माउस स्टिंग एगोनिस्ट DMXAA की संरचना के आधार पर नवीन स्टिंग अवरोधकों की खोज

अमूर्त:

उत्तेजक-ऑफ-इंटरफेरॉन-जीन (स्टिंग) प्रोटीन जन्मजात प्रतिरक्षा में शामिल है। दवा DMXAA (5,{4}}डाइमिथाइलक्सैन्थेनोन-4-एसिटिक एसिड) एक शक्तिशाली म्यूरिन-स्टिंग (mSTING) एगोनिस्ट साबित हुई, लेकिन मानव-स्टिंग (hSTING) पर इसका बहुत कम प्रभाव पड़ा। इस पेपर में, हम विभिन्न क्रिस्टल संरचनाओं और प्रोटीन-लिगैंड इंटरैक्शन संबंधों के विश्लेषण की तुलना करके इस परिकल्पना को आगे बढ़ाते हैं कि डीएमएक्सएए वेरिएंट के ड्रग डिज़ाइन में स्टिंग एगोनिस्ट को अवरोधकों में बदलने की क्षमता है। दो DMXAA एनालॉग्स, 3 और 4 (दोनों स्टिंग से जुड़ सकते हैं) की हमारी पिछली खोज के आधार पर, हमने क्रमशः उन्हें संरचनात्मक रूप से अनुकूलित किया और नए डेरिवेटिव को संश्लेषित किया। बाइंडिंग एसेज़ में, हमने स्टिंग बाइंडर्स का प्रतिनिधित्व करने के लिए यौगिक 11 और 27 पाया जो मूल संरचनाओं से बेहतर थे और संरचना-गतिविधि संबंधों पर चर्चा की। स्टिंग एगोनिस्टिक गतिविधि की स्क्रीनिंग के लिए सेलुलर परीक्षणों में सभी लक्ष्य यौगिक निष्क्रिय थे। संतुष्टिदायक रूप से, हमने 11 और 27 को स्टिंग अवरोधकों के रूप में पहचाना, जिनमें hSTING और mSTING दोनों मार्गों में माइक्रोमोलर गतिविधि है। इसके अलावा, 11 और 27 ने स्पष्ट साइटोटोक्सिसिटी के बिना 20 3 0 -सीजीएएमपी द्वारा सक्रिय इंटरफेरॉन और सूजन साइटोकिन्स के प्रेरण को रोक दिया। ये निष्कर्ष उस कठोर सोच को तोड़ते हैं कि DMXAA विशेष रूप से स्टिंग एगोनिस्ट के लिए संरचनात्मक आधार प्रदान करता है और नए स्टिंग एगोनिस्ट या अवरोधक विकसित करने के लिए अधिक संभावनाएं खोलता है।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

कीवर्ड:

डंक मारना; डीएमएक्सएए; प्रजाति चयनात्मकता; स्टिंग एगोनिस्ट; डंक अवरोधक

1 परिचय

स्टिमुलेटर-ऑफ-इंटरफेरॉन-जीन (STING) आंतरिक प्रतिरक्षा के लिए एक आवश्यक संकेतन अणु है, जो मुख्य रूप से साइटोप्लाज्मिक डीएनए-प्रेरित प्राकृतिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की मध्यस्थता करता है [1]। जब डीएनए रिसेप्टर चक्रीय ग्वानोसिन-एडेनोसिन फॉस्फेट सिंथेज़ (सीजीएएस) इंट्रासेल्युलर डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए का पता लगाता है, तो सीजीएएस सक्षम चक्रीय डाइन्यूक्लियोटाइड (सीडीएन) के संश्लेषण को उत्प्रेरित करता है। एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम पर स्टिंग को सीधे बांधने और सक्रिय करने का [2-4]। सक्रिय होने पर, STING समुच्चय बनाता है जो टैंक-बाइंडिंग किनेज़ 1 (TBK1) में डाउनस्ट्रीम में भर्ती होता है और इंटरफेरॉन नियामक कारक 3 (IRF3) को बांधता है, जो IRF3 को फॉस्फोराइलेट करता है, IRF3 डिमर को नाभिक में सक्रिय करता है, टाइप I इंटरफेरॉन (IFN) अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है और आरंभ करता है। एक इंटरफेरॉन प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया [1]। कई अध्ययनों से पता चला है कि STING कई बीमारियों के रोगजनन में शामिल है और STING की उत्तेजना रोगजनक संक्रमण और कैंसर के प्रति प्रभावी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न करती है; हालाँकि, क्रोनिक इंफ्लेमेटरी सिग्नलिंग को व्यवस्थित करने में विफलता से ऑटोइम्यून और सूजन संबंधी बीमारियाँ होती हैं [5-8]। जन्मजात प्रतिरक्षा के नियमन में स्टिंग की मौलिक भूमिका के कारण, बड़ी संख्या में टीमों ने स्टिंग एगोनिस्ट या अवरोधक विकसित करना शुरू कर दिया है।

चित्र 1. प्रतिनिधि स्टिंग मॉड्यूलेटर

पहली पीढ़ी के स्टिंग एगोनिस्ट पर शोध ने अंतर्जात सीडीएन की कुछ सीमाओं, जैसे कि खराब झिल्ली पारगम्यता और फॉस्फेटेस द्वारा हाइड्रोलिसिस की संवेदनशीलता को दूर करने के लिए सीडीएन एनालॉग्स के संरचनात्मक संशोधन पर ध्यान केंद्रित किया है [9,10]। छोटा अणु स्टिंग एगोनिस्ट 5, {{4}डाइमिथाइलक्सैन्थेनोन{{5}एसिटिक एसिड (डीएमएक्सएए), जिसने माउस मॉडल में ठोस ट्यूमर के खिलाफ चिकित्सीय वादा दिखाया है, सीडीएन डेरिवेटिव की कमियों का प्रतिकार कर सकता है [11]। हालाँकि, दवा मानव नैदानिक ​​​​परीक्षणों में विफल रही [12]। आगे यह पुष्टि की गई है कि DMXAA चुनिंदा रूप से मानव स्टिंग (hSTING) के बजाय म्यूरिन स्टिंग (mSTING) से बंधता है [13,14], जो मनुष्यों में DMXAA की चिकित्सीय क्षमता को बाधित करता है। {{10}कार्बोक्सिमिथाइल{{11}एक्रिडिनोन (सीएमए) एक अन्य प्रतिनिधि म्यूरिन-विशिष्ट स्टिंग एगोनिस्ट है जिसका उपयोग 1970 के दशक की शुरुआत में एंटीवायरल थेरेपी के लिए एक शक्तिशाली प्रकार I IFN प्रेरक के रूप में किया गया था [15]। इसलिए, छोटे-अणु स्टिंग एगोनिस्ट के विकास में प्रजातियों की चयनात्मकता एक महत्वपूर्ण कारक है। डायएबीजीआई, एसआर717, एमएसए02 और अन्य [16-19] सहित शोधकर्ताओं के अथक प्रयासों से पर्याप्त उपन्यास-कंकाल एचएसटीइंग एगोनिस्ट को सामने लाया गया है।

पुरुषों के लिए सिस्टैंच के फायदे - प्रतिरक्षा प्रणाली को मजबूत करें

बढ़ते सबूतों से पता चलता है कि स्टिंग हाइपरएक्टिवेशन ऑटोइंफ्लेमेटरी और ऑटोइम्यून बीमारियों से जुड़ा है। स्टिंग सिग्नलिंग मार्ग की अत्यधिक सक्रियता को सीमित करना आवश्यक है, जो स्टिंग अवरोधकों के संभावित मूल्य को उजागर करता है। हालांकि, स्टिंग एगोनिस्ट के विपरीत, स्टिंग अवरोधकों का विकास अभी भी अपनी प्रारंभिक अवस्था में है, और किसी भी दवा उम्मीदवार ने अभी तक नैदानिक ​​​​अध्ययन में प्रवेश नहीं किया है। ज्ञात स्टिंग अवरोधकों में दो प्रकार के यौगिक शामिल हैं: प्रतिस्पर्धी प्रतिपक्षी (एसएन-011 और मर्क-18) और सहसंयोजक अवरोधक (एच151) [20-22]। पहले पहचाने गए सहसंयोजक STING अवरोधक Cys88/91 या Cys91 के साथ परस्पर क्रिया करते हैं जो CDN-बाइंडिंग पॉकेट [22] के बाहर STING के एन-टर्मिनल ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन में स्थित है। हाल ही में, दो टीमों ने क्रमिक रूप से दो संरचनात्मक प्रकार के स्टिंग प्रतिपक्षी की सूचना दी है जो 20 3 0 -सीजीएएमपी बाइंडिंग पॉकेट पर कब्जा कर लेते हैं ताकि सीजीएएमपी की सक्रियता को बाधित कर सकें, जो सीडीएन-बाइंडिंग पॉकेट में दोधारी प्रभाव का सुझाव देता है। ,21]।

यहां, हम एक नया दृष्टिकोण प्रदान करते हैं। हमारा सुझाव है कि नीचे की जेब जहां डीएमएक्सएए और सीएमए स्थित हैं, हमारे गहन डेटा खनन और पहचाने गए स्टिंग प्रोटीन की सह-क्रिस्टल संरचना जानकारी की तुलना के आधार पर स्टिंग अवरोधकों के विकास की सुविधा प्रदान करती है। हमारे पिछले अध्ययन ने सीएमए और डीएमएक्सएए एनालॉग्स की एक श्रृंखला की सूचना दी और यौगिकों 3 और 4 की पहचान की जो एचएसटीइंग से जुड़ते हैं लेकिन कमजोर सेलुलर क्षमता के साथ [23] (चित्र 2)।

चित्र 2. यौगिकों 3 और 4 की रासायनिक संरचनाएँ उनकी जैविक गतिविधियों पर डेटा के साथ। यौगिकों 1-4 के ईसी50 मूल्यों को स्टिंग रिपोर्टर कोशिकाओं द्वारा मापा गया था, और बाइंडिंग आईसी50 को स्टिंग प्रतियोगिता बाइंडिंग किट द्वारा मापा गया था।

इस पेपर में, नीचे की जेब में अधिक संपर्कों के साथ अधिक शक्तिशाली बाइंडिंग एजेंटों की खोज के लिए स्टिंग अवरोधकों के डिजाइन के संबंध में, हमने क्रमशः 3 और 4 के लिए संरचनात्मक अनुकूलन किया। इसके बाद, हमने प्रतिस्पर्धा-बाध्यकारी परख पर आधारित एक एसएआर अध्ययन किया। बायोएक्टिविटी मूल्यांकन में, यौगिकों 11 और 27 ने व्यापक-स्पेक्ट्रम बाइंडर्स के रूप में कार्य किया और कई रिपोर्ट की गई कोशिकाओं में स्टिंग निरोधात्मक गतिविधि के माइक्रोमोलर स्तर का प्रदर्शन किया। डॉकिंग संरचना के संदर्भ में, दो यौगिक 11 अणु hSTING को एक निष्क्रिय "खुली" संरचना में रखते हैं, इस प्रकार प्रतिस्पर्धात्मक रूप से अंतर्जात 20 3 0 -cGAMP बाइंडिंग को रोकते हैं, जो मर्क की क्रिस्टल संरचना -18 और डॉकिंग संरचना के समान है एसएन का -011 [20,21]।

2. परिणाम

2.1. स्टिंग इनहिबिटर्स के रूप में DMXAA डेरिवेटिव्स की डिज़ाइन रणनीति

2.1.1. विभिन्न क्रिस्टल संरचनाओं की तुलना करके स्टिंग अवरोधकों के लिए डिज़ाइन साइटों की पहचान

स्टिंग लिगैंड बाइंडिंग डोमेन (एलबीडी) का एपीओ-प्रोटीन गैर-लिगैंड में एक सममित डिमर के रूप में क्रिस्टलीकृत हुआ, जो जेल निस्पंदन और विश्लेषणात्मक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन विश्लेषण [24-26] के कारण साबित नहीं हुआ। स्टिंग डिमर दो मोनोमर्स के बीच इंटरफेस पर स्थित लिगैंड बाइंडिंग साइट के साथ तितली जैसी संरचना को अपनाता है। सबसे पहले, यह पेपर hSTING और mSTING प्रोटीन के बुनियादी ढांचे और सक्रियण तंत्र की जांच करता है, उनके बीच के अंतरों की तुलना करता है, साथ ही कुछ दिलचस्प अंतर्दृष्टि का खुलासा करता है। एपीओ संरचना के लिए, दोनों प्रोटीनों की प्राकृतिक संरचना से पता चलता है कि mSTING hSTING (चित्रा 3) की तुलना में अधिक केंद्रित है। शिह एट अल. hSTING और mSTING के बीच अंतर का अध्ययन करने के लिए आणविक गतिशीलता (MD) सिमुलेशन को नियोजित किया गया है, जिससे पता चलता है कि hSTING एक खुली-निष्क्रिय संरचना को प्राथमिकता देता है, और mSTING एक लिगैंड बाउंड के बिना भी एक बंद-सक्रिय संरचना को प्राथमिकता देता है [27]।

जब 20,{1}}cGAMP से बंधा होता है, तो hSTING का गठनात्मक संक्रमण खुले (एपो-प्रोटीन, पार्श्व दूरी ~57 Å) से बंद (cGAMP-बाउंड प्रोटीन, पार्श्व दूरी ~40 Å) तक होता है, जबकि इसके विपरीत mSTING (29 Å से 40 Å) के लिए सत्य है। Apo-hSTING की संरचना apo-mSTING से नाटकीय रूप से भिन्न है, लेकिन STING की संरचनाएं 20,{11}}cGAMP ओवरलैप के साथ जटिल हैं। DMXAA, CMA, और cGAMP विभिन्न संरचनात्मक मचानों के साथ स्टिंग एगोनिस्ट हैं, लेकिन mSTING प्रोटीन से बंधने पर उनकी सक्रियण संरचनाएं भी मूल रूप से समान हैं (चित्रा 3)। ऊपर वर्णित परिदृश्य इस बात की गवाही देते हैं कि hSTING और mSTING के उत्तेजना तंत्र आश्चर्यजनक रूप से भिन्न हैं; हालांकि, स्टिंग द्वारा सक्रिय किए गए अनुरूपण अपेक्षाकृत स्थिर हैं, प्रजातियों की चयनात्मकता और एगोनिस्ट रीढ़ की हड्डी के प्रकार से स्वतंत्र हैं (जबकि स्टिंग एगोनिस्ट तक सीमित हैं जो गठनात्मक परिवर्तन लाते हैं)। विभिन्न क्रिस्टल कॉम्प्लेक्स के बाइंडिंग पॉकेट वॉल्यूम आम तौर पर अभिसरण (~ 300 Å3, टेबल एस 1) होते हैं, जो स्टिंग प्रोटीन सक्रियण संरचना की स्थिरता का एक और प्रमाण है।

चित्र 3. एपीओ- और कंपाउंड-बाउंड स्टिंग क्रिस्टल संरचनाओं की तुलना। mSTING प्रोटीन गेहूं (लाल रेखा के साथ परीक्षण की गई दूरी), PDB कोड: 4KC 0 (apo), 4LOJ (बाउंड-सीजीएएमपी), 4LOL (बाउंड-DMXAA), और 4JC5 (बाउंड-CMA) है।

दूसरे, सक्रियण गठनात्मक स्थिरता के उपरोक्त निष्कर्षों के आधार पर, हमने विभिन्न संरचनात्मक एगोनिस्टों की स्थिति का पता लगाने के लिए cGAMP, DMXAA, CMA, SR717, और MSA02 की सह-क्रिस्टल संरचनाओं को आरोपित किया, जो बंद-संरचनात्मक स्टिंग एगोनिस्ट हैं। स्टिंग प्रोटीन बाइंडिंग साइटें। प्रोटीन पॉकेट में स्टिंग एगोनिस्ट के वितरण के बाद प्रोटीन पॉकेट को दो क्षेत्रों में विभाजित किया जा सकता है: निचली पॉकेट और ऊपरी पॉकेट (चित्रा 4ए)। mSTING एगोनिस्ट DMXAA और CMA को छोड़कर जो पूरी तरह से निचली जेब में हैं, अन्य एगोनिस्ट hSTING मार्ग को सक्रिय कर सकते हैं और ऊपरी क्षेत्र में स्थित हो सकते हैं। फिर हमने स्टिंग प्रोटीन (लिगैंड के 5 Å के भीतर; चित्र S1) से जुड़े अमीनो एसिड अवशेषों के साथ पांच स्टिंग एगोनिस्ट की बातचीत को मैप किया, जिसमें दिखाया गया कि प्राथमिक अमीनो एसिड में R238, Y167, R232, S162, T263 और T267 शामिल हैं। (mSTING संगत अवशेष अनुक्रम संख्या शून्य से एक)। अवशेषों को जेबों से क्रमिक रूप से मिलाने से पता चला कि T267, T263, और S162 नीचे की जेब में हैं; शीर्ष पॉकेट में R238, R232, और Y167 हैं (चित्र 4बी)। जैसा कि बताया गया है, R238, Y167, और R232 STING के लिए एगोनिस्ट बाइंडिंग के लिए आवश्यक हैं, विशेष रूप से R238 (mSTING प्रोटीन R237 से मेल खाता है), जिसके उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप स्थिरीकरण (लिगैंड बाइंडिंग) का पूर्ण नुकसान होगा [28-30]। चे एट अल. यह भी पता चला है कि कुंजी-अवशेष R238 DMXAA के बंधन पर हावी है, और बिंदु उत्परिवर्तन (S162A/E260I) एमडी सिमुलेशन द्वारा DMXAA के साथ R238 की बातचीत को बढ़ा सकते हैं [31]।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

सिस्टैंच इनहांस इम्युनिटी उत्पादों को देखने के लिए यहां क्लिक करें

【अधिक के लिए पूछें】 ईमेल:cindy.xue@wecistanche.com / व्हाट्स ऐप: 0086 18599088692 / वीचैट: 18599088692

mSTING प्रोटीन पॉकेट पर कब्जा करने के लिए, DMXAA या CMA ने एक अद्वितीय बाइंडिंग मोड अपनाया जिसमें दो छोटे-अणु एगोनिस्ट एक एकल mSTING होमोडीमर से जुड़ते हैं। DMXAAs कीटो समूह और T266 साइड चेन (hSTING 267 से मेल खाती है) के बीच हाइड्रोजन बॉन्ड द्वारा निचली जेब में मजबूती से स्थापित होते हैं, जबकि कार्बोक्सिलेट समूह R237 और T262 साइड चेन (चित्रा 5 ए) के साथ इंटरैक्ट करता है। R237 (शीर्ष पॉकेट में एकमात्र प्रमुख अमीनो एसिड) के साथ DMXAA की परस्पर क्रिया mSTING गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण है। अक्सर अनदेखा किया जाने वाला विवरण यह है कि DMXAA केवल सममित मोनोमेरिक प्रोटीन के R237 पर कार्य कर सकता है, उदाहरण के लिए, DMXAA (अणु A) R237B (चित्र 5a) को प्रभावित करता है। क्योंकि DMXAA सबसे नीचे बैठता है, अणु A और R237B के बीच की दूरी 3.06 Å है, जबकि R237A की दूरी 5 Å (चित्र 5b) से अधिक है। mSTING प्रोटीन की अधिक कॉम्पैक्ट पॉकेट से लाभ उठाते हुए, DMXAA सममित mSTING मोनोमर के R237 के साथ सहजता से इंटरैक्ट करता है, लेकिन DMXAA के पास गठनात्मक रूप से खुले एपो-hSTING प्रोटीन (चित्रा 3) में किसी भी R238 के साथ जुड़ने का कोई तरीका नहीं है। इसलिए, DMXAA की पॉकेट स्थिति hSTING मार्ग की उत्तेजना को ख़राब कर देती है। हाल ही में, DMXAA के 2:1 बाइंडिंग अनुपात से प्रेरित होकर, मर्क ने बाइंडिंग पॉकेट पर कब्ज़ा करने में सक्षम स्टिंग प्रतिपक्षी की खोज की है [21]। मर्क 18 और hSTING प्रोटीन के क्रिस्टल कॉम्प्लेक्स से पता चलता है कि यौगिक मुख्य रूप से प्रोटीन पॉकेट के नीचे स्थित है और S162, T263 और T267 के साथ इंटरैक्ट करता है, जो सभी DMXAA (चित्र 5c) के गुणों से मेल खाते हैं। इससे, परिकल्पनाएँ उत्पन्न हुईं: शीर्ष जेब स्टिंग एगोनिस्ट को डिजाइन करने के लिए एक उत्कृष्ट गुहा है; निचली जेब अवरोधकों के लिए अधिक उपयुक्त घोंसला है, और DMXAA या CMA की संरचना को स्टिंग प्रतिपक्षी बनने की क्षमता के लिए अनुकूलित किया गया है।

चित्र 4. स्टिंग बाइंडिंग साइटों का उपखंड और प्रमुख अमीनो एसिड के साथ वितरण। (ए) स्टिंग मोनोमर में दो क्षेत्रों का स्थान। निचली जेब मैजेंटा रंग की है और ऊपरी जेब हरे रंग की है। ओवरलैपिंग क्रिस्टल कॉम्प्लेक्स के लिए पीडीबी कोड इस प्रकार हैं: 4LOH (cGAMP, हरा), 6UKV (MSA-02, पीला), 6XNP (SR717, नारंगी), 4LOL (DMXAA, मैजेंटा), और 4JC5 (CMA, बैंगनी)। (बी) शीर्ष और निचले क्षेत्रों में प्रमुख अमीनो एसिड का वितरण। नीचे की जेब में अवशेष मैजेंटा में दिखाए गए हैं, और हरे रंग शीर्ष क्षेत्र में हैं।

चित्र 5. DMXAA और मर्क 18 के क्रिस्टल कॉम्प्लेक्स। (ए) DMXAA और mSTING के कॉम्प्लेक्स में अंतर-आणविक संपर्क। बाउंड DMXAA को ग्रे रंग में दिखाया गया है, हरे और बैंगनी रंग में दिखाए गए सममित डिमर में व्यक्तिगत स्टिंग सबयूनिट के साथ। ए और बी सुपरस्क्रिप्ट प्रोटीन मोनोमर या व्यक्तिगत लिगैंड पहचान का संकेत देते हैं। (बी) क्रमशः प्रमुख अवशेषों आर237ए और आर237बी और डीएमएक्सएए (अणु ए) के बीच की दूरी। DMXAA के कार्बोक्सिल का R237A 6.02 Å है, DMXAA के कार्बोक्सिल का R237B 3.06 Å है। (सी) hSTING प्रोटीन (PDB 6MXE) से बंधे मर्क 18 की क्रिस्टल संरचना और इसके अंतर-आणविक संपर्कों का विवरण। बंधे हुए लिगैंड को ग्रे रंग में दिखाया गया है, हरे और बैंगनी रंग में दिखाए गए सममित डिमर में व्यक्तिगत स्टिंग सबयूनिट के साथ। ए और बी सुपरस्क्रिप्ट प्रोटीन मोनोमर या व्यक्तिगत लिगैंड पहचान का संकेत देते हैं

चित्र 6. DMXAA और CMA डेरिवेटिव के लिए अनुसंधान आधार और हमारे अनुकूलित हॉटस्पॉट। (ए) डीएमएक्सएए की संरचना का सुपरपोजिशन mSTING (PDB: 4LOL, गहरे नीले रंग के रूप में दिखाया गया है) के साथ hSTING S162A/G230I/Q266I (PDB: 4QXR, नारंगी के रूप में दिखाया गया है) से जुड़ा हुआ है। (बी) उत्परिवर्तित hSTING (PDB: 4QXR) से बंधे DMXAA का विवरण। धराशायी लाइन बॉक्स संभावित संशोधन साइटों का प्रतिनिधित्व करते हैं। हरे रंग में दिखाए गए अमीनो अवशेष उत्परिवर्तित अवशेष (S162A/Q266I) हैं।

हमने पाया कि होस्टिंग पाथवे को सक्रिय करने में DMXAA की असमर्थता नीचे की जेब में DMXAA के स्थान से संबंधित थी (धारा 2.1.1 के अनुसार), जिसने हमें STING अवरोधकों का डिज़ाइन विचार भी प्रदान किया: DMXAA डेरिवेटिव के संपर्कों को बढ़ाना स्टिंग को गैर-सक्रिय संरचना में रखने के लिए संरचनात्मक संशोधनों के माध्यम से निचले क्षेत्र के साथ। S162 और Q266 बाइंडिंग साइट के निचले भाग में उचित रूप से स्थित हैं, इसलिए DMXAAs को दोनों के सीधे संपर्क में अच्छी तरह से तैनात किया जा सकता है, जिससे लिगैंड पर बॉटम पॉकेट अमीनो एसिड के प्रभाव की खोज में सुविधा होती है। संरचना-गतिविधि संबंध (एसएआर) विश्लेषण से पता चला कि 5,{8}}डाइमिथाइल मोएटिटी और सी{9}}स्थिति मेथॉक्सी 3 और 4 की जैविक गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण थे। जैसा कि चित्र 6बी में दिखाया गया है, 5 ,6-डाइमिथाइल समूह ने नीचे की जेब में कई अमीनो एसिड के साथ हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन बनाया; DMXAA की C7 स्थिति की अमीनो एसिड Q266 से निकटता के कारण, संबंधित मेथॉक्सी संशोधन ने 3 और 4 को होस्टिंग से जुड़ने की अनुमति दी। इसलिए, हमारे संरचनात्मक विस्तार में 5, 6- डाइमिथाइल और सी 7 मेथॉक्सी की लॉकिंग और उपन्यास डेरिवेटिव के डिजाइन को सी 1/सी 2 स्थिति (एस 162 को प्रभावित करने) पर ध्रुवीय समूह को संशोधित करने और कार्बोक्जिलिक एसिड समूह को बदलने पर ध्यान केंद्रित किया गया था। संरचनात्मक विविधता का विस्तार)। हमने यौगिकों 3 और 4 को मचान के रूप में उपयोग करके डेरिवेटिव की एक श्रृंखला को डिजाइन और संश्लेषित किया, इस प्रकार हमारे प्रस्तावित अवरोधक अनुमान को मान्य किया।

2.2. रसायन विज्ञान

योजना 1 में सभी मध्यवर्ती और लक्ष्य यौगिकों की तैयारी की रूपरेखा दी गई है। {{1}मेथॉक्सी-2,{3}}डाइमिथाइल-4-नाइट्रोबेंजीन (5) और 2-ब्रोमोबेंजोइक एसिड ( 7) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध थे। प्रारंभ में, 1-मेथॉक्सी-2,{{10}डाइमिथाइल-4-नाइट्रोबेंजीन को 4-मेथॉक्सी- 2,3-डाइमिथाइलनिलिन (6) में परिवर्तित किया गया था लौह चूर्ण के साथ कमी के माध्यम से। फिर, 6 और 7 को संबंधित मध्यवर्ती 8 प्रदान करने के लिए एन, एन-डाइमिथाइलफॉर्मामाइड में तांबे और तांबे (आई) ऑक्साइड द्वारा उत्प्रेरक के साथ पोटेशियम कार्बोनेट के साथ उल्मैन प्रतिक्रिया के अधीन किया गया था। मध्यवर्ती प्रदान करने के लिए 8 की इंट्रामोल्यूलर संक्षेपण प्रतिक्रिया ईटन के अभिकर्मक के साथ की गई थी 2-मेथॉक्सी-3,4-डाइमिथाइलएक्रिडिन-9(10H)-एक (9)। 9 का बाद का प्रतिस्थापन एथिल ब्रोमोएसीटेट के साथ किया गया था, और एचबीआर के 1 इक्विव के नुकसान से एथिल 2-(2-मेथॉक्सी-3,{33}}डाइमिथाइल-9- हुआ। ऑक्सोएक्रिडिन-10(9H)- yl)एसीटेट (10)। अंत में, 10 में एथिल एसीटेट को सोडियम हाइड्रॉक्साइड द्वारा कार्बोक्जिलिक एसिड में हाइड्रोलाइज किया गया, जिससे 2-(2-मेथॉक्सी-3, 4- डाइमिथाइल-9-ऑक्सोएक्रिडिन-10 प्राप्त हुआ। (9एच)-वाईएल)एसिटिक एसिड (11)।

योजना 1. ए. EtOH, Fe, NH4Cl; बी। डीएमएफ, Cu, Cu2O, K2CO3; सी। ईटन का अभिकर्मक; डी। BrCH2COOC2H5 , NaH; इ। NaOH; एफ। CCl3CH(OH)2 , NH2OH; जी। H2SO4; एच। EtOH, H2O2, NaOH।

अधिक लक्ष्य यौगिकों के बाद के संश्लेषण के लिए, हमें पहले यौगिक 2-एमिनो-5-मेथॉक्सी-3,4-डाइमिथाइलबेन्ज़ोइक एसिड (14) को संश्लेषित करना होगा। 6 को क्लोरल हाइड्रेट और हाइड्रॉक्सिलमाइन के साथ प्रतिक्रिया की गई, जिससे एसिटामाइड और हाइड्रॉक्सीमिनो का निर्माण हुआ, मध्यवर्ती (ई) -2- (हाइड्रॉक्सिलमाइन) - एन- ({{9} मेथॉक्सी -2, 3- डाइमिथाइलफेनिल) के साथ )एसिटामाइड (12). 12 के हाइड्रॉक्सीमिनो की बाद की बेकमैन पुनर्व्यवस्था प्रतिक्रिया लैक्टम व्युत्पन्न 13 को वहन करने के लिए सल्फ्यूरिक एसिड के साथ की गई थी। अंत में, मध्यवर्ती 13 को इथेनॉल समाधान 14 में हाइड्रोजन पेरोक्साइड और सोडियम हाइड्रॉक्साइड के साथ हाइड्रोलाइज किया गया था। प्रतिक्रिया के लिए शुरुआती सामग्री के रूप में 14 का उपयोग करते हुए, हमने आगे चलकर {{18}मेथॉक्सी-9,{20}डाइमिथाइल{21}हाइपिरोलो[3,2,{24}}डी]एक्रिडीन-1,6( की एक शृंखला संश्लेषित की गई 2H)-R1 और R2 पर प्रतिस्थापन के साथ डायोन डेरिवेटिव। प्रारंभ में, 14 और 15-19 को संबंधित मध्यवर्ती 20-24 प्रदान करने के लिए एन, एन-डाइमिथाइलफॉर्मामाइड में कॉपर और कॉपर (आई) ऑक्साइड द्वारा उत्प्रेरक के साथ पोटेशियम कार्बोनेट के साथ उल्मैन प्रतिक्रिया के अधीन किया गया था। 20-24 की इंट्रामोल्युलर संघनन प्रतिक्रियाएं ईटन के अभिकर्मक के साथ 8-मेथॉक्सी-9,{41}}डाइमिथाइल-6एच-पाइरोलो[3,2,{46} को वहन करने के लिए की गईं। }डी]एक्रिडीन-1,6(2एच)-डायोन डेरिवेटिव (25-29)। इसी प्रकार, प्रतिक्रिया के लिए शुरुआती सामग्री के रूप में 14 का उपयोग करते हुए, हमने आगे चलकर 7-मेथॉक्सी-5,{56}डाइमिथाइल-9-ऑक्सो-9,{{ की एक श्रृंखला को संश्लेषित किया। 59}}डाइहाइड्रोएक्रिडीन-4- आर पर प्रतिस्थापन के साथ कार्बोक्जिलिक एसिड डेरिवेटिव। प्रारंभ में, 14 और 7 या 30 को एन, एन-डाइमिथाइलफॉर्मामाइड में कॉपर और कॉपर (आई) ऑक्साइड द्वारा उत्प्रेरक के साथ पोटेशियम कार्बोनेट के साथ उल्मैन प्रतिक्रिया के अधीन किया गया था। संगत मध्यवर्ती 31 और 32। 31 और 32 की इंट्रामोल्युलर संघनन प्रतिक्रियाएं ईटन के अभिकर्मक के साथ 7-मेथॉक्सी-5,{71}}डाइमिथाइल-9-ऑक्सो-9 को वहन करने के लिए की गईं। ,10-डायहाइड्रोएक्रिडिन-4-कार्बोक्जिलिक एसिड डेरिवेटिव (33,34)। इस प्रकार, हमने 16 एक्रिडोन एनालॉग्स को डिजाइन, संश्लेषित और जांचा, जिनकी संरचनाएं तालिका 1 में संक्षेपित हैं।

तालिका 1. वर्तमान अध्ययन के नए एनालॉग्स की संरचनाएँ।

2.3. नए यौगिकों की स्टिंग और उनके एसएआर से जुड़ने की क्षमता

नए यौगिकों को स्टिंग और उनके एसएआर से जोड़ने की क्षमता संरचनात्मक संशोधन की प्रभावशीलता की सीधे पुष्टि करने के लिए, हमने पहले सभी संश्लेषित यौगिकों की सीजीएएमपी विस्थापन परख द्वारा जांच की। प्रजातियों की चयनात्मकता के अलावा, STING के पांच प्रकार हैं जो मनुष्यों में बहुरूपी हैं, R232 (WT, जनसंख्या का 58%), HAQ (20%), H232 (13%), AQ (7%), और Q ( 2%) [32]। इसलिए, हमने mSTING और विभिन्न hSTING आइसोफॉर्म (WT, H232, और AQ) पर नए यौगिकों की जैव रासायनिक क्षमता का परीक्षण करने के लिए सजातीय समय-समाधान प्रतिदीप्ति (HTRF) तकनीक द्वारा वाणिज्यिक प्रतिस्पर्धा परख किट का उपयोग किया और उनकी तुलना नियंत्रण से की। जैसा कि अनुमान था, नियंत्रण यौगिक 1-4 सभी mSTING से बंधे थे; hSTING स्क्रीन से, यौगिक 3 और 4 में माइक्रोमोलर स्तर पर IC50 मान थे।

तालिका 2. विभिन्न hSTING आइसोफॉर्म और mSTING प्रतियोगिता बाइंडिंग परख वाले यौगिकों के परिणाम।

सबसे पहले, यौगिक 3 के आधार पर, C1/C2 साइट (तालिका 1) पर एक हैलोजन परमाणु या मेथॉक्सी समूह पेश किया गया था। यौगिक 27, यौगिक 3 (एफ के साथ प्रतिस्थापित सी1 स्थिति) के इष्टतम व्युत्पन्न के रूप में, यौगिक 3 (सभी जैव रासायनिक परीक्षणों में एकल-अंक माइक्रोमोलर गतिविधि, तालिका 2) की तुलना में बेहतर समग्र गतिविधि है। आर1-संशोधित यौगिक 25 में व्यापक स्पेक्ट्रम बाइंडिंग प्रभाव है लेकिन यह एफ-प्रतिस्थापित या अप्रतिस्थापित संस्करण जितना सक्रिय नहीं है। यौगिक 3 की तुलना में, C2- साइट पर प्रस्तुत समूह के साथ यौगिक (26, 28, और 29) सभी ने बंधन संबंध में कमी की अलग-अलग डिग्री दिखाई, विशेष रूप से यौगिक 29। दूसरा, यौगिक 4 की रीढ़ को बनाए रखना और प्रतिस्थापित करना C1/C2 साइट के विरुद्ध हैलोजन परमाणु से, हमें यौगिक 35-38 (तालिका 1) प्राप्त हुए। ये यौगिक 100 µM तक की सांद्रता पर सभी चार विस्थापन परीक्षणों में निष्क्रिय थे, जिससे पता चलता है कि C1/C2 साइट पर हैलोजन परमाणु के साथ प्रतिस्थापन बर्दाश्त नहीं किया जाता है। फिर, हमने यौगिक 4 पर एसीटेट समूह को कार्बोक्सिल समूह (33) में बदल दिया और सी2 साइट (34) पर मेथॉक्सी पेश किया। दुर्भाग्य से, यह परिवर्तन विफल रहा क्योंकि दोनों यौगिक निष्क्रिय रहे। अपनी विफलता से सीखते हुए, हमने एसीटेट समूह को एन स्थिति में स्थानांतरित करके और सी1/सी2 स्थिति को अपरिवर्तित छोड़कर यौगिक 4 डेरिवेटिव के एसएआर का पता लगाया। कंपाउंड 11 स्टिंग वेरिएंट की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए बाइंडिंग दिखाता है, सभी 20 µM से नीचे IC50 के साथ; गतिविधि यौगिक 4 से बेहतर है और यौगिक 27 से तुलनीय है। इसके अलावा, यौगिक 9 (एन साइट पर कोई कार्बोक्सिल समूह नहीं) और यौगिक 10 (एन-एसीटेट एथिल) यौगिक 11 के सिंथेटिक अग्रदूत हैं जो स्टिंग से बंध नहीं सकते हैं, जो अप्रत्यक्ष रूप से प्रदर्शित करता है कार्बोक्जिलिक एसिड समूह का महत्व.

2.4. सेलुलर जैविक मूल्यांकन

2.4.1. स्टिंग एगोनिस्ट गतिविधियों के साथ नए एनालॉग्स की इन विट्रो स्क्रीनिंग

हमने 293T hSTING-WT, 293T-mSTING, और THP1-KO-STING रिपोर्टर सेल लाइन्स (इनविवो जेन द्वारा प्रदान की गई) का उपयोग करके स्टिंग एगोनिस्ट गतिविधि के लिए सभी यौगिकों की व्यवस्थित रूप से जांच की। 293T-hSTING-R232 कोशिकाओं और 293T-mSTING कोशिकाओं का उपयोग करके, हमने स्रावी भ्रूणीय क्षारीय फॉस्फेट (SEAP) गतिविधि की निगरानी करके प्रकार I IFN प्रेरण के अप्रत्यक्ष उपाय के रूप में IRF मार्ग की सक्रियता दिखाई, जिससे प्रजातियों की चयनात्मकता के हमारे अध्ययन में योगदान हुआ। यौगिक. THP1-KO-STING कोशिकाएं THP1-डुअल कोशिकाओं से STING जीन के स्थिर नॉकआउट द्वारा उत्पन्न की गईं, और हमने यह पुष्टि करने के लिए THP1-KO-STING कोशिकाओं को नियोजित किया कि क्या यौगिक कार्य प्रदर्शित करता है स्टिंग-निर्भर साइटोकिन प्रेरण का। हमने सभी लक्षित डेरिवेटिव्स की स्टिंग एगोनिस्ट गतिविधियों की तुलना म्यूरिन (डीएमएक्सएए) और मानव (20,30 -सीजीएएमपी) स्टिंग के संदर्भ एगोनिस्टों से की है। आश्चर्यजनक रूप से, संश्लेषित यौगिकों में से कोई भी hSTING या mSTING मार्ग (200 µM पर अधिकतम सांद्रता) को सक्रिय नहीं कर सका, जो बाइंडिंग परख के परिणामों के साथ गंभीर रूप से असंगत है। इसलिए, हमारे जांचे गए स्टिंग बाइंडिंग एजेंटों में उपन्यास स्टिंग प्रतिपक्षी के रूप में संभावित बाइंडिंग पैटर्न हो सकते हैं।

2.4.2. स्टिंग अवरोधक गतिविधियों के साथ स्टिंग बाइंडर्स की इन विट्रो स्क्रीनिंग

सबसे पहले, हमने पूर्व-प्रयोग किया: एक सकारात्मक संदर्भ के रूप में 1 µM सहसंयोजक अवरोधक H151 के साथ, हमने इष्टतम स्थितियों को निर्धारित करने के लिए 20 3 0 -cGAMP की विभिन्न सांद्रता के साथ सह-संवर्धित mSTING और hSTING रिपोर्टर सेल लाइनों में इसके निरोधात्मक स्तरों का पता लगाया। अवरोधक की स्क्रीनिंग के लिए (प्रोटोकॉल विवरण के लिए धारा 4.2.3 देखें)। दूसरा, हमने शुरू में 100 µM की सांद्रता पर पूर्व-प्रयोगात्मक तरीकों से उपचार करके नए यौगिकों की निरोधात्मक क्षमता की जांच की। हमने पाया कि ब्रॉड-स्पेक्ट्रम स्टिंग-बाइंडिंग यौगिक 11 और 27 ने म्यूरिन और मानव स्टिंग रिपोर्टर कोशिकाओं दोनों में उत्कृष्ट निषेध प्रदर्शित किया, यौगिक 3 और 4 और अन्य यौगिक उतने प्रभावी नहीं थे। तीसरा, हम दोनों IC50 मानों का परीक्षण करने और H151 के साथ उनकी तुलना करने के लिए यौगिक 11 और 27 के लिए एकाग्रता ग्रेडिएंट सेट करते हैं। यौगिक 11 और 27 माइक्रोमोलर सांद्रता पर सक्रिय थे और hSTING और mSTING दोनों मार्गों में cGAMP-प्रेरित IFN-अभिव्यक्ति को बाधित कर रहे थे।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

IC50 मानों के साथ, कंपाउंड 11 (hSTING 19.93 µM और mSTING 15.47 µM) ने कंपाउंड 27 (hSTING 38.75 µM और mSTING 30.81 µM) से बेहतर प्रदर्शन किया (चित्र 7a)। इसकी तुलना में, 293T-hSTING और 293T-mSTING कोशिकाओं में H-151 का IC50 मान 1.04 और 0.82 µM (चित्र 7a) था, जो दर्शाता है कि सहसंयोजक अवरोधक H-151 STING पर बेहतर निरोधात्मक प्रभाव प्रदर्शित करता है। सेल-आधारित परखों में निर्भर सिग्नलिंग। यौगिकों 11 और 27 की निरोधात्मक संपत्ति की और पुष्टि करने के लिए, हमने एक और THP-1 मानव मोनोसाइट रिपोर्टर सेल लाइन THP1-Dual-hSTING-R232 को नियोजित किया, जो IRF सक्रियण पर रिपोर्ट करने के लिए एक दोहरे-रिपोर्टर सिस्टम का उपयोग करता है प्रकार I IFN प्रेरण के अप्रत्यक्ष माप के रूप में और NF-κB सक्रियण पर प्रिनफ्लेमेटरी साइटोकिन प्रेरण के अप्रत्यक्ष माप के रूप में। 20,{37}}cGAMP के साथ THP{35}} रिपोर्टर सेल लाइन उत्तेजना के बाद, हमने I IFN और प्रिनफ्लेमेटरी साइटोकिन के प्रेरण को रोकने के लिए उचित सांद्रता के साथ STING अवरोधक जोड़े। जैसा कि अनुमान था, यौगिक 11, 27, और एच151 ने स्टिंग-ट्रिगर आईआरएफ और एनएफ-κबी पाथवे सक्रियणों को महत्वपूर्ण रूप से बाधित किया (चित्र 7बी)। इसके अलावा, निरोधात्मक गतिविधि पर यौगिकों की साइटोटॉक्सिसिटी के प्रभाव को बाहर करने के लिए, हमने सेलुलर गतिविधि को परखने के लिए सेलटाइटर-ग्लो किट का उपयोग किया। संतुष्टिदायक बात यह है कि, H151 के विपरीत, जब यौगिकों 11 और 27 को सांद्रता (5 से 100 µM) में जोड़ा जाता है, जो STING को रोकता है, तो सेल व्यवहार्यता परख द्वारा 293T और THP -1 कोशिकाओं में साइटोटॉक्सिसिटी का कोई सबूत नहीं दिखा, जो पहले से ही महत्वपूर्ण साइटोटॉक्सिसिटी दिखा रहा था। 10 µM (चित्र 7सी)। इन अध्ययनों ने यौगिकों 11 और 27 को मध्यम स्टिंग अवरोधकों के रूप में पहचाना, जो प्रजातियों की संवेदनशीलता को तोड़ते हैं और स्पष्ट साइटोटॉक्सिसिटी के बिना आईआरएफ और एनएफ-κबी दोहरे मार्गों को रोकते हैं।

2.5. कंपाउंड 11 की गतिविधि के संरचनात्मक आधार की जांच डॉकिंग द्वारा की गई थी

प्रतिस्पर्धी स्टिंग प्रतिपक्षी का तंत्र बाइंडिंग साइट पर कब्जा करना और स्टिंग प्रोटीन की सक्रियण संरचना को बाधित करना है [20,21]। hSTING के लिए विशिष्ट, प्रतिपक्षी hSTING डिमर को "खुली" संरचना में छोड़ देते हैं। हमने मानव स्टिंग सीटीडी (पीडीबी आईडी कोड 6एमएक्सई) और सर्वोत्तम सक्रिय यौगिक 11 के बीच बातचीत को निर्धारित करने के लिए ग्लाइड डॉकिंग का उपयोग किया। डॉकिंग संरचना में, दो यौगिक 11 आंशिक रूप से एक दूसरे के समानांतर हैं और फांक के नीचे स्थित हैं। hSTING डिमर (चित्र 8a), hSTING को एक निष्क्रिय खुली संरचना में लॉक करता है (चित्र S2)। कंपाउंड 11 मुख्य रूप से हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन पैदा करता है, जिसमें लिगैंड की ट्राइसाइक्लिक संरचना नीचे की जेब में इंटरफ़ेस के साथ अधिक संपर्क की अनुमति देती है। DMXAA या CMA की तरह, कार्बोक्सिल समूह T263 की साइड चेन के साथ एक हाइड्रोजन बॉन्ड बनाता है, जबकि कीटो समूह T267 की साइड चेन के साथ एक हाइड्रोजन बॉन्ड बनाता है। स्थिति C2 पर मेथॉक्सी S162 के साथ घनिष्ठ रूप से संपर्क करता है, जिसके परिणामस्वरूप लिगैंड-लिगैंड एक-दूसरे के निकट होते हैं। बीआईएस-मिथाइल प्रतिस्थापन न केवल लिगैंड-लिगैंड इंटरैक्शन उत्पन्न करते हैं, बल्कि शीर्ष पॉकेट के प्रवेश द्वार पर भी आसानी से स्थित होते हैं, जो प्राकृतिक स्टिंग एगोनिस्ट को प्रमुख अवशेषों से बांधने से रोकता है (चित्र 8बी)।

चित्र 7. ब्रॉड-स्पेक्ट्रम स्टिंग-बाइंडर्स 11 और 27 स्टिंग विरोधी हैं। (ए) यौगिकों 11 और 27 की रासायनिक संरचनाएं, और एम- और एच-स्टिंग मार्गों दोनों के खिलाफ स्टिंग अवरोधकों की निरोधात्मक गतिविधि। 293T कोशिकाएं (mSTING या hSTING), जिन्हें यौगिकों की विभिन्न सांद्रता के साथ पहले से उपचारित किया गया था, उन्हें 20,30 -cGAMP द्वारा उत्तेजित किया गया था; आईआरएफ मार्ग गतिविधि का निषेध अप्रत्यक्ष रूप से ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) मूल्यों द्वारा मापा गया था। खुराक-निर्भर निरोधात्मक वक्र को यौगिकों के IC50s की गणना के लिए फिट किया गया था। (बी) यौगिक 11 और 27 hSTING दोहरे मार्गों की सक्रियता को रोक सकते हैं। THP1-hSTING-R232 रिपोर्टर सेल लाइनों को 20,30 -cGAMP से उत्तेजित किया गया था, और यौगिकों के साथ इलाज किया गया था, IFN- प्रेरण को बाधित किया गया था (लूसिया ल्यूसिफरेज की सापेक्ष प्रकाश इकाइयों (आरएलयू) द्वारा गतिविधि का आकलन करना) ) और प्रिनफ्लेमेटरी साइटोकिन इंडक्शन (ओडी मूल्यों द्वारा मापी गई एसईएपी की गतिविधि की निगरानी)। (सी) नए एनालॉग सहसंयोजक अवरोधक की तुलना में कम साइटोटोक्सिसिटी प्रदर्शित करते हैं। 293T (या THP-1 कोशिकाएं) को संकेतित समय अवधि के लिए अवरोधकों की संकेतित सांद्रता के साथ ऊष्मायन किया गया था। सेल व्यवहार्यता को सेलटाइटर-ग्लो किट द्वारा मापा गया था। दिखाए गए डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य हैं। एनएस (कोई महत्वपूर्ण नहीं) पी > 0.05, *** पी < 0.001। पी मानों की गणना दो-पूंछ वाले टी-टेस्ट द्वारा की गई थी।

चित्र 8. स्टिंग प्रोटीन से बंधे यौगिक 11 की डॉकिंग संरचना। (ए) यौगिक का बाइंडिंग मोड 11। बंधे हुए लिगैंड को ग्रे रंग में दिखाया गया है, सममित डिमर में व्यक्तिगत स्टिंग सबयूनिट हरे और बैंगनी रंग में दिखाए गए हैं। स्टिंग मोनोमर की बाइंडिंग पॉकेट में, नीचे का रंग मैजेंटा है और शीर्ष हरा है। (बी) यौगिक 11 के अंतर-आण्विक संपर्क स्टिंग से बंधे हैं। यौगिक 11 और संपर्क स्टिंग अमीनो एसिड को एक स्टिक मॉडल के रूप में दिखाया गया है। अंतर-आणविक संपर्क और हाइड्रोजन बांड को एक पीली धराशायी रेखा के साथ दिखाया गया है। ए और बी सुपरस्क्रिप्ट प्रोटीन मोनोमर या व्यक्तिगत लिगैंड पहचान का संकेत देते हैं।

3. चर्चा

स्टिंग के तंत्र और क्रिस्टल संरचना पर व्यापक रिपोर्टों के प्रकाश में, हमारे पास इस वैज्ञानिक समस्या को समझाने का अवसर है कि डीएमएक्सएए में मानव स्टिंग एगोनिस्टिक गतिविधि क्यों नहीं है। इस अध्ययन में, विभिन्न स्टिंग क्रिस्टल संरचनाओं की तुलना करके, हमने कुछ दिलचस्प निष्कर्ष प्राप्त किए: 1. स्टिंग सक्रियण संरचना स्थिर है; 2. hSTING और mSTING के लिए अलग-अलग सक्रियण तंत्र हैं; 3. डीएमएक्सएए और सीएमए बाइंडिंग साइट के निचले भाग में हैं जो उन्हें अन्य एगोनिस्ट से अलग करते हैं। mSTING और hSTING के विभिन्न सक्रियण तंत्रों को देखते हुए, नीचे की जेब में स्थित mSTING एगोनिस्ट DMXAA या CMA hSTING में सक्रियण नहीं कर सकते क्योंकि apo-hSTING में एक बड़ी बाइंडिंग कैविटी होती है जो लिगैंड को R238 के साथ जुड़ने से रोकती है।

गाओ एट अल. बताया गया है कि एकल उत्परिवर्तन (G230I, S162A, और Q266I) hSTING को mSTING के समान DMXAA संवेदनशीलता प्रदान करते हैं [33]। एमडी सिमुलेशन से पता चला कि ढक्कन क्षेत्र उत्परिवर्तन G230I साइड चेन DMXAA उत्सर्जन को रोकने के लिए एक स्टेरिक बाधा बनाने के लिए पर्याप्त है, जबकि DMXAA hSTING WT [27] में आसानी से बाहर निकल जाता है। बाइंडिंग साइट में hSTING पॉइंट म्यूटेशन (S162A/Q266I) के अनुरूप संरचनात्मक संशोधन के आधार पर, पर्याप्त DMXAA और CMA एनालॉग उपलब्ध हैं, लेकिन कोई शक्तिशाली hSTING एगोनिस्ट उपलब्ध नहीं हैं। इसके पीछे कारण यह हो सकता है कि "प्राकृतिक" और "उत्परिवर्तित" hSTINGs के बीच सूक्ष्म संरचनात्मक विसंगति पहचान प्रक्रिया में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती है। एमडी सिमुलेशन के माध्यम से, चे एट अल। पाया गया कि अप्राकृतिक रूप से उत्परिवर्तित hSTINGs पानी के अणुओं की समन्वित गति को परेशान करते हैं और लिगैंड बाइंडिंग पर निष्कासित पानी की मात्रा को बदल देते हैं, जो hSTING के DMXAA सक्रियण को बहाल करने के लिए अधिक अनुकूल है [31]।

बॉटम बाइंडिंग साइट [21] पर स्टिंग अवरोधकों की अध्ययन खोज से प्रोत्साहित होकर, हम यह परिकल्पना करने का साहस करते हैं कि उसी क्षेत्र में स्थित डीएमएक्सएए, नए स्टिंग अवरोधकों में तब्दील होने की क्षमता रखता है। पिछले अध्ययन में, हमने DMXAA और CMA की संरचनाओं को सूक्ष्म संरचनात्मक संशोधनों के साथ जोड़ा और सफलतापूर्वक 3 और 4 की खोज की जो hSTING से जुड़ सकते हैं, लेकिन उनकी कमजोर स्टिंग एगोनिस्टिक गतिविधि उनकी बाध्यकारी क्षमता से मेल नहीं खाती है। इस पेपर में, डिज़ाइन का विचार 20, 30 -cGAMP के बंधन का प्रतिस्पर्धात्मक रूप से विरोध करने के लिए नीचे की जेब के साथ DMXAA एनालॉग्स के संपर्कों को और बढ़ाना है, इसलिए हमने यौगिकों 3 और 4 की अनुकूलित संरचनाओं को डिज़ाइन और संश्लेषित किया है।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

पहला स्क्रीनिंग कदम उपन्यास डेरिवेटिव की बाइंडिंग क्षमता को चिह्नित करने के लिए कई स्टिंग वेरिएंट की बाइंडिंग किट का उपयोग करके जैव रासायनिक गतिविधि का परीक्षण करना था। बाइंडिंग परख के परिणामों ने हमारे डिज़ाइन निर्देशों की सुदृढ़ता को साबित कर दिया; हमने 11 और 27 को ब्रॉड-स्पेक्ट्रम स्टिंग बाइंडर्स (3 और 4 से बेहतर) के रूप में पहचाना और एसएआर पर चर्चा की। कंपाउंड 3 के एनालॉग्स के लिए, सी1 स्थिति में संशोधनों ने विभिन्न स्टिंग वेरिएंट के लिए बाइंडिंग में काफी सुधार किया, जबकि सी2-संशोधित यौगिकों का कोई प्रभाव नहीं पड़ा। हालाँकि, C1/C2 में संरचनात्मक संशोधनों के लिए यौगिक 4 को अच्छी तरह से सहन नहीं किया गया था। कार्बोक्जिलिक एसिड स्थिति (C4 से N) को स्थानांतरित करने के बाद, हमने बेहतर स्टिंग बाइंडर 11 पाया और निर्धारित किया कि कार्बोक्जिलिक एसिड समूह गतिविधि के लिए आवश्यक था। इसके बाद, हमने तीन रिपोर्टर सेल लाइनों का उपयोग करके सेलुलर-स्तरीय गतिविधि के लिए सभी यौगिकों की जांच की, और कोई भी लक्ष्य यौगिक सक्रिय नहीं था। फिर हमने स्टिंग अवरोधकों के लिए एक स्क्रीनिंग विधि स्थापित की और सभी नए एनालॉग्स की दोबारा जांच की। स्टिंग बाइंडिंग एजेंट 11 और 27 ने प्रतिस्पर्धी बाइंडिंग परख के तुलनीय डेटा के साथ, माइक्रोमोलर निरोधात्मक गतिविधियों का प्रदर्शन किया। सहसंयोजक अवरोधक H151 ने इन विट्रो में 11 और 27 की तुलना में थोड़ी बेहतर स्टिंग निरोधात्मक गतिविधि दिखाई। इसके अलावा, हमने आगे पुष्टि की कि 11 और 27 स्टिंग दोहरे मार्गों के 20, 30 -cGAMP-प्रेरित सक्रियण को प्रभावी ढंग से रोक सकते हैं। सबसे प्रभावशाली बात यह है कि 11 और 27 उच्च सांद्रता पर उच्च स्तर की सेल व्यवहार्यता बनाए रखते हैं, जो H151 के साथ संभव नहीं है। साइटोटोक्सिसिटी सहसंयोजक अवरोधकों के साथ एक आम समस्या है और H151 के अनुप्रयोग को सीमित करती है।

डॉकिंग विश्लेषण द्वारा, हमने सर्वोत्तम सक्रिय यौगिक 11 गतिविधि के संरचनात्मक आधार में अंतर्दृष्टि प्राप्त की है। कंपाउंड 11 नीचे की जेब पर पूरी तरह से कब्जा कर लेता है, hSTING को एक निष्क्रिय खुली संरचना में रखता है और इस प्रकार प्रतिस्पर्धात्मक रूप से 20, 30 -cGAMP बाइंडिंग को रोकता है। एक्रिडीन के ट्राइसाइक्लिक रिंग की संरचना हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन उत्पन्न करने के लिए महत्वपूर्ण है, जिसमें कार्बोक्जिलिक एसिड समूह और कीटोन की मात्रा पॉकेट के निचले भाग में यौगिक को स्थिर करती है। हम अनुमान लगाते हैं कि मेथॉक्सी एस162 के साथ घनिष्ठ जुड़ाव पैदा करता है, प्रोटीन संरचना को मामूली रूप से बंद कर देता है लेकिन इसे एगोनिस्टिक संरचना में बदलने के लिए पर्याप्त नहीं है। बीआईएस-मिथाइल संरचना एक स्थानिक साइट-ब्लॉकिंग बनाती है जो लिगैंड-लिगैंड इंटरैक्शन को बढ़ाती है और शीर्ष पॉकेट में एगोनिस्ट प्रवेश को रोकती है। वर्तमान में, mSTING और STING प्रतिपक्षी की कोई सह-क्रिस्टल संरचनाएं रिपोर्ट नहीं की गई हैं, इसलिए हम डॉकिंग दृष्टिकोण का उपयोग करके mSTING के साथ यौगिक 11 की क्रिया के तंत्र की व्याख्या नहीं कर सकते हैं। हालाँकि, हम अनुमान लगाते हैं कि दो संभावनाएँ हैं: एक यह कि अभिनय सिद्धांत hSTING के समान है; दूसरा यह है कि कंपाउंड 11 mSTING को अधिक एकत्रित एपीओ संरचना में रखता है और 20, 30 - cGAMP एगोनिस्टिक प्रभाव डालने के लिए पॉकेट में प्रवेश नहीं कर सकता है। संक्षेप में, कमजोर स्टिंग एगोनिस्ट के हमारे सूक्ष्म संरचनात्मक अनुकूलन ने स्टिंग अवरोधकों की खोज के लिए जैविक कार्य को सफलतापूर्वक उलट दिया है। ये निष्कर्ष स्टिंग बाइंडिंग पॉकेट्स की जटिलता को दर्शाते हैं और स्टिंग एगोनिस्ट या अवरोधकों के दवा विकास के लिए नई शोध अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।

4. सामग्री और विधियाँ

4.1. रसायन विज्ञान

संश्लेषण में प्रयुक्त सॉल्वैंट्स और अभिकर्मक बीजिंग इनोकेम साइंस एंड टेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड (बीजिंग, चीन) से प्राप्त किए गए थे। उत्पादों की संरचनाओं की पहचान 1H और 13C-NMR स्पेक्ट्रोस्कोपी (JNM-ECA-400, जापान) द्वारा की गई थी। उत्पादों के आणविक भार को उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एचआरएमएस) द्वारा इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) के साथ आयनीकरण मोड (एगिलेंट 1260- जी 6230 ए, जर्मनी) के रूप में मापा गया था। पूरक सामग्री में यौगिकों के एनएमआर और द्रव्यमान स्पेक्ट्रा प्रदान किए गए हैं। यौगिक 35-38 हमारे द्वारा संश्लेषित और पहचाने गए थे; कृपया विवरण के लिए पहले रिपोर्ट किया गया लेख देखें [23]।

इथाइल {0}}(2-मेथॉक्सी-3,4-डाइमिथाइल-9-ऑक्सोएक्रिडिन-10 (9H)-yl)एसीटेट (1{ {25}}): {{9}मेथॉक्सी{{10}},{11}}डाइमिथाइलनिलीन (6) ({{32%).97 ग्राम, 6.4 एमएमओएल) के घोल में और कमरे के तापमान पर डीएमएफ (6 एमएल) में ब्रोमो-बेंजोइक एसिड (7) (1.29 ग्राम, 6.4 एमएमओएल), बाद में हमने पाउडर सीयू (45%) मिलाया। Cu2O ({{60}}.05 ग्राम) और K2CO3 ({{186}}.71 ग्राम, 5.1 mmol)। प्रतिक्रिया मिश्रण को 12 घंटे के लिए 110 ◦C पर गर्म किया गया। वैक्यूम के तहत सॉल्वैंट्स को हटाने पर, अवशेषों को 1 एन NaOH समाधान (25 एमएल) में भंग कर दिया गया था। अपरिष्कृत उत्पाद सांद्रण के साथ निस्पंद के अम्लीकरण पर अवक्षेपण द्वारा प्राप्त किया गया था। एचसीएल. सूखने के बाद, कच्चे उत्पाद को कमरे के तापमान पर ईटन के अभिकर्मक (5 एमएल) में मिलाया गया, फिर मिश्रण को 1 घंटे के लिए 90 ◦C तक गर्म किया गया। ठंडा किया गया प्रतिक्रिया मिश्रण संतृप्त जलीय NaHCO3 घोल में डाला गया। मोटे उत्पाद को इकट्ठा करने के लिए अवक्षेप को फ़िल्टर किया गया था। सिलिका जेल कॉलम क्रोमैटोग्राफी द्वारा अवशेषों का शुद्धिकरण 9 प्रदान किया गया, एक हल्का पीला ठोस (0.61 ग्राम, 37.7% उपज)। कमरे के तापमान पर DMF (5 एमएल) में NaH (1.43 mmol) और 9 (0.33 g, 1.3 mmol) के घोल को 1 घंटे तक हिलाया गया और फिर 5-7 ◦C तक ठंडा किया गया। परिणामी मिश्रण में एथिल ब्रोमोएसेटेट (0.43 ग्राम, 2.6 मिमीओल) मिलाया गया और कमरे के तापमान पर 20 घंटे तक लगातार हिलाया गया। प्रतिक्रिया (टीएलसी) के पूरा होने के बाद, प्रतिक्रिया मिश्रण को बर्फ के पानी (15 एमएल) में डाला गया था। परिणामी अवक्षेपों को फ़िल्टर किया गया, सुखाया गया और फिर क्लोरोफॉर्म के साथ निकाला गया। विलायक के वाष्पीकरण ने एक कच्चा एस्टर दिया जिसे 10, एक पीला ठोस (0.33 ग्राम, 76% उपज) प्रदान करने के लिए पुन: क्रिस्टलीकरण द्वारा शुद्ध किया गया था। 1एच एनएमआर (400 मेगाहर्ट्ज, डीएमएसओ-डी6) δ 8.30 (डी, जे=8.4 हर्ट्ज, 1एच), 8.08 (डी, जे=8.6 हर्ट्ज, 1एच), 7.75–7.67 (एम) , 1H), 7.57–7.50 (m, 1H), 7.48 (s, 1H), 5.02 (s, 2H), 4.22 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3.96 (s, 3H) , 2.77 (एस, 3एच), 2.34 (एस, 3एच), 1.21 (टी, जे=7.1 हर्ट्ज, 3एच)। 13सी एनएमआर (101 मेगाहर्ट्ज, डीएमएसओ-डी6) δ (पीपीएम): 169.25, 157.87, 155.96, 147.46, 146.72, 135.46, 132.15, 130.17, 129.51, 125.88, 122.48, 119.80, 1 19.46, 95.26, 72.06, 61.28, 56.06, 14.59 , 14.34, 13.77. HRMS (ESI) m/z [M+H]+ की गणना C20H21NO4 के लिए की गई: 339.3910 पाया गया: 340.1546। 2-(2-मेथॉक्सी-3,4-डाइमिथाइल-9-ऑक्सोएक्रिडिन-10(9H)-yl)एसिटिक एसिड (11): का एक समाधान इथेनॉल (20 एमएल) में 10 (0.37 ग्राम, 1.1 एमएमओएल) और NaOH (0.05 ग्राम, 1.3 एमएमओएल) और पानी (2 एमएल) को 1 घंटे के लिए 60 ◦C तक गर्म किया गया था। सॉल्वैंट्स को हटाने पर, परिणामी अवशेष को पानी में घोल दिया गया और फ़िल्टर किया गया। सांद्रण के साथ निस्पंद को उदासीन करने के बाद। एचसीएल, मिश्रण को कच्चे ठोस प्राप्त करने के लिए फ़िल्टर किया गया था, बाद में 11, हल्का पीला पाउडर (0.29 ग्राम, 85.7% उपज) देने के लिए मेथनॉल द्वारा पुन: क्रिस्टलीकृत किया गया। 1एच एनएमआर (400 मेगाहर्ट्ज, डीएमएसओ-डी6) δ 10.51 (एस, 1एच), 8.33 (डी, जे=6.9 हर्ट्ज, 1एच), 8.04 (डी, जे {{213%).5 हर्ट्ज, 1एच ), 7.69 (एस, 1एच), 7.67-7.62 (एम, 1एच), 7.45 (टी, जे {{226%).8 हर्ट्ज, 1एच), 4.52 (एस, 2एच), 3.90 (एस, 3एच), 2.75 (एस, 3एच), 2.31 (एस, 3एच)। 13सी एनएमआर (101 मेगाहर्ट्ज, डीएमएसओ-डी6) δ (पीपीएम): 159.04, 155.63, 147.47, 146.64, 134.86, 131.52, 129.56, 128.98, 125.15, 122.85, 120.53, 119.69, 1 01.77, 96.02, 74.81, 55.69, 14.42, 13.33 . HRMS (ESI) m/z [M+H]+ की गणना C18H17NO4 के लिए की गई: 311.3370 पाया गया: 312.1229।

{{0}क्लोरो-8-मेथॉक्सी-9,{3}}डाईमिथाइल-6एच-पाइरोलो [3,2,1-डी]एक्रिडीन{ {9}},6(2एच)-डायोन (25): {{14}कार्बोक्सी-4-मेथॉक्सी-2,{17}}डाइमिथाइलबेनजेनामिनियम (14) (1.3 ग्राम) के घोल में कमरे के तापमान पर DMF (6 mL) में 6.4 mmol) और {{23} (0.05 ग्राम), Cu2O (0.05 ग्राम) और K2CO3 (0.71 ग्राम, 5.1 mmol)। प्रतिक्रिया मिश्रण को 12 घंटे के लिए 110 ◦C पर गर्म किया गया। वैक्यूम के तहत सॉल्वैंट्स को हटाने पर, अवशेषों को 1 एन NaOH समाधान (25 एमएल) में भंग कर दिया गया था। अपरिष्कृत उत्पाद सांद्रण के साथ निस्पंद के अम्लीकरण पर अवक्षेपण द्वारा प्राप्त किया गया था। एचसीएल. सूखने के बाद, कच्चे उत्पाद को कमरे के तापमान पर ईटन के अभिकर्मक (5 एमएल) में मिलाया गया, फिर मिश्रण को 1 घंटे के लिए 90 ◦C तक गर्म किया गया। ठंडा किया गया प्रतिक्रिया मिश्रण संतृप्त जलीय NaHCO3 घोल में डाला गया। मोटे उत्पाद को इकट्ठा करने के लिए अवक्षेप को फ़िल्टर किया गया था। सिलिका जेल कॉलम क्रोमैटोग्राफी द्वारा अवशेषों का शुद्धिकरण 25, एक पीला ठोस (0.80 ग्राम, 38.6% उपज) प्रदान करता है। 1एच एनएमआर (400 मेगाहर्ट्ज, डीएमएसओ-डी6) δ 8.17 (डी, जे =8.1, 1.5 हर्ट्ज, 1एच), 7.86 (डी, जे=6.9 हर्ट्ज, 1H), 7.51 (s, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.78 (s, 2H), 2.49 (s, 3H), 2.27 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ की गणना C18H14ClNO3 के लिए की गई: 327.7640 पाया गया: 328.0734। {{96}क्लोरो-8-मेथॉक्सी-9,{99}}डाइमिथाइल-6एच-पाइरोलो[3,2,1-डी]एक्रिडीन-1 ,6(2H)-डायोन (26): इस यौगिक का संश्लेषण 25 के समान था। 15 को 2-(2-ब्रोमो-5-क्लोरोफेनिल)एसिटिक एसिड (16) से प्रतिस्थापित किया गया था। हमने 38.7% की उपज के साथ हल्के पीले रंग के ठोस के रूप में 0.82 ग्राम 26 प्राप्त किया। 1एच एनएमआर (400 मेगाहर्ट्ज, डीएमएसओ-डी6) δ 7.73 (एस, 1एच), 7.52 (एस, 1एच), 7.38 (एस, 1एच), 3.71 (एस, 3एच), 3.64 (एस,2एच), 2.36 (एस, 3एच), 2.13 (एस, 3एच); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ की गणना C18H14ClNO3 के लिए की गई: 327.7640 पाया गया: 328.0734।

{0}}फ्लोरो-8-मेथॉक्सी-9,10-डाइमिथाइल-6एच-पाइरोलो[3,2,1-डी]एक्रिडीन{ {9}},6(2एच)-डायोन (27): इस यौगिक का संश्लेषण 25 के समान था। 15 को 2-(2-ब्रोमो-4-फ्लोरोफेनिल)एसिटिक एसिड से प्रतिस्थापित किया गया था (17). हमने 0.84 ग्राम (42.1% उपज) के साथ एक गहरा पीला ठोस 27 प्राप्त किया। 1एच एनएमआर (400 मेगाहर्ट्ज, डीएमएसओ-डी6) δ 8.21 (डी, जे=8.0 हर्ट्ज, 1एच), 7.68 (एस, 1एच), 7.23 (डी, जे {{39} }.5 हर्ट्ज, 1H), 3.88 (s, 3H), 3.81 (s, 2H), 2.53 (s, 3H), 2.30 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ की गणना C18H14FNO3 के लिए की गई: 311.3124 पाया गया: 312.1030। {{63}फ्लोरो-8-मेथॉक्सी-9,{66}}डाइमिथाइल-6एच-पाइरोलो[3,2,1-डी]एक्रिडीन-1 ,6(2एच)-डायोन (28): इस यौगिक का संश्लेषण 25 के समान था। 15 को 2-(2-ब्रोमो-5-फ्लोरोफेनिल)एसिटिक एसिड (18) से प्रतिस्थापित किया गया था। 0.81 ग्राम गहरा पीला ठोस प्राप्त हुआ (40.5% उपज)। 1एच एनएमआर (400 मेगाहर्ट्ज, डीएमएसओडी6) δ 7. 2.49 (एस, 3एच), 2.26 (एस, 3एच); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ की गणना C18H14FNO3 के लिए की गई: 311.3124 पाया गया: 312.1030।

4,8-डाइमिथॉक्सी-9,10-डाइमिथाइल-6एच-पाइरोलो[3,2,1-डी]एक्रिडीन-1,6(2एच) )-डायोन (29): इस यौगिक का संश्लेषण 25 के समान था। 15 को 2-(2-ब्रोमो-5-मेथॉक्सीफेनिल)एसिटिक एसिड (19) से प्रतिस्थापित किया गया था। 35.2% उपज के साथ 73 ग्राम पीला ठोस प्रदान किया गया। 1एच एनएमआर (400 मेगाहर्ट्ज, डीएमएसओ डी6) δ 7.93 (एस, 1एच), 7.61 (एस, 1एच), 7.47 (एस, 1एच), 3.84 (एस, 3एच), 3.81 ( एस, 3एच), 3.67 (एस, 2एच), 2.44 (एस, 3एच), 2.28 (एस, 3एच); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ की गणना C19H17NO4 के लिए की गई: 323.3480 पाया गया: 324.1230। 7-मेथॉक्सी-5,6-डाइमिथाइल-9-ऑक्सो-9,{65}}डायहाइड्रोएक्रिडीन-4-कार्बोक्जिलिक एसिड (33): एक समाधान के लिए {{68}कार्बोक्सी-4-मेथॉक्सी-2,{71}}डाइमिथाइलबेनजेनामिनियम (14) (1.30 ग्राम, 6.4 एमएमओएल) और 2-ब्रोमो-बेंजोइक एसिड (7) (1.29) कमरे के तापमान पर DMF (6 mL) में g, 6.4 mmol, बाद में हमने पाउडर Cu (0.05 g), Cu2O (0.05 g) और K2CO3 (0.71 g, 5.1 mmol) मिलाया। प्रतिक्रिया मिश्रण को 12 घंटे के लिए 110 ◦C पर गर्म किया गया। वैक्यूम के तहत सॉल्वैंट्स को हटाने पर, अवशेषों को 1 एन NaOH समाधान (25 एमएल) में भंग कर दिया गया था। अपरिष्कृत उत्पाद सांद्रण के साथ निस्पंद के अम्लीकरण पर अवक्षेपण द्वारा प्राप्त किया गया था। एचसीएल. सूखने के बाद, कच्चे उत्पाद को कमरे के तापमान पर ईटन के अभिकर्मक (5 एमएल) में मिलाया गया, फिर मिश्रण को 1 घंटे के लिए 90 ◦C तक गर्म किया गया। ठंडा किया गया प्रतिक्रिया मिश्रण संतृप्त जलीय NaHCO3 घोल में डाला गया। मोटे उत्पाद को इकट्ठा करने के लिए अवक्षेप को फ़िल्टर किया गया था। सिलिका जेल कॉलम क्रोमैटोग्राफी द्वारा अवशेषों का शुद्धिकरण 33, एक हल्का पीला ठोस (1.00 ग्राम, 52.7% उपज) प्रदान करता है। 1एच एनएमआर (400 मेगाहर्ट्ज, डीएमएसओ-डी6) δ 13.00 (एस, 1एच), 10.28 (एस, 1एच), 8.01 (डी, जे=9.7 हर्ट्ज, 1एच), 7.69 (डी , जे=8.5 हर्ट्ज, 1एच), 7.48 (टी, जे=9.0 हर्ट्ज, 1एच), 7.34 (एस, 1एच), 3.67 (एस, 3एच), 2.32 (एस, 3एच) ), 2.10 (एस, 3एच); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ की गणना C17H15NO4 के लिए की गई: 297.3100 पाया गया: 298.1073। 2,7-डाइमिथॉक्सी-5,{{158}डाइमिथाइल-9-ऑक्सो-9,{161}डाइहाइड्रोएक्रिडीन-4-कार्बोक्जिलिक एसिड (34): इस यौगिक का संश्लेषण 33 के समान था। 7 को 2-ब्रोमो-5- मेथॉक्सीबेन्जोइक एसिड (30) से प्रतिस्थापित किया गया था। पीले ठोस ने 50.2% उपज के साथ 1.05 ग्राम उत्पादन दिया। 1एच एनएमआर (400 मेगाहर्ट्ज, डीएमएसओ-डी6) δ 12.96 (एस, 1एच), 10.45 (एस, 1एच), 7.84 (एस, 1एच), 7.54 (एस, 1एच), 7.50 (एस, 1एच), 3.84 (एस, 3H), 3.81 (s, 3H), 2.48 (s, 3H), 2.27 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ की गणना C18H17NO5 के लिए की गई: 327.3360 पाया गया: 328.1179।

4.2. जैविक परख

माउस स्टिंग बाइंडिंग किट, मानव स्टिंग डब्ल्यूटी बाइंडिंग किट, मानव एक्यू स्टिंग बाइंडिंग किट, और मानव H232 स्टिंग बाइंडिंग किट सिस्बियो से खरीदे गए थे। 293T mSTING (ISG/KI-IFNb) सेल, 293T hSTING-R232 (ISG/KI-IFNb) सेल, THP{7}}KI-hSTING-R232 सेल, THP1-KO-STING सेल यहां से खरीदे गए थे। इनविवोजन। 293T mSTING कोशिकाओं और 293T hSTING-R232 कोशिकाओं को DMEM (गिब्को, वाल्थम, MA, USA), 2 mM L-ग्लूटामाइन (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, MO, USA), 4.5 g/L ग्लूकोज (सिग्मा-) का उपयोग करके संवर्धित किया गया। एल्ड्रिच), 10% एफबीएस (गिब्को), पेन-स्ट्रेप (100 यू/एमएल{{26%) µM) (गिब्को), 100 µM नॉर्मोसिन (इनविवोजेन, सैन डिएगो, सीए, यूएसए), और चयनात्मक एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक (इनवाइवोजेन) ) ब्लास्टिसिडिन (10 µM), हाइग्रोमाइसिन (100 µM) और जिओसिन (100 µM)। THP1-KO-STING कोशिकाएं और THP1-KI-hSTING-R232 कोशिकाओं को RPMI-1640 (गिब्को), 2 mM L-ग्लूटामाइन (सिग्मा-एल्ड्रिच), 25 mM HEPES का उपयोग करके संवर्धित किया गया था (सिग्मा-एल्ड्रिच), 10% ताप-निष्क्रिय एफबीएस (गिब्को), पेनस्ट्रेप (100 यू/एमएल {{46%) µM) (गिब्को), 100 µM नॉर्मोसिन (इनविवोजन), और चयनात्मक एंटीबायोटिक्स (इनविवोजेन) ब्लास्टिसिडिन के साथ पूरक ( 10 µM) और ज़ीओसिन (100 µM)। क्वांटि-ब्लू समाधान, क्वांटि-ल्यूक, 20, 30 -सीजीएएमपी इनविवोजन से खरीदे गए थे। H151 बीजिंग इनोकेम साइंस एंड टेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड (बीजिंग, चीन) से प्राप्त किया गया था। सेलटाइटर-ग्लो ल्यूमिनसेंट सेल व्यवहार्यता परख किट क्रोमेगा से प्राप्त की गई थी।

4.2.1. एचटीआरएफ स्टिंग बाइंडिंग प्रतिस्पर्धी परख

स्टिंग बाइंडिंग किट के निर्देशों के अनुसार, निम्नलिखित समाधानों को क्रमिक रूप से 384- वेल प्लेट में प्रत्येक कुएं में जोड़ा गया: डिटेक्शन यौगिकों के 5 μL या 2 0, 30 -cGAMP (सकारात्मक नियंत्रण) ) विभिन्न सांद्रता या मंदक (नकारात्मक नियंत्रण) के साथ; मानव स्टिंग 6हिज़-टैग प्रोटीन का 5 μL (डिटेक्शन बफर में नकारात्मक नियंत्रण जोड़ा गया था); 10 μL स्टिंग लिगैंड डी2 और एंटी 6हिज़-टीबी3+ प्रीमिक्स्ड वर्किंग सॉल्यूशन। प्लेट को सील करने और 3 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर ऊष्मायन के बाद, 665 एनएम और 620 एनएम पर प्रतिदीप्ति मान पढ़े गए। यौगिकों की बंधन क्षमता का अनुमान लगाने के लिए दो प्रतिदीप्ति तीव्रता (665 एनएम/620 एनएम) के अनुपात का उपयोग किया गया था। IC50 (50% निरोधात्मक एकाग्रता) मूल्यों की गणना सॉफ्टवेयर ग्राफपैड प्रिज्म का उपयोग करके की गई थी।

4.2.2. एगोनिस्टिक गतिविधि के लिए यौगिकों की स्क्रीनिंग के लिए सेलुलर परख

293T mSTING कोशिकाओं, 293T hSTING-R232 कोशिकाओं और THP1-KOSTING कोशिकाओं के निलंबन की 180 µL मात्रा ~50,{9}} कोशिकाओं के घनत्व के साथ {{6}अच्छी तरह से सपाट तल वाली प्लेटों में वितरित की गई थी। /वेल (293टी) या ~100,000 सेल/वेल (टीएचपी1)। सकारात्मक संदर्भ के रूप में खारा या परीक्षण यौगिक के खारा घोल की 20 μL की मात्रा, या 20, 30 - cGAMP को जोड़ा गया था, और कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए 5% CO2 के साथ 37 ◦C पर इनक्यूबेट किया गया था। इसके बाद, 20 µL सतह पर तैरनेवाला की मात्रा को एक 96-वेल फ्लैट-बॉटम प्लेट में जोड़ा गया, इसके बाद प्रत्येक कुएं में 180 µL क्वांटी-ब्लू घोल डाला गया। प्लेट को 3 घंटे के लिए 37 ◦C पर इनक्यूबेट किया गया था, और एसईएपी स्तर (आईआरएफ पाथवे गतिविधि) 620-655 एनएम पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके निर्धारित किया गया था।

4.2.3. निरोधात्मक गतिविधि के लिए यौगिकों की स्क्रीनिंग के लिए सेलुलर परख

पूर्व-प्रयोग: 293T mSTING कोशिकाओं के 180 μL, 293T hSTING-R232 कोशिकाओं (~50,000 कोशिकाओं/कुआं) को एक में 37 ◦C पर 48 घंटे के लिए उत्तेजित किया गया था। 5% CO2 इनक्यूबेटर 10 µL 20,30 -cGAMP (3.125 µM, 6.25 µM) और 10 µL H151 (1.0 µM) के साथ ). इसके बाद, 20 µL सतह पर तैरनेवाला की मात्रा को एक 96- वेल फ्लैट-बॉटम प्लेट में जोड़ा गया, इसके बाद प्रत्येक कुएं में 180 µL क्वांटी-ब्लू घोल डाला गया। प्लेट को 3 घंटे के लिए 37 ◦C पर इनक्यूबेट किया गया था, और एसईएपी स्तर (आईआरएफ पाथवे गतिविधि) 620-655 एनएम पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। 293T mSTING कोशिकाओं के 180 μL, 293T hSTING-R232 कोशिकाओं के निलंबन को ~50,{40}} कोशिकाओं/कुएं के घनत्व के साथ {{37}अच्छी तरह से सपाट तल वाली प्लेटों में वितरित किया गया था। 10 µL की मात्रा 2 0,30 -cGAMP (3.125 µM) और यौगिक 11 या यौगिक 27 (0.78 µM, 1.56 µM, 3.13 µM, 6.25 µM, 12.5 µM, 25 µM, 50 µM, 100 µM) या H151 (0.08 µM, 0.16 µM, 0.31 µM, 0.63 µM, 1.25 µM, 2.5 µM, 5 µM) जोड़े गए, और कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए 5% CO2 के साथ 37 ◦C पर इनक्यूबेट किया गया। इसके बाद, 20 µL सतह पर तैरनेवाला की मात्रा को एक 96- वेल फ्लैट-बॉटम प्लेट में जोड़ा गया, इसके बाद प्रत्येक कुएं में 180 µL क्वांटी-ब्लू घोल डाला गया। प्लेट को 3 घंटे के लिए 37 ◦C पर इनक्यूबेट किया गया था, और एसईएपी स्तर (आईआरएफ पाथवे गतिविधि) 620-655 एनएम पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। IC50 मानों की गणना ग्राफपैड सॉफ़्टवेयर द्वारा की गई थी।

4.2.4. स्टिंग दोहरे मार्गों के निषेध के लिए सेलुलर परख

180 µL THP{{1}KI-hSTING-R232 सेल सस्पेंशन को ~100,{7}} सेल/वेल के घनत्व के साथ 96-वेल फ्लैटबॉटम प्लेटों में वितरित किया गया था। 10 µL 20, 30 -cGAMP और 10 µL यौगिक 11 (20 µM) या यौगिक 27 (33 µM) या H151 (2 µM) की मात्रा जोड़ी गई, और कोशिकाओं को 5% के साथ 37 ◦C पर इनक्यूबेट किया गया। 24 घंटे के लिए CO2. इसके बाद, सतह पर तैरनेवाला की एक मात्रा को एक 96-वेल सफेद (अपारदर्शी) प्लेट में जोड़ा गया, इसके बाद प्रत्येक कुएं में क्वांटी-ल्यूक या क्वांटी-ब्लू समाधान डाला गया, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार ल्यूमिनसेंस स्तर या एसईएपी स्तर पढ़ा गया। यह SEAP की गतिविधि की निगरानी करके, लूसिया ल्यूसिफरेज़ और NF-κB मार्ग की गतिविधि का आकलन करके, IFN नियामक कारक (IRF) मार्ग के एक साथ अध्ययन की अनुमति देता है।

4.2.5. सेलटाइटर-ग्लो ल्यूमिनसेंट सेल व्यवहार्यता परख

सेल व्यवहार्यता को निर्माता के निर्देशों के अनुसार सेलटाइटर-ग्लो ल्यूमिनसेंट सेल व्यवहार्यता परख किट द्वारा मापा गया था। संक्षेप में, कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए यौगिक 11 यौगिक 27, या एच -151 के तीन अलग-अलग सांद्रता (5 µM, 10 µM, 100 µM) के साथ ऊष्मायन किया गया था। 100 μL सेलटाइटर-ग्लो अभिकर्मक को 10 मिनट के लिए एक 96-वेल परख प्लेट में जोड़ा गया, फिर ल्यूमिनसेंस रिकॉर्ड किया गया।

4.3. यौगिक की आणविक डॉकिंग 11

स्टिंग कॉम्प्लेक्स (पीडीबी आईडी: 6एमएक्सई) की क्रिस्टल संरचना प्रोटीन डेटा बैंक प्रविष्टि से ली गई थी और शुरुआती बिंदु के रूप में उपयोग की गई थी। प्रोटीन को मेस्ट्रो की प्रोटीन तैयारी का उपयोग करके तैयार किया गया था और श्रृंखला ए और श्रृंखला बी में विभाजित किया गया था। हमने रिसेप्टर ग्रिड जेनरेशन का उपयोग करके मूल लिगैंड (मर्क -18) के आधार पर स्टिंग मोनोमर के एलबीडी में एक बाइंडिंग साइट तैयार की। हमने आणविक डॉकिंग भाग के लिए ग्लाइड-डॉकिंग की एसपी परिशुद्धता का उपयोग किया, जिससे कंपाउंड 11 को अधिकतम 20 पोज़ उत्पन्न करने की अनुमति मिली। हमने अंततः 16 बाउंड कंफर्मेशन (सभी निचली जेब में) तैयार किए और श्रोडिंगर के सॉफ्टवेयर में प्राइम एमएम-जीबीएसए मॉड्यूल का उपयोग करके कॉम्प्लेक्स की बाइंडिंग मुक्त ऊर्जा का परीक्षण किया। इसके अलावा, डॉकिंग स्कोर, ग्लाइड मॉडल स्कोर और एमएमजीबीएसए डीजी बाइंड स्कोर के आधार पर, हमने इष्टतम संरचना का चयन किया जिसने दो में पहला स्कोर किया और एक में तीसरा स्थान प्राप्त किया (तालिका एस 2 में देखा गया)। अंत में, हमने संपूर्ण डॉकिंग संरचना प्राप्त करने के लिए ए और बी श्रृंखलाओं के सर्वोत्तम अनुरूपताओं को विलय कर दिया।

संदर्भ

1. अबे, टी.; हरशिमा, ए.; ज़िया, टी.; कोनो, एच.; कोनो, के.; मोरालेस, ए.; अहान, जे.; गुटमैन, डी.; बार्बर, जीएन स्टिंग साइटोप्लाज्मिक डीएनए की पहचान सेलुलर रक्षा को प्रेरित करती है। मोल. सेल 2013, 50, 5-15। [क्रॉसरेफ]

2. वू, जे.; सन, एल.; चेन, एक्स.; डू, एफ.; शि, एच.; चेन, सी.; चेन, जेडजे साइक्लिक जीएमपी-एएमपी साइटोसोलिक डीएनए द्वारा इनेट इम्यून सिग्नलिंग में एक अंतर्जात दूसरा मैसेंजर है। विज्ञान 2013, 339, 826-830। [क्रॉसरेफ]

3. अबे, टी.; बार्बर, जीएन साइटोसोलिक-डीएनए-मध्यस्थता, स्टिंग-निर्भर प्रिनफ्लेमेटरी जीन इंडक्शन को टीबीके1 के माध्यम से कैनोनिकल एनएफ-κबी सक्रियण की आवश्यकता होती है। जे. विरोल. 2014, 88, 5328-5341। [क्रॉसरेफ]

4. कै, एक्स.; चिउ, वाई.-एच.; चेन, जेडजे साइटोसोलिक डीएनए सेंसिंग और सिग्नलिंग का सीजीएएस-सीजीएएमपी-स्टिंग मार्ग। मोल. सेल 2014, 54, 289-296। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

5. गाओ, डी.; ली, टी.; ली, एक्स.-डी.; चेन, एक्स.; ली, क्यू.-जेड.; वाइट-कार्टर, एम.; चेन, जेडजे स्व-डीएनए द्वारा चक्रीय जीएमपी-एएमपी सिंथेज़ का सक्रियण ऑटोइम्यून बीमारियों का कारण बनता है। प्रोक. नेटल. अकाद. विज्ञान. यूएसए 2015, 112, ई5699-ई5705। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

6. ली, टीजे; चेंग, एच.; युआन, एच.; जू, क्यूएम; शू, सी.; झांग, वाईएफ; जू, पी.; टैन, जे.; रुई, वाई.; सीजीएएस-सीजीएएमपी-स्टिंग-आईआरएफ3 मध्यस्थता सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की उत्तेजना के माध्यम से सीजीएएमपी की ली, पीजेएसआर एंटीट्यूमर गतिविधि। विज्ञान. प्रतिनिधि 2016, 6, 19049। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

7. मोटवानी, एम.; पेसिरिडिस, एस.; स्वास्थ्य और बीमारी में सीजीएएस-स्टिंग मार्ग द्वारा फिट्जगेराल्ड, केए डीएनए सेंसिंग। नेट. रेव्ह जेनेट. 2019, 20, 657-674। [क्रॉसरेफ]

8. झांग, एच.; आप, क्यूडी; जू, एक्सएल इंटरफेरॉन जीन (स्टिंग) का लक्ष्यीकरण उत्तेजक: एक औषधीय रसायन विज्ञान परिप्रेक्ष्य। जे मेड. रसायन. 2020, 63, 3785-3816। [क्रॉसरेफ]

9. गाओ, जे.; ताओ, जे.; लियांग, डब्ल्यू.; झाओ, एम.; डू, एक्स.; कुई, एस.; डुआन, एच.; कान, बी.; सु, एक्स.; जियांग, जेड। फॉस्फोडिएस्टरेज़ की पहचान और लक्षण वर्णन जो विशेष रूप से चक्रीय जीएमपी-एएमपी को ख़राब करते हैं। सेल रेस. 2015, 25, 539-550। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

10. कोरालेस, एल.; मैकविहटर, एसएम; डबेंस्की, TW; गजेवस्की, टीएफ कैंसर और प्रतिरक्षा के इंटरफेस पर मेजबान स्टिंग मार्ग। जे. क्लिन. जांच। 2016, 126, 2404-2411। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

11. बगुले, बीसी; चिंग, एलएम डीएमएक्सएए: एकाधिक मेजबान प्रतिक्रियाओं वाला एक एंटीवास्कुलर एजेंट। इंट. जे. रेडिएट. ओंकोल. बायोल. भौतिक. 2002, 54, 1503-1511। [क्रॉसरेफ]

12. लारा, पीएन; डौइलार्ड, जे.-वाई.; नाकागावा, के.; वॉन पावेल, जे.; मैककीज, एमजे; अल्बर्ट, आई.; लोसोन्ज़ी, जी.; रेक, एम.; हेओ, डी.-एस.; फैन, एक्स.; और अन्य। उन्नत गैर-गैर-लघु-कोशिका फेफड़ों के कैंसर में संवहनी विघटनकारी एजेंट वादिमेज़न (एएसए404) के साथ या उसके बिना कार्बोप्लाटिन और पैक्लिटैक्सेल का यादृच्छिक चरण III प्लेसबो-नियंत्रित परीक्षण। जे. क्लिन. ओंकोल. 2011, 29, 2965-2971। [क्रॉसरेफ]

13. कॉनलोन, जे.; बर्डेट, डीएल; शर्मा, एस.; भट, एन.; थॉम्पसन, एम.; जियांग, जेड.; रथिनम, वीएके; भिक्षु, बी.; जिन, टी.; जिओ, टीएस; और अन्य। माउस, लेकिन मानव डंक नहीं, संवहनी विघ्नकारी एजेंट 5, 6-डिमिथाइलक्सैन्थेनोन-4-एसिटिक एसिड के जवाब में बंधन और संकेत। जे. इम्यूनोल. 2013, 190, 5216-5225। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

14. किम, एस.; ली, एल.; मालिगा, जेड.; यिन, क्यू.; वू, एच.; मिचिसन, टीजे एंटीकैंसर फ्लेवोनोइड्स माउस-सेलेक्टिव स्टिंग एगोनिस्ट हैं। एसीएस रसायन. बायोल. 2013, 8, 1396-1401। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

15. कैवलर, टी.; डीमलिंग, टी.; एब्लैसर, ए.; हॉपफनर, के.-पी.; हॉर्नुंग, वी. स्टिंग द्वारा एंटीवायरल छोटे-अणु यौगिक सीएमए की प्रजाति-विशिष्ट पहचान। ईएमबीओ जे. 2013, 32, 1440-1450। [क्रॉसरेफ]

16. रामांजुलु, जेएम; पेसिरिडिस, जीएस; यांग, जे.; कोंचा, एन.; सिंघौस, आर.; झांग, एस.-वाई.; ट्रान, जे.-एल.; मूर, पी.; लेहमैन, एस.; एबरल, एचसी; और अन्य। प्रणालीगत गतिविधि के साथ एमिडो बेंज़िमिडाज़ोल स्टिंग रिसेप्टर एगोनिस्ट का डिज़ाइन। प्रकृति 2018, 564, 439-443। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

17. चिन, एन; यू, सी.; वर्ताबेडियन, वीएफ; जिया, वाई.; कुमार, एम.; गामो, एएम; वर्नियर, डब्ल्यू.; अली, एसएच; किसाई, एम.; लज़ार, डीसी; और अन्य। एक प्रणालीगत स्टिंग-सक्रिय गैर-न्यूक्लियोटाइड सीजीएएमपी मिमेटिक की एंटीट्यूमर गतिविधि। विज्ञान 2020, 369, 993-999।

18. पैन, बीएस; परेरा, एसए; पिज़वॉक्स, जेए; प्रेस्लैंड, जेपी; श्रोएडर, जीके; कमिंग, जेएन; ट्रॉटर, बीडब्ल्यू; ऑल्टमैन, एमडी; ब्यूविच, एवी; नकद, बी.; और अन्य। एंटीट्यूमर गतिविधि के साथ मौखिक रूप से उपलब्ध गैर-न्यूक्लियोटाइड स्टिंग एगोनिस्ट। विज्ञान 2020, 369, eaba6098। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

19. साली, टीएम; प्राइके, केएम; जिनु, ए.; एंड्रयू, एल.; आइरिस, ए.; रेबेका, बी.; स्टवेरोस्की, जेए; स्मिथ, जेएल; अहमद, एएस; लिसी, एजेपीपी एक नवीन मानव-विशिष्ट स्टिंग एगोनिस्ट की विशेषता है जो उभरते अल्फावायरस के खिलाफ एंटीवायरल गतिविधि को उजागर करता है। प्लोस पैथोग। 2015, 11, ई1005324। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

20. हांग, जेड.; मेई, जे.; ली, सी.; बाई, जी.; मैमैती, एम.; हू, एच.; यू, डब्ल्यू.; सन, एल.; झांग, एल.; चेंग, डी.; और अन्य। स्टिंग अवरोधक चक्रीय डाइन्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग पॉकेट को लक्षित करते हैं। प्रोक. नेटल. अकाद. विज्ञान. यूएसए 2021, 118, ई2105465118। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

21. सिउ, टी.; ऑल्टमैन, एमडी; बाल्टस, जीए; चाइल्डर्स, एम.; एलिस, जेएम; गुनायदीन, एच.; हैच, एच.; गर्म।; ज्वेल, जे.; लेसी, बीएम; और अन्य। स्टिंग के निष्क्रिय रूप के एक नवीन सीजीएएमपी प्रतिस्पर्धी लिगैंड की खोज। एसीएस मेड. रसायन. लेट. 2019, 10, 92-97. [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

22. हाग, एसएम; गुलेन, एमएफ; रेमंड, एल.; गिबेलिन, ए.; अब्रामी, एल.; डेकौट, ए.; हेमैन, एम.; वैन डेर गूट, एफजी; टरकट्टी, जी.; बेहरेंड्ट, आर.; और अन्य। सहसंयोजक छोटे-अणु अवरोधकों के साथ स्टिंग को लक्षित करना। प्रकृति 2018, 559, 269-273। [क्रॉसरेफ]

23. होउ, एस.; लैन, एक्स.-जे.; ली, डब्ल्यू.; यान, एक्स.-एल.; चांग, ​​​​जे.-जे.; यांग, एक्स.-एच.; सन, डब्ल्यू.; जिओ, जे.-एच.; ली, एस. नवीन स्टिंग रिसेप्टर एगोनिस्ट के रूप में एक्रिडोन एनालॉग्स का डिजाइन, संश्लेषण और जैविक मूल्यांकन। बायोऑर्ग. रसायन. 2020, 95, 103556। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

24. ओयांग, एस.; गीत, एक्स.; वांग, वाई.; आरयू, एच.; शॉ, एन.; जियांग, वाई.; नीउ, एफ.; झू, वाई.; किउ, डब्ल्यू.; परवतियार, के.; और अन्य। स्टिंग एडाप्टर प्रोटीन के संरचनात्मक विश्लेषण से हाइड्रोफोबिक डिमर इंटरफ़ेस और चक्रीय डी-जीएमपी बाइंडिंग के मोड का पता चलता है। प्रतिरक्षा 2012, 36, 1073-1086। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

25. शू, सी.; यी, जी.; वत्स, टी.; काओ, सीसी; ली, पी. चक्रीय डी-जीएमपी से बंधे स्टिंग की संरचना से प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा चक्रीय डाइन्यूक्लियोटाइड पहचान के तंत्र का पता चलता है। नेट. संरचना. मोल. बायोल. 2012, 19, 722-724। [क्रॉसरेफ]

26. हुआंग, वाई.-एच.; लियू, एक्स.-वाई.; डू, एक्स.-एक्स.; जियांग, जेड-एफ.; सु, एक्स.-डी. STING द्वारा चक्रीय di-GMP की संवेदन और बाइंडिंग के लिए संरचनात्मक आधार। नेट. संरचना. मोल. बायोल. 2012, 19, 728-730। [क्रॉसरेफ]

27. शिह, अय; डैम-गनामेट, केएल; मिर्जाडेगन, टी. मानव और चूहे के डंक के बीच गतिशील संरचनात्मक अंतर DMXAA के प्रति अलग-अलग संवेदनशीलता का कारण बनता है। बायोफिज़। जे. 2018, 114, 32-39। [क्रॉसरेफ]

28. गाओ, पी.; एस्केनो, एम.; ज़िलिंगर, टी.; वांग, डब्ल्यू.; दाई, पी.; सेर्गानोव, एए; गैफ़नी, बीएल; शुमन, एस.; जोन्स, आरए; डेंग, एल.; और अन्य। सी[जी(20,50)पीए(30,50)पी] द्वारा स्टिंग सक्रियण का संरचना-कार्य विश्लेषण और एंटीवायरल डीएमएक्सएए द्वारा लक्ष्यीकरण। सेल 2013, 154, 748-762। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

29. झांग, सी.; शांग, जी.; गुई, एक्स.; झांग, एक्स.; बाई, एक्स.; चेन, जेडजेएन टीबीके1 द्वारा स्टिंग बाइंडिंग और फॉस्फोराइलेशन का संरचनात्मक आधार। प्रकृति 2019, 567, 394-398। [क्रॉसरेफ]

30. वावरिना, ज़ेड.; गुटेन, ओ.; स्मोला, एम.; ज़ेव्रेल, एम.; अलीअकबर तेहरानी, ​​ज़ेड.; चरवत, वी.; कोज़िसेक, एम.; बौरा, ई.; बिरकुस, जी.; रुलिसेक, एल. स्टिंग बाइंडिंग साइट में प्रोटीन-लिगैंड इंटरैक्शन, तर्कसंगत रूप से डिज़ाइन किए गए सिंगल-पॉइंट म्यूटेशन द्वारा जांचा गया: प्रयोग और सिद्धांत। जैव रसायन 2021, 60, 607-620। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

31. चे, एक्स.; डू, एक्स.-एक्स.; कै, एक्स.; झांग, जे.; ज़ी, डब्ल्यूजे; लांग, जेडआर; हाँ, Z.-Y.; झांग, एच.; यांग, एल.; सु, एक्स.-डी.; और अन्य। एकल उत्परिवर्तन DMXAA-ह्यूमन स्टिंग कॉम्प्लेक्स के संरचनात्मक सहसंबंध नेटवर्क को नया आकार देते हैं। जे. भौतिक. रसायन. बी 2017, 121, 2073-2082। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

32. डायनर, ईजे; बर्डेट, डीएल; विल्सन, एससी; मुनरो, केएम; केलेनबर्गर, सीए; ह्योडो, एम.; हयाकावा, वाई.; हैमंड, एमसी; वेंस, आरई इनेट इम्यून डीएनए सेंसर सीजीएएस एक नॉनकैनोनिकल साइक्लिक डायन्यूक्लियोटाइड का उत्पादन करता है जो मानव स्टिंग को सक्रिय करता है। सेल प्रतिनिधि 2013, 3, 1355-1361। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

33. गाओ, पी.; ज़िलिंगर, टी.; वांग, डब्ल्यू.; एस्केनो, एम.; दाई, पी.; हार्टमैन, जी.; टस्कल, टी.; डेंग, एल.; बरचेत, डब्ल्यू.; पटेल, डीजे बाइंडिंग-पॉकेट और ढक्कन-क्षेत्र प्रतिस्थापन मानव डंक को प्रजाति-विशिष्ट दवा डीएमएक्सएए के प्रति संवेदनशील बनाते हैं। सेल प्रतिनिधि 2014, 8, 1668-1676। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

34. ह्वांग, जे.; कांग, टी.; ली, जे.; चोई, बी.-एस.; हान, एस. संभावित मानव-स्टिंग एगोनिस्ट के रूप में कार्यात्मक DMXAA डेरिवेटिव का डिज़ाइन, संश्लेषण और जैविक मूल्यांकन। संगठन. बायोमोल. रसायन. 2019, 17, 1869-1874। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]