के साथ हाल के अध्ययन भी इस बात का समर्थन करते हैं कि ओएमवी जीवाणु विषाणु और पादप उपनिवेशण को बढ़ावा देते हैं। इओनेस्कु एट अल. (आयनेस्कु एट अल., 2014) से पता चला कि जाइलम वाहिका उपनिवेशण के दौरान पौधे के रोगज़नक़ जाइलेला फास्टिडिओसा द्वारा ओएमवी उत्पादन पौधे के जल-संवाहक तत्वों (जाइलम) के लिए बैक्टीरिया के लगाव को रोकता है, जिससे सेसाइल और मोबाइल रूपों के बीच संतुलन बिगड़ जाता है। गतिशील रूप की ओर रोगज़नक़। ऐसा माना जाता है कि यह रूप जाइलम में कोशिका फैलाव को बढ़ावा देता है, जिससे पौधे की तेजी से गिरावट होती है (इओनेस्कु एट अल., 2014)। दो अन्य अध्ययनों से पता चला है कि विषाणु कारक जैसे कि टाइप II-स्रावित लाइपेस/एस्टरेज़ और जाइलानेज़, और टाइप III-स्रावित प्रभावकारक, ओएमवी के सहयोग से स्रावित होते हैं (चौधरी और जगन्नाधम, 2013; सिधू एट अल., 2008; सोले एट अल) ., 2015) यह सुझाव देता है कि जीवाणु विषाणु में ओएमवी की महत्वपूर्ण भूमिका हो सकती है। ओएमवी की आणविक जटिलता, मेजबान में इसके दोहरे और संभवतः विरोधी कार्यों (प्रतिरक्षा को प्रेरित करना और विषाणु को बढ़ावा देना) के साथ, हमें ओएमवी चुनौती के लिए अरेबिडोप्सिस थालियाना (अरबीडोप्सिस) पौधों की व्यापक ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया का अध्ययन करने और यह परीक्षण करने के लिए प्रेरित करती है कि क्या यह ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तन है बाद के जीवाणु संक्रमण के प्रति प्रतिरोध या संवेदनशीलता उत्पन्न करेगा।

2। सामग्री और विधि

2.1 पौधों की सामग्री और विकास की स्थितियाँ

इस अध्ययन में एराबिडोप्सिस थालियाना (अरबीडोप्सिस) जंगली-प्रकार की कोल -0 लाइन के साथ-साथ निम्नलिखित उत्परिवर्ती लाइनें: बाक- (स्लेसिंगर एट अल., 2011) और फ़ॉल्स एवर (नेक्रासोव एट अल., 2009) का उपयोग किया गया था। जैसा कि वर्णित है (बहार एट अल., 2016)। प्लेटों को 2-4 दिनों के लिए 4◦C पर अंधेरे में रखा गया और फिर 5-8 दिनों के लिए अंकुरण के लिए 22◦C पर ले जाया गया। समान आकार के अंकुरित अंकुरों को 1% (w:v) सुक्रोज (डुचेफा बायोकेमी) के साथ एमएस माध्यम के 1 मिलीलीटर युक्त वेल प्लेटों (प्रति कुएं में दो अंकुर) में स्थानांतरित किया गया और अगले 8-10 दिनों के लिए उगाया गया। एलिसिटर के साथ चुनौती देने से पहले वही स्थितियाँ नीचे वर्णित हैं। प्राइमिंग परीक्षण के लिए, एराबिडोप्सिस जंगली प्रकार कोल -0 लाइन और उत्परिवर्ती लाइनों (हमेशा और पीछे गिरता है) के बीजों को ऊपर वर्णित अनुसार अंकुरित किया गया और फिर मिश्रण युक्त 7 × 7 × 6 सेमी के बर्तन (1 अंकुर / पॉट) में प्रत्यारोपित किया गया। मिट्टी हरी #7611 (इवेनरी, अशदोद, इज़राइल) और 22-24˚C पर 9.5 घंटे फोटोपीरियड में उगाई गई। पौधे थे

2.2 जीवाणु बाहरी झिल्ली पुटिकाओं का शुद्धिकरण

ज़ैंथोमोनस कैम्पेस्ट्रिस पीवी के ग्लिसरॉल स्टॉक। कैम्पेस्ट्रिस (एक्ससीसी) 33913 को न्यूट्रिएंट एगर (डिफ्को, एनए, बेक्टन, डिकिंसन और कंपनी) प्लेटों पर डाला गया और 28˚C पर 2-5 दिनों के लिए उगाया गया। एकल कालोनियों को एकत्र किया गया और 10 यूजी/एमएल सेफैलेक्सिन हाइड्रेट (सीपी, सिग्मा-एल्ड्रिच) युक्त 3-एमएल वाईईबी (खमीर निकालने वाला शोरबा) स्टार्टर का टीका लगाने के लिए उपयोग किया गया। स्टार्टर्स को रात भर 28◦C पर 185-2{17}}0 आरपीएम झटकों के साथ उगाया गया और फिर 500 मिलीलीटर पीएसबी (पेप्टोन सुक्रोज शोरबा) माध्यम को एंटीबायोटिक दवाओं (जैसा कि ऊपर वर्णित है) के साथ 2-एल फ्लास्क में टीका लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया। ∼1:1000 (v:v) के अनुपात पर। जैसा कि ऊपर बताया गया है, कल्चर को 0.6-0.8 के OD600 तक उगाया गया और फिर बैक्टीरिया कोशिकाओं को नीचे घुमाया गया और वर्णित के अनुसार सतह पर तैरनेवाला से OMV निकाला गया (मोर्दुखोविच और बहार, 2017)। क्रूड ओएमवी तैयारी को शुद्ध ओएमवी प्राप्त करने के लिए ऑप्टिप्रेप ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन के अधीन किया गया था, जैसा कि वर्णित है (बहार एट अल।, 2016; मोर्दुखोविच और बहार, 2017)। प्रत्येक ओएमवी बैच को 1.{23}}एल बैक्टीरिया कल्चर से शुद्ध किया गया था और अंत में पीबीएस के 1 मिलीलीटर (पीएच 7.3) में फिर से निलंबित कर दिया गया था। शुद्ध किए गए ओएमवी का तुरंत उपयोग किया गया या उपयोग से 7 दिन पहले तक 4◦C पर संग्रहीत किया गया। ओएमवी आकार वितरण को एक गतिशील प्रकाश बिखरने वाले उपकरण (ज़ेटासाइज़र नैनो जेडएस, मालवर्न पैनालिटिकल, वॉर्सेस्टरशायर, यूके) का उपयोग करके मापा गया था और इसका औसत व्यास 121.7 ± 55.43 एनएम (एसडी) था। कण सांद्रता को इसी तरह मापा गया था और नीचे प्रत्येक प्रयोग विवरण में प्रदान किया गया है।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

2.3 ओएमवी के साथ एराबिडोप्सिस अंकुर चुनौती

ओएमवी चुनौती के प्रति एराबिडोप्सिस की ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए, जैसा कि ऊपर बताया गया है, {{1}वेल प्लेटों में उगाए गए कोल{0}} पौधों का उपयोग किया गया था। ओएमवी चुनौती से एक दिन पहले, एमएस माध्यम को प्लेटों से हटा दिया गया था और 250 यूएल बाँझ डीएच2ओ के साथ बदल दिया गया था, और प्लेटों को रात भर बेंच पर छोड़ दिया गया था। अगली सुबह, शुद्ध ओएमवी के 20 उल (प्रति कुएं 1.44 × 109 कणों के अनुरूप 30 यूजी प्रति मिलीलीटर), या मॉक के रूप में बाँझ डीएच 2 ओ, प्रत्येक कुएं में जोड़े गए थे। चुनौती के बाद 2, 6, और 24 घंटे में अंकुर एकत्र किए गए, कागज पर सुखाए गए, और 2- एमएल एपेंडॉर्फ सेफ-लॉक ट्यूब (हैम्बर्ग, जर्मनी) में तरल नाइट्रोजन के साथ स्नैप-फ्रोजन किया गया। प्रत्येक समय बिंदु पर, चार ओएमवी-उपचारित और चार मॉक-उपचारित कुएं एकत्र किए गए, जो प्रत्येक समय बिंदु पर प्रत्येक उपचार के लिए चार जैविक प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करते थे।

2.4 आरएनए शुद्धि

निर्माता के निर्देशों के अनुसार ट्राईज़ोल अभिकर्मक (इनविट्रोजन) का उपयोग करके आरएनए को अरेबिडोप्सिस अंकुरों से निकाला गया था। निर्माता के निर्देशों के अनुसार टर्बो डीएनए-मुक्त किट (एम्बियन, थर्मो फिशर साइंटिफिक), और आरएनए क्लीन-अप और कंसंट्रेशन किट (नॉर्गेन बायोटेक) का उपयोग करके आरएनए को और अधिक शुद्ध किया गया। शुद्ध किए गए आरएनए नमूनों को टेपस्टेशन 2200 मशीन (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज), आरएनए स्क्रीन टेप और आरएनए स्क्रीन का उपयोग करके एकाग्रता और गुणवत्ता विश्लेषण के अधीन किया गया था।

2.5 आरएनए पुस्तकालय निर्माण और अनुक्रमण

प्रत्येक उपचार और समय बिंदु के लिए, उच्चतम शुद्धता दिखाने वाले दो नमूनों को विश्लेषण के लिए चुना गया था। पॉलीए कैप्चर के साथ ट्रूसेक एमआरएनए लाइब्रेरी (इलुमिना) को वीज़मैन इंस्टीट्यूट ऑफ साइंस (रेहोवोट, इज़राइल) के क्राउन इंस्टीट्यूट ऑफ जीनोमिक्स में चयनित आरएनए नमूनों से तैयार किया गया था। प्रत्येक नमूने को टैग किया गया और नमूनों से एक पूल तैयार किया गया। फिर इस पूल को दो एनजीएस लेन के अंदर लोड किया गया, और इलुमिना हाईसेक सीक्वेंसिंग मशीन में हाई आउटपुट रन मोड, सिंगल रीड (एसआर) 60 (v4) पर चलाया गया।

2.6 अनुक्रमण प्रारंभिक प्रसंस्करण को पढ़ता है

The raw sequence reads were cleaned with Trimmomatic software v 0.36 (Bolger et al., 2014), removing low-quality reads and remaining adapter sequences. The clean reads were mapped to the reference Arabidopsis TAIR10 reference genome (Lamesch et al., 2012) using bowtie2 (Langmead & Salzberg, 2012) and quantification of gene expression was done using RSEM (Li & Dewey 2011). Principal component analysis and sample correlation matrix were calculated with the function cor() and pre-comp (), respectively, of the R base package version 3.6.1. DEGs were determined using the DESeq2 tool (Love et al., 2014). The FDR (false discovery rate) cutoff chosen was FDR < 0.05. The LogFC (Log of the fold change) cutoff for the up-regulated and the downregulated genes, was > 

2.7 जीन ऑन्टोलॉजी और जीन विवरण 

टीएआईआर के जीओ एनोटेशन (//www.arabidopsis.org/tools/bulk/go/index.jsp) का उपयोग करके जीन ओन्टोलॉजी (जीओ) को पुनः प्राप्त किया गया। जीन मॉडल के अनुसार जीन विवरण, टीएआईआर की जीन विवरण खोज (//www.arabidopsis. org/tools/bulk/genes/) का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे। संदर्भ के रूप में अरेबिडोप्सिस जीनोम लोकस (TAIR10) का उपयोग करके एग्रीजीओ वेब टूल (http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/index.php) का उपयोग करके जीओ संवर्धन की गणना की गई थी।

2.8 मात्रात्मक-पीसीआर और आरएनए-सीक्यू सत्यापन

आरएनए-सीक्यू डेटा को मान्य करने के लिए, सीडीएनए संश्लेषण के लिए मॉक- और ओएमवी-चुनौती वाले अंकुरों के आरएनए नमूनों का उपयोग किया गया था, इसके बाद जीन-विशिष्ट प्राइमरों (सप्लीमेंट टेबल एस 4) का उपयोग करके मात्रात्मक-पीसीआर (क्यूपीसीआर) किया गया था, जैसा कि वर्णित है (बहार एट अल)। , 2016). कुल मिलाकर, आरएनए-सीक्यू डेटासेट से 17 डीईजी का परीक्षण किया गया, जिसमें ओएमवी के आरएनए के चार जैविक प्रतिकृति या नकली-उपचारित पौधों का उपयोग किया गया। परीक्षण किए गए जीन की सापेक्ष अभिव्यक्ति की तुलना 7500 फास्ट रियल-टाइम पीसीआर मशीन (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) का उपयोग करके यूबिकिटिन अभिव्यक्ति के साथ की गई थी, जैसा कि वर्णित है (बहार एट अल।, 2016)।

2.9 एमएएमपी और ओएमवी से एराबिडोप्सिस ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया की तुलना करना 

हमारे ओएमवी-प्रेरित डेटासेट की तुलना एफएलजी22, (डेनौक्स एट अल., 2008) एल्फ26 (जिपफेल एट अल., 2006), पीजीएन (विलमैन एट अल., 2011), ओजी (डेविडसन एट अल.) से चुनौती प्राप्त एराबिडोप्सिस के उपलब्ध ट्रांसक्रिप्टोम के साथ की गई थी। , 2017) और एलपीएस (लिवाजा एट अल., 2008)। डेटा तुलना के लिए, जीओ शर्तों का संवर्धन किया गया था और प्रेरित जीओ को ऊपर वर्णित अनुसार वेन आरेखों द्वारा देखा गया था।

2.10 अरेबिडोप्सिस प्राइमिंग प्रयोग

स्यूडोमोनास सिरिंज पीवी से संक्रमित एराबिडोप्सिस पर एक्ससीसी ओएमवी के प्राइमिंग प्रभाव का परीक्षण करने के लिए। टमाटर DC3000 (Pst), हमने जिपफेल एट अल द्वारा वर्णित प्रक्रिया का पालन किया। (2004)। संक्षेप में, जैसा कि ऊपर वर्णित है, 6-8 सप्ताह पुराने एराबिडोप्सिस पौधों की पत्तियों में 50-100 यूएल शुद्ध एक्ससीसी ओएमवी (30 यूजी/एमएल, 3 के अनुरूप) के साथ घुसपैठ की गई थी। प्रति पत्ती), 1 μM flg22, या सुई रहित सिरिंज का उपयोग करके पानी। प्रत्येक उपचार के लिए, 5 पत्तियों/पौधे और तीन पौधों की प्रतिकृतियों का उपयोग किया गया। पीएसटी इनोकुलम किंग्स बी मीडियम प्लेटों (20 ग्राम/लीटर पेप्टोन, 1.5 ग्राम/लीटर एमजीएसओ4 x7H2O, 10 मिली/लीटर ग्लिसरॉल, और 15 ग्राम/लीटर अगर) पर 2-3 दिनों के लिए 28˚C पर जीवाणु संवर्धन करके तैयार किया गया था। और फिर पानी के साथ कालोनियों को फिर से निलंबित करना और इनोकुलम एकाग्रता को 105 सीएफयू/एमएल पर समायोजित करना। पीएसटी इनोकुलम को सुई-रहित सिरिंज का उपयोग करके, प्राइमिंग के 24 घंटे बाद प्राइमेड पत्तियों में घुसपैठ किया गया था (लगभग 100 उल प्रत्येक पत्ती में घुसपैठ किया गया था)। बैक्टीरिया की वृद्धि 0 (टीका लगाने के 1 घंटे बाद) और टीकाकरण के 2 दिन बाद (डीपीआई) पर टीकाकृत पत्तियों को इकट्ठा करके और वजन करके, उन्हें 10 मिमी एमजीसीएल 2 के 1 मिलीलीटर में मैकराइज करके और किंग्स पर 10- गुना क्रमिक तनुकरण चढ़ाकर निर्धारित किया गया था। बी आगर प्लेटें. प्रत्येक प्लेट पर सीएफयू की संख्या 2 दिन बाद निर्धारित की गई और प्रति ग्राम पत्ती की गणना की गई।

चित्र 1 चुनौती के बाद 2, 6 और 24 पर ओएमवी के लिए एराबिडोप्सिस ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया। चुनौती के बाद 2, 6 और 24 घंटों में एराबिडोप्सिस अंकुरों के प्रमुख घटक विश्लेषण (ए) और नमूना सहसंबंध मैट्रिक्स (बी) ओएमवी, या नकली पर ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया

2.11 इन विट्रो बैक्टीरियल ग्रोथ एसेज़ 

इन विट्रो में पीएसटी वृद्धि पर शुद्ध एक्ससीसी ओएमवी के प्रभाव का आकलन करने के लिए, पीएसटीस्टार्टर्स को किंग्स बी तरल माध्यम में 24 घंटे के लिए 28˚C पर उगाया गया और फिर तीन अलग-अलग संस्कृतियों को टीका लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया, जिसमें प्रत्येक में किंग्स बी माध्यम के 12 मिलीलीटर शामिल थे, {{3 }}एमएल फाल्कन ट्यूब 1:100 के अनुपात में। बैक्टीरियल संस्कृतियों को नियंत्रण के रूप में 30 यूजी/एमएल ओएमवी (1:50 या 1:100, क्रमशः 1.44 × 109 या 7.2 × 108 कण प्रति एमएल के अनुरूप) या पीबीएस के साथ संशोधित किया गया था, और 28˚C पर 20 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया था। 22 घंटे में 600 एनएम के ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (एमर्सहम बायोसाइंसेज) का उपयोग करके बैक्टीरिया की वृद्धि को मापा गया था।

3। परिणाम

3.1 आरएनए-सीक्यू विश्लेषण से ओएमवी चुनौती के जवाब में भिन्न रूप से व्यक्त एराबिडोप्सिस जीन के एक बड़े समूह का पता चलता है

ओएमवी चुनौती के बाद एराबिडोप्सिस में ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए, हमने जीवाणु रोगज़नक़ ज़ैंथोमोनस कैम्पेस्ट्रिस पीवी से शुद्ध किए गए ओएमवी के साथ एराबिडोप्सिस अंकुरों का इलाज किया। कैम्पेस्ट्रिस 33913 (एक्ससीसी) और चुनौती के बाद 2, 6 और 24 घंटों में प्लांट आरएनए एकत्रित किया गया (एचपीसी)। ओएमवी- और मॉक-ट्रीटेड नमूनों से आरएनए को सामग्री और विधियों में वर्णित अनुसार अनुक्रमित और विश्लेषण किया गया था। प्रधान सहसंबंध (चित्रा 1ए) और नमूना सहसंबंध मैट्रिक्स विश्लेषण (चित्रा 1बी) से पता चलता है कि प्रत्येक उपचार क्लस्टर में जैविक प्रतिकृति एक साथ निकटता से होती है, जो जैविक प्रतिकृति के बीच समग्र ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया समानता का संकेत है। ओएमवी ने 2 और 6 एचपीसी क्लस्टर पर एक साथ नमूनों का इलाज किया, यह दर्शाता है कि नमूना समय (चित्रा 1 बी) की तुलना में ओएमवी उपचार का ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया पर अधिक प्रभाव पड़ा। दूसरी ओर, ओएमवी ने 24 एचपीसी पर अपने संबंधित मॉक उपचार के साथ नमूनों के क्लस्टर का इलाज किया, यह दर्शाता है कि इस समय ओएमवी द्वारा प्रेरित ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तन कम हो गया था और मॉक-ट्रीटेड पौधों के समान था।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

परीक्षण किए गए प्रत्येक समय बिंदु पर, ओएमवी-उपचारित पौधों की तुलना नकली-उपचारित पौधों से की गई और विभेदित रूप से व्यक्त जीन (डीईजी) निकाले गए। संयुक्त रूप से सभी समय बिंदुओं पर, कुल 984 और 175 जीन महत्वपूर्ण रूप से पाए गए (लॉग फोल्ड परिवर्तन > 1 या ← 1, पी मान और एफडीआर <{6}}.05) क्रमशः ऊपर या नीचे-विनियमित, ओएमवी चुनौती के जवाब में (चित्र 2ए; अनुपूरक तालिका एस1)। जीन अभिव्यक्ति लॉग फोल्ड-चेंज (लॉगएफसी) अधिकतम 9.08 (एटी1जी26410, 6 एचपीसी) तक होती है, जो कि 500-फोल्ड परिवर्तन से लेकर -5.73 (एटी3जी17520, 24 एचपीसी) से मेल खाती है। डीईजी की सबसे अधिक संख्या 2 और 6 एचपीसी पर पाई गई, जहां क्रमशः कुल 647 और 876 डीईजी की पहचान की गई (ऊपर और नीचे-विनियमित संयुक्त)। 24 एचपीसी पर, 121 डीईजी पाए गए। ओएमवी चुनौती के बाद 2 और 6 घंटे में 50% से अधिक अप-विनियमित जीन उनके बीच साझा किए गए थे (चित्र 2बी)। अस्थायी जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन की जांच करने के लिए, हमने सभी अप-विनियमित डीईजी निकाले जो सभी समय बिंदुओं (37 जीन) पर पाए गए और समय के साथ उनके गुना-परिवर्तन की तुलना की (चित्र 2सी)। इन जीनों की गुना-परिवर्तन अभिव्यक्ति अलग-अलग समय बिंदुओं (एकतरफ़ा एनोवा; F2, 108=8.1633, p=0.0005) के बीच काफी भिन्न थी। तुकी क्रेमर एचएसडी परीक्षण का उपयोग करते हुए एक पोस्ट हॉक तुलना से संकेत मिलता है कि लॉगएफसी 2 (एम=3.45, एसडी=1.72) और 6 एचपीसी (एम=3.87, एसडी) दोनों पर है।=1.98) 24 एचपीसी (एम=2.32, एसडी=1.31) (पी=0.0145 और पी {{65%) की तुलना में काफी अधिक था। .0005, क्रमशः) (चित्रा 2डी)। जबकि 6 एचपीसी पर औसत लॉगएफसी अभिव्यक्ति 2 एचपीसी से अधिक थी, यह सांख्यिकीय रूप से भिन्न नहीं थी (पी=0.5413)। इसलिए, परीक्षण किए गए तीन समय बिंदुओं पर डीईजी की संख्या और समग्र जीन लॉगएफसी पर विचार करते समय, हम यह निष्कर्ष निकाल सकते हैं कि सबसे महत्वपूर्ण ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तन ओएमवी चुनौती के बाद 2 और 6 घंटे में हुआ। आरएनए-सीक्यू परिणामों की वैधता की जांच करने के लिए, विशिष्ट प्राइमरों के साथ मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) का उपयोग करके 17 अप-विनियमित जीन की अभिव्यक्ति निर्धारित की गई थी। परीक्षण किए गए जीनों में से चौदह ने आरएनए-सीक्यू विश्लेषण के समान पैटर्न प्रदर्शित किया और मॉक की तुलना में उन्हें काफी हद तक विनियमित किया गया। परीक्षण किए गए जीनों में से तीन में उच्च सापेक्ष अभिव्यक्ति थी लेकिन इस विधि द्वारा नकली से काफी भिन्न नहीं थे (पूरक चित्र S1)।

चित्र 2 ओएमवी चुनौती के जवाब में एराबिडोप्सिस ने अलग-अलग जीन व्यक्त किए। (ए) विभेदित रूप से व्यक्त जीन (डीईजी) की कुल संख्या (ऊपर या नीचे-विनियमित, लॉगएफसी> 1 या ← 1, पी-वैल्यू और एफडीआर < 0। 05) 2 पर, चुनौती के बाद 6, और 24 घंटे। (बी) विभिन्न समय बिंदुओं पर डीईजी के बीच ओवरलैप (बाएं, ऊपर-विनियमित; दाएं, नीचे-विनियमित)। (सी) सभी तीन-समय बिंदुओं में पाए गए अप-विनियमित जीन को लॉगएफसी अभिव्यक्ति ग्राफ पर प्लॉट किया गया था, जो समय के साथ जीन अभिव्यक्ति दिखाता है। (डी) विभिन्न समय बिंदुओं पर सभी डीईजी का लॉगएफसी औसत। तुकी-क्रेमर एचएसडी परीक्षण द्वारा विभिन्न अक्षर p <0.05 पर सांख्यिकीय अंतर दर्शाते हैं

3.2 एराबिडोप्सिस प्रतिरक्षा प्रणाली की सक्रियता की दिशा में एक ट्रांसक्रिप्शनल बदलाव के साथ ओएमवी पर प्रतिक्रिया करता है

ओएमवी चुनौती से महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित अरेबिडोप्सिस मार्गों की पहचान करने के लिए, हमने एग्रीजीओ वेब टूल (डु एट अल., 2010; तियान एट अल., 2017) का उपयोग किया। हमने ओएमवी चुनौती के जवाब में संयुक्त रूप से सभी समय बिंदुओं पर क्रमशः 333 और 55 महत्वपूर्ण (एफडीआर <0.05) अप- और डाउन-रेगुलेटेड जीन ऑन्टोलॉजी (जीओ) शब्दों की पहचान की। लगभग 25% अप-विनियमित जीओ उत्तेजना के प्रति पौधों की प्रतिक्रिया से संबंधित थे (चित्र 3ए)। 'उत्तेजना की प्रतिक्रिया' श्रेणी के भीतर, सबसे प्रमुख जीओ शब्द तनाव प्रतिक्रिया, जैविक उत्तेजना, रसायनों और अंतर्जात उत्तेजना (चित्रा 3 बी; पूरक तालिका एस 2) से जुड़े थे। एग्रीगो टूल ने 'ट्रांसफरेज़ गतिविधि', काइनेज गतिविधि', 'प्रतिलेखन कारक गतिविधि', 'आयन और धातु आयन बाइंडिंग', 'कार्बोहाइड्रेट बाइंडिंग', 'प्रोटीन बाइंडिंग', 'कैटेलिटिक गतिविधि' सहित 103 महत्वपूर्ण रूप से अप-विनियमित आणविक कार्यों की भी पहचान की। , 'एडेनिल न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग', 'ट्रांसमेम्ब्रेन रिसेप्टर गतिविधि' और अधिक बाइंडिंग फ़ंक्शन (पूरक तालिका S2)। महत्वपूर्ण शब्दों का सेलुलर स्थान नाभिक, रिक्तिका और एंडोमेम्ब्रेन प्रणाली सहित कोशिका के विभिन्न डिब्बों में था, लेकिन सबसे उल्लेखनीय रूप से कोशिका परिधि से जुड़ा था और इसमें 'प्लाज्मा झिल्ली', 'बाह्यकोशिकीय क्षेत्र', 'कोशिका दीवार' और शामिल थे। 'एपोप्लास्ट' ऑन्टोलॉजी (पूरक तालिका S2)। दूसरी ओर, महत्वपूर्ण रूप से कम विनियमित जीओ में 'विष अपचय और चयापचय प्रक्रिया', 'पानी और पानी की कमी पर प्रतिक्रिया', 'लिपिड परिवहन और स्थानीयकरण', और अन्य (सप्लीमेंट टेबल एस 2) शब्द शामिल थे। जैविक उत्तेजना की प्रतिक्रिया से संबंधित जीओ को डाउन-रेगुलेटेड जीन में समृद्ध नहीं किया गया था। उल्लेखनीय रूप से डाउन-रेगुलेटेड आणविक कार्यों में कई रेडॉक्स शब्द शामिल हैं जैसे 'ऑक्सीडोरडक्टेज़ गतिविधि', 'हीम बाइंडिंग', 'आयरन आयन बाइंडिंग', 'लिपिड बाइंडिंग', 'ऑक्सीजन बाइंडिंग', और अधिक ऑक्सीजन-संबंधी फ़ंक्शन (सप्लीमेंट टेबल S2) . डाउन-रेगुलेटेड शब्द भी बाह्यकोशिकीय क्षेत्र में स्थित थे। यह निर्धारित करने के लिए कि उच्चतम अभिव्यक्ति वाले डीईजी किस जीओ शब्द से संबंधित हैं, हमने जीन का चयन करके मूल डीईजी सूची को फ़िल्टर किया, जिसमें लॉगएफसी 4 से अधिक था, या -4 से छोटा था (16- गुना अंतर के अनुरूप) . हमने 117 जीनों की पहचान की जो इन मानदंडों को पूरा करते थे, जिनमें से 115 को सभी समय बिंदुओं पर संयुक्त रूप से अप-विनियमित और 2 को डाउन-विनियमित किया गया था। -4 से कम लॉगएफसी के साथ डाउन रेगुलेटेड जीन की कम संख्या के कारण, कोई महत्वपूर्ण रूप से दमित जीओ की पहचान नहीं की गई। दूसरी ओर, 72 महत्वपूर्ण रूप से अप-विनियमित जीओ की पहचान की गई, जिनमें से सबसे महत्वपूर्ण 'बाहरी जैविक उत्तेजना की प्रतिक्रिया', 'अन्य जीवों की प्रतिक्रिया', 'ऑक्सीजन स्तर पर सेलुलर प्रतिक्रिया', 'रक्षा प्रतिक्रिया' से संबंधित हैं। , 'तनाव पर प्रतिक्रिया' और अधिक प्रतिरक्षा-संबंधित जीओ (चित्रा 3सी)।

चित्र 3 एक्ससीसी ओएमवी चुनौती के जवाब में एराबिडोप्सिस जीन ऑन्टोलॉजी (जीओ) शब्द समृद्ध हुए। अप-विनियमित जैविक प्रक्रिया (ए) और उत्तेजना की प्रतिक्रिया (बी) जीओ शर्तों में श्रेणी वितरण का पाई चार्ट प्रतिनिधित्व। (सी) ओएमवी चुनौती के जवाब में >4 के लॉगएफसी के साथ एराबिडोप्सिस जीन की सूची। जीन को डीईजी के संपूर्ण डेटासेट से फ़िल्टर किया गया था और एग्रीगो वेबटूल का उपयोग करके समृद्ध जीओ शब्दों की पहचान करने के लिए उपयोग किया गया था। एफडीआर कटऑफ <0.05

3.2 ओएमवी चुनौती से प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स का विनियमन हुआ

एमएएमपी सेंसिंग और एमएएमपी के प्रति पौधों की प्रतिक्रिया काफी हद तक झिल्ली-बद्ध पीआरआर द्वारा मध्यस्थ होती है जो रोगज़नक़ धारणा और संक्रमण के कुशल शमन में मध्यस्थता करती है। पीआरआर को आमतौर पर दो समूहों रिसेप्टर किनेसेस (आरके) और रिसेप्टर-जैसे प्रोटीन (आरएलपी) (बुट्रोट और जिपफेल, 2017) में वर्गीकृत किया जाता है। ओएमवी के जवाब में अलग-अलग व्यक्त किए गए पीआरआर की पहचान करने के लिए, हमने अपने डीईजी सेट की तुलना अरेबिडोप्सिस आरके (केमरलिंग एट अल।, 2011; मॉट एट अल।, 2016) और आरएलपी (वांग एट अल।, 2008) की पहले से स्थापित सूचियों के साथ की। हमने अपने डेटासेट में सभी समय बिंदुओं पर संयुक्त रूप से क्रमशः 33 और 10 अप-विनियमित आरके और आरएलपी की पहचान की है (तालिका 1)। 175 डाउन-रेगुलेटेड जीनों की हमारी सूची में कोई आरके या आरएलपी नहीं पाया गया। केमरलिंग एट अल. (2011) ने 49 आरके की एक सूची को परिभाषित किया, जिनकी अभिव्यक्ति एफएलजी22 और एनएलपी (नेक्रोसिस और एथिलीन-उत्प्रेरण पेप्टाइड {{16%) जैसे प्रोटीन), या रोगज़नक़ उपचार जैसे एमएएमपी द्वारा महत्वपूर्ण रूप से प्रेरित थी। हमने इस सूची की तुलना अपने प्रयोग से अप-विनियमित आरएलके के साथ की और पाया कि 45% आरके केमरलिंग एट अल द्वारा परिभाषित हैं। (2011) को भी ओएमवी के जवाब में प्रेरित किया गया था। उनमें से उल्लेखनीय हैं FRK1, SOBIR1, SERK4, RLK/IKU2, PSKR1, HAESA, EFR, BIR और IOS1 (तालिका 1)। आरके समूह में, एफआरके1 की अभिव्यक्ति क्रमशः 7.11 और 5.2 के लॉगएफसी के साथ 2 और 6 एचपीसी दोनों पर उच्चतम थी, जबकि सभी आरके का औसत लॉगएफसी 2 और 6 एचपीसी पर क्रमशः 2.11 और 2.13 था। जबकि झिल्ली-बद्ध आरके और आरएलपी ज्यादातर हमलावर रोगाणुओं की बाह्यकोशिकीय संवेदना में मध्यस्थता करते हैं, न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग साइट-ल्यूसीन-रिच रिपीट (एलआरआर) रिसेप्टर्स (एनएलआर), इंट्रासेल्युलर प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स हैं। हमने 2 और 6 एचपीसी पर ओएमवी-चुनौती के जवाब में 7 अलग-अलग एनएलआर जीनों को अप-विनियमित पाया, 24 एचपीसी पर कोई भी नहीं पाया गया (एनएलआर सूची टीएआईआर, 102 जीनों से निकाली गई थी) (तालिका 1)।

पुरुषों के लिए सिस्टैंच के फायदे - प्रतिरक्षा प्रणाली को मजबूत करें

3.3 ओएमवी कई WRKY प्रतिलेखन कारकों की अभिव्यक्ति को प्रेरित करते हैं

WRKY प्रतिलेखन कारक (TFs) पौधों की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में भूमिका निभाते हुए पाए गए हैं, जो MAMP-ट्रिगर प्रतिरक्षा (MTI) और प्रभावकार-ट्रिगर प्रतिरक्षा (ETI) प्रतिक्रियाओं (Birkenbihl et al., 2018; Rushton et al., 2010) दोनों में भाग लेते हैं। ). ओएमवी चुनौती के कारण केवल 2 और 6 एचपीसी (तालिका 1) पर 20 अलग-अलग डब्लूआरकेवाई टीएफ (टीएआईआर, 70 जीन से निकाली गई सूची) का अप-विनियमन हुआ। WRKY TFs हमारे डाउन-रेगुलेटेड जीन सेट से अनुपस्थित थे। ओएमवी चुनौती से प्रभावित टीएफ का एक अन्य परिवार एमवाईबी डोमेन-युक्त प्रोटीन (त्सुडा और सोम्सिच, 2015) है, जो जैविक और अजैविक तनाव (अंबावत एट अल, 2013) सहित कई प्रक्रियाओं में शामिल होने के लिए जाना जाता है। कुल मिलाकर, 9 अलग-अलग MYB TFs (TAIR, 211 जीन से निकाली गई सूची) को OMV चुनौती, 5 अप-रेगुलेटेड और 4 डाउन-रेगुलेटेड (तालिका 1) के जवाब में अलग-अलग व्यक्त किया गया था। अलग-अलग व्यक्त टीएफ की अतिरिक्त कक्षाएं जिनका पता लगाया गया था, तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं।

3.4 शुद्ध एमएएमपी की प्रतिक्रिया के साथ ओएमवी में अरेबिडोप्सिस ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया की तुलना करना

क्रूड और आणविक रूप से जटिल संरचना - ओएमवी बनाम शुद्ध एलीसिटर के प्रति एराबिडोप्सिस प्रतिक्रिया में अंतर के बारे में जानने के लिए, हमने अपने आरएनए-सीक्यू डेटा की तुलना एफएलजी 22, (डेनौक्स एट अल।, 2008) एल्फ26 सहित ज्ञात एमएएमपी के लिए एराबिडोप्सिस प्रतिक्रिया के मौजूदा ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा से की। (जिपफेल एट अल., 2006), पीजीएन (विलमैन एट अल., 2011), ओजी (डेविडसन एट अल., 2017) और एलपीएस (लिवाजा एट अल., 2008)। जैसा कि ऊपर वर्णित है (पूरक तालिका S3) उपर्युक्त डेटासेट से समृद्ध जीओ निकाले गए थे और ओएमवी चुनौती के बाद समृद्ध जीओ के साथ तुलना की गई थी। आम तौर पर, ओएमवी से प्रेरित एराबिडोप्सिस जीओ शब्द एकल, प्रोटीनयुक्त और गैर-प्रोटीनयुक्त एमएएमपी से प्रेरित शब्दों के समान थे, जो क्रमशः एफएलजी22, एल्फ26 और पीजीएन से प्रेरित जीओ के साथ ओएमवी-प्रेरित जीओ के 56, 51 और 47% को साझा करते थे। दूसरी ओर, एलपीएस और ओजी के साथ प्रेरित जीओ में कम ओवरलैप देखा गया, जो ओएमवी-प्रेरित जीओ (चित्रा 4 ए) के साथ क्रमशः 24 और 33% साझा करता है। विशेष रूप से, रोगजनन-संबंधी 1 (PR1) जीन (At2g14610), जो LPS-प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं (सिलिपो एट अल।, 2005, 2008) की एक पहचान है, परीक्षण किए गए सभी समय बिंदुओं पर OMV-प्रेरित जीन सूची से अनुपस्थित था। इकतालीस जीओ को ओएमवी द्वारा प्रेरित पाया गया, न कि यहां परीक्षण किए गए किसी भी अन्य एमएएमपी द्वारा (चित्रा 4बी)। इस सूची में 'एपोप्टोसिस', 'दवा के प्रति प्रतिक्रिया', 'दवा परिवहन और 'मल्टी-ड्रग ट्रांसपोर्ट', और 'लाइपेज गतिविधि' (पूरक तालिका एस 3, तारांकन और बोल्ड फ़ॉन्ट द्वारा दर्शाया गया) से संबंधित जीओ शामिल थे।

3.5 ओएमवी जीवाणु संक्रमण के प्रति एराबिडोप्सिस प्रतिरोध को प्रेरित करते हैं

यहां और पहले (बहार एट अल., 2016), हमने यह प्रदर्शित करने वाले साक्ष्य प्रदान किए हैं कि एराबिडोप्सिस प्रतिरक्षा प्रणाली ओएमवी चुनौती से प्रेरित है। यह जांचने के लिए कि क्या यह ओएमवी-मध्यस्थ प्रतिरक्षा प्रेरण एक प्रभावी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में तब्दील हो गया है, हमने एक प्लांटा बैक्टीरियल ग्रोथ टेस्ट (जिपफेल एट अल।, 2004) का उपयोग किया, जिसमें अरेबिडोप्सिस पौधों को ओएमवी के साथ पूर्व-उपचार किया जाता है और उसके बाद बैक्टीरिया का टीका लगाया जाता है। स्यूडोमोनास सिरिंज पीवी में 10-गुना से अधिक की महत्वपूर्ण कमी। टमाटर DC3000 (Pst) CFU/g पत्ती को टीकाकरण के दो दिन बाद मॉक प्रीट्रीटमेंट की तुलना में OMV- और flg{6}} प्रीट्रीटेड पौधों दोनों में देखा गया (चित्र 5A)। माध्यम में ओएमवी जोड़ने से पीएसटी की इन विट्रो वृद्धि नकारात्मक रूप से प्रभावित नहीं हुई, यह सुझाव देता है कि प्लांटा में कम पीएसटी वृद्धि ओएमवी के प्राइमिंग प्रभाव से संबंधित है, और बैक्टीरिया पर ओएमवी का सीधा प्रभाव नहीं है (चित्र देखें)। एस2). यह जांचने के लिए कि पीएसटी के लिए ओएमवी-प्रेरित प्रतिरोध एफएलएस2, ईएफआर, या बीएके1 द्वारा मध्यस्थ है या नहीं, हमने इस प्रयोग को कर्नल -0, बक-म्यूटेंट के साथ दोहराया, और डबल म्यूटेंट लाइन ईएफआर गिरती है। दोनों उत्परिवर्ती लाइनों के साथ, ओएमवी प्रीट्रीटमेंट के परिणामस्वरूप मॉक-ट्रीटेड पौधों की तुलना में पीएसटी सीएफयू/जी पत्ती में महत्वपूर्ण कमी आई (चित्र 5बी-सी)। जैसा कि अपेक्षित था, एफएलजी22 से उपचारित एफएलएस ईएफआर और बैक-म्यूटेंट लाइनों में अनुपचारित पौधों के समान पीएसटी टाइटर्स थे क्योंकि उन्हें एफएलजी22 के प्रति अनुत्तरदायी माना जाता है। प्राइमेड पौधों में रोगज़नक़ अनुमापांक में कॉल -0 बनाम प्रतिरक्षा रिसेप्टर उत्परिवर्ती रेखाएं कभी-कभी गिरती हैं और बेक में सापेक्ष कमी की तुलना करने के लिए, हमने तीन स्वतंत्र प्रयोगों में ओएमवी- और नकली-उपचारित पौधों में पीएसटी अनुमापांक में अंतर की गणना की (सप्लीमेंट) चित्र S3). ओएमवी-प्रीट्रीटेड बैक पौधों में पीएसटी टिटर में औसत कमी कोल -0 पौधों में देखी गई तुलना में कम थी (0.89 बनाम 1.14 लॉग सीएफयू/जीआर बक और कोल -0 के लिए पत्ती में कमी, क्रमशः, एक- रास्ता एनोवा; एफ2,4=4.3781, पी=0.0523)। हमने एफएलएस ईएफआर म्यूटेंट लाइन के साथ समान कमी नहीं देखी (क्रमशः एफएलएस ईएफआर और कॉलम के लिए 1.26 बनाम 1.32 लॉग सीएफयू कटौती, एक तरफा एनोवा: एफ1, {{44%).0352, पी=0.5698) (चित्र 5डी-ई)।

तालिका 1 ओएमवी-प्रेरित आरके/आरएलपी और एराबिडोप्सिस अंकुरों में प्रतिरक्षा-संबंधी प्रतिलेखन कारक

तालिका 1 (जारी)

तालिका 1 (जारी)

4। चर्चा

बैक्टीरियल बाहरी झिल्ली पुटिका (ओएमवी) बैक्टीरिया की बाहरी झिल्ली से उत्पन्न होने वाली जटिल नैनो संरचनाएं हैं और सैकड़ों प्रोटीन और अन्य कोशिका दीवार घटकों से बनी होती हैं। यह पहले दिखाया गया था कि अरेबिडोप्सिस पौधे आरओएस विस्फोट, प्रतिरक्षा मार्कर जीन अभिव्यक्ति और मध्यम क्षारीकरण (बहार एट अल।, 2016) जैसी विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को सक्रिय करके ओएमवी चुनौती का जवाब देते हैं। इस अध्ययन में, हमने बैक्टीरियल ओएमवी के प्रति एराबिडोप्सिस की व्यापक ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया और बाद के संक्रमण पर इसके प्रभाव की जांच की। इस अध्ययन में किए गए आरएनए-सीक्यू डेटा विश्लेषण से व्यापक निष्कर्ष यह है कि ज़ैंथोमोनस कैंपेस्ट्रिस पीवी.कैंपेस्ट्रिस (एक्ससीसी) ओएमवी के संपर्क के बाद एराबिडोप्सिस प्रतिरक्षा प्रणाली तैयार हो जाती है। यह निष्कर्ष विशिष्ट और पूरक विश्लेषणों द्वारा समर्थित है। सबसे पहले, एक्ससीसी ओएमवी के संपर्क में आने वाले पौधों में जीन ऑन्टोलॉजी (जीओ) संवर्धन स्पष्ट रूप से दर्शाता है कि ओएमवी को एराबिडोप्सिस द्वारा तनाव के रूप में माना जाता है। पौधे की प्रतिक्रिया का सेलुलर स्थान मुख्य रूप से सेल परिधि से जुड़ा था जो चुनौतीपूर्ण सामग्री, ओएमवी की बाहरी सेलुलर धारणा का सुझाव देता था। यह इस धारणा को और समर्थन प्रदान करता है कि ओएमवी और उनके घटकों को कई ज्ञात एमएएमपी के समान, बाह्य रिसेप्टर्स द्वारा महसूस किया जाता है। दूसरे, हमने देखा कि ओएमवी चुनौती के जवाब में आरके और आरएलपी के एक बड़े समूह को अपग्रेड किया गया है। इनमें से कई रिसेप्टर्स रोगज़नक़ धारणा में मध्यस्थता करने के लिए जाने जाते हैं या पहले उन्हें पौधों की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के साथ जुड़ा हुआ दिखाया गया था। FLG22-प्रेरित रिसेप्टर-जैसा किनेज़ 1 (FRK1) सबसे अधिक प्रेरित रिसेप्टर था। यह दिलचस्प है क्योंकि हम अपने एक्ससीसी ओएमवी प्रोटिओमिक्स विश्लेषण (डेटा नहीं दिखाया गया) में फ्लैगेलिन का पता नहीं लगा सके। यह ज्ञात है कि एफआरके1 भी अन्य प्रतिरक्षा एलिसिटर से प्रेरित है, लेकिन यह दिलचस्प है कि इसकी अभिव्यक्ति यहां विनियमित बाकी आरके की तुलना में इतनी अधिक क्यों है। दूसरी ओर, बढ़ाव कारक रिसेप्टर (ईएफआर) अभिव्यक्ति, केवल 2 घंटे के समय बिंदु पर महत्वपूर्ण रूप से विनियमित थी, और इसका लॉगएफसी 1.12 था, भले ही ईएफ-टू एक्ससीसी ओएमवी में पाया जाता है (बहार एट अल।, 2016) ). हमने ओएमवी चुनौती के जवाब में कुछ एनएलआर जीनों को अप-विनियमित भी पाया, जिनमें से आधे को रोग प्रतिरोधी प्रोटीन के रूप में एनोटेट किया गया है, फिर भी पौधों की प्रतिरक्षा में उनके कार्य का वर्णन नहीं किया गया है। हालांकि हम यह अनुमान नहीं लगाते हैं कि एनएलआर सीधे ओएमवी धारणा में शामिल हैं, उन्हें ओएमवी अणुओं के आरके/आरएलपी सेंसिंग के डाउनस्ट्रीम से प्रेरित किया जा सकता है, जैसा कि flg22, elf18 और LPS (डेनौक्स एट अल।, 2008) जैसे शुद्ध एमएएमपी के जवाब में भी देखा गया था। ; लिवाजा एट अल., 2008; जिपफेल एट अल., 2006)। तीसरा, कई प्रतिरक्षा-संबंधित प्रतिलेखन कारक, WRKY, MYB, और अन्य, OMVs (ब्योर्नसन एट अल।, 2021) द्वारा महत्वपूर्ण रूप से अपग्रेड किए गए थे। हमारे अध्ययन में, ओएमवी की प्रतिक्रिया में मुख्य ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तन पहले दो समय बिंदुओं (2 और 6 एचपीसी) पर हुआ। इसे विभेदित रूप से व्यक्त जीन (डीईजी) की काफी बड़ी संख्या और 2 और 6 एचपीसी पर काफी अधिक लॉग फोल्डचेंज (लॉगएफसी) दोनों द्वारा चित्रित किया गया था। फिर भी, 24 एचपीसी पर पाए गए कुल 121 डीईजी में से, लगभग आधे (52) 2 या 6 एचपीसी पर नहीं पाए गए। इससे पता चलता है कि 24 एचपीसी पर आधे डीईजी देर से विनियमित जीन हैं, जिनकी अभिव्यक्ति 6 ​​एचपीसी के बाद ऊपर या नीचे विनियमित हुई थी। वास्तव में, एलिसिटर चुनौतियों के बाद विभिन्न अभिव्यक्ति गतिशीलता वाले एराबिडोप्सिस जीन की पहले पहचान की गई थी (ब्योर्नसन एट अल।, 2021)।

चित्र 4 ओएमवी और एकल शुद्ध एमएएमपी के जवाब में समृद्ध जीन ऑन्टोलॉजी (जीओ) शब्दों की तुलना। MAMP चुनौती (elf26, flg22, OGs, PGN, और LPS; संदर्भ के लिए सामग्री और तरीके अनुभाग देखें) के जवाब में एरीबिडोप्सिस अभिव्यक्ति डेटासेट का उपयोग एग्रीगो वेब टूल का उपयोग करके समृद्ध जीओ निकालने के लिए किया गया था। प्रत्येक एमएएमपी के समृद्ध जीओ सेट की तुलना वेनी (ए, और सप्लिमेंट टेबल एस 3) का उपयोग करके ओएमवी के जवाब में समृद्ध जीओ सूची के साथ की गई थी। केवल ओएमवी डेटासेट में समृद्ध जीओ शब्द उनके एफडीआर मूल्य के अनुसार क्रमबद्ध (बी) में दिखाए गए हैं।

हमारे अध्ययन में, ओएमवी की प्रतिक्रिया में मुख्य ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तन पहले दो समय बिंदुओं (2 और 6 एचपीसी) पर हुआ। इसे विभेदित रूप से व्यक्त जीन (डीईजी) की काफी बड़ी संख्या और 2 और 6 एचपीसी पर काफी अधिक लॉग फोल्ड चेंज (लॉगएफसी) दोनों द्वारा चित्रित किया गया था। फिर भी, 24 एचपीसी पर पाए गए कुल 121 डीईजी में से, लगभग आधे (52) 2 या 6 एचपीसी पर नहीं पाए गए। इससे पता चलता है कि 24 एचपीसी पर आधे डीईजी देर से विनियमित जीन हैं, जिनकी अभिव्यक्ति 6 ​​एचपीसी के बाद ऊपर या नीचे विनियमित हुई थी। वास्तव में, एलिसिटर चुनौतियों के बाद विभिन्न अभिव्यक्ति गतिशीलता वाले एराबिडोप्सिस जीन की पहले पहचान की गई थी (ब्योर्नसन एट अल।, 2021)। हमने यहां जो तीव्र और अधिकतर क्षणिक जीन अभिव्यक्ति पैटर्न देखा है, वह अन्य अध्ययनों के अनुसार है, जिन्होंने एमएएमपी के लिए एराबिडोप्सिस की अस्थायी प्रतिक्रिया का परीक्षण किया है। उदाहरण के लिए, डेनौक्स एट अल। (2008) और ब्योर्नसन एट अल। (2021) से पता चला है कि विभिन्न एमएएमपी के जवाब में एराबिडोप्सिस में ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तन मिनटों से लेकर घंटों के भीतर होता है, और ज्यादातर मामलों में, डीईजी पौधे की चुनौती के बाद 24 घंटे के भीतर आधार स्तर पर वापस आ जाते हैं। एक पौधे और एक रोगज़नक़ के बीच की बातचीत के विपरीत, जहां बातचीत गतिशील होती है और निर्जीव नमूने, जैसे कि शुद्ध एमएएमपी या ओएमवी के साथ चुनौती दी जाती है, तब भी चलती रहती है - यह उम्मीद की जा सकती है कि पौधे की प्रतिक्रिया, कम से कम एक ट्रांसक्रिप्शनल स्तर पर, यह क्षणिक होगा और कई दिनों तक कायम नहीं रहेगा। पिछले तीन दशकों में गहन शोध से सूक्ष्म जीवों की पहचान के लिए जिम्मेदार कई पौधों के प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स का पता चला है। इनमें से कई रिसेप्टर्स में एकल माइक्रोबियल विशेषताओं का पता लगाने की क्षमता है और रोगज़नक़ धारणा, प्रतिरक्षा प्रणाली सिग्नलिंग और मॉडल और फसल पौधों की प्रतिक्रिया को बेहतर ढंग से समझने के लिए विस्तार से अध्ययन किया जा रहा है। हालाँकि, पौधे एक साथ विभिन्न स्रोतों से कई माइक्रोबियल विशेषताओं के संपर्क में आते हैं, जो प्रतिरक्षा धारणा और प्रतिक्रिया में जटिलता जोड़ते हैं। हम ओएमवी बनाम एकवचन शुद्ध एमएएमपी के लिए अरेबिडोप्सिस की ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया में अंतर की जांच करने में रुचि रखते थे, जो एक अधिक प्राकृतिक और जटिल माइक्रोबियल संरचना का प्रतिनिधित्व करता है लेकिन एक सूक्ष्म जीव से जटिलता की एक डिग्री हटा दी जाती है। ओएमवी में विषाणु कारक, अपघटक एंजाइम, विषाक्त पदार्थ और अन्य जैव-अणु होते हैं जो पौधों में बैक्टीरिया के विकास के लिए कार्यात्मक भूमिका निभा सकते हैं, और इसलिए यह परीक्षण करना दिलचस्प था कि क्या ओएमवी चुनौती अद्वितीय जीओ को प्रेरित करती है जो सिंथेटिक एमएएमपी से प्रेरित नहीं हैं।

चित्र 5 ओएमवी के साथ एराबिडोप्सिस पत्तियों का पूर्व उपचार करने से बाद के जीवाणु संक्रमण के प्रति प्रतिरोध उत्पन्न होता है। कोल -0 पौधों (ए) को नियंत्रण के रूप में ओएमवी, पानी (मॉक), या एफएलजी 22 के साथ पूर्व-उपचार किया गया था, और 24 घंटे बाद सुई रहित सिरिंज घुसपैठ का उपयोग करके पीएसटी डीसी 3000 के 1 0 5 सीएफयू/एमएल निलंबन के साथ टीका लगाया गया था। . टीका लगाए गए पत्तों में पीएसटी DC3000 सेल टिटर को सीरियल कमजोर पड़ने वाली प्लेटिंग द्वारा टीकाकरण के 48 घंटे बाद निर्धारित किया गया था। एराबिडोप्सिस कोल -0 और एफएलएस ईएफआर (बी), या बाक (सी) पौधों का परीक्षण (ए) में वर्णित एक समान प्रयोग में किया गया था। ओएमवी प्रीट्रीटमेंट (अनुपचारित पौधों की तुलना में) के बाद औसत लॉग पीएसटी DC3000 सीएफयू/जीआर कमी की तुलना कॉलम में की गई थी। प्रत्येक बार तीन स्वतंत्र प्रयोगों से माध्य लॉग Pst DC3000 CFU/gr कमी का प्रतिनिधित्व करता है (स्वतंत्र प्रयोगों का डेटा पूरक चित्र S3 में प्रस्तुत किया गया है)। अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं थे (टू-टेल स्टूडेंट टी-टेस्ट। पी मान ग्राफ़ बार के ऊपर दर्शाए गए हैं)। प्रयोग ए, बी, और सी समान परिणामों के साथ कम से कम तीन बार आयोजित किए गए (प्रत्येक प्रयोग में प्रति उपचार 3 पौधे/प्रतिकृति)। तारांकन (**) मॉक (डननेट का परीक्षण पी <0.001) की तुलना में एक महत्वपूर्ण अंतर दर्शाता है

हमारी ट्रांसक्रिप्टोमिक तुलनाओं के लिए, हमने समान प्रयोगात्मक स्थितियों, यानी पौधों और समान समय बिंदुओं पर अध्ययनों से डेटा इकट्ठा किया। जीओ संवर्धन में एक महत्वपूर्ण ओवरलैप ओएमवी और एफएलजी22, एल्फ26 और पीजीएन के लिए अरेबिडोप्सिस प्रतिक्रिया में देखा गया था। यह अप्रत्याशित नहीं है क्योंकि यह ज्ञात है कि विशिष्ट एलिसिटर या उसके स्रोत (ब्योर्नसन एट अल., 2021; जिपफेल एट अल., 2006) की परवाह किए बिना रोगज़नक़ संवेदन पर सक्रिय कई रक्षा मार्ग समान हैं। फिर भी, कुछ अद्वितीय जीओ को ओएमवी द्वारा अपग्रेड किया गया पाया गया, न कि हमारे द्वारा सर्वेक्षण किए गए अन्य एमएएमपी द्वारा। इनमें कोशिका भित्ति क्षरण से संबंधित जीओ जैसे 'लाइपेज गतिविधि' और 'ग्लाइकोसिल बांड पर अभिनय करने वाली हाइड्रॉलेज़ गतिविधि' शामिल हैं, जो संकेत दे सकते हैं कि संयंत्र रक्षा प्रणाली ओएमवी क्षरण को लक्षित कर रही है। दिलचस्प बात यह है कि दवा परिवहन से संबंधित तीन जीओ को भी ओएमवी चुनौती द्वारा विशिष्ट रूप से अपग्रेड किया गया पाया गया। यह संकेत दे सकता है कि पौधों को उनकी कोशिकाओं में जहरीले यौगिकों के पहुंचने का सामना करना पड़ रहा है, शायद ओएमवी-मध्यस्थता वितरण द्वारा। प्रतिरक्षा-उत्प्रेरक पेप्टाइड्स और पीजीएन के प्रति एराबिडोप्सिस की प्रतिक्रिया के विपरीत, हमने ओएमवी ओजी और एलपीएस के प्रति एराबिडोप्सिस की प्रतिक्रिया के बीच अपेक्षाकृत कम ओवरलैप देखा। यह छोटा ओवरलैप, विशेष रूप से एलपीएस के साथ, कुछ हद तक आश्चर्यजनक है, यह देखते हुए कि स्तनधारी कोशिकाओं में, एलपीएस को ओएमवी द्वारा प्रेरित मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में शक्तिशाली योगदानकर्ता के रूप में अच्छी तरह से स्वीकार किया जाता है (एलिस एट अल।, 2010)। इसके अलावा, तथ्य यह है कि हम एलपीएस प्रतिरक्षा हॉलमार्क पीआर1 (सिलिपो एट अल., 2005) का अपग्रेडेशन नहीं पा सके, यह सुझाव दे सकता है कि एलपीएस बैक्टीरिया ओएमवी के साथ पौधे की प्रतिरक्षा बातचीत का एक प्रमुख उत्प्रेरक नहीं है। हालाँकि, इसकी और अधिक गहनता से जांच की जानी बाकी है। ओएमवी को स्तनधारी और पादप मेजबान दोनों के जीवाणु उपनिवेशण में और कुछ मामलों में जीवाणु विषाणु में योगदान करते हुए दिखाया गया है। दूसरी ओर, ओएमवी मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली को सक्रिय करते हैं, इसलिए एक दोधारी तलवार के रूप में कार्य करते हैं, एक तरफ जीवाणु अस्तित्व और विषाणु को बढ़ावा देते हैं, और दूसरी तरफ मेजबान सर्वेक्षण प्रणाली को खिलाते हैं और मेजबान प्रतिरक्षा को सक्रिय करते हैं (मैकमिलन और कुहेन, 2021) ). हमारे प्राइमिंग परीक्षण से पता चला कि ओएमवी चुनौती के कारण स्यूडोमोनास सिरिंज पीवी का महत्वपूर्ण निषेध हुआ। प्लांटा में टमाटर DC3000 (Pst) की वृद्धि, सिंथेटिक एमएएमपी (जंग एट अल., 2009) के साथ देखे गए प्राइमिंग प्रभाव के समान है। इसलिए, इस उदाहरण में, टीका लगाए गए ऊतक में ओएमवी के पूर्व-प्रशासन ने बैक्टीरिया के उपनिवेशण को बढ़ावा नहीं दिया, बल्कि पौधों को एक प्रभावी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न करने के लिए प्रेरित किया जिसने रोगज़नक़ विकास को रोक दिया। यह परिणाम हमारे ट्रांसक्रिप्शनल डेटा और हमारे पिछले अध्ययन के अनुरूप है, जो इस धारणा का समर्थन करता है कि ओएमवी एराबिडोप्सिस में एक मजबूत और प्रभावी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न करता है। हाल के दो अध्ययनों से यह भी पता चला है कि रोगजनक या कमेंसल स्यूडोमोनास प्रजाति के ओएमवी के साथ अरेबिडोप्सिस प्री-ट्रीटमेंट ने बाद के पीएसटी संक्रमण को दबा दिया (जांडा एट अल., 2021; मैकमिलन एट अल., 2021)। ये परिणाम संचयी रूप से संकेत देते हैं कि परीक्षण की गई स्थितियों के तहत, ओएमवी घुसपैठ रोगज़नक़ संक्रमण की सुविधा नहीं देती है। पिछले अध्ययन में, हमने दिखाया है कि कई प्रतिरक्षा रिसेप्टर म्यूटेंट एक्ससीसी ओएमवी के प्रति डब्ल्यूटी प्रतिक्रिया बनाए रखते हैं। इन म्यूटेंट में ज्ञात पीआरआर शामिल हैं, जो या तो प्रोटीनयुक्त (एफएलएस2, ईएफआर, आरएलपीआरईमैक्स) या गैर-प्रोटीनयुक्त एमएएमपी (एलवाईएम1/एलवाईएम3) (बहार एट अल., 2016) को पहचानते हैं। दिलचस्प बात यह है कि जांडा एट अल। (2021) ने बताया कि जब एराबिडोप्सिस (फ्लू) की एफएलएस2 रिसेप्टर उत्परिवर्ती लाइन को पीएसटी से ओएमवी के साथ चुनौती दी गई थी, तो एफआरके1 अभिव्यक्ति अपरिवर्तित थी और मॉक-ट्रीटेड पौधों के समान थी, यह सुझाव देते हुए कि एफएलएस2 पीएसटी ओएमवी की प्रतिक्रिया में मध्यस्थता करता है। यह संभव है कि फ्लैगेलिन पीएसटी ओएमवी तैयारियों में एक्ससीसी 33913 ओएमवी की तुलना में अधिक प्रचुर मात्रा में है, और इसलिए फ्लैगेलिन रिसेप्टर को हटाने से एक्ससीसी ओएमवी की तुलना में पीएसटी के प्रति पौधों की प्रतिक्रिया पर अधिक स्पष्ट प्रभाव पड़ा।

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यह दिखाया गया है कि विभिन्न पौधों की प्रतिरक्षा जांच से अलग-अलग परिणाम मिल सकते हैं, जिससे कथित तौर पर विरोधाभासी निष्कर्ष निकल सकते हैं। उदाहरण के लिए, हमने दिखाया है कि लीफ-डिस्क आरओएस बर्स्ट परख में, ओएमवी के प्रति एराबिडोप्सिस की प्रतिक्रिया ईएफआर रिसेप्टर पर निर्भर थी, हालांकि, एराबिडोप्सिस अंकुरों के साथ प्रतिरक्षा मार्कर जीन अभिव्यक्ति परख में, कभी-कभी उत्परिवर्ती रेखा ओएमवी के प्रति उतनी ही प्रतिक्रियाशील थी जितनी कि डब्ल्यूटी. मैकमिलन एट अल. (2021) से पता चला कि ओएमवी पर लागू विभिन्न भौतिक उपचारों ने अंकुर विकास अवरोध जैसी कुछ गतिविधियों को समाप्त कर दिया। हालाँकि, इसने प्लांट प्राइमिंग जैसे अन्य प्रतिरक्षा आउटपुट में कोई बदलाव नहीं किया। इसलिए, किसी दिए गए एलिसिटर के प्रति पौधे की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का यथासंभव व्यापक दृष्टिकोण प्राप्त करने के लिए विभिन्न प्रतिरक्षा आउटपुट का परीक्षण करने के लिए विभिन्न प्रकार के परीक्षणों को संयोजित करना महत्वपूर्ण है। कुछ ज्ञात पीआरआर और सह-रिसेप्टर्स की भागीदारी की जांच करने के लिए, हमने प्लांट प्राइमिंग परख का उपयोग करके फॉल्स एवर और बेक म्यूटेंट लाइनों का परीक्षण किया है। हमारे परिणामों से पता चलता है कि एराबिडोप्सिस डबल म्यूटेंट लाइन फॉल्स को Xcc OMV द्वारा उसी तरह से प्राइम किया गया था जैसे कि WT प्लांट थे, इस धारणा का समर्थन करते हुए कि फ्लैगेलिन और EF-Tu के अलावा अन्य MAMP भी Xcc 33913 OMV में मौजूद हैं। प्रतिरक्षा मार्कर जीन अभिव्यक्ति परख के आधार पर, हमने पहले सुझाव दिया था कि BAK1 सह-रिसेप्टर OMV धारणा और/या प्रतिक्रिया में शामिल है (बहार एट अल., 2016)। इस अध्ययन में, हमने प्राइमिंग परख का उपयोग करके इस सुझाव पर दोबारा गौर किया। यहां, बाक म्यूटेंट लाइन को ओएमवी प्रीट्रीटमेंट द्वारा प्राइम किया गया था, लेकिन डब्ल्यूटी कोल -0 पौधों की तुलना में थोड़ा कम। हालाँकि यह मार्जिन सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं था, लेकिन यह डबल एफएलएस कभी उत्परिवर्ती रेखा के साथ देखी गई तुलना में अधिक था। यह परिणाम एक हालिया अध्ययन के अनुरूप भी है जिसमें दिखाया गया है कि बेक म्यूटेंट लाइन प्रतिरक्षा प्राइमिंग प्रयोगों में डब्ल्यूटी पौधों के रूप में ओएमवी के प्रति उत्तरदायी थी (ट्रान एट अल।, 2021)। कुल मिलाकर, यह सुझाव दे सकता है कि जबकि BAK1 OMV धारणा में शामिल है, अन्य प्रतिरक्षा धारणा और सिग्नलिंग रास्ते OMV द्वारा तैयार किए जाते हैं, जिससे एक प्रभावी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया होती है और रोगज़नक़ विकास का दमन होता है। ओएमवी (बहार एट अल., 2016) के जवाब में सह-रिसेप्टर्स BAK1 और SOBIR1 की भागीदारी ने हमें यह मानने के लिए प्रेरित किया कि कई प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स, संभावित पीआरआर, ओएमवी धारणा में शामिल हैं। हालाँकि, एक हालिया अध्ययन से पता चला है कि ओएमवी द्वारा पादप प्रतिरक्षा सक्रियण एमएएमपी-स्वतंत्र हो सकता है और यह ओएमवी एकीकरण (ट्रान एट अल., 2021) से प्रेरित पादप प्लाज्मा झिल्ली में भौतिक-रासायनिक परिवर्तनों के परिणामस्वरूप होता है। यह एक दिलचस्प परिकल्पना है जिस पर आगे विचार किया जाना बाकी है। दिलचस्प बात यह है कि मैकमिलन एट अल। (2021) ने बताया कि प्रोटीनएज़ K से उपचारित ओएमवी ने अपनी प्रतिरक्षा भड़काने की क्षमता बरकरार रखी है, यह दर्शाता है कि यह गतिविधि ओएमवी प्रोटीनियस कार्गो से स्वतंत्र हो सकती है। हालांकि यह परिणाम ट्रान एट अल की एमएएमपी-स्वतंत्र प्रतिरक्षा सक्रियण परिकल्पना का समर्थन कर सकता है। (2021), ओएमवी में मौजूद अन्य, गैर-प्रोटीनयुक्त एमएएमपी जैसे एलपीएस और पीजीएन एमटीआई को सक्रिय कर सकते हैं (बहार एट अल., 2016; मैकमिलन एट अल., 2021)। इसके अतिरिक्त, प्रोटीनएज़ के-उपचारित ओएमवी ने अंकुर विकास अवरोध को प्रेरित करने की अपनी क्षमता बरकरार रखी है, यह दर्शाता है कि विकास अवरोध ओएमवी के प्रोटीनयुक्त कार्गो पर निर्भर है (मैकमिलन एट अल।, 2021)। कुल मिलाकर, ये परिणाम ओएमवी के प्रति पौधों की प्रतिक्रिया की जटिलता और विशिष्ट मार्गों में किसी विशेष एलिसिटर की भागीदारी का परीक्षण करने के लिए विभिन्न प्रकार के आउटपुट का उपयोग करने के महत्व पर जोर देते हैं।

2021 के दौरान, इस सहित चार स्वतंत्र अध्ययन (जो संभवतः एक साथ हुए हैं) ने बताया कि बैक्टीरियल ओएमवी पौधे की प्रतिरक्षा प्रणाली को नियंत्रित करते हैं और रोगज़नक़ संक्रमण के खिलाफ एक प्रभावी प्रतिक्रिया उत्पन्न करते हैं (जांडा एट अल।, 2021; मैकमिलन एट अल।, 2021; ट्रान एट अल., 2021)। ये रोमांचक परिणाम ओएमवी को प्लांट-माइक्रोब इंटरैक्शन में एक नए और महत्वपूर्ण खिलाड़ी के रूप में स्थापित करते हैं, जहां अभी भी बहुत कुछ सीखना बाकी है। इस अध्ययन में, हम एक्ससीसी ओएमवी के लिए अरेबिडोप्सिस की ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया का एक व्यापक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं। ओएमवी की संयंत्र धारणा में शामिल घटकों और तंत्रों को और अधिक समझने के लिए पूरक अनुसंधान दृष्टिकोण की आवश्यकता होगी।

प्रतिक्रिया दें संदर्भ

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