गर्भनाल रक्त उपचार के एंटी-एजिंग प्रभाव की निगरानी के लिए बायोसे

संपर्क करें:jerry.he@wecistanche.com

संग-हुन बीए1*, अला जो1,2*, जे ह्यून पार्क1, चुल-वू लिम1, यूरी चोई1, जुह्युन ओह2, जी-मिन पार्क1, ताएहो कोंग1, राल्फ वीसलेडर2,3, हाखो ली2, जिसूक मून1

1. जैव प्रौद्योगिकी विभाग, कॉलेज ऑफ लाइफ साइंस, सीएचए विश्वविद्यालय, ग्योंगगी-डो 13488, कोरिया गणराज्य

2. सेंटर फॉर सिस्टम्स बायोलॉजी, मैसाचुसेट्स जनरल हॉस्पिटल, हार्वर्ड मेडिकल स्कूल, बोस्टन, एमए 02114, यूएसए

3. सिस्टम बायोलॉजी विभाग, हार्वर्ड मेडिकल स्कूल, बोस्टन, एमए 02115, यूएसए *इन लेखकों ने समान रूप से योगदान दिया।

संबंधित लेखक: हाखो ली, पीएचडी। सेंटर फॉर सिस्टम्स बायोलॉजी, मैसाचुसेट्स जनरल हॉस्पिटल, 185 कैम्ब्रिज सेंट, सीपीजेडएन 5206, बोस्टन, एमए 02114, यूएसए। 617-726-8226 hlee@mgh.harvard.edu जिसूक मून, पीएचडी। जैव प्रौद्योगिकी विभाग, कॉलेज ऑफ लाइफ साइंस, सीएचए विश्वविद्यालय, पैंग्यो-आरओ 335, बुंदांग-गु, सेओंगनाम-सी, ग्योंगगी-डो 13488, कोरिया गणराज्य। 82-31-881-7210 jmoon@cha.ac.kr

© आइवीस्प्रिंग इंटरनेशनल पब्लिशर। यह क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन (CC BY-NC) लाइसेंस (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/) की शर्तों के तहत वितरित एक ओपन एक्सेस लेख है। पूर्ण नियम और शर्तों के लिए http://ivyspring.com/terms देखें।

प्राप्त: 2018.10.04; स्वीकृत: 2018। 11. 18; प्रकाशित: 2019.01.01

Cistanche का उम्र बढ़ने-रोधी प्रभाव होता है

सार

पार्श्वभूमि: प्रारंभिक विकासात्मक चरण (जैसे, गर्भनाल प्लाज्मा) के प्लाज्मा के साथ वृद्ध जानवरों का इलाज करने से न्यूरोनल और संज्ञानात्मक कार्यों की उम्र से संबंधित गिरावट को धीमा करने की एक प्रभावशाली क्षमता दिखाई देती है। इस तरह के निष्कर्षों को नैदानिक ​​​​वास्तविकताओं में अनुवाद करने के लिए, हालांकि, उपचार प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए प्रभावी तरीकों की आवश्यकता होती है; आदर्श तरीके न्यूनतम इनवेसिव, सीरियल एसेज़ के लिए उत्तरदायी, लागत प्रभावी और मात्रात्मक होना चाहिए।

तरीकों: हमने निगरानी के लिए एक नया बायोसेंसर दृष्टिकोण विकसित किया हैबुढ़ापा विरोधीचिकित्सा। हमने दो प्रमुख सेंसर घटकों को उन्नत किया: i) एक रक्त-जनित मेटाबोलाइट की पहचान सरोगेट एजिंग-मार्कर के रूप में की गई थी; और ii) साइट पर अनुप्रयोगों के लिए एक कॉम्पैक्ट और लागत प्रभावी परख प्रणाली विकसित की गई थी। हमने वृद्ध चूहों का इलाज या तो मानव गर्भनाल प्लाज्मा या खारा से किया; माउस प्लाज्मा पर निष्पक्ष मेटाबोलाइट प्रोफाइलिंग ने एराकिडोनिक एसिड (एए) को किसके साथ जुड़े एक शक्तिशाली संकेतक के रूप में प्रकट कियाबुढ़ापा विरोधीप्रभाव। हमने अगली बार एक प्रतिस्पर्धी मैग्नेटो-इलेक्ट्रोकेमिकल सेंसर (cMES) लागू किया, जो सीधे प्लाज्मा से AA डिटेक्शन के लिए अनुकूलित है। विकसित प्लेटफॉर्म 1.5 घंटे के भीतर प्लाज्मा की छोटी मात्रा (0.5 μL) से सीधे AA का पता लगा सकता है।

परिणाम: cMES assays ने AA स्तरों और के बीच एक मजबूत संबंध की पुष्टि कीविरोधी उम्र बढ़ने प्रभाव: एए के स्तर, उम्र बढ़ने के साथ घटते हुए, प्लाज्मा-उपचारित वृद्ध चूहों में वृद्धि हुई, जिसने बेहतर सीखने और स्मृति प्रदर्शन को भी दिखाया।

निष्कर्ष: सीएमईएस प्लेटफॉर्म प्री-और क्लिनिकल दोनों को सशक्त करेगाबुढ़ापा विरोधीन्यूनतम इनवेसिव, अनुदैर्ध्य उपचार निगरानी को सक्षम करके अनुसंधान; इन क्षमताओं के विकास में तेजी आएगीबुढ़ापा विरोधीउपचार, व्यक्तिगत जीवन की गुणवत्ता में सुधार।

कीवर्ड: एंटी-एजिंग, एराकिडोनिक एसिड, मेटाबोलाइट प्रोफाइलिंग, मैग्नेटो-इलेक्ट्रोकेमिकल सेंसर, बायोसेंसर

परिचय

उम्र बढ़ने को संज्ञानात्मक अध: पतन (जैसे, न्यूरोडीजेनेरेशन, मनोभ्रंश) और अन्य पुरानी बीमारियों (जैसे, कैंसर, हृदय रोग, पेशीय अध: पतन) के लिए एक नैदानिक ​​जोखिम कारक के रूप में मान्यता प्राप्त है। मानव जीवनकाल के विस्तार और बढ़ती बुजुर्ग आबादी के साथ, उम्र बढ़ने के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण प्रयास चल रहे हैं [1-3] और उम्र बढ़ने की प्रक्रियाओं को धीमा करने या यहां तक ​​​​कि उलटने के लिए चिकित्सीय रणनीति खोजने के लिए [4]। दरअसल, जानवरों के अध्ययन से आशाजनक परिणाम सामने आए हैं; युवा चूहों से प्लाज्मा आधान प्राप्त करने वाले वयस्क चूहों ने संज्ञानात्मक कार्य, सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी और न्यूरोनल गतिविधि [5] को पुनः प्राप्त कर लिया। में तेजी से विकासबुढ़ापा विरोधीउपचार और मानव परीक्षणों में उनका अनुवाद प्रत्याशित है [6]। उपचार प्रभावों की निगरानी के लिए वर्तमान मेट्रिक्स में सीमित व्यावहारिकता है, क्योंकि विधियों को अक्सर मनुष्यों (जैसे, आक्रामक मस्तिष्क इमेजिंग, नियंत्रित व्यवहार अवलोकन) और व्यक्तिपरक (जैसे, रोगी के अनुभवों पर प्रश्नावली) के साथ लागू करना मुश्किल होता है। आगे बढ़ने में एक प्रमुख आवश्यकताबुढ़ापा विरोधीउपचार इस प्रकार उपचार की निगरानी के लिए मात्रात्मक, न्यूनतम इनवेसिव एसेज़ विकसित करने में निहित है।

हमने तर्क दिया कि मेटाबोलाइट्स के लिए एक शक्तिशाली स्रोत होगाबुढ़ापा विरोधीबायोमार्कर। मेटाबोलाइट्स एक जीव में एक आवश्यक फेनोटाइप हैं और अन्य बीमारियों के लिए नैदानिक ​​बायोमार्कर के रूप में अध्ययन किया जा रहा है [7]। विशेष रूप से, वृद्धावस्था आमतौर पर चयापचय परिवर्तन या शिथिलता से जुड़ी होती है, जो जीवों में समग्र मेटाबोलाइट प्रोफाइल को प्रभावित करती है। जैसे, यह बोधगम्य है कि मेटाबोलाइट्स की संरचना और/या स्तरों का पता लगाने से की प्रभावकारिता को सूचित किया जाएगाबुढ़ापा विरोधीइलाज। इसके अलावा, मेटाबोलाइट परख, विशेष रूप से रक्त परीक्षण के रूप में, मात्रात्मक और न्यूनतम इनवेसिव हो सकता है; ये गुण सीरियल सैंपलिंग के माध्यम से विभिन्न उपचार के नियमों या रोगी समूहों, और निगरानी (विरोधी) उम्र बढ़ने की गतिशीलता से अवगत कराने की सुविधा प्रदान करेंगे।

हम यहां निगरानी के लिए एक नई बायोसेंसर रणनीति का वर्णन करते हैंबुढ़ापा विरोधीइलाज। दो प्रमुख तत्व उन्नत थे: i) एक रक्त-जनित मेटाबोलाइट की पहचान सरोगेट एजिंग-मार्कर के रूप में की गई थी; और ii) नियमित नैदानिक ​​सेटिंग्स में अनुप्रयोगों के लिए एक तेज, लागत प्रभावी परख प्रणाली विकसित की गई थी। विशेष रूप से, हमने मानव गर्भनाल रक्त से प्लाज्मा के साथ वृद्ध चूहों (लगभग 2 वर्ष पुराने) के एक समूह का इलाज किया। माउस रक्त पर व्यापक चयापचय विश्लेषण से पता चला है कि एराकिडोनिक एसिड (एए), जिसका स्तर उम्र बढ़ने के साथ काफी कम हो गया, उपचारित समूह में विपरीत रूप से बढ़ गया। इस अवलोकन ने हमें छोटे आणविक लक्ष्यों के लिए एक मैग्नेटो-इलेक्ट्रोकेमिकल सेंसर तैयार करने के लिए प्रेरित किया: हमने एक प्रतिस्पर्धी विद्युत रासायनिक प्रतिक्रिया को अनुकूलित किया जिसमें एए को चुंबकीय मोतियों पर कब्जा कर लिया गया और उच्च संवेदनशीलता के लिए केंद्रित किया गया। विकसित प्लेटफॉर्म 1.5 घंटे के भीतर प्लाज्मा की छोटी मात्रा (0.5 μL) से सीधे AA का पता लगा सकता है। इस मंच का उपयोग करके, हम रक्त एए स्तरों और मोटर कार्य में जानवरों के बेहतर प्रदर्शन के बीच सकारात्मक संबंध स्थापित कर सकते हैं।

परिणाम

गर्भनाल रक्त प्लाज्मा के साथ वयस्क चूहों का उपचार करना चित्र 1क समग्र प्रयोग योजना को दर्शाता है।

एक एजेंट के रूप में, हमने मानव गर्भनाल रक्त के नमूनों से प्राप्त प्लाज्मा का उपयोग किया। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि वृद्ध चूहों को युवा माउस प्लाज्मा के साथ इंजेक्ट किया गया था, उन्होंने स्थानिक स्मृति समारोह को पुनर्प्राप्त किया, और मानव गर्भनाल रक्त प्लाज्मा के प्रणालीगत प्रशासन ने वृद्ध चूहों में हिप्पोकैम्पस-निर्भर अनुभूति में सुधार किया [5, 8]। प्लाज्मा इंजेक्शन, जो सेलुलर घटकों से रहित है, प्रजातियों के बेमेल होने से प्रतिरक्षा अस्वीकृति के जोखिम को कम करता है। वृद्ध चूहों (शुरुआती उम्र, 18 महीने की उम्र) को यादृच्छिक रूप से प्राप्त किया गया था और पूंछ-व्यर्थ इंजेक्शन (130 µ एल; विवरण के लिए अंजीर। एस 1 देखें) के माध्यम से या तो प्लाज्मा (एक उपचार समूह) या खारा बफर (एक दिखावा समूह) प्राप्त किया। सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, युवा चूहों (3 महीने पुराने) का उपयोग किया गया। गर्भनाल रक्त से प्राप्त प्लाज्मा को पूल नहीं किया गया था और प्रत्येक माउस को एक ही दाता (चित्र। S1) से बार-बार प्लाज्मा से संक्रमित किया गया था। एक 4-सप्ताह के उपचार के बाद, चूहों को एक व्यवहार परीक्षण (यानी, रोटारोड) के अधीन किया गया था, और विश्लेषण के लिए रक्त खींचा गया था।

चित्रा 1. प्रायोगिक डिजाइन। मानव गर्भनाल रक्त प्लाज्मा युवा (3-महीने पुराना), बूढ़ा (20- और 23-महीने पुराना), और प्लाज्मा-उपचारित पुराने समूहों (20- को दिया गया। और 23-महीने पुराना)। मोटर समन्वय और सीखने को मापने के लिए तीन समूहों को 2-परीक्षण रोटारोड परीक्षणों के अधीन किया गया था। तीन समूहों के रक्त पर लक्षित मेटाबोलाइट प्रोफाइलिंग की गई, और सबसे अधिकबुढ़ापा विरोधी-प्रासंगिक मार्ग एक जैव सूचनात्मक दृष्टिकोण के माध्यम से निर्धारित किया गया था। मार्ग के सबसे महत्वपूर्ण मेटाबोलाइट का पता लगाने के लिए बायोसेंसर विकसित किया गया था।

चित्रा 2. मानव गर्भनाल रक्त प्लाज्मा उपचार से जुड़े मेटाबोलाइट बायोमार्कर का निर्धारण। (ए) मेटाबोलाइट गड़बड़ी की वैश्विक प्रोफ़ाइल। पंक्तियाँ LC/MS और स्तंभों से नमूनों तक सुविधाओं (m/z मान और अवधारण समय का एक अद्वितीय संयोजन) के अनुरूप हैं। पंक्तियों को श्रेणीबद्ध रूप से क्लस्टर किया जाता है। (बी) आयामी कमी के लिए पीसीए का स्कोर प्लॉट। नमूने मुख्य घटक (पीसी) 1 और 2 के खिलाफ प्लॉट किए गए थे। अक्ष किंवदंतियों के कोष्ठक में मान उन घटकों द्वारा समझाया गया भिन्नता के अनुपात हैं। PC1 सबसे अधिक संभावना एंटी-एजिंग प्रभावों की व्याख्या करता है, यह देखते हुए कि प्लाज्मा उपचारित समूह शम समूह की तुलना में युवा समूह के बहुत करीब था। (सी) मार्ग संवर्धन विश्लेषण। मापित m/z मानों को आण्विक द्रव्यमान सूचना से मिला कर मेटाबोलाइट्स की पहचान की गई। प्रत्येक सर्कल एक विशिष्ट मार्ग का प्रतिनिधित्व करता है। किसी दिए गए मार्ग के लिए, वृत्त का x स्थान या आकार मेटाबोलाइट्स की सापेक्ष-बीच केंद्रीयता (मार्ग प्रभाव का एक माप) और y स्थान या रंग (लाल के लिए कम p मान और नीले रंग के लिए उच्चतर) से मेल खाता है। कौन से मेटाबोलाइट्स अधिक प्रतिनिधित्व करते हैं। प्रमुख पथों में उच्च x और y मान होते हैं। तदनुसार, एराकिडोनिक एसिड (एए) चयापचय को व्याख्या करने के लिए सबसे संभावित मार्ग के रूप में पहचाना गया थाविरोधी उम्र बढ़ने प्रभावगर्भनाल रक्त प्लाज्मा की।

माउस रक्त के नमूनों पर चयापचय विश्लेषण

हमने सबसे पहले माउस प्लाज्मा में एक निष्पक्ष छोटे-अणु मेटाबोलाइट प्रोफाइलिंग का प्रदर्शन किया। सभी तीन माउस समूहों के रक्त के नमूने तरल क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी / एमएस) विश्लेषण के अधीन थे। हमने MAIT (मेटाबोलाइट स्वचालित पहचान टूलकिट) द्वारा m/z डेटा को संसाधित किया और ANOVA (m/z और अवधारण समय के 8572 अद्वितीय संयोजन) (छवि 2ए) के माध्यम से सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण विशेषताओं की पहचान की। मेटाबोलाइट्स के पदानुक्रमित क्लस्टरिंग विश्लेषण (एचसीए) ने दो प्रमुख पैटर्न प्रकट किए: i) मेटाबोलाइट प्रोफाइल वृद्ध (गैर-इलाज) और युवा चूहों के बीच विशिष्ट रूप से भिन्न थे; और ii) प्लाज्मा-उपचारित वृद्ध चूहों की रूपरेखा युवा चूहों के करीब थी।

प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) ने मेटाबोलामिक्स डेटा (छवि 2 बी) की अंतर्निहित संरचनाओं का खुलासा किया। कुल विविधताओं का लगभग 50 प्रतिशत पहले (पीसी1) और दूसरे प्रमुख घटकों (पीसी 2) द्वारा समझाया जा सकता था। सभी तीन समूह (यानी, युवा, प्लाज्मा-उपचारित, और दिखावटी समूह) असतत पदों पर बसे, यह दर्शाता है कि समूह वर्गों को अलग करने के लिए जैविक रूप से प्रासंगिक विशेषताओं की पहचान की गई थी। दिलचस्प बात यह है कि प्लाज्मा-उपचारित वृद्ध समूह दिखावा से हटकर युवा समूह की ओर चला गया। समूह पृथक्करण की मात्रा निर्धारित करने के लिए, हमने दो प्रमुख घटकों पर श्रेणीबद्ध क्लस्टरिंग की गणना की। डेंड्रोग्राम में, युवा और प्लाज्मा-उपचारित समूहों को गैर-उपचारित समूह (3162.5) (चित्र। S2) की तुलना में कम असमानता स्तर (या उच्च समानता स्तर, 1120.9) पर क्लस्टर किया गया था। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि चयनित विशेषताओं (अंजीर 2a में चर या पंक्तियाँ) का उपयोग उम्र बढ़ने के लिए प्रासंगिक मेटाबोलाइट बायोमार्कर का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है औरबुढ़ापा विरोधी. हमने सार्वजनिक डोमेन [9] में डेटाबेस का उपयोग करके ज्ञात मेटाबोलाइट्स के साथ सुविधाओं की व्याख्या की।

हमने KEGG (क्योटो इनसाइक्लोपीडिया ऑफ जीन्स एंड जीनोम्स) [10] मैपिंग को लागू करते हुए, पहचाने गए मेटाबोलाइट्स के कार्यों और इंटर-कनेक्टिविटी का आकलन किया। किसी दिए गए मार्ग के लिए, हमने i) एक उम्मीदवार मेटाबोलाइट का अति-प्रतिनिधित्व और ii) इसका महत्व (यानी, केंद्रीयता केंद्रीयता) [11] अन्य मेटाबोलाइट्स के जोड़े के बीच एक प्रमुख मध्यवर्ती नोड के रूप में मापा (विवरण के लिए तरीके देखें)। हमने पाया कि एराकिडोनिक एसिड (एए) चयापचय सबसे अधिक प्रतिनिधित्व वाला मार्ग था (अंजीर 2 सी में उच्चतम वाई-मान), और उस मार्ग में मेटाबोलाइट्स संचार पथों (छवि 2 सी में उच्च एक्स-मान) का पता लगाने के लिए प्रवृत्त थे। सूचना प्रवाह को नियंत्रित करें। एए चयापचय में कई चयापचयों के बीच, हमने एए को ही बायोमार्कर के रूप में चुना; मार्ग में एक प्रारंभिक प्रवेश के रूप में, अकेले एए अन्य विकृत चयापचयों का प्रतिनिधि हो सकता है।

प्लाज्मा में एए का पता लगाने के लिए प्रतिस्पर्धी मैग्नेटो-इलेक्ट्रोकेमिकल सेंसर (सीएमईएस)

हम अगली बार AA डिटेक्शन के लिए एक तेज़, ऑनसाइट परख प्रणाली को आगे बढ़ाने के लिए निकल पड़े। हमने मैग्नेटो-इलेक्ट्रोकेमिकल सेंसिंग तकनीक [12–17] का उपयोग करने का विकल्प चुना। यह लक्ष्य संवर्धन और पहचान को एक ही मंच में जोड़ती है: चुंबकीय मोतियों (एमबी) का उपयोग आणविक लक्ष्यों को पकड़ने और लेबल करने के लिए किया जाता है, और विद्युत रासायनिक संवेदन के माध्यम से मनके-बाध्य लक्ष्यों का पता लगाया जाता है। इस दृष्टिकोण के कई व्यावहारिक लाभ हैं: i) देशी नमूनों (प्लाज्मा या रक्त) का नमूना शुद्धिकरण की आवश्यकता के बिना सीधे उपयोग किया जा सकता है; ii) परख चुंबकीय संवर्धन और एंजाइमी संकेत प्रवर्धन के माध्यम से उच्च पहचान संवेदनशीलता प्राप्त करता है; iii) विद्युत पहचान योजना के आधार पर, सेंसर को पोर्टेबल डिवाइस के रूप में आसानी से छोटा किया जा सकता है (चित्र 3ए)।

मैग्नेटो-इलेक्ट्रोकेमिकल सेंसिंग के माध्यम से एए का पता लगाना, हालांकि, एक तकनीकी चुनौती थी; चूंकि एए एक छोटा अणु (~ 304.5 डीए) है, एए-एंटीबॉडी की एक जोड़ी का उपयोग करने वाले इम्युनोसे को लागू करना मुश्किल था। इस प्रकार हमने एक प्रतिस्पर्धी परख प्रारूप (cMES; प्रतिस्पर्धी मैग्नेटो-इलेक्ट्रोकेमिकल सेंसर) का पता लगाया, जिसके लिए केवल एक AA एंटीबॉडी (छवि 3 बी) की आवश्यकता होती है। लक्ष्य पर कब्जा करने के लिए, हमने एमबी को एए-एंटीबॉडी (एमबीएबी) के साथ लेपित किया। हमने एए को एक ऑक्सीकरण एंजाइम (हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज, एचआरपी) के साथ संयुग्मित करके एक प्रतिस्पर्धी एजेंट (एए-एचआरपी) भी तैयार किया। विशेष रूप से, हमने हैप्टेन फॉर्म का इस्तेमाल किया; एए गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) पर संयुग्मित होता है, और आगे बीएसए वाहक (छवि। एस 3) के लिए एचआरपी संयुग्मित होता है। CMES परख के लिए, रक्त के नमूनों को MBAb और AA-HRP के साथ मिलाया गया। एए-एचआरपी की मात्रा एमबीएबी (विधियों) में एए-बाध्यकारी साइटों को संतृप्त करने के लिए पर्याप्त थी। इससे नमूनों में अंतर्जात एए मात्रा के आधार पर एमबी पर अंतर एचआरपी-लोडिंग हो जाएगी। क्रमिक रूप से एक क्रोमोजेनिक इलेक्ट्रॉन मध्यस्थ (3,3', 5,5'-टेट्रामेथिलबेन्ज़िडाइन, टीएमबी) को जोड़ने से एक विद्युत प्रवाह उत्पन्न होता है जिसे एक प्लेनर इलेक्ट्रोड द्वारा पढ़ा गया था। एए कैप्चर और टीएमबी ऊष्मायन के लिए प्रतिक्रिया समय को सिग्नल स्तर (छवि S4) को अधिकतम करने के लिए अनुकूलित किया गया था।

चित्रा 3. एए परख के लिए प्रतिस्पर्धी मैग्नेटो-इलेक्ट्रोकेमिकल सेंसर (सीएमईएस)। (ए) डिवाइस योजनाबद्ध। सीएमईएस डिवाइस में एक छोटा पदचिह्न और सामर्थ्य है

साइट पर संचालन। (बी) हमने एए का पता लगाने के लिए एक प्रतिस्पर्धी विद्युत रासायनिक परख तैयार की। चुंबकीय मोतियों (एमबीएबी) को एए के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ संयुग्मित किया गया था।

नियंत्रण नमूनों में केवल AA-HRP था और उन्हें चुंबकीय मोतियों के साथ मिलाया गया था। परीक्षण के नमूने चुंबकीय मोतियों और एए-एचआरपी के साथ मिश्रित किए गए थे। (सी) विद्युत धाराएं

पोर्टेबल सीएमईएस रीडर द्वारा मापा जाता है। सीएमईएस परख में, एए एकाग्रता [एए] बढ़ने के साथ वर्तमान परिमाण कम हो जाता है। नियंत्रण से संकेत

नमूना [एए]=0 एनजी/एमएल के लिए आधार रेखा सेट करें। नियंत्रण और लक्षित प्लाज्मा नमूनों के बीच वर्तमान अंतर (∆I) का उपयोग विश्लेषणात्मक मीट्रिक के रूप में किया गया था। (डी)

एए की ज्ञात मात्रा को सीरम में बढ़ाया गया और सीएमईएस द्वारा मापा गया। पता लगाने की सीमा ~ 126 एनजी/एमएल थी। (ई) सीएमईएस और एलिसा की तुलना के लिए की गई थी

सहमति दोनों तौर-तरीकों के परिणामों ने एक अच्छा समझौता दिखाया (R2=0.959)। डेटा को तीन प्रतियों के माप से माध्य ± SEM के रूप में प्रदर्शित किया जाता है।

चित्रा 4. प्लाज्मा नमूनों में एए माप। (ए) प्लाज्मा इंजेक्शन के बाद माउस एए स्तर का समय पाठ्यक्रम विश्लेषण। हमने 13 {{1 0}} μL प्लाज्मा (AA एकाग्रता=7 .2 माइक्रोग्राम / एमएल) को चूहों (n=6) में इंजेक्ट किया और 3, 7 और 14 के बाद चूहों का रक्त एकत्र किया। दिन। चूहों के रक्त के एए स्तर की निगरानी की गई। एए का स्तर 3 दिन में काफी बढ़ गया और 7 दिनों के बाद सामान्य स्तर पर लौट आया। *पी < 0.05;="" **पी="">< 0.01;="" ***पी="">< 0.001.="" (बी)="" माउस="" प्लाज्मा="" नमूनों="" की="" परख="" की="" गई।="" नियंत्रण="" समूह="" (एन="5)" में,="" युवा="" चूहों="" (उम्र,="" 5="" और="" 8="" महीने)="" में="" नकली="" इलाज="" वाले="" पुराने="" चूहों="" (उम्र,="" 20="" और="" 23="" महीने;="" एन="8)" की="" तुलना="" में="" एए="" स्तर="" अधिक="" था।="" प्लाज्मा-उपचारित="" समूह="" (n="5)" के="" लिए,="" aa="" में="" निरंतर="" वृद्धि="" देखी="" गई।="" *="" पी=""><0.05; **पी=""><0.01; ***पी=""><0.001। (सी)="" मास="" स्पेक्ट्रोमेट्री="" द्वारा="" (बी)="" के="" समान="" समूहों="" से="" प्लाज्मा="" के="" नमूनों="" का="" विश्लेषण="" किया="" गया="" था।="" एए="" स्तरों="" ने="" एक="" समान="" रुझान="" दिखाया="" जैसा="" कि="" सीएमईएस="" द्वारा="" मापा="" गया="" था।="" *="" पी=""><0.05; **पी=""><0.01; ***पी=""><0.001। डेटा="" को="" माध्य="" ±="" sem="" के="" रूप="" में="" प्रदर्शित="" किया="" जाता="">

प्रतिस्पर्धी परख के परिणामस्वरूप, उच्च प्लाज्मा AA सांद्रता ([AA]) के साथ विद्युत प्रवाह का परिमाण कम हो गया। इसलिए हमने केवल AA-HRP के साथ MBAb को इनक्यूबेट करके एक नियंत्रण नमूना तैयार किया। सिग्नल अंतर की गणना के लिए ऊपरी आधार रेखा (यानी, [एए]=0 एनजी/एमएल) सेट करने के लिए नियंत्रण नमूने का उपयोग किया गया था; नियंत्रण और प्लाज्मा नमूने से विद्युत धाराओं को मापा गया, और शुद्ध अंतर |∆I |=|आईकंट्रोल - आईप्लाज्मा|प्राप्त किया गया था (चित्र 3सी)। ऐसा

सामान्य पृष्ठभूमि संकेत के लिए विभेदक माप की भी भरपाई की जाती है।

एए की अलग-अलग मात्रा के साथ नुकीले नमूनों का उपयोग करते हुए अनुमापन प्रयोग (छवि 3 डी) ने पता लगाने की सीमा (एलओडी) को ~ 125.9 एनजी / एमएल के रूप में प्रकट किया। परख का एलओडी युवा चूहों के प्लाज्मा (5 महीने, एन=2) में विशिष्ट एए एकाग्रता (38 माइक्रोग्राम / एमएल) की तुलना में ~ 300- गुना कम था। इन परिणामों के आधार पर, हमने एक बफर समाधान (तरीके देखें) जोड़कर प्रारंभिक प्लाज्मा नमूनों (100- गुना) को पतला किया। गैर-विशिष्ट बंधन से संकेत एक आंतरिक पृष्ठभूमि स्तर (~ 43 एनए) के करीब था, संभावित रूप से उच्च कमजोर पड़ने वाले कारक से लाभान्वित हो रहा था। हमने यह भी पुष्टि की कि परख के परिणाम पारंपरिक एलिसा (आर 2=0.961, अंजीर। 3e) से मेल खाते हैं। हालांकि, सीएमईएस परख एलिसा (4 घंटे) की तुलना में तेज (1 घंटा) था, ज्यादातर तेजी से बाध्यकारी कैनेटीक्स के कारण; सीएमईएस में, एमबी पूरे नमूना मात्रा (3- आयामी प्रसार) में एए को कैप्चर करते हैं, जबकि एए कैप्चर प्लेट-आधारित एलिसा में 1-आयामी प्रसार पर निर्भर करता है।

प्लाज्मा-उपचारित चूहों में एए निगरानी

हमने एकल प्लाज्मा उपचार के बाद चूहों में AA स्तरों का विश्लेषण करने के लिए cMES लागू किया। चूंकि एए मानव गर्भनाल रक्त में स्वाभाविक रूप से मौजूद होता है, प्लाज्मा इंजेक्शन अतिरिक्त रूप से माउस एए स्तरों को बढ़ा देगा। छह अलग-अलग मानव गर्भनाल रक्त प्लाज्मा से औसत एए एकाग्रता 7.2 ± 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल (मतलब ± SEM) थी। हमने चूहों (n=6) में मानव गर्भनाल रक्त प्लाज्मा के 13 0 µL को इंजेक्ट किया और उनके AA स्तरों (चित्र 4ए) की निगरानी की। प्लाज्मा इंजेक्शन ने तुरंत रक्त एए स्तर (दिन 3; पी <0.01, अन्य="" सभी="" समय="" बिंदुओं="" की="" तुलना="" में)="" में="" वृद्धि="" की,="" लेकिन="" प्रभाव="" अस्थायी="" था;="" उपचार="" के="" 7="" दिनों="" के="" बाद="" aa="" का="" स्तर="" सामान्य="" हो="" गया="" (p="0.34," प्लाज्मा="" इंजेक्शन="" से="" पहले="" के="" समय="" बिंदु="" की="" तुलना="">

हम अगले पूर्ण उपचार अनुसूची (छवि S1) के बाद प्लाज्मा एए स्तरों की निगरानी करते हैं। तीन अलग-अलग माउस कॉहोर्ट्स का उपयोग किया गया था: एक प्लाज्मा-उपचारित (n=8) और एक दिखावा (n=8) आयु वर्ग (20-23 महीने पुराना), और एक युवा नियंत्रण समूह (<8 months="" old,="" n="5)." we="" used="" 0.5="" µl="" of="" mouse="" plasma="" for="" each="" measurement.="" the="" sham="" group="" showed="" lower="" aa="" level="" compared="" to="" the="" young="" group="" (p="0.003," fig.="" 4b).="" the="" plasma="" treated="" group,="" however,="" showed="" increased="" aa="" levels="" even="" after="" 1="" month="" after="" the="" treatment.="" the="" effect="" was="" sustained="" up="" to="" 4="" months="" post="" treatment;="" the="" plasma-treated="" group="" had="" higher="" aa="" level="" than="" the="" sham="" group="" (p="0.0003)." we="" also="" analyzed="" aliquots="" of="" samples="" via="" lc/ms="" (fig.="" 4c).="" the="" results="" from="" both="" assays="" were="" concordant,="" corroborating="" aa's="" value="" as="" a="">

प्लाज्मा उपचार से वृद्ध चूहों में संज्ञानात्मक और व्यवहार में सुधार होता है

हमने आगे जानवरों के सहकर्मियों के व्यवहार संबंधी फेनोटाइप का आकलन किया, विशेष रूप से उनके मोटर सीखने और स्मृति कार्यों का मूल्यांकन किया। हमने प्लाज़्मा या दिखावा उपचार के बाद 1 और 4 महीने में {0}} परीक्षण रोटारोड परीक्षण किए (चित्र 5क); घूमने वाली छड़ पर गिरने से पहले माउस की विलंबता (चलने का समय) का उपयोग जानवर के मोटर प्रदर्शन का आकलन करने के लिए किया गया था। उपचार के 1 महीने बाद (20-महीने पुराना), दिखावा और प्लाज्मा-उपचारित समूहों दोनों की विलंबता युवा (5- महीने की उम्र की तुलना में काफी कम (p <0.0001) थी।="" )="" समूह="" (चित्र।="" 5="" बी)।="" हालांकि,="" प्लाज्मा-उपचारित="" समूह="" ने="" मोटर="" सीखने="" और="" स्मृति="" में="" धीरे-धीरे="" सुधार="" दिखाया,="" जबकि="" नकली="" समूह="" में="" समान="" संकाय="" में="" गिरावट="" आई।="" एए="" स्तरों="" में="" बदलाव="" से="" व्यवहार="" में="" बदलाव="" आया="" है,="" जो="" के="" शुरुआती="" संकेतक="" के="" रूप="" में="" काम="" कर="" सकता="">बुढ़ापा विरोधीउपचार प्रभाव (चित्र। 5c)।

मस्तिष्क के ऊतक विश्लेषण (अंजीर। 5d, 5e) से पता चला है कि वृद्ध चूहों (शम समूह) में युवा चूहों की तुलना में उप-वेंट्रिकुलर क्षेत्र में DCX-पॉजिटिव कोशिकाओं का छोटा क्षेत्र था। इसके विपरीत, प्लाज्मा-उपचारित जानवर में DCX-पॉजिटिव कोशिकाओं का क्षेत्र बढ़ गया और अपरिवर्तित रहा (p=0.04) यह दर्शाता है कि इंजेक्टेड कॉर्ड ब्लड प्लाज्मा पुराने मस्तिष्क के न्यूरोजेनेसिस को उत्तेजित करता है। परिणाम निरंतर न्यूरोजेनेसिस पर प्लाज्मा उपचार के संभावित लाभ का सुझाव देते हैं जिसके परिणामस्वरूप उपचारित समूह में बेहतर मोटर फ़ंक्शन हुआ।

बहस

कायाकल्प उपचारों में प्रगति उपचार प्रभावकारिता को पढ़ने के लिए एक उद्देश्य और मात्रात्मक उपाय की आवश्यकता को बढ़ाती है। इस प्रकार हमने अपने अध्ययन को आणविक बायोमार्कर की पहचान करने के लिए डिज़ाइन किया है जो उम्र बढ़ने की फेनोटाइपिक विशेषताओं को सर्वोत्तम रूप से समझा सकते हैं औरबुढ़ापा विरोधीइलाज। हमारे पशु प्रयोगों ने निम्नलिखित टिप्पणियों का नेतृत्व किया: i) युवा और वयस्क माउस कोहॉर्ट्स के मेटाबोलाइट प्रोफाइल स्पष्ट रूप से भिन्न हैं; और ii) मानव गर्भनाल प्लाज्मा को वृद्ध चूहों में इंजेक्ट करने से उनका मेटाबोलाइट पैटर्न युवा चूहों के करीब बदल जाता है। दिलचस्प बात यह है कि हमने एराकिडोनिक एसिड (एए) को सबसे प्रभावी सरोगेट बायोमार्कर के रूप में पायाबुढ़ापा विरोधीइलाज; एए चयापचय युवा और प्लाज्मा-उपचारित चूहों दोनों में अत्यधिक अनियमित था, और अन्य चयापचय मार्गों जैसे कि लिनोलिक एसिड चयापचय [10, 18] के साथ बातचीत करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हुए पाया गया था।

हमने नियमित अनुसंधान और नैदानिक ​​सेटिंग्स में एए का पता लगाने की सुविधा के लिए एक तेज, पोर्टेबल सेंसर सिस्टम (सीएमईएस) विकसित किया है। हमने विशेष रूप से प्लाज्मा नमूनों से छोटे आणविक लक्ष्यों (यानी, मेटाबोलाइट्स) का पता लगाने के लिए इम्यूनोमैग्नेटिक संवर्धन के साथ एक प्रतिस्पर्धी परख योजना को एकीकृत किया। यह संयोजन निम्नलिखित फायदे लाता है। (i) परख तेजी से बाध्यकारी कैनेटीक्स से लाभान्वित होती है, क्योंकि चुंबकीय मोती पूरे नमूना मात्रा (3-आयामी प्रसार) में एए को पकड़ लेते हैं। (ii) मनका संग्रह के लिए उपयोग किए जाने वाले बाहरी चुम्बकों के साथ परख प्रक्रियाओं (जैसे, धोने के चरण) को सरल बनाया जाता है। (iii) डिटेक्शन इलेक्ट्रोड के पास एए-बाउंड बीड्स को चुंबकीय रूप से केंद्रित करके, समग्र विश्लेषणात्मक संकेत में सुधार किया जा सकता है (~ 72 प्रतिशत) [12]। दरअसल, हमने दिखाया कि सीएमईएस परख उपयोग करता है<1 µl="" of="" plasma="" with="" the="" total="" assay="" time="" within="" 1.5="" hour.="" both="" cmes="" and="" mass="" spectrometry="" consistently="" showed="" that="" plasma="" aa="" levels="" decrease="" with="" aging,="" but="" that="" they="" reversely="" increase="" with="" cord-plasma="" treatment.="" importantly,="" increases="" in="" aa="" levels="" could="" be="" an="" early="" indicator="" of="" improved="" cognitive="" functions="" in="" treated="" animals.="" these="" results="" highlight="" the="" utility="" of="" aa-cmes;="" with="" minimally="" invasive="" blood="" draw,="" individual="" patients="" can="" be="" monitored="" in="" a="" serial="" fashion="" to="" better="" assess="" treatment="">

चित्रा 5. व्यवहार और आणविक परख। (ए) 2-प्लाज्मा इंजेक्शन के 1 और 4 महीने बाद परीक्षण रोटारोड परीक्षण किए गए। (बी) प्लाज्मा-उपचारित समूह

मोटर समन्वय में प्रगतिशील सुधार दिखाया; प्रदर्शन अंत में युवा समूह के करीब था (3 महीने में दूसरा परीक्षण)। उम्र बढ़ने के साथ शम समूह का दौड़ने का समय कम होता गया। *p < 0.05;="" **पी="">< 0.01.="" (सी)="" प्लाज्मा="" उपचारित="" समूह="" के="" लिए,="" मोटर="" फ़ंक्शन="" में="" सुधार="" से="" पहले="" एए="" स्तरों="" में="" वृद्धि="" हुई।="" *पी="">< 0.05;="" **पी=""><0.01; ***पी=""><0.001। (डी)="" सबवेंट्रिकुलर="" ज़ोन="" में="" मस्तिष्क="" कोशिकाओं="" को="" एक="" न्यूरोजेनेसिस="" मार्कर,="" डबलकोर्टिन="" (डीसीएक्स)="" के="" लिए="" प्रतिरक्षित="" किया="" गया="">

स्केल बार 50 µm है। ध्यान दें कि शम समूह में युवा चूहों की तुलना में उप-वेंट्रिकुलर क्षेत्र में DCX-पॉजिटिव कोशिकाओं का महत्वपूर्ण छोटा क्षेत्र था, जबकि प्लाज्मा-उपचारित जानवर में क्षेत्र में वृद्धि हुई और अपरिवर्तित रहा। (ई) छवि (डी) में डीसीएक्स-पॉजिटिव कोशिकाओं का क्षेत्र मापा गया था। *पी < 0.05;="" ***पी=""><>

एए को मांसपेशियों की वृद्धि और मस्तिष्क के विकास को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है [19, 20]। अन्य रिपोर्टों में एए के संभावित लाभों पर भी प्रकाश डाला गयाबुढ़ापा विरोधी[21, 22]। वर्तमान अध्ययन इन निष्कर्षों के अनुरूप है, लेकिन इसका दायरा एए स्तरों और के बीच एक सहसंबंधी संबंध स्थापित करने तक सीमित था।बुढ़ापा विरोधीफेनोटाइप। सीरियल एए निगरानी, ​​​​हालांकि, संकेत दिया कि प्लाज्मा-उपचारित चूहों में एए की वृद्धि अंतर्जात स्रोतों से होने की संभावना थी, न कि ट्रांसफ्यूज्ड प्लाज्मा से। इसके अलावा, निरंतरबुढ़ापा विरोधीप्लाज्मा उपचार की समाप्ति के 4 महीने बाद भी प्राप्तकर्ता चूहों में प्रभाव देखा गया। मोटर सीखने और स्मृति कार्यों में सुधार हुआ; और मस्तिष्क में न्यूरोनल अग्रदूत कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि हुई। ये अवलोकन प्लाज्मा-उपचारित चूहों में शारीरिक परिवर्तन का दृढ़ता से सुझाव देते हैं; सटीक तंत्र अभी तक स्पष्ट नहीं किया गया है।

इस अध्ययन की कई अन्य सीमाओं को भविष्य के शोध में संबोधित किया जाना चाहिए। सबसे पहले, उच्च सटीकता के लिए सीएमईएस परख को परिष्कृत करने की आवश्यकता है। विशेष रूप से, सच्चे नकारात्मक नमूनों की कमी के साथ (यानी, बिना किसी अंतर्जात एए के रक्त के नमूने), गैर-विशिष्ट बंधन से संकेतों का हिसाब देना मुश्किल था। निश्चित रूप से, रक्त मैट्रिक्स का प्रभाव नगण्य हो सकता है क्योंकि हमने नमूनों को 100-गुना करके पतला कर दिया है। हालांकि, इस तरह की धारणा को एए-हटाए गए प्लाज्मा नमूनों का उपयोग करके मान्य किया जाना है जो एए-कमी वाले माउस मॉडल [23] या एए के इम्युनोडेप्लिकेशन के माध्यम से तैयार किए जा सकते हैं। दूसरा, हमने सादगी के लिए एए चयापचय में एकल मेटाबोलाइट का पता लगाने पर ध्यान केंद्रित किया, लेकिन यह दृष्टिकोण किसी दिए गए मार्ग में मेटाबोलाइट्स के बीच बातचीत जैसे जैविक संदर्भ को अनदेखा कर सकता है। मेटाबोलाइट्स के एक पैनल को शामिल करने से मेटाबॉलिक गड़बड़ी को बेहतर ढंग से पकड़ लिया जाएगा और नैदानिक ​​​​सटीकता में भी वृद्धि होगी। छोटी नमूना मात्रा का उपभोग करते हुए विविध मार्करों का पता लगाने के लिए सीएमईएस को आसानी से बढ़ाया जा सकता है। तीसरा, मनुष्यों के लिए वर्तमान निष्कर्षों को प्रक्षेपित करना चुनौतीपूर्ण होगा। हालांकि चूहे और इंसान समान चयापचय मार्ग साझा करते हैं, चूहों में 7-मनुष्यों की तुलना में उच्च चयापचय दर [24] होती है। जलसेक के लिए इष्टतम प्लाज्मा खुराक निर्धारित करने और बायोमार्कर के लिए आधार रेखा निर्धारित करने के लिए मानव परीक्षण आवश्यक हैं; जानवरों के अध्ययन से पता चलता है कि हम ऐसे मानव अध्ययन की योजना बना रहे हैं। इन प्रयासों से भारत के विकास में तेजी आएगीबुढ़ापा विरोधीउपचार, व्यक्तिगत जीवन की गुणवत्ता में सुधार के साथ-साथ सामाजिक बोझ को कम करना।

तरीकों

प्रयोगात्मक परिरूप

प्रसव के समय एकत्र किए गए मानव गर्भनाल रक्त से प्लाज्मा को अलग किया गया था। गर्भनाल रक्त प्लाज्मा को पुराने चूहों (18-महीने पुराने), और शम नियंत्रण (18-महीने पुराने) और युवा चूहों (3-महीने के सकारात्मक के रूप में अंतःशिरा जलसेक द्वारा प्रशासित किया गया था। नियंत्रण) को खारा इंजेक्शन लगाया गया था। प्रत्यारोपण के 1 और 4 महीने बाद, मोटर समन्वय और दीर्घकालिक स्मृति (चित्र। S1) का आकलन करने के लिए 2- परीक्षण रोटारोड परीक्षण किए गए। तीन समूहों के रक्त पर अलक्षित मेटाबोलाइट प्रोफाइलिंग की गई और जैव सूचनात्मक विश्लेषण ने निर्धारित कियाबुढ़ापा विरोधीप्रासंगिक मार्ग (एराकिडोनिक एसिड चयापचय)। बायोसेंसर को आसानी से और कुशलता से रक्त-परिसंचारी एराकिडोनिक एसिड का पता लगाने के लिए विकसित किया गया था।

गर्भनाल रक्त नमूना तैयार करना

CHA सामान्य अस्पताल (सियोल, कोरिया, IRB No. CHAMC-2015- 08-130-009) के संस्थागत समीक्षा बोर्ड के तहत मानव गर्भनाल रक्त एकत्र किया गया था। मानव गर्भनाल रक्त 4 दाताओं से दान किया गया था और साइट्रेट-फास्फेट-डेक्सट्रोज के साथ एडेनिन (सीपीडीए -1) थक्कारोधी के साथ इलाज किया गया था। मानव गर्भनाल रक्त प्लाज्मा को कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 2,000 g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग किया गया था। पृथक प्लाज्मा नमूने -80 डिग्री पर संग्रहीत किए गए थे और कमरे के तापमान पर एकल फ्रीज-पिघलना चक्र के साथ उपयोग किए गए थे।

पशु प्रयोग

पशु प्रोटोकॉल को CHA विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था। हमने 18-महीने की मादा C57BL/6 चूहों का उपयोग चयापचय संबंधी गड़बड़ी और व्यवहार संबंधी फेनोटाइप का मूल्यांकन करने के लिए किया जो उम्र बढ़ने औरबुढ़ापा विरोधी. सकारात्मक नियंत्रण 3-महीने की मादा C57BL/6 चूहे थे। सभी चूहों को कमरे के तापमान पर मानक 12 घंटे के प्रकाश-अंधेरे चक्र में प्रतिबंधित किया गया था। वयस्क चूहों के लिए, गर्भनाल रक्त प्लाज्मा या खारा (130 µ एल) को 4 सप्ताह के लिए 12 बार अंतःक्षिप्त किया गया था। पृथक मानव गर्भनाल रक्त प्लाज्मा को जमा नहीं किया गया था, और किसी दिए गए जानवर को उसी दाता से गर्भनाल रक्त प्लाज्मा प्राप्त हुआ था। प्रत्येक प्रयोग में प्रयुक्त पशुओं की संख्या को संबंधित विधि अनुभागों में वर्णित किया गया है। प्लाज्मा को सेंट्रीफ्यूजेशन (3, 000 जी, 15 मिनट कमरे के तापमान पर) के माध्यम से एकत्र किया गया था।

मेटाबोलाइट अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण

रक्त-जनित मेटाबोलाइट्स की रूपरेखा के लिए, निर्धारित समय बिंदुओं पर कार्डियक पंचर द्वारा चूहों से रक्त एकत्र किया गया था: युवा समूह (3-महीने पुराना, n=10), दिखावा समूह ({{ 4}}महीने पुराना, n=10; 23-महीने पुराना, n=12), प्लाज्मा-उपचारित समूह (20-महीने पुराना, n {{13 }}; 23-महीने पुराना, एन=5)। तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) प्रणाली (एगिलेंट) का उपयोग करके रक्त के नमूनों का विश्लेषण किया गया। हमने LC/MS फ़ाइलों को एक मानक mzXML प्रारूप (ProteoWizard) [25] में परिवर्तित किया और फिर फीचर का पता लगाने, सांख्यिकीय विश्लेषण और मेटाबोलाइट पहचान के लिए MAIT (मेटाबोलाइट स्वचालित पहचान टूलकिट) [26] का उपयोग करके उन्हें संसाधित किया। सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण विशेषताओं (यानी, आयनित और/या खंडित मेटाबोलाइट्स) की पहचान विचरण (ANOVA) के विश्लेषण के माध्यम से की गई थी। इन विशेषताओं का मिलान मेटाबॉलिक डेटाबेस [9] में सभी संभावित पुटीय मेटाबोलाइट्स से किया गया था, जो मास स्पेक्ट्रल आयन के द्रव्यमान / आवेश अनुपात ({22}} के m / z सहिष्णुता पर आधारित था। 0 05)। हम प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) के माध्यम से पदानुक्रमित क्लस्टरिंग विश्लेषण और मेटाबोलामिक्स डेटा की अंतर्निहित संरचनाओं के माध्यम से वैश्विक मेटाबोलाइट परिवर्तनों की विशेषता रखते हैं। प्रति माउस दो या तीन तकनीकी प्रतिकृति (यह सुनिश्चित करना कि तकनीकी भिन्नता जैविक भिन्नता से बहुत छोटी है) को पीसीए और पदानुक्रमित क्लस्टरिंग जैसे अनुपयोगी शिक्षण में शामिल किया गया था। मुख्य घटकों (एचसीपीसी) पर पदानुक्रमित क्लस्टरिंग फैक्टोमाइनर, एक आर पैकेज [27] द्वारा किया गया था। एक कार्यात्मक विश्लेषण के लिए, उम्र बढ़ने और प्लाज्मा उपचार से प्रभावित होने वाले सबसे संभावित चयापचय मार्गों को केईजीजी मार्ग विश्लेषण (मेटाबोएनालिस्ट 3.0) [28] के माध्यम से निर्धारित किया गया था। विशिष्ट KEGG पथों में मिलान किए गए मेटाबोलाइट्स के अति-प्रतिनिधित्व को मापने के लिए हाइपरजोमेट्रिक वितरण का उपयोग किया गया था।

इम्यूनोमैग्नेटिक मोतियों की तैयारी

एपॉक्सी समूहों (डायनाबीड्स एम -270 एपॉक्सी, इंविट्रोजन) के साथ लेपित चुंबकीय मोतियों (5 मिलीग्राम) को 0.1 एम सोडियम फॉस्फेट समाधान के 1 0 0 μL में निलंबित कर दिया गया था। एराकिडोनिक एसिड (बायोमैटिक) के खिलाफ एक सौ माइक्रोग्राम एंटीबॉडी को जोड़ा गया और अच्छी तरह मिलाया गया। 3 एम अमोनियम सल्फेट समाधान के एक सौ माइक्रोलीटर जोड़ा गया था, और मिश्रण को 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर ऊष्मायन किया गया था और फिर धीमी झुकाव रोटेशन के साथ रात भर के लिए 4 डिग्री पर ऊष्मायन किया गया था। संयुग्मन अभिक्रिया pH=7.4 पर की गई। ये प्रक्रियाएं एपॉक्सी (बीड) और एमाइन (एंटीबॉडी) समूहों के बीच सहसंयोजक बंधन के गठन को प्रेरित करती हैं, जिसकी पुष्टि हमने पहले एंटीबॉडी-बीड संयुग्मों को पीएच चुनौतियों [29] के अधीन करके की थी। औसतन 2.4 × 104 एंटीबॉडी प्रति मनका स्थिर थे। एंटीबॉडी-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों को एक स्थायी चुंबक से अलग किया गया, पीबीएस समाधान के साथ दो बार धोया गया, और 1 प्रतिशत बीएसए के साथ पीबीएस के 200 μL में फिर से जोड़ा गया। मोतियों को एक महीने तक 4 डिग्री में संग्रहित किया गया था।

एराकिडोनिक एसिड के लिए एचआरपी संयुग्मन

एचआरपी को तब रिडक्टिव एमिनेशन केमिस्ट्री के माध्यम से बीएसए में संयुग्मित किया गया था। विशेष रूप से, बीएसए-संयुग्मित एए (आरपीयू51089, बायोमैटिक) के 100 माइक्रोग्राम को 0.2 एम कार्बोनेट-बायोकार्बोनेट बफर (पीएच 9.4) के 0.5 एमएल में भंग कर दिया गया था, जिसे एक मिलीग्राम लियोफिलाइज्ड ईज़ी-लिंक में जोड़ा गया था। प्लस सक्रिय पेरोक्साइड (थर्मो वैज्ञानिक), और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया। इसके बाद, 10 µL सोडियम सायनोबोरोहाइड्राइड (थर्मो साइंटिफिक) मिलाया गया और मिश्रण को कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। अंत में, शमन बफर (थर्मो साइंटिफिक) के 20 µ एल को जोड़ा गया, इसके बाद कमरे के तापमान पर 15 मिनट ऊष्मायन किया गया। जेल वैद्युतकणसंचलन और प्रोटीन बैंड विश्लेषण ने बीएसए-एए (छवि। एस 3 ए) के लिए एचपीआर संयुग्मन की पुष्टि की। एचआरपी-संयुग्मित एए को एमिकॉन अल्ट्रा 100K सेंट्रीफ्यूगल फिल्टर (मिलिपोर) के साथ एकत्र और केंद्रित किया गया था। शेष पेरोक्सीडेज और बीएसए-एए को चार बार पीबीएस से धोया गया।

प्लाज्मा नमूनों में एए का विद्युत रासायनिक पता लगाना

एए के विद्युत रासायनिक पता लगाने के लिए, 1 महीने के लिए युवा (एन {0}}), शम (एन=8), और प्लाज्मा-उपचारित समूहों (एन=5 से रक्त एकत्र किया गया था। और n=5 3 महीने के लिए)। माउस प्लाज्मा के नमूने (0.5 μL) पीबीएस (× 100- गुना कमजोर पड़ने) में 1 प्रतिशत बीएसए के 50 μL में पतला थे और इम्यूनोमैग्नेटिक बीड सॉल्यूशन (50 μL) और एचआरपी-संयुग्मित एए समाधान के साथ मिलाया गया था। (50 µ l). चुंबकीय मोतियों में बाध्यकारी साइटों को संतृप्त करने के लिए एए-एचआरपी की मात्रा काफी बड़ी थी। हमने प्रति परीक्षण लगभग 8.4×107 मोतियों का उपयोग किया, जिससे 2.0×1012 एए-बाध्यकारी साइटें उपलब्ध हुईं। एए-एचआरपी की मात्रा ~1.7×1013 थी; एए-एचआरपी और बाध्यकारी साइटों के बीच का अनुपात ~ 8:1 था। मिश्रण को कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए धीमी झुकाव रोटेशन के साथ ऊष्मायन किया गया था। नियंत्रण मनका पीबीएस (50 µ एल) में 1 प्रतिशत बीएसए को इम्यूनोमैग्नेटिक बीड सॉल्यूशन (50 µ एल) और एचआरपी-संयुग्मित एए सॉल्यूशन (50 µ एल) के साथ मिलाकर तैयार किया गया था। सभी प्रतिक्रिया वाले मोतियों को एक स्थायी चुंबक से अलग किया गया और दो बार 80 µL पीबीएस (1 प्रतिशत बीएसए) से धोया गया। अंत में, मोतियों को पंजाब के 7 µ l में फिर से निलंबित कर दिया गया । तैयार मनका समाधान और टीएमबी समाधान (बायोमैटिक) के 20 μL इलेक्ट्रोड के ऊपर लोड किए गए थे। 6 मिनट के बाद, क्रोनोएम्परोमेट्री माप शुरू किया गया था। हमने एक लघु विद्युत रासायनिक सेंसर (AcurreHealth Inc. द्वारा विकसित एक प्रोटोटाइप प्रणाली) का उपयोग किया। 40-45 s की सीमा में वर्तमान स्तर औसत थे। प्लाज्मा में अनुमानित मूल एए सांद्रता की रिपोर्ट करने के लिए हमने रूपांतरण कारक (× 100) का उपयोग किया।

एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा)

एलिसा प्रयोगों को विनिर्माण दिशानिर्देशों के अनुसार माउस एराकिडोनिक एसिड (एए) एलिसा किट (बायोमैटिक) का उपयोग करके किया गया था। क्रमिक रूप से पतला एए प्रत्येक कुएं में जोड़ा गया था, और एचआरपी-संयुग्मित एए के साथ 40 मिनट के लिए 37 डिग्री पर ऊष्मायन किया गया था। चार बार धोने के बफर से धोने के बाद, टीएमबी समाधान जोड़ा गया और 20 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया। स्टॉप सॉल्यूशन जोड़कर रंग विकास को रोक दिया गया था। माइक्रोप्लेट रीडर (टेकन) का उपयोग करके अवशोषण को 450 एनएम पर पढ़ा गया था।

रोटारोड परीक्षण

हमने कोंग एट अल के रोटारोड परीक्षण को संशोधित किया। [30] लोकोमोटर समन्वय का आकलन करने के लिए। 3-cm व्यास की छड़ के साथ रोटारोड 4 आरपीएम पर शुरू हुआ और 5 मिनट के लिए 4 आरपीएम प्रति 30 सेकंड में त्वरित हुआ। चूहों को रॉड पर रखा गया था, और चूहों के रॉड से गिरने में लगने वाले समय को मापा गया था। प्रत्येक माउस को एक दिन में 3 परीक्षण दिए गए थे, और प्रत्येक दिन के चलने के समय की गणना प्रशिक्षण समय के औसत के रूप में की गई थी। पहला रोटारोड परीक्षण 1-माह के बाद प्लाज्मा उपचार में आयोजित किया गया था: युवा समूह (n=29), दिखावा समूह (n=17), प्लाज्मा-उपचारित समूह (n {{ 1 1}})। प्लाज्मा उपचार के 4-महीने बाद एक पुन: प्रशिक्षण सत्र शुरू किया गया था। अति-प्रशिक्षण से बचने के लिए, 2 दिनों के लिए पुन: प्रशिक्षण आयोजित किया गया था। दूसरी प्रक्रिया पहले सत्र की तरह ही थी।

मस्तिष्क ऊतक इमेजिंग

1 महीने (n=4) और 4 महीने (n=3) को मानव गर्भनाल रक्त प्लाज्मा या खारा इंजेक्शन के इंजेक्शन के बाद, जानवरों को इच्छामृत्यु दी गई और फिर 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) और पीबीएस के माध्यम से सुगंधित किया गया। दिल का बायां निचला भाग। युवा (n=5) और शम समूह (n=4) को नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था। उनके दिमाग थे

निकाला और क्रायोप्रोटेक्टेड। प्रत्येक मस्तिष्क को क्रायोटोम पर 30 माइक्रोन की मोटाई में विभाजित किया गया था। प्रति

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री करते हैं, गैर-विशिष्ट बंधन को 5 प्रतिशत सामान्य बकरी सीरम के साथ 0 .3 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100 में 40 मिनट के लिए अवरुद्ध किया गया था। डबलकोर्टिन (DCX; 1:400, सेल सिग्नलिंग, #4604S) के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी रातोंरात 4 डिग्री पर लागू किया गया था, और फिर पीबीएस को धोने के लिए इस्तेमाल किया गया था [31]। DCX का पता लगाने के लिए सेकेंडरी एंटीबॉडी Alexa Fluor 488 (1:2000, Invitrogen, #A11008) का इस्तेमाल किया गया। छवियों को एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (निकॉन एक्लिप्स 80i) का उपयोग करके लिया गया था और इमेज जे [32] का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था।

सांख्यिकीय विश्लेषण

सांख्यिकीय विश्लेषण R बुनियादी कार्यों और lme4 का उपयोग करके किया गया था, जो कि रैखिक के लिए एक R पैकेज है

मिश्रित-प्रभाव मॉडल या सामान्यीकृत रैखिक मॉडल

(जीएलएम) उसके बाद एलएसडी पोस्ट-हॉक टेस्ट [33]। डेटा को ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत किया जाता है और <0.05 के="" एपी="" मूल्य="" को="" महत्वपूर्ण="" माना="" जाता="">

पूरक सामग्री

पूरक आंकड़े।

http://www.thno.org/v09p0001s1.pdf

स्वीकृतियाँ

लघु विद्युत रासायनिक सेंसर प्रदान करने के लिए हम AccureHealth Inc. को धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को कोरिया सरकार (MSIT) (2017M3A9B4025699) द्वारा वित्त पोषित सूचना और संचार प्रौद्योगिकी संवर्धन संस्थान (IITP) अनुदान द्वारा आंशिक रूप से समर्थित किया गया था।

प्रतिस्पर्धी रुचियां

लेखकों ने घोषणा की है कि कोई प्रतिस्पर्धी हित मौजूद नहीं है।