CaWRKY30 सकारात्मक रूप से रक्षा-संबंधित जीन भाग 2 के माध्यम से रालस्टोनिया सोलानेसीरम इनोक्यूलेशन के खिलाफ CaWRKY40 को लक्षित करके काली मिर्च की प्रतिरक्षा को नियंत्रित करता है

2.5। CaWRKY30 ट्रांसिएंट ओवर-एक्सप्रेशन स्टिम्युलेटेड एचआर-लाइक सेल डेथ, एच2ओ2 का उत्पादन, और इम्युनिटी से संबंधित मार्कर जीन का ट्रांसक्रिप्शनल अपरेगुलेशन

VIGS प्रयोगों ने संकेत दिया कि CaWRKY30 RSI के प्रति काली मिर्च की प्रतिरोधक क्षमता को सकारात्मक रूप से नियंत्रित करता है। इस अटकल के आगे सत्यापन के लिए 35S: 00 (EV) या 35S: CaWRKY30 ले जाने वाली GV3101 कोशिकाओं में घुसपैठ करके क्षणिक ओवर-एक्सप्रेशन प्रयोग किए गए। हमने काली मिर्च के पौधों में एचआर-जैसी कोशिका मृत्यु और एच2ओ2 संचय के शामिल होने पर सीएडब्ल्यूआरकेवाई30 क्षणिक ओवर-एक्सप्रेशन की भूमिका का अध्ययन किया। काली मिर्च के पौधों में CaWRKY30 की अभिव्यक्ति वेस्टर्न ब्लॉटिंग प्रयोगों द्वारा स्थापित की गई थी (चित्र 5क)।

एचआर जैसी कोशिका मृत्यु और एच ओ संचय की पुष्टि क्रमशः ट्रिपैन ब्लू और डीएबी धुंधला द्वारा की गई थी। परिणामों से पता चला है कि CaWRKY30 की क्षणिक ओवर-एक्सप्रेशन के कारण एचआर जैसी कोशिका मृत्यु और काली मिर्च के पत्तों में H2O2 संचय गहरे ट्रिपैन ब्लू स्टेनिंग और डार्क ब्राउन डीएबी स्टेनिंग (चित्र 5बी) द्वारा प्रकट हुआ। CaWRKY30 के क्षणिक ओवर-एक्सप्रेशन के कारण सेल नेक्रोसिस की तीव्रता का अध्ययन करने के लिए चालकता का प्रदर्शन किया गया था, और परिणामों से संकेत मिलता है कि काली मिर्च के पत्तों की तुलना में काली मिर्च के पत्तों की तुलना में 24 और 48 घंटे में अधिक आयन रिसाव दिखाया गया है। खाली वेक्टर व्यक्त करना (चित्र 5C)। क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण द्वारा ईटी-बायोसिंथेसिस-संबंधित सीएपीआर1, एसए-संबंधित सीएएनपीआर1, एबीए-उत्तरदायी सीएएबीआर1, और एचआर-जुड़े मार्कर जीन सीएएचआईआर1 जैसे रक्षा-संबंधित मार्कर जीन के सापेक्ष ट्रांसक्रिप्शनल अभिव्यक्ति स्तर का पता लगाया गया।

हमारे परिणाम दर्शाते हैं कि काली मिर्च में CaWRKY30 की क्षणिक ओवर-एक्सप्रेशन 48 डीपीआई (चित्रा 5D) पर खाली वेक्टर काली मिर्च के पौधों की तुलना में काली मिर्च में सीएपीआर1, सीएएनपीआर1, सीएडीईएफ1, सीएएबीआर1, और सीएएचआईआर1 के ट्रांसक्रिप्शनल संचय को उल्लेखनीय रूप से बढ़ाता है। इन परिणामों से पता चलता है कि CaWRKY30 प्लांट एचआर-जैसे सेल डेथ, एचटू प्रोडक्शन और इम्युनिटी से संबंधित मार्कर जीन के ट्रांसक्रिप्शनल अपरेगुलेशन के सकारात्मक नियामक के रूप में कार्य करता है।

चित्र 5. CaWRKY30 प्रेरित एचआर-जैसे कोशिका मृत्यु, H2O2 संचय, और काली मिर्च के पत्तों में प्रतिरक्षा-जुड़े मार्कर जीन की अभिव्यक्ति की क्षणिक अति-अभिव्यक्ति। सीएडब्ल्यूआरकेवाई 30- के सफल ओवर-एक्सप्रेशन की पुष्टि वेस्टर्न ब्लॉटिंग प्रयोग (ए) द्वारा की गई, एचआर जैसी सेल-डेथ 35 एस के क्षणिक ओवर-एक्सप्रेशन से शुरू हुई: सीएडब्ल्यूआरकेवाई30, फेनोटाइप डिटेक्शन द्वारा पुष्टि, यूवी प्रकाश के तहत एक्सपोजर, और डीएबी और ट्रिपैन ब्लू स्टेनिंग क्रमशः 48 एचपीआई पर; स्केल बार=50 µm (B), इलेक्ट्रोलाइट रिसाव (आयन चालकता) का मापन क्रमशः कृषि-घुसपैठ के बाद 24 और 48 घंटे में काली मिर्च पत्ती डिस्क में कोशिका मृत्यु प्रतिक्रिया का अनुमान लगाने के लिए (C), qRT-PCR परख 35S में CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1, और CaHIR1 सहित प्रतिरक्षा-जुड़े मार्कर जीन के ट्रांसक्रिप्शनल अभिव्यक्ति स्तरों की जांच करें: CaWRKY30 ने क्रमशः 48 डीपीआई पर काली मिर्च के पत्ते व्यक्त किए (डी)। काली मिर्च के पत्तों में ज्ञात रक्षा-संबंधी मार्कर जीन के सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर क्षणिक रूप से खाली वेक्टर को ओवर-एक्सप्रेस करते हुए "1" पर सेट किया गया था। चार जैविक प्रतिकृति से मतलब ± SE का प्रतिनिधित्व करने वाला डेटा। त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटियाँ हैं। सलाखों के ऊपर अलग-अलग अक्षर साधनों के बीच महत्वपूर्ण अंतर का संकेत देते हैं।

2.6। CaWRKY30 और CaWRKY40 के बीच अंतर-संबंध

यह बताया गया है कि अलग-अलग WRKY TF एक साथ नेटवर्क बनाते हैं और हमने पहले बताया था कि WRKY TFs के विभिन्न सदस्य, यानी CaWRKY6, CaWRKY22, और CaWRKY40, अभिव्यंजक और कार्यात्मक रूप से एक दूसरे से जुड़े हुए हैं। इसलिए, हम मानते हैं कि CaWRKY30, WRKY परिवार के अन्य सदस्यों से संबंधित हो सकता है, जिसमें CaWRKY40 भी शामिल है, जो कि RSI के खिलाफ काली मिर्च की प्रतिरक्षा का एक सकारात्मक नियामक है। CaWRKY30 द्वारा CaWRKY40 के संभावित प्रतिक्रिया विनियमन की आगे की जांच के लिए qRT-PCR विश्लेषण किया गया था, और CaWRKY40 क्षणिक ओवर-एक्सप्रेशन परख द्वारा CaWRKY30 के संभावित मॉडुलन का अध्ययन करने के लिए या VIGS द्वारा CaWRKY40 को शांत करके किया गया था।

CaWRKY40 एक WRKY प्रतिलेखन कारक है जो विभिन्न जैविक और अजैविक तनावों के लिए पौधों की प्रतिक्रियाओं में शामिल है। अध्ययनों से पता चला है कि CaWRKY40 टमाटर में प्रेरित होता है और सूखे और कम तापमान के उपचार के तहत पौधों के प्रतिरोध को बढ़ा सकता है। इसके अलावा, अध्ययन में यह भी पाया गया कि सीएडब्ल्यूआरकेवाई40 का अतिअभिव्यक्ति टमाटर के सूखे प्रतिरोध में सुधार कर सकता है और नमक तनाव के कारण विकास अवरोध को कम कर सकता है, लेकिन रोगजनकों के प्रतिरोध को और अध्ययन की आवश्यकता है। इसलिए, CaWRKY40 पौधों की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और कृषि उपज में वृद्धि के लिए एक निश्चित क्षमता रखता है। साथ ही हमें अपनी रोग प्रतिरोधक क्षमता पर भी ध्यान देने की जरूरत है। हमारे शरीर की रोग प्रतिरोधक क्षमता बहुत जरूरी है। प्रतिरक्षा में सुधार पर सिस्टैंच का महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। Cistanche विभिन्न एंटीऑक्सिडेंट पदार्थों, जैसे विटामिन सी, विटामिन सी, कैरोटीनॉयड आदि से भरपूर होता है। ये तत्व मुक्त कणों को नष्ट कर सकते हैं, ऑक्सीडेटिव तनाव को कम कर सकते हैं और प्रतिरक्षा प्रणाली के प्रतिरोध में सुधार कर सकते हैं।

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हमारे परिणामों ने काली मिर्च के पत्तों में CaWRKY30 के ट्रांसक्रिप्शनल स्तर को क्षणिक रूप से ओवर-एक्सप्रेस करने वाले CaWRKY40 को 24 और 48 hp की वृद्धि के साथ पौधों की तुलना में ट्रांसिएंटली ओवर-एक्सप्रेसिंग खाली वेक्टर (EV) (चित्र 6A) में व्यक्त किया, जबकि CaWRKY40 के ट्रांसक्रिप्शनल स्तर में उन पौधों में क्षणिक रूप से वृद्धि हुई क्षणिक रूप से ओवर-एक्सप्रेसिंग EV (चित्र 6B) के पौधों की तुलना में ओवर-एक्सप्रेसिंग CaWRKY30। इसके विपरीत, हमारे परिणामों ने दर्शाया कि CaWRKY40 के ट्रांसक्रिप्शनल संचय को Ralstonia- संक्रमित CaWRKY 30- साइलेंटेड पौधों में अन-साइलेंट पौधों (चित्र 6C) की तुलना में विशेष रूप से डाउनग्रेड किया गया था। इसके अतिरिक्त, ज्ञात प्रतिरक्षा-लिंक्ड मार्कर जीन का ट्रांसक्रिप्शनल संचय, उदाहरण के लिए, CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1, और CaHIR1 को CaWRKY30 खामोश पौधों में पूरी तरह या आंशिक रूप से दबा दिया गया था जो CaWRK40 (चित्र 6D) द्वारा ट्रिगर किए गए थे।

यह डेटा CaWRKY30 द्वारा CaWRKY40 के ट्रांसक्रिप्शनल रेगुलेशन और CaWRKY30 और CaWRKY40 से जुड़े एक सकारात्मक नियामक लूप की उपस्थिति को इंगित करता है।

चित्र 6. CaWRKY30 और CaWRKY40 के बीच अंतर-संबंध। ट्रांसक्रिप्शनल एक्सप्रेशन लेव। 24 और 48 डीपीआई (ए) के समय अंतराल पर काली मिर्च की पत्तियों में सीएडब्ल्यूआरकेवाई40 के एल्स ट्रांसिएंटली ओवर-एक्सप्रेसिंग सीएडब्ल्यूआरकेवाई30, काली मिर्च की पत्तियों में सीएडब्ल्यूआरकेवाई30 के ट्रांसक्रिप्शनल एक्सप्रेशन स्तर 24 और 48 डीपीआई (बी) के समय अंतराल पर सीएडब्ल्यूआरकेवाई40 के क्षणिक रूप से ओवर-एक्सप्रेसिंग होते हैं। CaWRKY में CaWRKY40 ट्रांसक्रिप्शनल एक्सप्रेशन लेवल का gRT-PCR विश्लेषण 30- 48 dpi पर साइलेंट और अन-साइलेंट काली मिर्च के पौधे (C) CaWRKY में रक्षा से जुड़े मार्कर जीन के ट्रांसक्रिप्शनल स्तर के gRT-PCR परख 30- साइलेंट और 35S: CaWRKY40-HA और 35S:00 48 hpi (D) पर अन-साइलेंट काली मिर्च के पौधे क्षणिक रूप से ओवर-एक्सप्रेस करते हैं। चार जैविक प्रतिकृति से डेटा का मतलब प्लस एसई है। त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटियाँ हैं। सलाखों के ऊपर अलग-अलग अक्षर साधनों के बीच महत्वपूर्ण अंतर दिखाते हैं।

2.7। CaWRY30 और CaWRKY6, CaWRKY22, और CaWRKY27 के बीच अंतर-संबंध

हमारे पिछले अध्ययनों में, CaWRKY40 को अलग-अलग WRKY TFs, जैसे CaWRKY6 और CaWRKY22 के साथ अभिव्यंजक और कार्यात्मक रूप से संबद्ध होने का पता चला था। CaWRKY30 और CaWRKY40 के बीच संबंध इंगित करता है कि CaWRKY30 संभवतः RSI के खिलाफ काली मिर्च की प्रतिरक्षा में शामिल विभिन्न WRKY TFs से जुड़ा हुआ है। इस धारणा की पुष्टि करने के लिए qRT-PCR विश्लेषण CaWRKY30 और विभिन्न WRKY TFs के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए किया गया था, जो पहले CaWRKY6, CaWRKY22, और CaWRKY27 सहित RSI के खिलाफ काली मिर्च की प्रतिरक्षा में शामिल होने की सूचना दी गई है। हमारे परिणामों ने संकेत दिया कि CaWRKY30 के ट्रांसक्रिप्शनल संचय को CaWRKY6, CaWRKY22, और CaWRKY27 में 48 डीपीआई (चित्रा 7A) पर क्षणिक रूप से ओवर-एक्सप्रेसिंग काली मिर्च के पौधों में बढ़ाया गया था, जबकि CaWRKY6, CaWRKY22, और CaWRKY27 के ट्रांसक्रिप्शनल संचय को काली मिर्च के पत्तों में क्षणिक रूप से ओवर-एक्सप्रेसिंग में भी बढ़ाया गया था। 48 डीपीआई पर सीएडब्लूआरकेवाई30 (चित्र 7बी)। QRT-PCR परख के हमारे परिणाम का अर्थ है कि CaWRKY30 और CaWRKY6, CaWRKY22, और CaWRKY27 अभिव्यंजक और कार्यात्मक रूप से परस्पर जुड़े हुए हैं।

3. चर्चा

WRKY प्रोटीन पादप प्रतिलेखन कारकों (TFs) के सबसे बड़े परिवारों में से एक है। WRKY TFs परिवार के सदस्यों का एक समूह, जो Arabidopsis thaliana और Oryza sativa से रिपोर्ट किया गया है, को पौधों की प्रतिरक्षा विनियमन में भाग लेने और एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है। WRKYs के बारीकी से संरचनात्मक होमोलॉग्स के बीच काफी कार्यात्मक भिन्नताएं बताई गई हैं [17,48], और गैर-मॉडल पौधों, जैसे कि काली मिर्च, की प्रतिरक्षा में WRKY TFs के कार्यों की अपर्याप्त जांच की जाती है।

CaWRKY30, एक समूह Ill WRKY जीन, को वर्तमान अध्ययन में कार्यात्मक रूप से चित्रित किया गया है। परिणामों ने सुझाव दिया कि सीएडब्ल्यूआरकेवाई30 आरएसएल के खिलाफ काली मिर्च की प्रतिरक्षा को सकारात्मक रूप से नियंत्रित करता है, और यह डब्ल्यूआरकेवाई वेब का एक महत्वपूर्ण घटक है जिसमें सीएडब्ल्यूआरकेवाई6, सीएडब्ल्यूआरकेवाई22सीएडब्ल्यूआरकेवाई27, और सीएडब्ल्यूआरकेवाई40 शामिल हैं। काली मिर्च की प्रतिरोधक क्षमता में CaWRKY30 के उलझाव को TGA तत्व, TGACG-motifIATC- बॉक्स, TATA- बॉक्स और W- बॉक्स सहित CaWRKY30 के प्रमोटर क्षेत्र में मौजूद रोगजनक-उत्तरदायी cis- तत्वों द्वारा समर्थित किया गया है। यह धारणा ईटीएच, एबीए और एसए [49,50] की आपूर्ति के बाद और बाद में सीएडब्ल्यूआरकेवाई30 के ट्रांसक्रिप्शनल स्तरों के उत्थान के अनुरूप थी।

चूंकि एक निश्चित तनाव कारक के संपर्क में आने वाले जीन को अक्सर उस तनाव [51] के जवाब में शामिल होने के लिए जाना जाता है, हमने अनुमान लगाया कि CaWRKY30 आरएसआई के लिए काली मिर्च की प्रतिरक्षा को सकारात्मक रूप से नियंत्रित कर सकता है। इस अटकल को VIGS द्वारा CaWRKY30 की साइलेंसिंग के डेटा और CaWRKY30 ट्रांसिएंट ओवर-एक्सप्रेशन परख द्वारा समर्थित किया गया था। सीएडब्ल्यूआरकेवाई30 के कार्य के नुकसान के कारण यह कम प्रतिरक्षा आरएसआई के प्रवर्धित विकास और एसए-निर्भर सीएपीआर1 (52सीएएनपीआर1 [53], जेए-संबंधित सीएडीईएफ1 (54], एबीए से जुड़े सीएएबीआर1 [55) जैसे प्रतिरक्षा संबंधी मार्कर जीन के डाउनरेगुलेशन के साथ हुई थी। ], और एचआर से जुड़े CaHIR1 (561। दूसरी ओर, एचआर-जैसी कोशिका मृत्यु और HO, स्राव को CaWRKY30 के क्षणिक अति-अभिव्यक्ति द्वारा ट्रिगर किया गया था, साथ ही CaPR1, CaNPR1, CaDEF1 जैसे प्रतिरक्षा-संबंधी मार्कर जीन के ट्रांसक्रिप्शनल अपरेगुलेशन के साथ। CaABR1, और CaHIR1। यह एचआर-जैसे सेल डेथ और आरएसआई के खिलाफ काली मिर्च की प्रतिरक्षा के सकारात्मक नियामक के रूप में CaWRKY30 की भूमिका का सुझाव देता है। इसी तरह, पिछले अध्ययनों में यह देखा गया है कि AtWRKY30, अरबिडोप्सिस में CaWRKY30 का एक होमोलॉग, पौधों की इम्युनिटी को सकारात्मक रूप से नियंत्रित करता है। -munitv विरुद्ध जैविक और अजैविक तनाव 157.581. यह सुझाव दिया जा सकता है कि CaWRKY30 को रालस्टोनिया संक्रमण पर नियंत्रित किया जाता है, जिससे जीवाणु रोगजनक संक्रमण के लिए काली मिर्च की भेद्यता कम हो जाती है।

ईटी, एबीए और एसए जैसे फाइटोहोर्मोन आवश्यक सिग्नलिंग अणु हैं जो पौधों के रोगज़नक़ हमलों और उच्च तापमान तनाव की प्रतिक्रिया में निहित हैं। ये जैविक और अजैविक तनावों [59] के लिए पौधों की प्रतिक्रियाओं के बीच क्रॉसस्टॉक में भी शामिल हैं। एसए बायोट्रोफिक रोगजनकों के खिलाफ प्रतिरोध को बढ़ावा देता है, जबकि ईटी नेक्रोट्रोफिक रोगजनकों [60] के खिलाफ पौधों की प्रतिरक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। आम तौर पर, SA, ET, और JA के संश्लेषण को PAMP-ट्रिगर इम्युनिटी (PTI) या इफेक्टर-ट्रिगर-इम्युनिटी (ETI) के साथ जोड़ा जाता है। ये फाइटोहोर्मोन रक्षा संकेतन [61] के दौरान अपनी सांद्रता के आधार पर सहक्रियाशील और विरोधी दोनों तरह से अपनी भूमिका निभा सकते हैं। पीटीआई में इन तीन सिग्नलिंग तत्वों के बीच एक सहक्रियात्मक संघ का पता लगाया गया है, जबकि ईटीआई [62] में एक प्रतिपूरक संघ का पता लगाया गया है। सीएडब्लूआरकेवाई30 को बहिर्जात रूप से आपूर्ति किए गए फाइटोहोर्मोन द्वारा लगातार प्रेरित किया गया था। सीएपीआर1, सीएएनपीआर1, सीएडीईएफ1, और सीएएबीआर1 जैसे ज्ञात एसए, ईटी, और एबीए-आश्रित प्रतिरक्षा संबंधी मार्कर जीन को सीएडब्ल्यूआरके30 की साइलेंसिंग द्वारा डाउनरेगुलेट किया गया; हालांकि, उन्हें काली मिर्च के पौधों में सीएडब्ल्यूआरकेवाई30 के क्षणिक ओवर-एक्सप्रेशन द्वारा अपग्रेड किया गया था, यह दर्शाता है कि सीएडब्ल्यूआरकेवाई30 एसए, ईटी और एबीए द्वारा सहक्रियात्मक रूप से मध्यस्थता वाले रक्षा संकेतन में भाग लेता है, जिससे पीटीआई हो जाता है।

जीनोम-वाइड विश्लेषण ने पौधों की प्रतिरक्षा [63-65] में कई WRKY TFs की भागीदारी को दिखाया। कार्यात्मक जीनोमिक्स अध्ययन द्वारा, WRKY1 [66], -11 [67], -17 [67], -18 [68], -22 [69], {{13} } [70], -28 [71], -33 [72], -38 [73], -40 [68], -45 [74], -46 [75], -53 [76], -54 [75], -60 [68], -62 [77], -70 [75], और -75 [78] अरबिडोप्सिस की प्रतिरक्षा में कार्यात्मक रूप से चित्रित किया गया है, प्रतिरक्षा को सकारात्मक या नकारात्मक रूप से नियंत्रित करता है। इन WRKY TFs को खुद को WRKY ट्रांसक्रिप्शनल वेब में व्यवस्थित करने का सुझाव दिया गया है, जिसमें प्लस ve और -ve फीडबैक लूप और फीड-फॉरवर्ड मॉड्यूल [12] शामिल हैं। हालांकि, इन डब्लूआरकेवाई नेटवर्कों की कॉन्फ़िगरेशन खराब समझ में आती है।

पहले के अध्ययनों में, हमने पाया कि CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27, और CaWRKY40 RSI [9,44,45] के प्रति काली मिर्च की प्रतिरोधक क्षमता के सकारात्मक नियामक हैं, जबकि CaWRKY58 एक नकारात्मक नियामक [46] है। वर्तमान अध्ययन का अनुमान है कि CaWRKY30 काली मिर्च की एचआर-जैसी कोशिका मृत्यु और आर. सोलानेसीरम संक्रमण के प्रति काली मिर्च की प्रतिक्रिया में एक सकारात्मक नियामक के रूप में कार्य करता है। CaWRKY30 के ट्रांसक्रिप्शनल एक्सप्रेशन लेवल को CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27, और CaWRKY40 के क्षणिक ओवर-एक्सप्रेशन पर अपग्रेड किया गया था। इसके विपरीत, CaWRKY30 क्षणिक ओवर-एक्सप्रेशन ने CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27, और CaWRKY40 के ट्रांसक्रिप्शनल संचय को अपग्रेड किया, WRKY TFs नेटवर्क की उपस्थिति और CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27, और CaWRKY40 के बीच प्लस ve फीडबैक लूप का सुझाव दिया। माना जाता है कि पौधों की प्रतिरक्षा में एक जैसे प्लस वी फीडबैक लूप शामिल होते हैं [47]। CaWRKY40 और CaWRKY6, CaWRKY40 और CabZIP63, CaWRKY40 और CaCDPK15 के बीच एक ही तरह का प्लस वी फीडबैक लूप मौजूद है। पिछले अध्ययनों में, CaWRKY6 [44] और CabZIP63 [16] को RSI के विरुद्ध CaWRKY40 अभिव्यक्ति के नियमन में सीधे और ट्रांसक्रिप्शनल रूप से शामिल होने का भी पता चला है। इन परिणामों को ध्यान में रखते हुए, यह सुझाव दिया जा सकता है कि CaWRKY40 को विभिन्न TFs द्वारा समन्वित किया जा सकता है। अंत में, CaWRKY40 अभिव्यक्ति को RSI पर CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY30, और CabZIP63 द्वारा सह-विनियमित किया जाता है, और CaWRKY40 अभिव्यक्ति को CaWRKY6, और CabZIP63 द्वारा नियंत्रित किया जाता है, लेकिन उच्च तापमान के संपर्क में आने के बाद काली मिर्च में CaWRKY30 द्वारा नहीं।

4. सामग्री और तरीके

4.1। संयंत्र सामग्री और विकास की स्थिति

काली मिर्च की खेती 'मैक्सी' और निकोटियाना बेंथमियाना के बीज अयूब कृषि अनुसंधान संस्थान, फैसलाबाद, पाकिस्तान से प्राप्त किए गए थे। काली मिर्च और एन. बेंथमियाना के बीज मिट्टी के मिश्रण [पीट मॉस और पेर्लाइट; 2/1 (v/v)] और नियंत्रित परिस्थितियों में विकास कक्ष में रखा जाता है, यानी, 25 ◦C तापमान, 60–70 µmol फोटॉन m−2 s −1 प्रकाश की तीव्रता और 16 h प्रकाश/8 के तहत 70 प्रतिशत सापेक्षिक आर्द्रता एच डार्क फोटोपीरियड।

4.2। वैक्टर की पीढ़ी

वैक्टर उत्पन्न करने के लिए गेटवे-क्लोनिंग तकनीक को नियोजित किया गया था। उपग्रह वैक्टर का निर्माण करने के लिए, CaWRKY30 पूर्ण-लंबाई ORF (टर्मिनल कोडन के साथ या टर्मिनल कोडन के बिना) को BP प्रतिक्रिया का उपयोग करके एंट्री वेक्टर pDONR207 में क्लोन किया गया था। बाद में, इस निर्माण को गंतव्य वैक्टर pMDC83, CD3687 (HA-tag), CD3688 (फ्लैग-टैग), और Pk7WG2 में क्रमशः उप-सेलुलर स्थानीयकरण और अति-अभिव्यक्ति के लिए वैक्टर उत्पन्न करने के लिए LR प्रतिक्रिया करके स्थानांतरित किया गया था।

VIGS के लिए वैक्टर के निर्माण के लिए, CaWRKY30 के 30 - अनट्रांसलेटेड रीजन (UTR) में 364 बीपीएस अंश का चयन किया गया था और CM334 (//peppergenome.snu) के डेटाबेस में जीनोम अनुक्रम के खिलाफ ब्लास्ट द्वारा विशिष्टता की पुष्टि की गई थी। ac.kr/ (29 अक्टूबर 2021 को एक्सेस किया गया)) और Zunla-1 (http://peppersequence.genomics.cn/page/species/blast. jsp (29 अक्टूबर 2021 को एक्सेस किया गया))। इसके बाद, इस टुकड़े को pDONR207/201 में क्लोन करने के लिए BP प्रतिक्रिया की गई, इसके बाद इस निर्माण को LR प्रतिक्रिया करके वेक्टर PYL279 में स्थानांतरित किया गया।

4.3। पैथोजन की वृद्धि और इनोक्यूलेशन प्रक्रियाएं

हमने डेरा गाजी खान, पाकिस्तान से राल्सटोनिया से संक्रमित काली मिर्च के पौधों से आर. सोलानेसीरम के संगत विषाणुजनित तनाव को अलग किया। टेट्राजोलियम क्लोराइड विधि का उपयोग रोगज़नक़-संक्रमित पौधों [9,45] के ऊपर-जमीन के संवहनी ऊतक भाग के निकास को शुद्ध करने के लिए किया गया था। आइसोलेटेड R. सोलनसीरम की खेती एसपीए माध्यम में थर्मो कंट्रोल शेकर (200 ग्राम आलू, 20 ग्राम सूक्रोज, 3 ग्राम बीफ एक्सट्रैक्ट, 5 ग्राम ट्राइप्टोन और 1 एल डबल-डिस्टिल्ड एच2ओ) में 200 आरपीएम और 28 ◦C पर की गई थी। रात भर। इसके बाद, कल्टीवेटेड आर. सोलनसीरम स्ट्रेन को 6500 बजे और 28 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया। अपकेंद्रित्र के बाद तरल सतह पर तैरनेवाला डाला गया था, और अपकेंद्रित्र ट्यूब के तल में छर्रों को निष्फल 10 मिमी MgCl2 समाधान में पतला किया गया था। बैक्टीरियल सेल घनत्व को 108 सीएफयू एमएल−1 (ओडी 600=0.8) में समायोजित किया गया था।

सीएडब्ल्यूआरकेवाई30 के ट्रांसक्रिप्शनल स्तरों पर आरएसआई के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए और काली मिर्च के पौधों के प्रतिरोध पर आर. सोलनसीरम हमले के लिए, काली मिर्च के पौधों के शीर्ष तीसरे पत्ते को सुई के बिना एक सिरिंज द्वारा 10 μL आर. सोलनसीरम समाधान के साथ घुसपैठ किया गया था। रोगज़नक़-उपचारित पत्तियों के नमूनों को अधिक प्रयोगों के लिए हिस्टोकेमिकल धुंधला प्रयोगों (जैसे, डीएबी धुंधला या ट्रिपैन ब्लू धुंधला), विद्युत चालकता, सीएफयू और आरएनए निष्कर्षण के लिए विशिष्ट समय बिंदुओं पर काटा गया था। CaWRKY30-ख़ामोश और बिना आवाज़ वाले पौधों के फेनोटाइपिंग प्रयोग के लिए, एक कांच की छड़ का उपयोग करके जड़ों को घायल कर दिया गया था और संगत विषाणु आर सोलानेसीरम के साथ घुसपैठ कर दिया गया था। पौधों को 28 ± 2 ◦C तापमान, 60–70 µmol फोटॉन m−2 s −1 प्रकाश की तीव्रता, 70 प्रतिशत सापेक्ष आर्द्रता, और एक 16-हलाइट/{{12) के तहत नियंत्रण स्थितियों में विकास कक्ष में रखा गया था। }}एच डार्क फोटोपीरियोड आफ्टर आर. सोलनसीरम इनोक्यूलेशन। विशिष्ट समय अंतराल पर RSI के बाद फेनोटाइप के चित्र कैप्चर किए गए।

4.4। फाइटोहोर्मोन्स का पर्णीय अनुप्रयोग

फाइटोहोर्मोन के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए, स्वस्थ काली मिर्च के पौधों को चार पत्ती चरणों में 100 µM ETH, 100 µM ABA, और 1 mM SA के साथ छिड़का गया। मॉक (नियंत्रण) पौधों को बाँझ ddH2O के साथ उपचारित किया गया। आरएनए निष्कर्षण और आगे के अध्ययन के लिए वांछित समय बिंदुओं पर फाइटोहोर्मोन के साथ इलाज किए गए नमूने एकत्र किए गए थे।

4.5। CaWRKY30 उप-सेलुलर स्थानीयकरण की परीक्षा

35S: CaWRKY 30- GFP या 35S: GFP (नियंत्रण) वाली एग्रोबैक्टीरियम कोशिकाओं को संबंधित एंटीबायोटिक युक्त एलबी माध्यम में रातोंरात खेती की गई। कल्चर्ड मीडिया को 6500 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया, तरल सतह पर तैरनेवाला डाला गया, और तल में गोली एक प्रेरण माध्यम (10 मिमी एमईएस, 10 मिमी एमजीसीएल2, पीएच 5.7, और 150 माइक्रोन एसीटोसिरिंगोन) में पतला किया गया था, और आयुध डिपो {{{ 10}}.8. 35S युक्त एग्रोबैक्टीरियम: CaWRKY 30- GFP और 35S: GFP को सुई के बिना एक सिरिंज का उपयोग करके N. बेंटहैमियाना की पत्तियों में इंजेक्ट किया गया। पहले वर्णित विधि का उपयोग 4, 6- डायमिडीनो -2- फेनिलइंडोल धुंधला (डीएपीआई) [9] करने के लिए किया गया था। 48 hpt पर, GFP और DAPI प्रतिदीप्ति संकेत देखे गए, और चित्रों को एक लेजर स्कैनिंग कन्फोकल माइक्रोस्कोप (TCS SP8, Leica, Solms, Germany) द्वारा कैप्चर किया गया, जिसमें 488 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और 505-530 एनएम बैंड-पास उत्सर्जन था। फिल्टर।

4.6। हिस्टोकेमिकल धुंधला

हिस्टोकेमिकल स्टेनिंग (ट्रिपैन ब्लू और 3, 30 -डायमिनोबेंज़िडाइन) को पहले [9,11,79] के रूप में वर्णित किया गया था। ट्रिपैन ब्लू स्टेनिंग परख करने के लिए, 30 मिनट के लिए ट्रिपैन ब्लू सॉल्यूशन (10 एमएल लैक्टिक एसिड, 10 एमएल ग्लिसरॉल, 10 एमएल फिनोल, 40 एमएल इथेनॉल, 10 एमएल ddH2O, और 1 एमएल ट्रिपैन ब्लू) में काली मिर्च के पत्तों को उबाला गया। बाद में, पत्तियों को 8 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर रखा गया, क्लोरल हाइड्रेट (2.5 ग्राम क्लोरल हाइड्रेट को 1 एमएल डिस्टिल्ड वॉटर में घोलकर) के घोल में डुबोया गया, और 30 मिनट तक उबालकर डी-स्टेन किया गया। पृष्ठभूमि को कम करने के लिए क्लोरल हाइड्रेट घोल को कई बार बदला गया और फिर 70 प्रतिशत ग्लिसरॉल में नमूने लगाए गए। डीएबी धुंधला परख के लिए पत्तियों को रातोंरात डीएबी समाधान के 1 मिलीग्राम/एमएल में रखा गया था। डीएबी-सना हुआ पत्तियों को लैक्टिक एसिड: ग्लिसरॉल: एब्सोल्यूट इथेनॉल [1:1:3 (v/v/v)] में उबाला गया और फिर रातोंरात एब्सोल्यूट इथेनॉल में डी-स्टेन किया गया [80]। ट्रिपैन ब्लू और डीएबी-सना हुआ पत्तियों की तस्वीरें एक कैमरे और एक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी (लीका, वेटज़लर, जर्मनी) द्वारा ली गई थीं।

4.7। वायरस-प्रेरित जीन साइलेंसिंग (VIGS) के माध्यम से CaWRKY30 की साइलेंसिंग

काली मिर्च के पौधों [47,81,82] में CaWRKY30 साइलेंसिंग के लिए पहले वर्णित तम्बाकू रैटल वायरस (TRV) आधारित वायरस-प्रेरित जीन साइलेंसिंग (VIGS) प्रणाली की गई थी। PYL192, PYL279-CaWRKY30, PYL279, और PYL279-PDS (OD600=0.8) वाले एग्रोबैक्टीरियम GV3101 को 1:1 के अनुपात में मिलाया गया। इस मिश्रण को सुई के बिना एक सिरिंज द्वारा 2-सप्ताह पुराने काली मिर्च के पौधों के बीजपत्रों में डाला गया था। घुसपैठ किए गए पौधों को 16 ◦C तापमान और 45 प्रतिशत सापेक्ष आर्द्रता पर अंधेरे में 56 घंटे के लिए विकास कक्ष में ऊष्मायन किया गया था, और फिर 25 ± 2 ◦C, 60-70 μmol फोटॉन एम-2 पर नियंत्रित परिस्थितियों में विकास कक्ष में स्थानांतरित कर दिया गया था। s -1, और 16 h प्रकाश/8 h अंधेरे के प्रकाशकाल के तहत 70 प्रतिशत की सापेक्षिक आर्द्रता।

4.8। काली मिर्च की पत्तियों में CaWRKY30 ट्रांसिएंट ओवर-एक्सप्रेशन

Agrobacterium cells GV3101 युक्त CaWRKY30-Flag और EV की खेती थर्मो कंट्रोल शेकर में LB माध्यम में की गई थी, जिसमें रातोंरात OD600=1.0 के अनुरूप एंटीबायोटिक्स थे। बाद में, इन एग्रोबैक्टीरियम GV3101 को 6000 बजे और 10 मिनट के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। अपकेंद्रित्र के बाद, तरल सतह पर तैरनेवाला हटा दिया गया था और तल में ठोस गोली आयुध डिपो 600=0 .8 को एक प्रेरण माध्यम (10 मिमी एमईएस, पीएच 5.4, 10 मिमी एमजीसीएल 2, 200 माइक्रोन एसीटोसिरिंगोन) में पतला कर दिया गया था। इस मिश्रण को बिना सुई की सीरिंज से पत्तियों में डाला गया। एचआर जैसी कोशिका मृत्यु के लिए इन क्षणिक रूप से अधिक व्यक्त पत्तियों को देखा गया था, या डीएबी और ट्रिपैन ब्लू धुंधला प्रयोगों को करने के लिए और अधिक प्रयोगों के लिए आरएनए अलगाव के लिए नमूने एकत्र किए गए थे।

4.9। आरएनए एक्सट्रैक्शन और क्वांटिटेटिव रियल-टाइम आरटी-पीसीआर

TRIzol अभिकर्मक विधि (Invitrogen) का उपयोग उपचारित काली मिर्च के पौधों की पत्तियों के नमूनों से और नकली पौध से कुल RNA निकालने के लिए किया गया था। बाद में, प्राइम स्क्रिप्ट आरटी-पीसीआर किट (ताकारा, डालियान, चीन) का उपयोग निकाले गए आरएनए को उलटने के लिए किया गया था। लक्षित मार्कर जीन के सापेक्ष ट्रांसक्रिप्शनल स्तरों का अध्ययन करने के लिए वास्तविक समय qRT-PCR विश्लेषण किया गया था। बायो-रेड रियल-टाइम पीसीआर सिस्टम (बायो-रेड, फोस्टर सिटी, सीए, यूएसए) के लिए निर्माता के निर्देशों का उपयोग करते हुए, विशिष्ट प्राइमरों (सप्लीमेंट्री टेबल S3) के साथ डेटा प्रोसेसिंग पहले वर्णित विधियों [45,82] के अनुसार किया गया था। SYBR प्रीमिक्स Ex Taq II सिस्टम (TaKaRa परफेक्ट रियल टाइम)।

4.10। विद्युत चालकता का अनुमान

विद्युत चालकता (आयन रिसाव) की गणना छोटे बदलावों [44,83] के साथ पहले वर्णित विधि का उपयोग करके की गई थी। होल पंचर का उपयोग करके छह पत्ती डिस्क (चौड़ाई में 4 मिमी) प्राप्त की गई। डिस्क को तीन बार निष्फल ddH2O से धोया गया और तुरंत 10 mL ddH2O में इनक्यूबेट किया गया। उसके बाद, इन पत्तों की डिस्क को 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर धीरे-धीरे हिलाने वाले (60 आरपीएम) शेकर में रखा गया। विद्युत चालकता पर डेटा रिकॉर्ड करने के लिए एक चालकता मीटर (Mettler Toledo 326 Mettler, Zurich, Switzerland) का उपयोग किया गया था।

4.11। इम्यूनो ब्लोटिंग

काली मिर्च के पत्तों [3] से प्रोटीन निकालने के लिए प्रोटीन निष्कर्षण बफर की पहले वर्णित प्रक्रिया का उपयोग किया गया था। निकाले गए प्रोटीन को रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वॉलथम, एमए, यूएसए) में एंटीहा एग्रोसे के साथ डाला गया। चुंबकीय दरार का उपयोग मोतियों को इकट्ठा करने के लिए किया गया था और ट्रिस बफर सलाइन (टीबीएस) और 2 0 (0.05 प्रतिशत) के बीच तीन बार धोया गया था। इम्युनो-ब्लॉटिंग और एंटी-एचए-पेरोक्सीडेज (Abcam, कैम्ब्रिज, यूके) का उपयोग करके एल्यूटेड प्रोटीन देखा गया।

प्र. 5। निष्कर्ष

अंत में, हमारा विचार है कि CaWRKY30 ट्रांसक्रिप्शनल रूप से आरएसआई के खिलाफ काली मिर्च की प्रतिरक्षा को सक्रिय करता है। VIGS द्वारा CaWRKY30 की साइलेंसिंग ने जीवाणु रोगजनक संक्रमण के लिए काली मिर्च के पौधों की प्रतिरोधक क्षमता को कम कर दिया, जबकि CaWRKY30 के क्षणिक ओवर-एक्सप्रेशन ने R. solanacearum के प्रतिरोध को प्रेरित किया। सामूहिक रूप से, एक सकारात्मक प्रतिक्रिया पाश का गठन और अन्य TFs के साथ समानांतर में इसका कार्य जैविक तनाव के तहत इसकी सक्रियता का पर्याप्त प्रमाण है। इसके अतिरिक्त, हम जीवाणु रोगजनकों के खिलाफ और विभिन्न चयापचय मार्गों में भी इस जीन की भूमिका का व्यापक रूप से पता लगाने के लिए CaWRKY30 स्थिर ट्रांसजेनिक काली मिर्च के पौधों और CaWRKY30 लक्ष्य प्रोटीन की पीढ़ी का प्रस्ताव करते हैं।

लेखक योगदान:

अवधारणा, एएच, एमआईके, एमए, बीएसए, जेडएल और एटीकेजेड; डेटा क्यूरेशन, एएच, एमआईके और एएमई-एस।; औपचारिक विश्लेषण, ZL और SF; फ़ंडिंग अधिग्रहण, AH, MIK, MAAA, MA, BSA, AME-S। और एटीकेजेड; परियोजना प्रशासन, एएच और एमआईके; संसाधन, एएच; सत्यापन, एसएम; विज़ुअलाइज़ेशन, एसएम और एसएफ; लेखन - मूल मसौदा, एएच और एमआईके; लेखन- समीक्षा और संपादन, आईआरएन, एमएएए, एमए, बीएसए, एएमई-एस, जेडएल, एसएफ और एटीकेजेड सभी लेखकों ने पांडुलिपि के प्रकाशित संस्करण को पढ़ लिया है और इससे सहमत हैं।

अनुदान:

एसआरजीपी अनुदान संख्या 21-2651/एसआरजीपी/एचआरडी/एचईसी/2020 के तहत इस अध्ययन को पूरा करने के लिए वित्तीय सहायता के लिए प्रमुख लेखक पाकिस्तान के उच्च शिक्षा आयोग के प्रति अत्यधिक आभारी हैं। वर्तमान कार्य को तैफ यूनिवर्सिटी रिसर्चर्स सपोर्टिंग प्रोजेक्ट नंबर (TURSP2020/245), तैफ यूनिवर्सिटी, तैफ, सऊदी अरब द्वारा वित्त पोषित किया गया था। अध्ययन को फ़ुज़ियान कृषि और वानिकी विश्वविद्यालय (CXZX2018114, CXZX2020008A, और CXZX2019024G) के विकास निधि परियोजना द्वारा भी समर्थित किया गया था।

संस्थागत समीक्षा बोर्ड का बयान: लागू नहीं।

सूचित सहमति वक्तव्य: लागू नहीं।

डेटा उपलब्धता विवरण: सभी डेटा पांडुलिपि और इसकी पूरक फाइलों के भीतर हैं।4

हितों का टकराव: लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

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