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काइमेरिक ह्यूमन पैपिलोमावायरस-16 एचआईवी से पी18आई10 और टी20 पेप्टाइड प्रस्तुत करने वाले वायरस जैसे कण -1 लिफाफा एचपीवी16 और एचआईवी को प्रेरित करते हैं-1-बीएएलबी/सी चूहों में विशिष्ट ह्यूमोरल और टी सेल-मध्यस्थ प्रतिरक्षा

Dec 07, 2023

अमूर्त:

इस अध्ययन में, एचआईवी के V3 लूप से प्राप्त एचआईवी -1 P18I10 CTL पेप्टाइड -1 gp120 और एचआईवी के T20 एंटी-फ़्यूज़न पेप्टाइड -1 gp41 को HPV16 L1 कैप्सिड प्रोटीन में डाला गया था स्तनधारी कोशिका अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करके काइमेरिक एचपीवी: एचआईवी (एल1:पी18आई10 और एल1:टी20) वीएलपी का निर्माण करना। एचपीवी: एचआईवी वीएलपी को क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध किया गया था। हमने प्रदर्शित किया कि एचपीवी16 एल1 कैप्सिड प्रोटीन के डीई लूप में पी18आई10 या टी20 पेप्टाइड्स के सम्मिलन से काइमेरिक एचपीवी: एचआईवी वीएलपी की इन विट्रो स्थिरता, स्व-संयोजन और आकृति विज्ञान पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। महत्वपूर्ण बात यह है कि इसने काइमेरिक एचपीवी: एचआईवी वीएलपी पर प्रस्तुत अनुक्रमिक और गठनात्मक पी18आई10 और टी20 पेप्टाइड्स को लक्षित करने वाली एचआईवी एंटीबॉडी प्रतिक्रियाशीलता या विवो में एचपीवी 16 एल 1- विशिष्ट एंटीबॉडी के प्रेरण के साथ हस्तक्षेप नहीं किया। हमने देखा कि काइमेरिक एल1:पी18आई10/एल1:टी20 वीएलपी टीके एचपीवी को प्रेरित कर सकते हैं, लेकिन कमजोर एचआईवी विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रिया और एचपीवी और एचआईवी विशिष्ट टी उत्पन्न कर सकते हैं। BALB/c चूहों में कोशिका प्रतिक्रियाएँ। इसके अलावा, बीसीजी.एचआईवीए वैक्सीन के साथ प्राइमिंग के बाद विषम टीकाकरण में एचआईवी-विशिष्ट सेलुलर प्रतिक्रियाओं को बढ़ाने के लिए एक संभावित बूस्टर हो सकता है। यह शोध कार्य नवीन काइमेरिक एचपीवी के विकास की दिशा में एक कदम बढ़ाने में योगदान देगा: एचपीवी16 और एचआईवी संक्रमण को नियंत्रित करने के लिए एचआईवी वीएलपी-आधारित वैक्सीन प्लेटफॉर्म, जिसकी विकासशील और औद्योगिक देशों में तत्काल आवश्यकता है।

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कीवर्ड:

एचआईवी-1; एचपीवी16; टीका; वायरस जैसे कण; P18I10; टी20 एनफ्यूवर्टाइड; बीसीजी.एचआईवीए; त्रिदोषन प्रतिरोधक क्षमता; टी कोशिका-मध्यस्थ प्रतिरक्षा

1 परिचय

ह्यूमन इम्युनोडेफिशिएंसी वायरस -1 (एचआईवी -1), जो एक्वायर्ड इम्युनोडेफिशिएंसी सिंड्रोम (एड्स) का कारण बनता है, की खोज 1980 के दशक की शुरुआत में की गई थी और तब से यह एक वैश्विक महामारी बन गई है [1]। यद्यपि अत्यधिक सक्रिय एंटी-रेट्रोवायरल उपचार (HAART), प्री-एक्सपोज़र प्रोफिलैक्सिस (PrEP) के साथ मिलकर एचआईवी संक्रमण के नियंत्रण पर वास्तविक प्रभाव डाल सकता है, फिर भी सार्वजनिक लाभ के लिए टीकाकरण एक मौलिक दृष्टिकोण है। वैश्विक एचआईवी महामारी का अंत [2]। तीन दशकों से अधिक के गहन एचआईवी शोध और कई वैक्सीन नैदानिक ​​परीक्षणों के बावजूद, अब तक एक लाइसेंस प्राप्त एचआईवी वैक्सीन अभी भी अप्राप्य है। थाईलैंड में आयोजित आरवी144 परीक्षण एचआईवी संक्रमण के खिलाफ 31.2% की मामूली प्रभावकारिता प्रकट करने वाला पहला मामला था [3]। क्लिनिकल परीक्षण से गुजरने वाले अधिकांश अन्य एचआईवी वैक्सीन उम्मीदवार मुख्य रूप से डीएनए, पुनः संयोजक वायरल वैक्टर, या सबयूनिट प्रोटीन मॉडल [4,5] पर आधारित थे। आदर्श रूप से, एक प्रभावशाली एचआईवी -1 टीका जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने, वायरल संक्रमण को रोकने के लिए एंटीबॉडी को निष्क्रिय करने [6] के साथ-साथ संक्रमित कोशिकाओं को खत्म करने के लिए साइटोटॉक्सिक टी लिम्फोसाइट (सीटीएल) प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने में सक्षम है [7]। हालाँकि, प्रत्येक प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए अलग-अलग वैक्सीन रणनीतियों की आवश्यकता हो सकती है, जिसके लिए अलग लेकिन समानांतर विकास प्रयासों की आवश्यकता होती है। इम्युनोजेन और डिलीवरी वैक्टर के चयन से एचआईवी -1 टीकों [8,9] के कार्य और विशिष्टता पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ेगा। एचआईवी वैक्सीन विकास के लिए मानक दृष्टिकोण का उपयोग करने में बार-बार विफलताओं के कारण ह्यूमरल और सेलुलर प्रतिक्रियाओं दोनों में डिलीवरी वेक्टर चयन, प्राइम-बूस्ट शासन और इम्युनोजेन विशिष्टता के महत्व को मान्यता मिली। 100 से अधिक प्रकार के ह्यूमन पैपिलोमावायरस (एचपीवी) पहले से ही ज्ञात हैं और एचपीवी जीनोटाइप 16 और 18 को दुनिया भर में लगभग 70% सर्वाइकल कैंसर के लिए जिम्मेदार माना जाता है [10]। एचपीवी एल1 वायरस जैसे कण (वीएलपी), जिन्हें एक प्रकार के सबयूनिट टीकों के रूप में वर्गीकृत किया गया है, मुख्य रूप से जंगली-प्रकार के विषाणु और टी सेल-मध्यस्थता प्रतिक्रियाओं के लिए तुलनीय एल 1- विशिष्ट विनोदी प्रतिक्रियाओं को प्रेरित कर सकते हैं [11-13]। वर्तमान में, तीन एचपीवी निवारक टीकों को बाजार में लाइसेंस दिया गया है और ये सभी एचपीवी एल1 कैप्सिड प्रोटीन के वीएलपी पर आधारित हैं। उनमें से दो, गार्डासिल (मर्क, राहवे, एनजे, यूएसए) और गार्डासिल (मर्क) यीस्ट (सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया) अभिव्यक्ति प्रणाली द्वारा निर्मित होते हैं, जबकि दूसरा, सर्वारिक्स (जीएसके, ब्रेंटफोर्ड, यूके), निर्मित होता है। बैकुलोवायरस अभिव्यक्ति वेक्टर/कीट कोशिका (बीईवीएस/आईसी) प्रणाली द्वारा [14]। अब तक, स्तनधारी अभिव्यक्ति प्रणाली में एचपीवी16 एल1 प्रोटीन के उत्पादन की इष्टतम स्थितियाँ अच्छी तरह से स्थापित नहीं हुई हैं। इस प्रकार, एक संयुक्त टीके का विकास जो एचपीवी और एचआईवी संक्रमण से रक्षा करेगा, इन दो प्रमुख वैश्विक रोगजनकों के खिलाफ लड़ाई में एक तार्किक प्रयास है।

वायरस-लाइक पार्टिकल (वीएलपी)-आधारित एचआईवी -1 टीकों की डिजाइन अवधारणाओं के संबंध में हमारे पिछले समीक्षा पेपर प्रकाशन में, हमने उल्लेख किया था कि गैर-आवरण वाले वीएलपी, जैसे पैपिलोमावायरस वीएलपी, वर्तमान में डिलीवरी वैक्टर के रूप में एक कार्यात्मक भूमिका निभा सकते हैं। एचआईवी-1 सीटीएल या निष्क्रिय करने वाले एंटीबॉडी एपिटोप्स [15,16]। इस परिकल्पना की पुष्टि कई काइमेरिक बोवाइन पेपिलोमावायरस (बीपीवी) एल1 वीएलपी में की गई है, जो जीपी120 एचआईवी के वी3 लूप से पी18आई10 सीटीएल एपिटोप प्रस्तुत करता है। [17-22]। मानव पेपिलोमावायरस प्रकार -16 (एचपीवी16) एल1 कैप्सिड प्रोटीन की संरचनात्मक विशेषता बीपीवी के समान है और यह एकल-परत एल1 वीएलपी में स्वयं-इकट्ठा हो सकता है [23]। HPV16 L1 प्रोटीन में से पांच एक पेंटामर बनाते हैं और 72 पेंटामर स्वयं-इकट्ठे होकर एक HPV16 VLP बनाते हैं [24]। हालाँकि, अभी भी कोई स्पष्ट प्रमाण नहीं है कि काइमेरिक एचपीवी16: एचआईवी कैप्सिड प्रोटीन इन विट्रो में स्थिर हो सकता है और रूपात्मक रूप से अभिन्न वीएलपी में स्वयं-इकट्ठा हो सकता है। दूसरी ओर, एचपीवी16 एल1 वीएलपी को अत्यधिक इम्युनोजेनिक दिखाया गया है और एंटीजन-विशिष्ट टी और बी-सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने में सक्षम हैं [11-13]। यह अभी भी देखा जाना बाकी है कि क्या एचपीवी: एचआईवी वीएलपी के माध्यम से एचआईवी एपिटोप्स की प्रस्तुति इम्युनोजेनिक हो सकती है। इस अध्ययन में, हमारा लक्ष्य मानव 293F कोशिकाओं, एक अच्छी तरह से स्थापित स्तनधारी कोशिका अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करके एक काइमेरिक वीएलपी-आधारित एचपीवी: एचआईवी वैक्सीन विकसित करना है। एचपीवी 16 एल1 प्रोटीन ने संरचनात्मक वैक्सीन मचान के रूप में काम किया, और पी18आई10 और टी20 पेप्टाइड्स को एचआईवी इम्युनोजेन के रूप में चुना गया और एचपीवी 16 एल1 प्रोटीन के डीई लूप में डाला गया। इम्युनोडोमिनेंट P18I10 CTL एपिटोप जिसमें 10 अमीनो एसिड (अवशेष 311-320: RGP GRAFVTI) शामिल हैं, एचआईवी के तीसरे चर डोमेन (V3) लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन gp120 से प्राप्त होता है। P18I10 पेप्टाइड को साइटोटॉक्सिक टी लिम्फोसाइट (CTL) प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए H-2Dd-प्रतिबंधित MHC वर्ग-I अणु के रूप में पहचाना गया है [25,26]। टी20 पेप्टाइड, जिसे एनफुविर्टाइड के नाम से जाना जाता है और एक एंटीरेट्रोवायरल मल्टीमेरिक फ्यूजन पेप्टाइड के रूप में डिज़ाइन किया गया है, इसमें 36 अमीनो एसिड अनुक्रम (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ ELLELDKWASLWNWF) होता है जो झिल्ली के करीब सी-टर्मिनल हेप्टाड हेलिक्स अनुक्रम की नकल करता है।0 एचआईवी का समीपस्थ बाहरी क्षेत्र (एमपीईआर) -1 लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन 41 (जीपी41) [27]। इन दो एचआईवी -1 टी (पी18आई10) और बी (टी20) सेल-आधारित एपिटोप्स को काइमेरिक वीएलपी-आधारित एचपीवी: एचआईवी वैक्सीन विकास मंच के लिए प्रारंभिक बिंदु और अवधारणा प्रयोग के प्रमाण के रूप में चुना गया था।

पिछले दशक में, वीएलपी-आधारित एचआईवी -1 वैक्सीन के कई अलग-अलग प्राइम-बूस्ट प्रारूपों का परीक्षण किया गया है [15]। हालाँकि पिछली अधिकांश एचआईवी -1 वीएलपी [28] या काइमेरिक बीपीवी: एचआईवी वीएलपी [17-22] वैक्सीन रणनीतियाँ समजात प्राइम-बूस्ट आहार का उपयोग करके प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने पर केंद्रित थीं, दो पूर्व अध्ययनों ने सुझाव दिया था कि विषम टीकाकरण पुनः संयोजक से मिलकरमाइकोबैक्टीरियम बोविसबैसिलस कैलमेट-गुएरिन (आरबीसीजी) एचआईवी को व्यक्त करता है -1 गैग प्राइम और एचआईवी -1 गैग वीएलपी बूस्ट टी-सेल प्रतिरक्षा को बढ़ाने में योगदान दे सकता है [29,30]। हमारे अनुसंधान समूह में, हमने आरबीसीजी के साथ एचआईवीए इम्युनोजेन को व्यक्त करने वाले प्राइमिंग और पुनः संयोजक वायरल वेक्टर एमवीए के साथ बूस्टिंग का प्रदर्शन किया है। एचआईवीए सुरक्षित था और बीएएलबी/सी चूहों [31-33] में एचआईवी {6}} विशिष्ट टी-सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं प्राप्त कीं। डॉ. टॉमस हैंके द्वारा डिजाइन किया गया एचआईवीए इम्युनोजेन, सी-टर्मिनस [34] पर पी18आई10 एपिटोप्स सहित कई सीटीएल एपिटोप्स के साथ संयुक्त पूर्ण लंबाई वाले एचआईवी -1 गैग प्रोटीन से बना है। इसलिए, हमारा लक्ष्य यह मूल्यांकन करना था कि क्या बीसीजी.एचआईवीए बीएएलबी/सी चूहों में एचआईवी: एचपीवी (एल1:पी18आई10) वीएलपी से प्रेरित टी-सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा दे सकता है।

इस अध्ययन में, काइमेरिक एचपीवी: एचआईवी (एल1:पी18आई10 और एल1:टी20) इम्युनोजेन को 293एफ अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करके डिजाइन और उत्पादित किया गया था। काइमेरिक L1:P18I10 और L1:T20 प्रोटीन अभिव्यक्ति की पुष्टि इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा की गई थी। एचपीवी: एचआईवी वीएलपी को बाद में कटियन (सीईसी), आकार बहिष्करण (एसईसी), और हेपरिन एफ़िनिटी (एच-एसी) क्रोमैटोग्राफी सहित एक चरण क्रोमैटोग्राफ़िक विधि द्वारा शुद्ध किया गया था। फिर, इन विट्रो स्थिरता, इन विट्रो सेल्फ-असेंबली, और शुद्ध एचपीवी की आकृति विज्ञान: एचआईवी वीएलपी की पुष्टि क्रमशः गैर-कम करने वाले एसडीएस-पेज, आणविक द्रव्यमान परख और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) द्वारा की गई। काइमेरिक एचपीवी पर प्रस्तुत अनुक्रमिक और गठनात्मक पी18आई10 और टी20 पेप्टाइड्स: एचआईवी वीएलपी को वेस्टर्न ब्लॉट और अप्रत्यक्ष एलिसा परख का उपयोग करके इन विट्रो में एंटी-एचआईवी -1 जीपी120 वी3 और 2एफ5 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी द्वारा चित्रित किया गया था। अंत में, एचपीवी: एचआईवी वीएलपी की इम्युनोजेनेसिटी का मूल्यांकन BALB/c चूहों के मॉडल में किया गया। हमने प्रदर्शित किया कि काइमेरिक L1:P18I10 और L1:T20 वीएलपी-आधारित टीके एचपीवी 16- और एचआईवी {{32} विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को प्रेरित कर सकते हैं और काइमेरिक L1:P18I10 वीएलपी एचपीवी 16- और एचआईवी को प्रेरित कर सकते हैं। {37}}BALB/c चूहों में विशिष्ट टी-सेल प्रतिक्रियाएं। क्योंकि इम्युनोजेनिक एचपीवी: एचआईवी वैक्सीन का विकास और निर्माण अभी भी असंभव है, इस अध्ययन ने एक आधारभूत रणनीति प्रदान की है जो एचपीवी और एचआईवी संक्रमण को नियंत्रित करने के लिए उपन्यास काइमेरिक वीएलपी-आधारित टीके विकसित करने के वैश्विक प्रयासों का समर्थन करने लायक हो सकती है।

2। सामग्री और विधि

2.1. BCG.HIVA2auxo.int वैक्सीन स्ट्रेन का निर्माण

एचआईवीए इम्युनोजेन को व्यक्त करने वाले पुनः संयोजक बीसीजी का निर्माण पहले ई.कोली-माइकोबैक्टीरियल इंटीग्रेटिव शटल वेक्टर p2auxo.int का उपयोग करके किया गया था। एचआईवीए एंटीजन को व्यक्त करने वाले ई. कोली/माइकोबैक्टीरियल वेक्टर का निर्माण पहले वर्णित किया गया था [31-33]। BCG.HIVA2auxo.int को PBS-Tween20 में 2 × 107 cfu/mL तक पतला किया गया, बैक्टीरिया के गुच्छों को बाधित करने के लिए सोनिकेट किया गया, और पीछे के भोजन पैड या BALB/c चूहों (50 µL, 106 cfu/माउस) में टीका लगाया गया।

Desert ginseng-Improve immunity (23)

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

2.2. जीवाणु संवर्धन और परिवर्तन

डॉ. पाउ फेरर द्वारा प्रदान किए गए ई. कोली, एम151ग्लाइए (इन्विट्रोजन, वाल्थम, एमए, यूएसए) के ग्लाइसीन ऑक्सोट्रोफिक स्ट्रेन की कोशिकाओं को न्यूनतम एम9-व्युत्पन्न माध्यम (एम9-डी) में संवर्धित किया गया था। Na2HPO4, 6.78 ग्राम/लीटर; KH2PO4, 3 ग्राम/लीटर; NaCl, {{10}}.5 ग्राम/लीटर; NH4Cl, 1 ग्राम/लीटर, ग्लूकोज, 1{{20 }} g/L; MgSO4, 2 mmol/L; CaCl2, 0.1 mmol/L; थायमिन, 0.1 g/L; FeCl3, 0.{{56 }}25 ग्राम/ली; AlCl3·6H2O, 0.13 mg/L; ZnSO4·7H2O, 2.6 mg/L; CoCl2·6H2O, 0.47 mg/L; CuSO4·H2O, 4.6 मिलीग्राम/लीटर; H3BO3, 0.03 मिलीग्राम/लीटर; MnCl2·4H2O, 4.2 मिलीग्राम/लीटर; NiCl2·6H2O, 0.02 मिलीग्राम/लीटर; Na2MoO4·2H2O, 0.06 मिलीग्राम/लीटर) , ग्लाइसीन (70 µg/mL) के साथ पूरक। ई. कोली M151Gly कोशिकाओं को विद्युतीकरण द्वारा p2auxo.HIVA प्लास्मिड के साथ रूपांतरित किया गया। इसके लिए, ई. कोली संस्कृतियों को 600 एनएम पर 0.9 के ऑप्टिकल घनत्व तक उगाया गया और 2.5 केवी, 25 µF, और 200 Ω पर बायो-रेड जीन पल्सर इलेक्ट्रोपोरेटर का उपयोग करके रूपांतरित किया गया। रूपांतरित कोशिकाओं को बाद में चयन के लिए ग्लाइसिन अनुपूरण के बिना या नियंत्रण के रूप में ग्लाइसीन अनुपूरण के बिना एम {{75 }}डी एगर प्लेटों (पहले वर्णित घटकों, 1.5% बैक्टोएगर के साथ) पर संवर्धित किया गया। डब्ल्यूआर जैकब्स जूनियर, बीआर ब्लूम और टी. एचएसयू द्वारा प्रदान किया गया लाइसिन ऑक्सोट्रोफिक बीसीजी स्ट्रेन, बीसीजी∆लिस को इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा p2auxo.HIVAint प्लास्मिड डीएनए के साथ बदल दिया गया था। माइकोबैक्टीरिया को मिडलब्रुक 7H9 ब्रोथ माध्यम में या मिडलब्रुक अगर 7H10 माध्यम पर 0.05% ट्वीन 80 युक्त एल्ब्यूमिन-डेक्सट्रोज-कैटालेज़ (एडीसी; डिफको) के साथ संवर्धित किया गया था। एल-लाइसिन मोनोहाइड्रोक्लोराइड (सिग्मा, कावासाकी, जापान) को आसुत जल में घोल दिया गया था और 40 µg/mL की अंतिम सांद्रता पर पूरक के रूप में उपयोग किया जाता है। परिवर्तन के लिए, बीसीजी को 600 एनएम पर 1.5 के ऑप्टिकल घनत्व में सुसंस्कृत किया गया और 2.5 केवी, 25 µF, और 1000 Ω पर बायो-रेड जीन पल्सर इलेक्ट्रोपोरेटर का उपयोग करके रूपांतरित किया गया। ट्रांसफॉर्मेंट्स को एडीसी-पूरक मिडिलब्रुक अगर 7H10 माध्यम पर 0.05% ट्विन 80 बिना लाइसिन अनुपूरण के सुसंस्कृत किया गया था।

2.3. सेल लाइन्स और सेल कल्चर

मानव भ्रूण के गुर्दे (एचईके) 293 कोशिकाओं से प्राप्त 293एफ कोशिकाओं (टिब्को) को फ्रीस्टाइल 293 अभिव्यक्ति माध्यम (टिब्को) में 5 एमएल/एल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (टिब्को) के साथ संवर्धित किया गया और 37 डिग्री सेल्सियस वाले इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट किया गया। 125 आरपीएम पर घूमने वाले एक कक्षीय शेकर प्लेटफॉर्म पर 5% सीओ2 का आर्द्र वातावरण।

2.4. 293F अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करके L1:P18I10 और L1:T20 प्रोटीन का उत्पादन

PCDNA3.1 निर्माण में क्रमशः काइमेरिक L1:P18I10 और L1:T20 प्रोटीन के अनुरूप L1:P18I10 या L1:T20 डीएनए कोडिंग अनुक्रम शामिल थे। HIV-1 P18I10 CTL पेप्टाइड (RGPGRAFVTI) या T20 पेप्टाइड (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE LLELD KWASLWNWF) को HPV16 L1 कैप्सिड प्रोटीन के DE लूप में डाला गया था। HPV16 L1 DE लूप अनुक्रम एन्कोडिंग 130-136 अमीनो एसिड को P18I10I10 या T20 पेप्टाइड से बदल दिया गया था। L1:P18I10 या L1:T20 डीएनए कोडिंग अनुक्रमों को कोज़क अनुक्रम के साथ संशोधित किया गया था, मानव कोडन के साथ अनुकूलित किया गया था, हिंदIII और XbaI के प्रतिबंध एंजाइम साइटों द्वारा फ़्लैंक किया गया था, और GeneArt जीन संश्लेषण सेवाओं का उपयोग करके PCDNA3.1(+) वेक्टर में क्लोन किया गया था ( थर्मो फिशर, वाल्थम, एमए, यूएसए)। पुनः संयोजक प्लास्मिड डीएनए (पीडीएनए) को प्रवर्धन के लिए ई. कोली डीएच5 सक्षम कोशिकाओं (इन्विट्रोजन) में बदल दिया गया और प्लास्मिड मैक्सी किट (क्यूआईएजीएन, हिल्डेन, जर्मनी) का उपयोग करके निकाला गया। 293F कोशिकाओं को 125mL एर्लेनमेयर फ्लास्क (कॉर्निंग, न्यूयॉर्क, NY, यूएसए) में 30mL फ्रीस्टाइल 293 अभिव्यक्ति माध्यम के साथ 1.0 × 106/mL के घनत्व पर संवर्धित किया गया और शाखित का उपयोग करके L1:P18I10 या L1:T20 pDNA के साथ क्षणिक रूप से ट्रांसफ़ेक्ट किया गया। डीएनए से पीईआई 1:3 (डब्ल्यू/डब्ल्यू) और डीएनए से कल्चर माध्यम 1:1 (डब्ल्यू/वी) के अनुकूलित अनुपात पर 25 केडीए (पीईआई-25के) (पॉलीसाइंसेज) के मेगावाट के साथ पॉलीइथाइलीनमाइन, के अनुसार निर्माता के निर्देशों के अनुसार [35]। 293F कोशिकाओं को ट्रांसफ़ेक्शन के 96 घंटे बाद काटा गया। 293एफ कोशिकाएं लगभग 50% व्यवहार्यता के साथ 3.6 × 106 कोशिकाओं/एमएल के संगम घनत्व तक पहुंच सकती हैं।

2.5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधलापन

कोशिकाओं को 100% ठंडे एसीटोन के साथ ग्लास स्लाइड पर पारगम्य बनाया गया था। इसके बाद, स्थिर कोशिकाओं की जांच एंटी-एचपीवी16 एल1 एंटीबॉडी कैमवीर -1 (एबीकैम, कैम्ब्रिज, यूके) से की गई और एंटी-माउस आईजीजी-एफआईटीसी (सिग्मा) से पकड़ी गई। इम्यून-सना हुआ सेल मोनोलेयर्स को पीबीएस से अच्छी तरह से धोया गया और डीएपीआई (एबीकैम) के साथ बढ़ते माध्यम से कवर किया गया। इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों का निरीक्षण 40× आवर्धन पर एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत किया गया। अभिकर्मक दक्षता FITC (हरा)-सकारात्मक कोशिकाओं और DAPI (नीला)-रंजित कोशिकाओं के अनुपात से निर्धारित की गई थी।

2.6. एचपीवी का शुद्धिकरण: एचआईवी (एल1:पी18आई10 और एल1:टी20) वीएलपी

125 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क (30 एमएल कल्चर मीडियम/फ्लास्क) में कुल 108 ट्रांसफ़ेक्टेड 293F कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 1500 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एकत्र किया गया और पीबीएस के साथ दो बार धोया गया। सेल छर्रों को 1% ट्राइटन एक्स -100, एक प्रोटीज अवरोधक (1:100) (मिलिपोर), और बेंज़ोनेस (25 यू/एमएल) (मिलिपोर) के साथ तैयार किए गए लिसिस बफर में फिर से निलंबित कर दिया गया था। सेल लाइसेट्स को 0.45 µm पीवीडीएफ सिरिंज फिल्टर (मिलिपोर) के साथ स्पष्ट किया गया था। एचपीवी: एचआईवी (एल1:पी18आई10 और एल1:टी20) वीएलपी नमूनों को कटियन एक्सचेंज (कैप्टो एसपी इम्परेस, जीई, बोस्टन, एमए, यूएसए), आकार बहिष्करण (कैप्टो कोर 700, जीई) और एफ़िनिटी (हाईट्रैप हेपरिन एचपी) का उपयोग करके क्रमिक रूप से शुद्ध किया गया था। , जीई) क्रोमैटोग्राफी। क्रोमैटोग्राफ़िक प्रोटोकॉल का वर्णन हमारे पिछले अध्ययनों [36,37] में किया गया था और निर्माता के प्रोटोकॉल [38] का पालन किया गया था। प्रत्येक शुद्धिकरण चरण में L1 प्रोटीन सिग्नल को वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण द्वारा चित्रित किया गया और एंटी-HPV16 L1 एंटीबॉडी CAMVIR -1 [39] के साथ जांच की गई।

2.7. नॉन-रिड्यूसिंग एसडीएस-पेज

HPV16 L1, L1:P18I10, और L1:T20 VLP को 5% (v/v) 2-मर्कैप्टोएथेनॉल ({{11}) की अनुपस्थिति या उपस्थिति में 2× लेम्मली नमूना बफर (BIO-RAD) के साथ मिलाया गया था। }एमई) और 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर प्रतिक्रिया की। नमूनों को 8-16% टीजीएक्स दाग-मुक्त प्रोटीन जैल (बीआईओ-आरएडी) द्वारा अलग किया गया था। फिर, जैल को पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित कर दिया गया। झिल्लियों की जांच 1:4000 के तनुकरण पर एंटी-HPV16 L1 CAMVIR -1 mAb से की गई। उसके बाद, झिल्लियों को 1:4000 के तनुकरण पर एंटी-माउस आईजीजी पेरोक्सीडेज कॉन्जुगेट (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) के साथ इनक्यूबेट किया गया। सिग्नल को वेस्टर्न ब्लॉट ईसीएल सब्सट्रेट किट (बायो-रेड, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) का उपयोग करके केमिलुमिनसेंस द्वारा विकसित और कल्पना की गई थी। ब्लॉट छवियां ओडिसी एफसी इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करके हासिल की गईं।

2.8. आणविक द्रव्यमान विश्लेषण

HPV16 L1, L1:P18I10, और L1:T20 वीएलपी बिना 2-ME उपचार के 1000 kDa आणविक भार कटऑफ (MWCO) अल्ट्राफिल्ट्रेशन डिवाइस (SARTORIUS) के माध्यम से फ़िल्टर किए गए थे। HPV16 L1, L1:P18I10, और L1:T20 VLPs 2-ME उपचार के साथ 100 kDa MWCO अल्ट्राफिल्ट्रेशन डिवाइस (एमिकॉन) के माध्यम से पारित किए गए थे। रेटेंटेट्स को मूल मात्रा में पुनर्गठित किया गया था और फ़िल्टर डिवाइस नमूना जलाशय से एकत्र किया गया था, जबकि फ़िल्ट्रेट्स को सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के नीचे एकत्र किया गया था। एल1 सिग्नल को एंटी-एचपीवी16 एल1 एमएबी के साथ जांचे गए डॉट ब्लॉट का उपयोग करके मापा गया था और एंटी-माउस आईजीजी-पेरोक्सीडेज कंजुगेट (सिग्मा-एल्ड्रिच) द्वारा पता लगाया गया था। केमिलुमिनसेंस चैनल पर ओडिसी एफसी इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके छवियां हासिल की गईं।

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2.9. नकारात्मक धुंधलापन और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

कार्बन-लेपित कॉपर ग्रिड (सिग्मा-एल्ड्रिच) को 5 मिनट के लिए पराबैंगनी प्रकाश के तहत चार्ज करने के बाद, वाणिज्यिक एचपीवी 16 एल 1 (एबीकैम), शुद्ध एल 1: पी 18 आई 10 और एल 1: टी 20 वीएलपी को 20 मिमी ट्रिस-एचसीएल (पीएच 7.4, 137 मिमी NaCl) के साथ संतुलित किया गया। ) को 1 मिनट के लिए ग्रिड पर अवशोषित किया गया और मिलिक्यू पानी से तीन बार धोया गया। एचपीवी: एचआईवी वीएलपी 1 मिनट के लिए पीएच 4.5 (सिग्मा-एल्ड्रिच) पर 2% यूरेनिल एसीटेट के साथ नकारात्मक दाग वाले थे। व्हाटमैन गुणात्मक फ़िल्टर पेपर (सिग्मा-एल्ड्रिच) द्वारा अतिरिक्त धुंधला एजेंटों को हटा दिया गया था। अवलोकन से कम से कम 2 घंटे पहले ग्रिड को डीह्यूमिडिफ़ायर कक्ष में रखा गया था। छवियां क्रमशः SA135K (100 एनएम) और SA59000 (200 एनएम) आवर्धन पर एक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टेक्नाई स्पिरिट 120 केवी) का उपयोग करके प्राप्त की गईं।

2.10. सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और वेस्टर्न ब्लॉटिंग विश्लेषण

HPV16 L1 प्रोटीन (Abcam), शुद्ध L1:P18I10, और L1:T20 VLP की समान मात्रा (500 एनजी) को 5% 2-ME वाले 2× लेमली सैंपल बफर के साथ मिलाया गया और 5 मिनट के लिए 95 ◦C पर उबाला गया। . नमूनों को 8-16% टीजीएक्स स्टेन-मुक्त प्रोटीन जैल द्वारा अलग किया गया और फिर सेमी-ड्राई ट्रांसफर डिवाइस (बायो-रेड) का उपयोग करके पीवीडीएफ झिल्ली (मिलिपोर, बर्लिंगटन, एमए, यूएसए) में स्थानांतरित किया गया। झिल्ली को टीबीएसटी में 5% मलाई रहित दूध से अवरुद्ध किया गया था। फिर, झिल्लियों की जांच 1:4000 के तनुकरण पर एंटी-HPV16 L1 CAMVIR -1 mAb, 1:4000 के तनुकरण पर एंटी-एचआईवी -1 gp120 V3 लूप mAb (NIBSC, EVA3012) से की गई। 40 और एचआईवी1 जीपी41 (2एफ5) एमएबी (एनआईबीएससी, एआरपी3063) क्रमशः 1:4000 के तनुकरण पर। उसके बाद, झिल्लियों को 1:4000 के तनुकरण पर एंटी-माउस आईजीजी पेरोक्सीडेज कॉन्जुगेट (सिग्मा-एल्ड्रिच) के साथ इनक्यूबेट किया गया। सिग्नल विकास के लिए वेस्टर्न ईसीएल सब्सट्रेट किट (बीआईओ-आरएडी) का उपयोग किया गया था। ब्लॉट छवियों को केमिलुमिनसेंस चैनल पर ओडिसी एफसी इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके हासिल किया गया था।

2.11. चूहों का टीकाकरण, सेरा का संग्रह, और स्प्लेनोसाइट्स का अलगाव

यह HPV: HIV VLPs (L1:P18I10 और L1:T20 VLPs) की रोग प्रतिरोधक क्षमता प्रदर्शित करने के लिए एक प्रारंभिक अवधारणा-प्रूफ़ अध्ययन है। हमारे एचपीवी की खुराक, प्रशासन मार्ग और प्राइम-बूस्ट अंतराल: एचआईवी वीएलपी ने पिछले अध्ययनों को संदर्भित किया है जिसमें बोवाइन पेपिलोमावायरस (बीपीवी) के साथ चूहों को प्रतिरक्षित किया गया था: एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए एचआईवी वीएलपी [20,21]। शुद्ध एचपीवी: लाइसेंस प्राप्त गार्डासिल एचपीवी वैक्सीन [40] के समान फॉर्मूलेशन सुनिश्चित करने के लिए एचआईवी वीएलपी को एल्युमीनियम हाइड्रॉक्सीफॉस्फेट सल्फेट (थर्मो फिशर) की समान मात्रा (प्रत्येक 0.5 एमएल खुराक पर 225 माइक्रोग्राम) के साथ इमल्सीफाइड किया गया था। सभी माउस समूहों में समान लिंग वितरण था (प्रति समूह नर एन {{15%) और मादा एन {{16%)। समूह ए और बी में, बीएएलबी/सी चूहों को एक घरेलू प्राइम-बूस्ट शासन का पालन करके क्रमशः 10 माइक्रोग्राम एल1:पी18आई10 या एल1:टी20 वीएलपी के साथ इंट्रामस्क्युलर (आईएम) प्रतिरक्षित किया गया था। समूह सी में, चूहों को इंट्राडर्मली (आईडी, फूड पैड पर) 106 सीएफयू बीसीजी.एचआईवीए2ऑक्सो.इंट का टीका लगाया गया और इंट्रामस्क्युलर रूप से 10 माइक्रोग्राम एल1:पी18आई10 वीएलपी बढ़ाया गया। समूह डी में, सकारात्मक नियंत्रण चूहों को गार्डासिल प्राइम का टीका लगाया गया और उसके बाद गार्डासिल को 10 माइक्रोग्राम एचपीवी16 एल1 वीएलपी के साथ इंट्रामस्क्युलर बूस्ट किया गया। समूह ई में, नकारात्मक नियंत्रण चूहों को पीबीएस बफर के साथ दो बार प्रतिरक्षित किया गया था। प्राइम-बूस्ट अंतराल 2 सप्ताह था। 28वें दिन चूहों की बलि दी गई। चूहों के दिलों से रक्त के नमूने एकत्र किए गए। सेरा को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पुनर्प्राप्त किया गया और एलिसा परीक्षण के लिए -20 ◦C पर संग्रहीत किया गया। म्यूरिन स्प्लीन्स को हटा दिया गया और 5 एमएल सिरिंज रबर प्लंजर के साथ एक सेल स्ट्रेनर (फाल्कन) के माध्यम से व्यक्तिगत रूप से दबाया गया। एसीके लाइज़िंग बफर (लोन्ज़ा) के साथ लाल रक्त कोशिकाओं को हटाने के बाद, स्प्लेनोसाइट्स को धोया गया और लिम्फोसाइट माध्यम आर 10 (आरपीएमआई 1640 में 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस), पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 20 मिमी एचईपीईएस और 15 मिमी {{के साथ पूरक किया गया) में फिर से निलंबित कर दिया गया। 46}}एमई) 2 × 107 कोशिकाओं/एमएल की सांद्रता पर।

2.12. एन्ज़ाइम - लिंक्ड इम्यूनोसॉरबेंट एसै जांच

काइमेरिक एचपीवी से जुड़ने वाले एचपीवी16 एल1- और एचआईवी{2}}विशिष्ट एंटीबॉडी का परीक्षण करने के लिए: एचआईवी वीएलपी इन विट्रो में पुनः संयोजक एचपीवी16 एल1 प्रोटीन (एबीकैम, एबी119880) के 50 μL समान सांद्रता (200 एनजी/एमएल) का निर्माण करता है। ), 50 एमएम कार्बोनेट बाइकार्बोनेट बफर (पीएच=9.6) (सिग्मा) में शुद्ध एल1:पी18आई10 और एल1:टी20 वीएलपी को क्रमिक रूप से 2- गुना पतला किया गया और मैक्सिसॉर्ब प्लेट्स (नंक) पर लेपित किया गया। प्लेटों को रात भर 4 ◦C पर इनक्यूबेट किया गया। प्लेटों को कम से कम 2 घंटे के लिए 37 ◦C पर ब्लॉकिंग बफर (टीबीएसटी में 5% स्किम दूध) के साथ अवरुद्ध किया गया था। टीबीएसटी के साथ दो बार धोने के बाद, वीएलपी-लेपित प्लेटों को 1:8000 के कमजोर पड़ने पर एंटी-एचपीवी 16 एल 1 कैमवीर -1 एमएबी, 1: 8000 के कमजोर पड़ने पर 2 एफ 5 एमएबी (एनआईबीएससी, एआरपी 3063) के साथ इनक्यूबेट किया गया था। एचआईवी -1 जीपी120 वी3 लूप एमएबी (एनआईबीएससी, ईवीए3012) क्रमशः ब्लॉकिंग बफर में 1:40 के तनुकरण पर, 2 घंटे के लिए 37 ◦C पर। टीबीएसटी के साथ तीन बार धोने के बाद, प्लेटों को 1 घंटे के लिए 37 ◦C पर ब्लॉकिंग बफर में 1: 4000 के कमजोर पड़ने पर पुनः संयोजक प्रोटीन जी पेरोक्सीडेज संयुग्म (थर्मो साइंटिफिक, वाल्थम, एमए, यूएसए) के साथ ऊष्मायन किया गया था। टीएमबी का उपयोग एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा) सिग्नल विकसित करने के लिए किया गया था और 2M H2SO4 के 50 μL के साथ बंद कर दिया गया था। ईएल × 800 अवशोषक माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके प्रत्येक कुएं के ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) को 450 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर मापा और रिकॉर्ड किया गया था।

BALB/c चूहों में VLP-प्रेरित एंटीबॉडी को मापने के लिए, माइक्रोटिटर प्लेटों को 50 μL 2 μg/mL पुनः संयोजक HPV16 L1 प्रोटीन (Abcam, ab119880), HIV-1 P18I10 पेप्टाइड (NIBSC, ARP734) के साथ लेपित किया गया था। टी20 पेप्टाइड (एनआईबीएससी, एआरपी984), क्रमशः 50 एमएम कार्बोनेट-बाइकार्बोनेट बफर (पीएच=9.6) के साथ। प्लेटों को रात भर 4 ◦C पर इनक्यूबेट किया गया। प्लेटों को कम से कम 2 घंटे के लिए 37 ◦C पर ब्लॉकिंग बफर (टीबीएसटी में 5% स्किम दूध) के साथ अवरुद्ध किया गया था। उसी समय, समूह एई प्रतिरक्षित चूहों से एकत्र किए गए सीरा को 1:50 के अनुपात में टीबीएसटी में 5% स्किम दूध के साथ पतला किया गया था। टीबीएसटी से दो बार धोने के बाद, प्लेटों को 2 घंटे के लिए 37 ◦C पर पतला सीरा के साथ इनक्यूबेट किया गया। टीबीएसटी से तीन बार धोने के बाद, प्लेटों को ब्लॉकिंग बफर में 1:4000 के तनुकरण पर पुनः संयोजक प्रोटीन जी एचआरपी संयुग्म के साथ जोड़ा गया और 1 घंटे के लिए 37 ◦C पर इनक्यूबेट किया गया। टीएमबी का उपयोग एलिसा सिग्नल को विकसित करने के लिए किया गया था और 2M H2SO4 के 50 μL के साथ बंद कर दिया गया था। ईएल × 800 अवशोषक माइक्रोप्लेट रीडर (बायोटेक) का उपयोग करके प्रत्येक कुएं के ओडी को 450 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर मापा गया था।

2.13. आईएफएन-एलिसपॉट परख

निर्माता के निर्देशों के अनुसार, एंजाइम-लिंक्ड इम्यून एब्जॉर्बेंट स्पॉट (ELISpot) परख वाणिज्यिक म्यूरिन IFN- ELISpot किट (Mabtech, Nacka Strand, स्वीडन) का उपयोग करके किया गया था। एलीस्पॉट प्लेट्स (MSISP4510, {{3%) पॉलीविनाइलिडीन डिफ्लुओराइड झिल्ली के साथ अच्छी प्लेटें, मिलिपोर, मिडलसेक्स काउंटी, एमए, यूएसए) को 70% EtOH उपचारित किया गया और शुद्ध एंटी-माउस इंटरफेरॉन- (IFN-) कैप्चर मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ लेपित किया गया। फॉस्फेट-बफ़र्ड सेलाइन (पीबीएस) को रात भर में 4 ◦C पर 5 μg/mL की अंतिम सांद्रता तक। फिर, प्रत्येक कुएं में 2.5 × 105 ताजा स्प्लेनोसाइट्स जोड़े गए। इसके बाद, समूह ए और बी की कोशिकाओं को क्रमशः 2 माइक्रोग्राम/एमएल एचपीवी16 एल1 वीएलपी और एचआईवी -1 पी18आई10 पेप्टाइड्स से उत्तेजित किया गया। सभी नमूने और नियंत्रण डुप्लिकेट कुओं में चढ़ाए गए थे। ELISpot परखों को 16 घंटे के लिए 37 ◦C, 5% CO2 पर इनक्यूबेट किया गया। बाद में प्लेटों को पीबीएस के साथ 5 × धोया गया, बायोटिनाइलेटेड एंटी-आईएफएन-मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) के साथ 2 घंटे के लिए पीबीएस 2% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) में 2 माइक्रोग्राम / एमएल की अंतिम सांद्रता तक पतला किया गया, 5 बार धोया गया पीबीएस में, और पीबीएस 2% एफसीएस में स्ट्रेप्टाविडिन-क्षारीय फॉस्फेट संयुग्म के साथ ऊष्मायन किया गया। फिर, प्लेटों को 100 μL 5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-इंडोलिल फॉस्फेट (बीसीआईपी)/नाइट्रो ब्लू टेट्राजोलियम (एनबीटी) सब्सट्रेट समाधान (सिग्मा-एल्ड्रिच) के साथ इनक्यूबेट करने से पहले पीबीएस के साथ 5 बार धोया गया था , सेंट लुइस, एमओ, यूएसए)। 5-10 मिनट के बाद, प्लेटों को नल के पानी से धोया गया, सुखाया गया और परिणामी धब्बों को ELISPOT रीडर (AID, ऑटोइम्यून डायग्नोस्टिका GmbH, स्ट्रासबर्ग, जर्मनी) का उपयोग करके गिना गया। प्रत्येक जानवर के लिए, समूहों के बीच IFN-स्पॉट फॉर्मिंग सेल (SFC)/106 की तुलना को सक्षम करने के लिए सभी कुओं से पृष्ठभूमि प्रतिक्रियाओं का औसत अलग-अलग घटाया गया था। सकारात्मक प्रतिक्रियाओं को परिभाषित करने के लिए, एक सीमा को प्रति कुएं कम से कम पांच स्पॉट के रूप में परिभाषित किया गया था, और प्रतिक्रियाएं नकारात्मक नियंत्रण कुओं में स्पॉट की औसत संख्या और नकारात्मक नियंत्रण कुओं के तीन मानक विचलन से अधिक थीं।

2.14. सांख्यिकीय विश्लेषण

सभी सांख्यिकीय विश्लेषण प्रिज्म 6 ग्राफपैड सॉफ्टवेयर (सीए, यूएसए) का उपयोग करके किया गया था। हमने पुनः संयोजक HPV16 L1 प्रोटीन (Abcam, ab119880) और HPV: HIV VLPs के 5 अलग-अलग एलिसा प्लेट कोटिंग सांद्रता (0, 50, 100, 150, 200 एनजी/एमएल) पर किए गए प्रयोगों से डेटा का उपयोग किया। हमने 2 समूहों (एचपीवी16 एल1 और एचपीवी: एचआईवी वीएलपी) से डेटा एकत्र किया और प्रत्येक कोटिंग एकाग्रता के लिए तीन प्रतिकृति एकत्र कीं। प्रिज्म में ग्राफ़ ने डेटा को एक स्कैटरप्लॉट के रूप में दिखाया जो एक्स-अक्ष पर कोटिंग एकाग्रता (एनजी/एमएल) और वाई-अक्ष पर OD450 दिखा रहा है। चूंकि हमने अनुमान लगाया था कि हमारा इन विट्रो एलिसा डेटा एक रैखिक पैटर्न में संबंधित है, इसलिए हमने रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण किया और उस डेटा सेट -1 और डेटा सेट -2 (एंटीबॉडी) की पुष्टि करने के लिए दो लाइनों के ढलानों की तुलना की। एचपीवी16 एल1 और एचपीवी: एचआईवी वीएलपी) के बीच प्रतिक्रियाशीलता उनके कार्यों में भिन्न होती है। हमने सर्वोत्तम-फिट लाइन के साथ-साथ 95% विश्वास अंतराल का चयन किया। प्रिज्म स्वचालित रूप से हमारे दोनों डेटा सेटों पर एक रेखीय प्रतिगमन रेखा को ओवरलैप करता है और इसने 95% विश्वास अंतराल का प्रतिनिधित्व करने वाली एक बिंदीदार रेखा खींची है। रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण के दौरान, सॉफ़्टवेयर ने हमारे डेटा सेट के केवल माध्य Y मान की गणना की, जो फिट की अच्छाई दर्शाता है। इसके अलावा, प्रिज्म ने हमें एक टिप्पणी दी, जिससे हम यह निष्कर्ष निकाल सकते हैं कि दोनों ढलानों के बीच अंतर बेहद महत्वपूर्ण हैं।

हमारे पास माउस टीकाकरण प्रयोगों से एकत्र किए गए डेटा के 5 सेट (एलिसा) और 4 सेट (एलिसपॉट) थे। इन डेटा सेटों में प्रत्येक समूह में एक समान संख्या (पुरुष n=4 और महिला n=4) थी। हमने गार्डासिल प्रतिरक्षित चूहों को एक सकारात्मक नियंत्रण समूह के रूप में और पीबीएस-प्रतिरक्षित चूहों को एक नकारात्मक नियंत्रण समूह के रूप में उपयोग किया। हमारे डिज़ाइन किए गए प्रयोगों का डेटा मेल नहीं खा रहा था या युग्मित नहीं हो रहा था। हमने यह देखने के लिए विचरण (एनोवा) का एक-तरफ़ा विश्लेषण किया कि क्या ये साधन भिन्न थे। हमने सबसे पहले अपने डेटा को गॉसियन सामान्य वितरण के अनुरूप जांचा। हमने पाया कि एलिसा परख में डेटा के कुछ समूह गॉसियन सामान्य वितरण परीक्षण पास नहीं कर पाए। इसलिए, हमने इन आंकड़ों का एक गैर-पैरामीट्रिक सांख्यिकीय विश्लेषण किया। इसके विपरीत, ELISPOT में डेटा के सभी समूह गॉसियन सामान्य वितरण परीक्षण से आगे निकल जाते हैं। इस प्रकार, हमने इन आंकड़ों का एक पैरामीट्रिक सांख्यिकीय विश्लेषण किया। महत्व सीमा और आत्मविश्वास का स्तर 0.05 (95% विश्वास अंतराल के बराबर) पर सेट किया गया था। पी मान सामान्य तौर पर यह संभावना दर्शाता है कि समूहों के बीच अंतर हैं। चूँकि इस प्रयोग के लिए हमारी मुख्य चिंता यह है कि हमारे समूहों के बीच क्या अंतर हैं, प्रिज्म में कई तुलनाओं ने हमें सभी समूहों में हर दूसरे समूह के साथ तुलना का परिणाम दिया।

2.15. नैतिकता कथन

छह से आठ सप्ताह पुराने BALB/c चूहों को एनविगो (एक इनोटिव कंपनी, शिकागो, आईएल, यूएसए) से खरीदा गया था और स्थानीय अधिकारियों (जनरलिटैट डी कैटालुन्या, प्रोजेक्ट नंबर 11157) और यूनिवर्सिटैट ऑटोनोमा डी बार्सिलोना एथिक्स कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया था। पशु प्रयोग सख्ती से जनरलिटैट डी कैटालुन्या के पशु कल्याण कानून के अनुरूप थे। सभी प्रयोगों को स्थानीय अनुसंधान आचार समिति (प्रक्रिया 43.19, हॉस्पिटल डे ला वैल डी'हेब्रोन, यूनिवर्सिटैट ऑटोनोमा डी बार्सिलोना) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

3। परिणाम

3.1. L1:P18I10 और L1:T20 इम्यूनोजेन का डिज़ाइन और HPV का मूल्यांकन: 293F अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करके एचआईवी प्रोटीन अभिव्यक्ति

एचआईवी से P18I10 पेप्टाइड -1 Env तृतीय चर डोमेन (V3) लूप और HIV से T20 पेप्टाइड -1 Env झिल्ली के समीपस्थ बाहरी क्षेत्र (MPER) को काइमेरिक L1 उत्पन्न करने के लिए HPV16 L1 DE लूप प्रोटीन में डाला गया था :P18I10 और L1:T20 इम्युनोजेन। काइमेरिक L1:P18I10 और L1:T20 डीएनए कोडिंग अनुक्रमों को 293F कोशिकाओं में क्षणिक अभिकर्मक के लिए PCDNA3.1 (+) प्लास्मिड डीएनए अभिव्यक्ति वेक्टर में क्लोन किया गया था (चित्रा 1ए)। एचपीवी16 एल1, काइमेरिक एल1:पी18आई10, और एल1:टी20 कैप्सिड प्रोटीन की मोनोमर संरचनाओं की प्रारंभिक भविष्यवाणी स्विस-मॉडल सर्वर (चित्र 1बी) का उपयोग करके की गई थी। HPV16 प्रमुख कैप्सिड प्रोटीन L1 (7cn2.1.R) को HPV16 L1, L1:P18I10, और L1:T20 कैप्सिड प्रोटीन होमोलॉजी मॉडलिंग बनाने के लिए संरचनात्मक टेम्पलेट के रूप में चुना गया था। पिछले अध्ययन [41] में बाध्य P18I10 पेप्टाइड की संरचना की तुलना में, हमारे काइमेरिक L1:P18I10 प्रोटीन पर P18I10 पेप्टाइड की N से C टर्मिनस मुख्य श्रृंखला दिशा दाएं से बाएं चलती है (चित्र 1बी, मध्य और शीर्ष पैनल), और उजागर होने वाली P18I10 साइड चेन संभावित रूप से टी सेल रिसेप्टर्स (चित्रा 1बी, मध्य और निचला पैनल) के साथ बातचीत कर सकती हैं। पिछले समीक्षा पत्र [42] में एचआईवी फ्यूजन इनहिबिटर पेप्टाइड की संरचना की तुलना में, एचपीवी16 एल1 कैप्सिड प्रोटीन पर डाला गया टी20 पेप्टाइड एक -हेलिक्स-जैसी संरचना के रूप में प्रस्तुत किया गया है (चित्र 1बी, दाएं और शीर्ष पैनल) ), और उजागर होने वाली टी20 साइड चेन को संभावित रूप से बी सेल रिसेप्टर्स (चित्र 1बी, दाएं और निचला पैनल) द्वारा पहचाना जा सकता है। चूंकि एचपीवी16 एल1 कैप्सिड प्रोटीन 72 पेंटामेरिक कैप्सोमेरेस [43] के साथ एक टी=7 आइकोसाहेड्रल कण में एकत्रित हो सकते हैं, काइमेरिक एचपीवी की बाहरी सतह पर पी18आई10 या टी20 पेप्टाइड्स का उच्च घनत्व प्रदर्शन: एचआईवी वीएलपी संभावित रूप से अत्यधिक इम्युनोस्टिम्युलेटरी है। एपिटोप-विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए।

Figure 1. L1:P18I10 and L1:T20 immunogen design and construction of chimeric HPV: HIV VLPs by using 293F expression system. (A) The chimeric L1:P18I10 and L1:T20 DNA coding sequences were cloned into pcDNA3.1+ expression vectors, respectively, for transient transfection in 293F cells. (B) Prediction of monomer structures of HPV16 L1 and chimeric HPV: HIV capsid proteins by using the SWISS-model server. HPV16 major capsid protein L1 (7cn2.1.R) was selected as the structural template to build the HPV16 L1 (left panel), L1:P18I10 (middle panel), and L1:T20 (right panel) capsid protein homology modeling. Secondary structural elements of HPV16 L1 capsid protein are labeled, with letters h1–h5 for the 5 α-helices. Loops of HPV16 L1 capsid protein between strands are labeled BC, CD, DE, EF, FG, and HI. Secondary structural elements of HIV-1 P18I10 and T20 peptides L1 are labeled by the arrows (top panel). The part of the P18I10 and T20 peptide that protrudes above the surface of the HPV16 L1 capsid protein is indicated by the arrows (bottom panel). (C) Immunofluorescence staining of L1 protein in 293F cells. The following pDNA.L1:P18I10 (left), pDNA.L1:T20 (middle), and pDNA.without insertion (right) were transfected in 293F cells. The transfected cells were probed with anti-HPV16 L1 mAb and detected with anti-mouse IgG-FITC (green channel). Cell nuclei were stained with DAPI (blue channel). Immunofluorescence images were merged by using Adobe Photoshop


चित्र 1. L1:P18I10 और L1:T20 इम्युनोजेन डिज़ाइन और काइमेरिक एचपीवी का निर्माण: 293F अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करके एचआईवी वीएलपी। (ए) काइमेरिक एल1:पी18आई10 और एल1:टी20 डीएनए कोडिंग अनुक्रमों को 293एफ कोशिकाओं में क्षणिक अभिकर्मक के लिए क्रमशः पीसीडीएनए3.1+ अभिव्यक्ति वैक्टर में क्लोन किया गया था। (बी) स्विस-मॉडल सर्वर का उपयोग करके एचपीवी16 एल1 और काइमेरिक एचपीवी: एचआईवी कैप्सिड प्रोटीन की मोनोमर संरचनाओं की भविष्यवाणी। HPV16 प्रमुख कैप्सिड प्रोटीन L1 (7cn2.1.R) को HPV16 L1 (बाएं पैनल), L1:P18I10 (मध्य पैनल), और L1:T20 (दायां पैनल) कैप्सिड प्रोटीन होमोलॉजी मॉडलिंग बनाने के लिए संरचनात्मक टेम्पलेट के रूप में चुना गया था। एचपीवी16 एल1 कैप्सिड प्रोटीन के द्वितीयक संरचनात्मक तत्वों को 5 -हेलिकॉप्टरों के लिए एच1-एच5 अक्षरों के साथ लेबल किया गया है। स्ट्रैंड्स के बीच HPV16 L1 कैप्सिड प्रोटीन के लूप्स को BC, CD, DE, EF, FG और HI लेबल किया जाता है। एचआईवी के माध्यमिक संरचनात्मक तत्व -1 पी18आई10 और टी20 पेप्टाइड्स एल1 को तीर (शीर्ष पैनल) द्वारा लेबल किया गया है। P18I10 और T20 पेप्टाइड का वह हिस्सा जो HPV16 L1 कैप्सिड प्रोटीन की सतह से ऊपर फैला हुआ है, तीरों (निचला पैनल) द्वारा दर्शाया गया है। (सी) 293एफ कोशिकाओं में एल1 प्रोटीन का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधलापन। निम्नलिखित pDNA.L1:P18I10 (बाएं), pDNA.L1:T20 (मध्य), और pDNA.बिना सम्मिलन (दाएं) को 293F कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की जांच एंटी-एचपीवी16 एल1 एमएबी से की गई और एंटी-माउस आईजीजी-एफआईटीसी (ग्रीन चैनल) से पता लगाया गया। कोशिका नाभिक को डीएपीआई (नीला चैनल) से रंग दिया गया था। एडोब फोटोशॉप का उपयोग करके इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों को मर्ज किया गया था

चूंकि एचपीवी16 एल1 प्रोटीन सी टर्मिनल अनुक्रम संक्रमण के दौरान सेलुलर परमाणु आयात मशीनरी की मध्यस्थता करता है [44], पूर्व अध्ययनों में एचपीवी16 एल1 प्रोटीन के परमाणु स्थानीयकरण संकेतों (एनएलएस) की पहचान की गई है [45]। HPV16 L1 एपिटोप (GFGAMDF, 230-236 aa) [39] को पहचानने के लिए CAMVIR -1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का चयन किया गया था, और L1:P18I10 और L1 की अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए एक रिपोर्टर के रूप में फ्लोरेसिन-आधारित डाई FITC का उपयोग किया गया था: टी20 प्रोटीन. इम्यूनोफ्लूओ उपस्थिति छवियों ने स्पष्ट रूप से दिखाया कि HPV16 L1 (हरे रंग में) मुख्य रूप से 293F कोशिकाओं के नाभिक (नीले रंग में) में स्थानीयकृत था। नियंत्रण प्लास्मिड-ट्रांसेक्टेड 293एफ कोशिकाओं (बिना सम्मिलित किए पीसीडीएनए3.1 प्लास्मिड) में कोई एल1 सिग्नल नहीं देखा गया (चित्र 1सी)। परिणामों ने सुझाव दिया कि काइमेरिक L1:P18I10 और L1:T20 कैप्सिड प्रोटीन दोनों को पॉलीइथाइलीनमाइन (PEI) - मध्यस्थ अभिकर्मक का उपयोग करके व्यक्त किया जा सकता है और HPV16 L1 CAMVIR -1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी द्वारा पहचाना जा सकता है।

3.2. क्रोमैटोग्राफ़िक विधियों का उपयोग करके L1:P18I10 और L1:T20 वीएलपी का शुद्धिकरण

The chimeric L1:P18I10 and L1:T20 proteins were produced by using the 293F expression system. The capture, intermediate purification, and polishing (CiPP) strategy to develop our chromatographic purification protocol is shown in Figure 2A. Flowthrough (FT) in each purification step was collected and the level of L1 protein expression was detected by Western blot analysis using anti-L1 mAb to trace intermediate HPV: HIV VLPs (Figure 2B, C). A cation exchange (CEC) column was selected as a capturing step to isolate HPV: HIV VLPs from host cell proteins (HCPs). The result of CEC FT revealed that most of the L1:P18I10 and L1T20 VLPs were lost in the FT over the CEC column (Figure 2B, C, lane 2). Traditional CEC matrices we used heavily rely on diffusion-limited mass transfer [46]. Large macromolecular complexes, such as our HPV: HIV VLP samples, might be inefficient for the VLP binding to CEC matrices. In order to reach the maximum binding capacities of the CEC column (~50 mg protein/mL resin), we loaded a double amount of soluble cell lysate containing approximately 2% of HPV: HIV VLPs into the CEC column. In the intermediate purification step, HPV: HIV VLPs were purified using a layered-bead size exclusion chromatography (SEC) resin [38]. Large HPV: HIV particles (>700 kDa) were eluted while most of the small impurities were trapped in the beads (Figure 2B, C, lane 5). Due to heparin having a similar structure as DNA and possibly binding to positively charged peptides of conformational HPV16 L1 VLPs, we selected a heparin affinity chromatography (H-AC) as a polishing step to remove heterogeneous or closely related particles [47]. Analysis of densitometry from Western blot analysis and bovine serum albumin (BCA) assay confirmed that purity of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs after diafiltration step was high, over 76% (Figure 2B, C, lane 10). The purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs were detected as a band in size of approximately 56 kDa and 58 kDa, respectively. We found that the commercial HPV16 L1 protein and our purified chimeric HPV: HIV VLPs (L1:P18I10 and L1:T20) share a similar protein pattern (a target band >50 केडीए और एक विषम निचला बैंड<50 kDa). These heterologous lower bands could be detected, especially, when we loaded SDS-PAGE gel with a high amount of chimeric HPV: HIV VLP samples (Figure 2B, C, lane 1 to 10). It is probably caused by proteolytic degradation or heterogeneous formation of L1 proteins. A similar pattern (2 bands) was also found in many previous HPV16 L1 purification studies [23,48–51]. These data demonstrated that the 293F expression system and chromatographic purification methods are feasible approaches to engineer chimeric HPV: HIV VLPs.

Figure 2. Purification and characterization of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Schematic process flowchart of L1:P18I10 and L1:T20 VLP purification by chromatography. (B, C) Western blot analysis of L1:P18I10 and L1:T20 VLP samples from each purification step. The signal of L1 in each purification step was characterized by Western blot analysis probed with anti-HPV16 L1 mAb. The arrow indicates the molecular weight of ~56 kDa of L1:P18I10 and ~58 kDa of L1:T20 proteins. Lane 1: clarified cell lysate (CCL); Lane 2: flow-through (FT) from cation exchange chromatography (CEC) sample loading; Lane 3: CEC eluate; Lane 4: FT from CEC 2M NaCl regeneration step; Lane 5: size exclusion chromatography (SEC) FT-1; Lane 6: SEC FT-2; Lane 7: FT from heparin affinity chromatography (H-AC) sample loading; Lane 8: H-AC eluate; Lane 9: FT from H-AC 2M NaCl regeneration step; Lane 10: 10-fold diafiltration.


चित्र 2. L1:P18I10 और L1:T20 वीएलपी का शुद्धिकरण और लक्षण वर्णन। (ए) क्रोमैटोग्राफी द्वारा एल1:पी18आई10 और एल1:टी20 वीएलपी शुद्धि का योजनाबद्ध प्रक्रिया फ़्लोचार्ट। (बी, सी) प्रत्येक शुद्धिकरण चरण से एल1:पी18आई10 और एल1:टी20 वीएलपी नमूनों का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। प्रत्येक शुद्धिकरण चरण में एल1 के संकेत को एंटी-एचपीवी16 एल1 एमएबी के साथ जांचे गए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा चित्रित किया गया था। तीर L1:P18I10 के ~56 kDa और L1:T20 प्रोटीन के ~58 kDa के आणविक भार को इंगित करता है। लेन 1: स्पष्ट सेल लाइसेट (सीसीएल); लेन 2: कटियन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी (सीईसी) नमूना लोडिंग से फ्लो-थ्रू (एफटी); लेन 3: सीईसी स्पष्टीकरण; लेन 4: सीईसी 2एम NaCl पुनर्जनन चरण से एफटी; लेन 5: आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) एफटी-1; लेन 6: एसईसी एफटी-2; लेन 7: हेपरिन एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी (एच-एसी) नमूना लोडिंग से एफटी; लेन 8: एच-एसी इलुएट; लेन 9: एच-एसी 2एम NaCl पुनर्जनन चरण से एफटी; लेन 10: 10-फोल्ड डायफिल्ट्रेशन।

3.3. L1:P18I10 और L1:T20 वीएलपी की इन विट्रो स्थिरता और सेल्फ-असेंबली

यह पुष्टि करने के लिए कि शुद्ध एचपीवी: एचआईवी वीएलपी ने एचपीवी 16 एल1 वीएलपी के समान इन विट्रो स्थिरता प्रदर्शित की है, हमने एचपीवी: एचआईवी कैप्सिड प्रोटीन (चित्रा 3 ए) के डाइसल्फ़ाइड क्रॉस-लिंकिंग का मूल्यांकन करने के लिए गैर-कम करने वाले एसडीएस-पेज का प्रदर्शन किया। यह ज्ञात है कि पीएच, आयनिक शक्ति, तापमान [52], और रेडॉक्स वातावरण सभी एचपीवी16 एल1 कैप्सिड प्रोटीन [53] के डाइसल्फ़ाइड बांड से संबंधित हैं। एचपीवी एल1 वीएलपी कम पीएच और उच्च आयनिक शक्ति पर स्व-संयोजन करते हैं। वीएलपी के अधिकतम पृथक्करण के लिए आमतौर पर कम करने वाले एजेंट की उच्च सांद्रता के संपर्क की आवश्यकता होती है, जैसे कि अपेक्षाकृत लंबी अवधि के लिए 5% 2-मर्कैप्टोएथेनॉल (2-एमई)। [54]। कम करने वाले एजेंटों 2-एमई की अनुपस्थिति में, एचपीवी -16 एल1, एल1:पी18आई10, और एल1:टी20 प्रोटीन का केवल एक छोटा सा हिस्सा 55 केडीए के स्पष्ट आणविक भार (एमडब्ल्यू) के साथ मोनोमर्स में स्थानांतरित हो गया। . लगभग 70% एल1 प्रोटीन डाइसल्फ़ाइड से बड़े डिमर्स या पेंटामर्स में बंधे थे, अनुमानित मेगावाट 110 केडीए और 280 केडीए (चित्र 3ए, लेन 2, 4, और 6) के साथ। इसके विपरीत, डिस्सेम्बली बफर में लगभग सभी एचपीवी -16 एल1, एल1:पी18आई10 और एल1:टी20 प्रोटीन गैर-कम करने वाले एसडीएस-पेज (चित्र 3ए, लेन 3, 5, और 7) में मोनोमेरिक संरचनाएं दिखाई दीं। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि शुद्ध L1:P18I10 और L1:T20 वीएलपी की इन विट्रो स्थिरता समान पीएच, आयनिक ताकत और थर्मल स्थितियों के तहत एचपीवी16 एल1 वीएलपी के समान डाइसल्फ़ाइड क्रॉस-लिंकिंग पैटर्न प्रस्तुत करती है। कम करने वाले एजेंटों की उच्च सांद्रता के लंबे समय तक संपर्क के बाद शुद्ध वीएलपी पेंटामर्स, ट्रिमर्स और डिमर के स्तर तक टूट जाते हैं। ये आंकड़े पिछले अध्ययनों के अनुरूप हैं [53,54] हालांकि, एचपीवी: एचआईवी वीएलपी का पृथक्करण अभी भी पूर्ण (मोनोमर्स) से दूर था।

Figure 3. In vitro stability of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Disulfide cross-linking of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs in non-reducing SDS-PAGE. The HPV16 L1 VLPs, purified L1:P18I10, and L1:T20 VLPs were mixed with Laemmli sample buffer in the absence or presence of 2-mercaptoethanol (2-ME), respectively, and analyzed by non-reducing SDS-PAGE. The position of the L1 monomer (55 kDa), L1 dimer (110 kDa), and L1 pentamer (280 kDa) are indicated by the arrow. Lane 1: protein molecular weight marker; Lane 2: HPV16 L1 VLP; Lane 3: HPV16 L1 VLP treated with 2-ME; Lane 4: L1:P18I10 VLP; Lane 5: L1:P18I10 VLP treated with 2-ME; Lane 6: L1:T20 VLP; Lane 7: L1:T20 VLP treated with 2-ME. (B) Molecular mass analysis of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. Assembled VLPs untreated with 2-ME (lanes 2, 4, and 6) were filtered out through 1000kDa molecular weight cutoff (MWCO) diafiltration devices (upper panel). Disassembled VLPs treated with 2-ME (lanes 3, 5, and 7) were filtered out through 100kDa MWCO centrifugal filter devices (lower panel). Retentates (R) were collected from filter device sample reservoirs, while the filtrates (F) were collected at the bottom of centrifuge tubes. The L1 protein signal was detected by using a dot blot probed with anti-HPV16 L1 mAb.


चित्र 3. L1:P18I10 और L1:T20 वीएलपी की इन विट्रो स्थिरता। (ए) गैर-कम करने वाले एसडीएस-पेज में एल1:पी18आई10 और एल1:टी20 वीएलपी की डाइसल्फ़ाइड क्रॉस-लिंकिंग। HPV16 L1 VLPs, शुद्ध L1:P18I10, और L1:T20 VLPs को क्रमशः 2-मर्कैप्टोएथेनॉल (2-ME) की अनुपस्थिति या उपस्थिति में लाम्मली नमूना बफर के साथ मिलाया गया था, और गैर-कम करने वाले द्वारा विश्लेषण किया गया था एसडीएस-पेज। L1 मोनोमर (55 kDa), L1 डिमर (110 kDa), और L1 पेंटामर (280 kDa) की स्थिति को तीर द्वारा दर्शाया गया है। लेन 1: प्रोटीन आणविक भार मार्कर; लेन 2: एचपीवी16 एल1 वीएलपी; लेन 3: एचपीवी16 एल1 वीएलपी को 2-एमई से उपचारित किया गया; लेन 4: एल1:पी18आई10 वीएलपी; लेन 5: एल1:पी18आई10 वीएलपी का 2-एमई से उपचार; लेन 6: एल1:टी20 वीएलपी; लेन 7: एल1:टी20 वीएलपी का उपचार 2-एमई से किया गया। (बी) एल1:पी18आई10 और एल1:टी20 वीएलपी का आणविक द्रव्यमान विश्लेषण। 2-एमई (लेन 2, 4, और 6) के साथ अनुपचारित असेंबल किए गए वीएलपी को 1000 केडीए आणविक भार कटऑफ (एमडब्ल्यूसीओ) डायफिल्ट्रेशन डिवाइस (ऊपरी पैनल) के माध्यम से फ़िल्टर किया गया था। 2-एमई (लेन 3, 5, और 7) के साथ उपचारित अलग किए गए वीएलपी को 100 केडीए एमडब्ल्यूसीओ केन्द्रापसारक फिल्टर उपकरणों (निचले पैनल) के माध्यम से फ़िल्टर किया गया था। रिटेन्टेट्स (आर) को फिल्टर डिवाइस नमूना जलाशयों से एकत्र किया गया था, जबकि फिल्ट्रेट्स (एफ) को सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों के नीचे एकत्र किया गया था। एल1 प्रोटीन सिग्नल का पता एंटी-एचपीवी16 एल1 एमएबी के साथ जांचे गए डॉट ब्लॉट का उपयोग करके लगाया गया था।

To demonstrate that purified HPV: HIV proteins by chromatography are able to self-assemble to icosahedral particles, we further performed molecular mass analysis under the same reducing condition (5% 2-ME). The commercial HPV16 L1, purified L1:P18I10, and L1T20 proteins without reducing agent treatment were filtered out through 1000 kDa molecular weight cut-off (MWCO) diafiltration devices individually (Figure 3B, top panel). The L1 monomers (55 kDa), oligomers (110~200 kDa), or pentameric capsomers (280 kDa) were expected to pass through an ultrafiltration membrane retaining the integral VLPs (MW~20,000 kDa). The L1 signal of commercial HPV16 L1 proteins was detected in both retentates and filtrates. Most of the purified L1:P18I10 and L1T20 proteins formed large particles (>1000 केडीए) और रिटेनटेट में संरक्षित थे। यह पैटर्न गैर-घटाने वाले एसडीएस-पेज में देखे गए डेटा के साथ मेल खाता था। यद्यपि 2-एमई के साथ इलाज किए गए सभी वीएलपी समूहों को गैर-कम करने वाले एसडीएस-पेज (चित्रा 3ए, लेन 3, 5 और 7) में एक मोनोमेरिक बैंड (~55 केडीए) में दिखाया गया था। हालाँकि, संबंधित कम किए गए वीएलपी को 100kDa अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली (चित्र 3बी, निचला पैनल) के माध्यम से फ़िल्टर नहीं किया गया था। इन परिणामों ने सुझाव दिया कि काइमेरिक एचपीवी: एचआईवी प्रोटीन बड़े कणों में स्वयं-संयोजन करने में सक्षम थे, लेकिन मोनोमर्स में वीएलपी के अधिकतम विघटन के लिए न केवल डाइसल्फ़ाइड बांड में कमी की आवश्यकता होती है, बल्कि पीएच या आयनिक ताकत जैसे अन्य विकृतीकरण कारकों की भी आवश्यकता होती है।

3.4. L1:P18I10 और L1:T20 वीएलपी का रूपात्मक लक्षण वर्णन

ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) का उपयोग एचपीवी16 एल1 और एचपीवी: एचआईवी वीएलपी की रूपात्मक संरचना की जांच करने के लिए किया गया था। HIV-1 P18I10 और T20 पेप्टाइड्स को क्रमशः HPV16 L1 प्रोटीन के DE लूप में डाला गया था। ये वाणिज्यिक एचपीवी16 एल1 और काइमेरिक एचपीवी: एचआईवी कैप्सिड प्रोटीन लगभग 50-60 एनएम (चित्रा 4ए-सी, दायां पैनल) के व्यास में इंटीग्रल वीएलपी में इन विट्रो में स्वचालित रूप से स्वयं-इकट्ठा हो सकते हैं। पिछले अध्ययनों [55,56] में प्रकाशित एचपीवी16 एल1 वीएलपी के इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ की तुलना में, यहां एचपीवी16 एल1, एल1:पी18आई10, और एल1:टी20 वीएलपी की इकोसाहेड्रल संरचना कम विपरीत और अस्पष्ट थी। इसका श्रेय उस नकारात्मक दाग अभिकर्मक को दिया जा सकता है जिसका उपयोग हमने इस अध्ययन में किया था। पिछले अध्ययन [37] और सहकर्मी समीक्षा (डेटा नहीं दिखाया गया) के तहत चल रहे एक अन्य पेपर में प्रकाशित हमारे हालिया अध्ययन में, हमें इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ की अच्छी गुणवत्ता और रिज़ॉल्यूशन मिला है जब यीस्ट- और बैकोलोवायरस-व्युत्पन्न एल1:पी18आई10 वीएलपी (समान काइमेरिक) निर्माण) को पीबीएस में संतुलित किया गया और फॉस्फोटंगस्टिक एसिड (पीटीए) के साथ नकारात्मक-रंजित किया गया। क्योंकि हमने इस अध्ययन में विभिन्न वीएलपी उत्पादन और शुद्धिकरण प्रणालियों का उपयोग किया था, स्तनधारी कोशिका-व्युत्पन्न एल1:पी18आई10 और एल1:टी20 वीएलपी को ट्रिस-एचसीएल के साथ संतुलित किया गया था और यूरेनिल एसीटेट के साथ नकारात्मक-दाग दिया गया था। यद्यपि इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ में सुधार किया जा सकता है, फिर भी हम एक स्पष्ट पैटर्न देख सकते हैं कि अधिकांश एचपीवी16 एल1, एल1:पी18आई10, और एल1:टी20 कैप्सिड प्रोटीन टीईएम स्क्रीन के तहत रूपात्मक वीएलपी में स्व-इकट्ठा हो सकते हैं (चित्र 4ए-सी, बायां पैनल) ). मूल रूप से, एचपीवी वीएलपी उच्च नमक स्थितियों में एकत्रीकरण से सुरक्षित रहते हैं [57]। एचपीवी16 एल1 और एचपीवी के कुछ पता लगाने योग्य एकत्रीकरण: कम नमक ट्रिस-एचसीएल बफर में एचआईवी वीएलपी को कम आवर्धन (चित्रा 4ए-सी, बाएं पैनल) के तहत देखा जा सकता है। इन परिणामों से, हमने निष्कर्ष निकाला कि एचआईवी -1 पी18आई10 या टी20 पेप्टाइड्स के सम्मिलन द्वारा आंशिक एल1 डीई लूप अनुक्रम में संशोधन ने एचपीवी: एचआईवी वीएलपी की आकृति विज्ञान को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं किया।

Figure 4. Electron micrographs of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Morphology of HPV16 VLPs. (B) Morphology of L1:P18I10 VLPs. (C) Morphology of L1:T20 VLPs. Purified VLPs were absorbed on UV-charged carbon-coated copper grids, and negatively stained with 2% uranyl acetate. Images were acquired under transmission electron microscopy. The bar represents 200 nm at magnification 59,000 (left panel) and 100 nm at magnification 135K (right panels), respectively


चित्र 4. L1:P18I10 और L1:T20 वीएलपी के इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ। (ए) एचपीवी16 वीएलपी की आकृति विज्ञान। (बी) एल1:पी18आई10 वीएलपी की आकृति विज्ञान। (सी) एल1:टी20 वीएलपी की आकृति विज्ञान। शुद्ध वीएलपी को यूवी-चार्ज कार्बन-लेपित तांबे ग्रिड पर अवशोषित किया गया था, और 2% यूरेनिल एसीटेट के साथ नकारात्मक रूप से दाग दिया गया था। छवियां ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के तहत हासिल की गईं। बार क्रमशः 59, 000 (बाएं पैनल) के आवर्धन पर 200 एनएम और 135K (दाएं पैनल) के आवर्धन पर 100 एनएम का प्रतिनिधित्व करता है।

3.5. एचपीवी -16 और एचआईवी -1 एपिटोप्स की प्रस्तुति और प्रतिक्रियाशीलता 

यह पुष्टि करने के लिए कि अनुक्रमिक एचआईवी -1 P18I10 या 2F5 एपिटोप्स को क्रोमैटोग्राफी-शुद्ध L1:P18I10 या L1:T20 वीएलपी में प्रस्तुत किया गया था, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण और अप्रत्यक्ष एलिसा को एपिटोप-विशिष्ट mAbs का उपयोग करके तैयार किया गया था। हमने एचपीवी16 एल1 प्रोटीन [39,58] के अत्यधिक संरक्षित एपिटोप (जीएफजीएएमडीएफ, एए 230-236) को पहचानने के लिए एक प्रसिद्ध मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) का चयन किया, जिसे सीएएमवीआईआर -1 नामित किया गया है। अनुक्रमिक P18I10 एपिटोप्स (RGPGRAFVTI, aa311–320) [59] का पता लगाने के लिए एचआईवी को लक्षित करने वाले पहले प्रकाशित mAb -1 gp120 V3 लूप एपिटोप (RIQRGPGRAFVTIGK, aa308–322) को चुना गया था। दूसरी ओर, एचआईवी को पहचानने वाले व्यापक न्यूट्रलाइज़िंग एंटीबॉडी (bnAb) को प्रयोगशाला एचआईवी उपभेदों की एक विस्तृत विविधता के विरुद्ध -1 gp{31}}F5 एपिटोप (ELDKWA) को T20 पेप्टाइड लक्षण वर्णन के लिए चुना गया था। 60,61]। HPV16 L1 mAb के साथ जांचे गए वेस्टर्न ब्लॉट परख ने क्रमशः HPV16 L1, L1:P18I10, और L1:T20 प्रोटीन के अनुरूप बैंड 55, 56 और 58 kDa दिखाया (चित्र 5A, B, बाएँ)। L1:P18I10 प्रोटीन का आणविक भार (MW) HPV16 L1 प्रोटीन (चित्र 5A, बाएं) के समान था। L1:T20 प्रोटीन से संबंधित बैंड HPV16 L1 प्रोटीन से थोड़ा अधिक देखा गया, जैसा कि अतिरिक्त अमीनो एसिड अनुक्रम (चित्रा 5बी, बाएं) से अनुमान लगाया गया था। L1:P18I10 और L1:T20 प्रोटीन के अनुरूप लगभग 56 और 58 kDa के बैंड, एंटी-एचआईवी -1 gp120 V3 और 2F5 mAb के साथ जांचे गए वेस्टर्न ब्लॉट परख में क्रमशः पाए गए (चित्र 5A, B, दाएं) ). हमने सोचा कि एंटी-{75}}एफ-सना हुआ एल1:टी20 प्रोटीन का आणविक भार (मेगावाट) सही था और अपेक्षित 58 केडीए (चित्र 5बी, दाएं) के अनुरूप था। हालाँकि, एंटी-एचआईवी -1 जीपी120 वी 3- सना हुआ एल1:पी18आई10 प्रोटीन का मेगावाट थोड़ा कम है (चित्रा 5ए, दाएं)। इसका श्रेय काइमेरिक L1:P18I10 प्रोटीन की विषम संरचना को दिया जा सकता है। चूंकि एसडीएस-पेज में विकृतीकरण स्थिति के तहत अनुक्रमिक एपिटोप संरचना खो सकती है। इसलिए, हमने अपने काइमेरिक L1:P18I10 VLPs (चित्र 5E) पर उचित रूप से प्रस्तुत किए गए गठनात्मक P18I10 पेप्टाइड को प्रदर्शित करने के लिए अप्रत्यक्ष एलिसा का प्रदर्शन किया। दूसरी ओर, हमने जिस एंटी-एचआईवी जीपी120 वी3 लूप एंटीबॉडी का उपयोग किया, उसने पी18आई10 एपिटोप के बजाय पूरे एचआईवी वी3 लूप को पहचाना। नतीजतन, समग्र एंटी-वी3 सिग्नल कम था (चित्रा 5ए, बी, दाएं पैनल)। फिर भी, इन परिणामों ने संकेत दिया कि अनुक्रमिक एचआईवी -1 पी18आई10 और टी20 पेप्टाइड्स एचपीवी: एचआईवी वीएलपी में प्रस्तुत किए गए हैं।

Figure 5. Presentation of HPV-16 and HIV-1 epitopes. (A, B) Sequential epitope detection of chimeric L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. The purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs were analyzed by Western blot, using anti-HPV16 L1, anti-HIV-1 gp120 V3 and 2F5 mAb. The HPV16 L1 VLPs were used as a control. The molecular weight of the L1 (55 kDa), L1:P18I10 (56 kDa), and L1:T20 (58 kDa) proteins are indicated by the arrow. Lane 1: protein molecular weight marker; Lane 2: HPV16 L1 protein; Lane 3: L1:P18I10 protein; Lane 4: L1:T20 protein. (C, D) Binding of HPV16 L1 mAb to chimeric L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (E) Binding of anti-HIV-1 gp120 V3 mAb to chimeric L1:P18I10 VLPs. (F) Binding of HIV-1 2F5 mAb to chimeric L1:T20 VLPs. The line graph of indirect ELISAs was performed to detect the conformational epitopes of recombinant HPV16 L1, L1:P18I10, and L1:T20 VLPs bound to anti-L1, anti-HIV-1 gp120 V3 or 2F5 mAbs, respectively. Data are representative of three independent experiments. A simple linear regression test was done to compare the line difference of purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs with the standard curve of commercial L1 VLPs; ns: not significant; ** p < 0.01.


चित्र 5. एचपीवी-16 और एचआईवी-1 एपिटोप्स की प्रस्तुति। (ए, बी) काइमेरिक एल1:पी18आई10 और एल1:टी20 वीएलपी का अनुक्रमिक एपिटोप पता लगाना। शुद्ध किए गए L1:P18I10 और L1:T20 VLP का विश्लेषण वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा एंटी-एचपीवी16 L1, एंटी-एचआईवी -1 gp120 V3 और 2F5 mAb का उपयोग करके किया गया। एचपीवी16 एल1 वीएलपी का उपयोग नियंत्रण के रूप में किया गया था। L1 (55 kDa), L1:P18I10 (56 kDa), और L1:T20 (58 kDa) प्रोटीन का आणविक भार तीर द्वारा दर्शाया गया है। लेन 1: प्रोटीन आणविक भार मार्कर; लेन 2: एचपीवी16 एल1 प्रोटीन; लेन 3: L1:P18I10 प्रोटीन; लेन 4: एल1:टी20 प्रोटीन। (सी, डी) एचपीवी16 एल1 एमएबी को काइमेरिक एल1:पी18आई10 और एल1:टी20 वीएलपी से बाइंडिंग। (ई) एचआईवी-विरोधी जीपी120 वी3 एमएबी को काइमेरिक एल1:पी18आई10 वीएलपी से जोड़ना। (एफ) एचआईवी -1 2एफ5 एमएबी को काइमेरिक एल1:टी20 वीएलपी से बांधना। अप्रत्यक्ष ईएलआईएसए का लाइन ग्राफ क्रमशः एंटी-एल1, एंटी-एचआईवी -1 जीपी120 वी3 या 2एफ5 एमएबीएस से बंधे पुनः संयोजक एचपीवी16 एल1, एल1:पी18आई10, और एल1:टी20 वीएलपी के गठनात्मक एपिटोप का पता लगाने के लिए किया गया था। डेटा, तीन स्वतंत्र अनुभवों के प्रतिनिधि हैं। वाणिज्यिक एल1 वीएलपी के मानक वक्र के साथ शुद्ध एल1:पी18आई10 और एल1:टी20 वीएलपी के लाइन अंतर की तुलना करने के लिए एक सरल रैखिक प्रतिगमन परीक्षण किया गया था; एनएस: महत्वपूर्ण नहीं; ** पी <0.01.

इसके अलावा, यह निर्धारित करने के लिए कि क्या एचपीवी पर प्रस्तुत एचआईवी {{{5 {{59 }}}}}} गठनात्मक एपिटोप्स: एचआईवी वीएलपी को इन विट्रो में जीपी120 वी3 और 2एफ5 न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडीज द्वारा पहचाना जा सकता है, हमने जांच करने के लिए एक अप्रत्यक्ष एलिसा परख की। एपिटोप-बाध्यकारी विशिष्टता और प्रतिक्रियाशीलता। जैसा कि चित्र 5सी में दिखाया गया है, डी, एचपीवी16 एल1, एल1:पी18आई10, और एल1:टी20 वीएलपी को एंटी-एल1 एमएबी द्वारा पहचाना गया था। हमने प्रत्येक कमजोर पड़ने वाली रेखा की ढलान की तुलना करने के लिए रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण किया। परिणामों से पता चला कि L1:P18I10 या L1:T20 VLPs की L1 एपिटोप-बाइंडिंग विशिष्टता HPV16 L1 VLPs से भिन्न नहीं थी। इसके अलावा, एचआईवी-विरोधी gp120 V3 mAb L1:P18I10 VLPs को बांधने में सक्षम था, लेकिन HPV16 L1 VLPs को नहीं बांधने में सक्षम था (चित्र 5E)। इसके अलावा, 2F5 mAb L1:T20 VLPs को पहचान सकता है, लेकिन HPV16 L1 VLPs को नहीं (चित्र 5F)। रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण के बाद, L1:P18I10 और HPV16 L1 के बीच gp120 V3 एपिटोप-बाइंडिंग विशिष्टता में अंतर बेहद महत्वपूर्ण था (p <0.01%)। L1:T20 VLPs की 2F5 एपिटोप-बाइंडिंग विशिष्टता HPV16 L1 VLPs (p <0.01%) से काफी भिन्न थी। इस पैटर्न से पता चला कि हाइड्रोफोबिक सेलुलर लिपिड इन विट्रो में एचपीवी: एचआईवी वीएलपी को निष्क्रिय करने वाले 2एफ 5- एंटीबॉडी के बंधन के लिए आवश्यक नहीं थे। यद्यपि एचआईवी-विरोधी जीपी120 वी3 और 2एफ5 एचपीवी: एचआईवी वीएलपी को निष्क्रिय करने वाले एंटीबॉडी की प्रतिक्रिया अपेक्षाकृत हल्की है, एचआईवी-विरोधी जीपी120 वी3 और 2एफ5 एमएबी का एचपीवी: एचआईवी वीएलपी से बंधन महत्वपूर्ण था। एपिटोप-विशिष्ट।

3.6. BALB/c चूहों के टीकाकरण के बाद L1:P18I10 और L1:T20 वीएलपी की प्रतिरक्षण क्षमता

हमने L1:P18I10 और L1:T20 वीएलपी के साथ BALB/c चूहों के टीकाकरण के बाद एचपीवी 16- और एचआईवी -1- विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन किया। टीकाकरण कार्यक्रम चित्र 6ए में दिखाया गया है। क्योंकि म्यूकोसल प्रशासन के बाद वीएलपी-प्रेरित इम्युनोजेनेसिटी आम तौर पर प्रणालीगत प्रशासन के बाद कमजोर थी, चूहों को गार्डासिल -9 एचपीवी16 एल1 खुराक [22,62] के छठे हिस्से के साथ इंट्रामस्क्युलर रूप से प्रतिरक्षित किया गया था। काइमेरिक एचपीवी की एक खुराक (10 µg/100 µL) के लिए एल्यूमीनियम हाइड्रॉक्सी फॉस्फेट सल्फेट सहायक: एचआईवी वीएलपी को गार्डासिल के समान एकाग्रता (1 मिलीग्राम/1 एमएल) में समायोजित किया गया था। टीकाकरण के परिणामों में लिंग अंतर का आकलन करने के लिए, नर (n=4) और मादा (n=4) चूहों के बीच एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं की तुलना का मूल्यांकन किया गया था। L1:P18I10 VLP, L1:T20 VLP और गार्डासिल -9 के समूह में, मादा चूहों की एंटी-एचपीवी16 L1 एंटीबॉडी प्रतिक्रियाएं उन नर चूहों की तुलना में औसतन अधिक थीं (चित्र 6बी)। 4 में से 2 (50%) एल1:पी18आई10 वीएलपी-प्रतिरक्षित मादाएं, 4 में से 3 (75%) एल1:टी20 वीएलपी-प्रतिरक्षित मादाएं और सभी (100%) गार्डासिल-प्रतिरक्षित मादा चूहों में एंटी-एल1 एंटीबॉडी का उच्च अनुमापांक प्राप्त हुआ। नर चूहों की तुलना में. गार्डासिल समूह में मादा चूहों द्वारा प्रेरित एंटी-एल1 प्रतिक्रियाएं नर चूहों (पी {{52%).0041) (चित्र 6बी) की तुलना में काफी अधिक थीं। बीसीजी.एचआईवीए प्राइमिंग और एल1:पी18आई10 वीएलपी बूस्टिंग के समूह में एंटी-एल1 एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं का बहुत कम स्तर पाया गया। यह पैटर्न पिछले निष्कर्षों से मेल खाता है जिसमें बताया गया है कि बीसीजी मुख्य रूप से आईजीजी उत्पादन के बजाय टी-सेल प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करता है [63]।

Figure 6. Induction of humoral immune responses by L1:P18I10 and L1:T20 VLPs in BALB/c mice. The immunization schedule is depicted in (A) All mouse groups had equal gender distribution (male n = 4 and female n = 4). Groups A and B: homologous prime-boost immunization with 10 µg L1:P18I10 or L1:T20 VLPs intramuscularly (i.m.); Group C: priming with 106 cfu rBCG.HIVA intradermally (i.d.) and boosting with 10 µg L1:P18I10 VLPs i.m.; Group D: homologous prime-boost vaccination with Gardasil-9 containing 10 µg of HPV16 L1 VLPs i.m.; Group E: immunization twice with PBS buffer. The prime-boost interval was 2 weeks. The endpoint of this trial was on day 28. Sera were collected and diluted at a titer of 1:50 for ELISA assay. (B) HPV L1-specific IgG in male and female mice. (C–E) Epitope-specific IgG induced by L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. ELISA was performed to analyze anti-L1, anti-P18I10, and anti-T20 IgG induced by BALB/c mice following different prime-boost combinations as described above. Data are shown as mean ± S.D. One-way ANOVA (nonparametric) test was done to compare differences between groups. OD: opticaldensity. Ns not significant; ** p < 0.01


चित्र 6. BALB/c चूहों में L1:P18I10 और L1:T20 VLPs द्वारा हास्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का प्रेरण। टीकाकरण कार्यक्रम को (ए) में दर्शाया गया है, सभी माउस समूहों में समान लिंग वितरण (पुरुष एन=4 और महिला एन=4) था। समूह ए और बी: 10 माइक्रोग्राम एल1:पी18आई10 या एल1:टी20 वीएलपी इंट्रामस्क्युलर (आईएम) के साथ समजात प्राइम-बूस्ट टीकाकरण; समूह सी: 106 सीएफयू आरबीसीजी.एचआईवीए इंट्राडर्मली (आईडी) के साथ प्राइमिंग और 10 माइक्रोग्राम एल1:पी18आई10 वीएलपी आईएम के साथ बूस्टिंग; ग्रुप डी: गार्डासिल के साथ समजात प्राइम-बूस्ट टीकाकरण -9 जिसमें 10 माइक्रोग्राम एचपीवी16 एल1 वीएलपी आईएम; समूह ई: पीबीएस बफर के साथ दो बार टीकाकरण। प्राइम-बूस्ट अंतराल 2 सप्ताह था। इस परीक्षण का समापन बिंदु 28वें दिन था। एलिसा परीक्षण के लिए सेरा को 1:50 के अनुमापांक पर एकत्र और पतला किया गया था। (बी) नर और मादा चूहों में एचपीवी एल1-विशिष्ट आईजीजी। (सी-ई) एपिटोप-विशिष्ट आईजीजी एल1:पी18आई10 और एल1:टी20 वीएलपी द्वारा प्रेरित। जैसा कि ऊपर वर्णित है, अलग-अलग प्राइम-बूस्ट संयोजनों के बाद BALB/c चूहों द्वारा प्रेरित एंटी-एल1, एंटी-पी18आई10 और एंटी-टी20 आईजीजी का विश्लेषण करने के लिए एलिसा का प्रदर्शन किया गया था। डेटा को माध्य के रूप में दिखाया गया है ± एसडी समूहों के बीच अंतर की तुलना करने के लिए वन-वे एनोवा (नॉनपैरामीट्रिक) परीक्षण किया गया था। OD: ऑप्टिकल घनत्व। एनएस महत्वपूर्ण नहीं; ** पी <0.01

हमने मूल्यांकन किया कि क्या चूहों को L1: P18110 और L1: T20 VLPs से प्रतिरक्षित किया गया है, जो BALB/c चूहों में HPV -16 L 1- विशिष्ट और एचआईवी -1 एपिटोप-विशिष्ट एंटीबॉडी उत्पन्न कर सकते हैं। मुरीन सेरा में वीएलपी-प्रेरित आईजीजी एंटीबॉडी को क्रमशः पुनः संयोजक एचपीवी 16 एल 1 प्रोटीन, पी 18 आई 10, या टी 20 पेप्टाइड्स के साथ लेपित एलिसा द्वारा मापा गया था। पीबीएस नियंत्रण समूह (पी=0.0039) की तुलना में गार्डासिल -9 समूह में 1:50 के सीरम अनुमापांक पर एल 1- विशिष्ट आईजीजी में एक सांख्यिकीय अंतर पाया गया। गार्डासिल -9, एल1:पी18आई10, और एल1:टी20 वीएलपी-प्रतिरक्षित चूहों के बीच एंटी-एल1 प्रतिक्रियाएं समान थीं और महत्वपूर्ण रूप से भिन्न नहीं थीं (चित्रा 6सी)। BCG.HIVA2auxo.int prime और L1:P18I10 VLP बूस्ट चूहों में एंटी-L1 आईजीजी का स्तर बहुत कम पाया गया। इन परिणामों से पता चला कि एचपीवी: एचआईवी वीएलपी-प्रतिरक्षित चूहों ने गार्डासिल प्रतिरक्षित चूहों के समान ही एंटी-एल1 आईजीजी का उत्पादन किया (चित्र 6सी)। यद्यपि L1:P18I10 VLP समूह संख्यात्मक रूप से अन्य टीकाकरण समूहों की तुलना में P18I10 एपिटोप-विशिष्ट IgG के उच्च स्तर की ओर रुझान रखता है, ये अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं थे (चित्र 6D)। कुछ एल1:पी18आई10 वीएलपी-प्रतिरक्षित चूहों (8 में से 4, 50%) में, गार्डासिल प्रतिरक्षित चूहों की तुलना में उच्च एंटी-पी18आई10 बाइंडिंग एंटीबॉडीज देखी गईं। वैकल्पिक रूप से, एक टी-परीक्षण विश्लेषण से पता चला कि एल1:पी18आई10 वीएलपी और गार्डासिल-9 समूह के बीच अंतर महत्वपूर्ण था (पी=0.005) (डेटा नहीं दिखाया गया)। एल1:टी20 वीएलपी समूह में, गार्डासिल समूह (पी {{70%).0083) की तुलना में टी20 पेप्टाइड के खिलाफ काफी अधिक एंटीबॉडी प्रतिक्रिया पाई गई। जैसा कि अपेक्षित था, गार्डासिल -9, पीबीएस, एल1:पी18आई10 वीएलपी, और बीसीजी.एचआईवीए प्राइम में एल1:पी18आई10 वीएलपी बूस्ट ग्रुप (चित्र 6ई) के साथ संयुक्त एंटी-टी20 टाइटर्स का पता नहीं लगाया जा सका। टी20 पेप्टाइड-विशिष्ट एंटीबॉडी का अनुमापांक अपेक्षाकृत कम था। इसकी संभावना निम्न कारणों से है: (1) टी20 एक सबडोमिनेंट पेप्टाइड है; (2) एमपीईआर या 2एफ5 न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडीज के उत्सर्जन के लिए पेप्टाइड-लिपिड संयुग्मों की आवश्यकता होती है (चित्र 6ई)। कुल मिलाकर, हमारे परिणामों से पता चला कि L1:P18I10 और L1:T20 वीएलपी चूहों में एचपीवी 16- लेकिन कमजोर एचआईवी विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को प्रेरित कर सकते हैं।

Desert ginseng-Improve immunity (2)

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

चूहों में एचपीवी और एचआईवी-विशिष्ट टी-सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए, हमने चित्र 7ए में दिखाए गए टीकाकरण कार्यक्रम का पालन किया। इसके अलावा, विषम BCG.HIVA2auxo.int प्राइमिंग और L1:P18I10 VLPs बूस्टिंग की तुलना समजात L1:P18I10 VLP प्राइम और बूस्ट टीकाकरण से की गई ताकि विशिष्ट-HPV16 और HIV-1 टी-सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की आवृत्ति का मूल्यांकन किया जा सके। एचपीवी16 एल1 वीएलपी के साथ स्प्लेनोसाइट उत्तेजना के बाद आईएफएन-स्राव के संबंध में गार्डासिल और पीबीएस समूहों के बीच कोई अंतर नहीं था। L1:P18I10 VLP और गार्डासिल -9 समूहों के बीच L1- विशिष्ट IFN- स्राव में अंतर भी महत्वपूर्ण नहीं था। हमने निष्कर्ष निकाला कि कमजोर एल 1- विशिष्ट आईएफएन-स्राव को उत्तेजना के रूप में उपयोग किए जाने वाले एचपीवी16 एल1 वीएलपी की कम सांद्रता (2 माइक्रोग्राम/एमएल) के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। BCG.HIVA2auxo.int prime और L1:P18I10 VLP के समूह ने IFN-स्रावित स्प्लेनोसाइट्स की उच्च आवृत्ति को प्रेरित किया और IFN-स्राव में महत्वपूर्ण अंतर तब देखा गया जब इसकी तुलना गार्डासिल समूह (पी {{36) से टीका लगाए गए चूहों से की गई। }}.0103). 8 में से 3 चूहों (~38%) ने उच्चतम एल1- विशिष्ट आईएफएन-प्रतिक्रियाएं प्राप्त कीं (चित्र 7बी)। हमारे पिछले अध्ययनों [64-66] के अनुसार इसका श्रेय बीसीजी की अनिर्दिष्ट सहायकता को दिया जा सकता है। स्पष्ट प्राइमिंग प्रभाव, यहां तक ​​कि वाइल्डटाइप बीसीजी द्वारा भी, आरबीसीजी डेरिवेटिव की क्षमता के अनुरूप है जो बाद में बूस्टिंग टीकों के लिए शक्तिशाली सहायक के रूप में कार्य करता है [64,65]। एचआईवी विशिष्ट टी-सेल प्रतिक्रियाओं के संबंध में, आईएफएन-स्पॉट-फॉर्मिंग सेल्स (एसएफसी)/106 स्प्लेनोसाइट्स का उच्चतम कुल परिमाण गार्डासिल प्राप्त करने वाले चूहों की तुलना में बीसीजी.एचआईवीए2ऑक्सो.इंट प्राइमेड चूहों में देखा गया था। } टीके या L1:P18I10 वीएलपी। बीसीजी.एचआईवीए युक्त चूहों और एल1:पी18आई10 वीएलपी से संवर्धित चूहों ने एल1:पी18आई10 वीएलपी होमोलॉगस प्राइम-बूस्ट (पी {{66%).0268) से टीका लगाए गए चूहों की तुलना में काफी अधिक आईएफएन-स्राव प्राप्त किया। इसके अलावा, गार्डासिल टीके (पी {{73%).0157) (चित्र 7सी) प्राप्त करने वाले चूहों की तुलना में एल1:पी18आई10 वीएलपी का टीका लगाए गए चूहों में काफी अधिक आईएफएन-स्राव देखा गया। जैसा कि अपेक्षित था, आईएफएन-स्राव गार्डासिल -9 और पीबीएस समूहों में पता नहीं चल पाया था। इन परिणामों से पता चला कि (1) एल1:पी18आई10 वीएलपी ने एचआईवी -1-विशिष्ट टी-सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं प्राप्त कीं; (2) एल1:पी18आई10 वीएलपी ने एचपीवी-विशिष्ट टी-सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं प्राप्त कीं और (3) बीसीजी.एचआईवीए2ऑक्सो.इंट एल1:पी18आई10 वीएलपी द्वारा प्राप्त एचआईवी विशिष्ट टी-सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा दे सकता है।

Figure 7. Induction of HPV16 and HIV-1 specific T cell responses by chimeric L1:P8I10 VLPs and BCG.HIVA in BALB/c mice. The immunization schedule is depicted in (A). All mouse groups had equal gender distribution (male n = 4 and female n = 4). Group A: homologous prime-boost immunization with 10 µg L1:P18I10 VLPs intramuscularly (i.m.); Group B: priming with 106 cfu rBCG.HIVA intradermally (i.d.) and boosting with 10 µg L1:P18I10 VLPs i.m.; Group C: homologous prime-boost vaccination with Gardasil-9 containing 10 µg of HPV16 L1 VLPs i.m.; Group D: immunization twice with PBS buffer. The prime-boost interval was 2 weeks. The endpoint of this trial was on day 28. Splenocytes were isolated for IFN-γ ELISpot assay. T-cell immune responses to HPV16 and HIV-1 were assessed ex vivo by IFN-γ ELISpot after splenocyte stimulation with HPV16 L1 VLP and P18I10 peptide. (B, C) HPV16 L1- and HIV-1 P8I10-specific T-cell responses elicited by L1:P8I10 VLPs and BCG.HIVA prime combined with L1:P18I10 VLP boost. Data are shown as median ± S.D. A one-way ANOVA test was done to compare differences between groups. Ns not significant; * p < 0.05.


चित्र 7. BALB/c चूहों में काइमेरिक L1:P8I10 VLPs और BCG.HIVA द्वारा HPV16 और HIV-1 विशिष्ट T सेल प्रतिक्रियाओं का प्रेरण। टीकाकरण कार्यक्रम (ए) में दर्शाया गया है। सभी माउस समूहों में समान लिंग वितरण था (पुरुष एन=4 और महिला एन=4)। ग्रुप ए: 10 माइक्रोग्राम एल1:पी18आई10 वीएलपी इंट्रामस्क्युलर (आईएम) के साथ समजात प्राइम-बूस्ट टीकाकरण; समूह बी: 106 सीएफयू आरबीसीजी.एचआईवीए इंट्राडर्मली (आईडी) के साथ प्राइमिंग और 10 माइक्रोग्राम एल1:पी18आई10 वीएलपी आईएम के साथ बूस्टिंग; समूह सी: गार्डासिल के साथ समजात प्राइम-बूस्ट टीकाकरण -9 जिसमें 10 माइक्रोग्राम एचपीवी16 एल1 वीएलपी आईएम; ग्रुप डी: पीबीएस बफर के साथ दो बार टीकाकरण। प्राइम-बूस्ट अंतराल 2 सप्ताह था। इस परीक्षण का समापन बिंदु 28वें दिन था। स्प्लेनोसाइट्स को IFN- ELISpot परख के लिए अलग किया गया था। एचपीवी16 और एचआईवी के प्रति टी-सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन एचपीवी16 एल1 वीएलपी और पी18आई10 पेप्टाइड के साथ स्प्लेनोसाइट उत्तेजना के बाद आईएफएन-एलिसपॉट द्वारा किया गया था। (बी, सी) एचपीवी 16 एल {{36 }} और एचआईवी {{37 }} पी 8 आई {{39 }} विशिष्ट टी-सेल प्रतिक्रियाएं एल1:पी8आई10 वीएलपी और बीसीजी.एचआईवीए प्राइम द्वारा प्राप्त की गईं जो एल1:पी18आई10 वीएलपी बूस्ट के साथ संयुक्त हैं। डेटा को माध्यिका ± एसडी के रूप में दिखाया गया है समूहों के बीच अंतर की तुलना करने के लिए एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण किया गया था। एनएस महत्वपूर्ण नहीं; * पी <0.05.

4. डिसचर्चा

HPV16 और HIV-1 दोनों यौन संचारित रोग हैं और वर्तमान में कई वैक्सीन अध्ययनों का केंद्र बिंदु हैं। यद्यपि एचपीवी रोगनिरोधी टीकों का व्यावसायीकरण किया गया है और एंटी-रेट्रोवायरल उपचार (एआरटी) और पीआरईपी द्वारा एचआईवी संचरण को काफी हद तक नियंत्रित किया गया है, दोनों वायरस के खिलाफ एक प्रभावी, सुरक्षित और किफायती काइमेरिक एचपीवी: एचआईवी वैक्सीन की तत्काल आवश्यकता है। इस अध्ययन में, (1) हमने प्रदर्शित किया कि 293एफ अभिव्यक्ति प्रणाली और क्रोमैटोग्राफिक शुद्धि विधि काइमेरिक एल1:पी18आई10 और एल1:टी20 वीएलपी का उत्पादन और शुद्ध करने के लिए व्यवहार्य दृष्टिकोण हो सकते हैं; (2) हमने पुष्टि की कि एचपीवी16 एल1 कैप्सिड प्रोटीन के डीई लूप में पी18आई10 या टी20 पेप्टाइड्स के सम्मिलन से काइमेरिक एचपीवी: एचआईवी वीएलपी की इन विट्रो स्थिरता, स्व-संयोजन और आकृति विज्ञान पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा; (3) काइमेरिक एचपीवी के डीई लूप के संपर्क में आने वाले अनुक्रमिक और गठनात्मक पी18आई10 या टी20 पेप्टाइड्स: एचआईवी वीएलपी का पता एचआईवी-विरोधी जीपी120 वी3 और 2एफ5 इन विट्रो में निष्क्रिय एंटीबॉडी द्वारा लगाया जा सकता है; (4) काइमेरिक एल1:पी18आई10 और एल1:टी20 वीएलपी एचपीवी उत्पन्न कर सकते हैं लेकिन बीएएलबी/सी चूहों में कमजोर एचआईवी विशिष्ट बाइंडिंग एंटीबॉडीज उत्पन्न कर सकते हैं। इसके अलावा, एचपीवी16 एल1 प्रोटीन में एचआईवी पी18आई10 या टी20 पेप्टाइड्स के सम्मिलन ने विवो में एचपीवी16 एल{42}} विशिष्ट एंटीबॉडी प्रेरण को प्रभावित नहीं किया; (5) एल1:पी18आई10 वीएलपी एचपीवी16 और एचआईवी दोनों विशिष्ट टी-सेल प्रतिक्रियाओं को प्रेरित कर सकते हैं; (6) बीसीजी.एचआईवीए प्राइम और एल1:पी18आई10 वीएलपी बूस्ट ने बीएएलबी/सी चूहों में एल1:पी18आई10 वीएलपी होमोलॉगस प्राइम-बूस्ट की तुलना में आईएफएन-उत्पादक स्प्लेनोसाइट्स की उच्चतम परिमाण प्राप्त किया। इन निष्कर्षों ने आरबीसीजी और काइमेरिक एचपीवी: एचआईवी वीएलपी पर आधारित एचआईवी टीकों के आगे विकास का समर्थन किया। कुल मिलाकर, यह अध्ययन एक आधारभूत रणनीति प्रदान करता है जो एचपीवी और एचआईवी संक्रमण को नियंत्रित करने के लिए उपन्यास काइमेरिक वीएलपी-आधारित टीके विकसित करने के वैश्विक प्रयासों का समर्थन करने के लिए उपयुक्त हो सकता है।

इस अध्ययन में, L1:P18I10 और L1:T20 वीएलपी एचपीवी गार्डासिल -9 वैक्सीन के समान एंटी-एचपीवी16 एल1 बाइंडिंग एंटीबॉडी के समान स्तर को प्रेरित कर सकते हैं। हालाँकि, L1:P18I10 और L1:T20 वीएलपी केवल P18I10 और T20 एपिटोप-विशिष्ट एचआईवी-बाध्यकारी एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं के निम्न स्तर उत्पन्न करते हैं। हमने अनुमान लगाया कि यह एलिसा परख प्लेटों को क्रमशः पुनः संयोजक एचपीवी 16 एल1 प्रोटीन, एचआईवी {21 }} पी18आई10 पेप्टाइड, और एचआईवी 24 टी 20 पेप्टाइड के साथ लेपित होने के कारण हो सकता है। हमारे L1:P18I10 और L1:T20 VLPs से प्रेरित म्यूरिन एंटी-L1 एंटीबॉडी L1 प्रोटीन के कई बाइंडिंग एपिटोप्स को लक्षित कर सकते हैं। इसके विपरीत, हमारे L1:P18I10 और L1:T20 VLPs द्वारा प्राप्त म्यूरिन एंटी-एचआईवी -1 एंटीबॉडीज़ HPV: HIV VLPs पर केवल एक एचआईवी पेप्टाइड (P18I10 या T20) को लक्षित करते हैं। नतीजतन, एचआईवी-विरोधी बाइंडिंग एंटीबॉडीज का कुल अधिकतम OD450 मान एंटी-एचपीवी16 एल1 एंटीबॉडीज की तुलना में बहुत कम था।

एचआईवी इम्यूनोजेन के प्रारंभिक सम्मिलन क्षेत्र के रूप में हमने एचपीवी16 एल1 कैप्सिड प्रोटीन डीई लूप को चुनने का कारण पिछले अध्ययन को संदर्भित किया है जिसमें बोवाइन पैपिलोमावायरस (बीपीवी) के साथ चूहों को प्रतिरक्षित किया गया था: एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए एचआईवी वीएलपी [20]। यह ज्ञात है कि एचपीवी एल1 प्रमुख कैप्सिड प्रोटीन के सतह-उजागर डीई और एफजी लूप के भीतर स्थित एपिटोप्स वैक्सीन-प्रेरित क्रॉस-न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडीज में प्रमुख रूप से योगदान करते हैं [67]। इसके अलावा, यह पिछले अध्ययनों से पता चला है कि बीपीवी एल1 डीई लूप में एचआईवी -1 एमपीईआर का सम्मिलन आंशिक रूप से निष्क्रिय एंटीबॉडी को प्रेरित कर सकता है जो विशेष रूप से एचआईवी में एमपीईआर की मूल संरचना को पहचानते हैं -1 एनवी [20]। हालाँकि, कोई भी डेटा यह नहीं दिखाता है कि क्या पुनः संयोजक BPV L1:MPER VLP, BPV L1 प्रोटीन में एचआईवी -1 MPER के सम्मिलन के बाद BPV के विरुद्ध प्रतिरक्षाजन्यता और तटस्थता को प्रभावित करता है। एचआईवी एंटीजन डिलीवरी वेक्टर के रूप में एचपीवी16 एल1 वीएलपी का उपयोग करते हुए हमारे अध्ययन में, हमने देखा है कि एचआईवी -1 पेप्टाइड सम्मिलन ने एचपीवी एल1 संरचना को संशोधित नहीं किया है, और काइमेरिक एचपीवी: एचआईवी प्रोटीन अभी भी वीएलपी बनाने की क्षमता रखते हैं। इसके अलावा, हमने एचपीवी: एचआईवी वीएलपी उम्मीदवार (हमारा) और एक अनुमोदित वीएलपी-आधारित एचपीवी वैक्सीन (लाइसेंस प्राप्त गार्डासिल -9) के बीच तुलनीय प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रदर्शित करने के लिए इम्यूनोब्रिडिंग की अवधारणा को लागू किया। हमारे डेटा से पता चला है कि काइमेरिक एचपीवी में एचआईवी -1 पी18आई10 या टी20 पेप्टाइड का सम्मिलन: एचआईवी वीएलपी एचपीवी गार्डासिल की तुलना में एचपीवी 16 एल {{27} विशिष्ट बाइंडिंग एंटीबॉडी के समान अनुमापांक प्राप्त कर सकता है। टीका। लाइसेंस प्राप्त एचपीवी गार्डासिल वीएलपी वैक्सीन के साथ देखे गए प्रकार-विशिष्ट एंटी-एचपीवी 16 एल 1 बाइंडिंग एंटीबॉडीज की तुलना एचपीवी गार्डासिल वीएलपी वैक्सीन के काइमेरिक संस्करण से की गई। यह हमारे डेटा के अनुरूप था।

एचपीवी16 एल1 वीएलपी में शामिल इष्टतम एचआईवी -1 विदेशी एंटीजन की लंबाई और साइट और परिणामी काइमेरिक एचपीवी की इन विट्रो स्थिरता: एचआईवी वीएलपी को चूहों के टीकाकरण से पहले सत्यापित किया जाना चाहिए। हमारे वर्तमान अध्ययन से पता चला है कि एचपीवी16 एल1 प्रोटीन में पी18आई10 या टी20 पेप्टाइड्स के सम्मिलन से काइमेरिक एचपीवी: एचआईवी वीएलपी की इन विट्रो स्थिरता, स्व-संयोजन और आकृति विज्ञान पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। ये परिणाम पिछले अध्ययनों के अनुरूप थे जो दर्शाते हैं कि बीपीवी एल1 डीई लूप अनुक्रम में एचआईवी -1 एमपीईआर डोमेन के सम्मिलन से वीएलपी में बीपीवी एल1 कैप्सिड प्रोटीन के स्व-संयोजन की क्षमता पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है [20]। मूल रूप से, एचपीवी एल1 कैप्सिड प्रोटीन के सतह-उजागर डीई और एफजी लूप के भीतर स्थित एपिटोप्स एल1-विशिष्ट क्रॉस-न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडीज को प्रेरित करने में प्रमुख रूप से योगदान करते हैं [67]। यहां, हमने प्रदर्शित किया कि HPV16 L1 DE लूप में HIV-1 P18I10 या T20 पेप्टाइड्स के सम्मिलन से चूहों के टीकाकरण के बाद काइमेरिक HPV: HIV VLPs द्वारा L1- विशिष्ट एंटीबॉडी प्रेरण पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। इसके अलावा, काइमेरिक एचपीवी के एचपीवी16 डीई लूप पर एचआईवी -1 पी18आई10 या टी20 एपिटोप्स: एचआईवी वीएलपी इन विट्रो में पाए गए और विवो में इम्युनोजेनिक थे। एचपीवी16 एल1 वीएलपी रुचि के एचआईवी प्रसंग के सतही प्रदर्शन के लिए एक संभावित मंच का निर्माण करते हैं। इस अध्ययन में, हमने अपने काइमेरिक एचपीवी: एचआईवी वीएलपी की सतह पर प्रस्तुत गठनात्मक पी18आई10 और टी20 पेप्टाइड को प्रदर्शित करने के लिए अप्रत्यक्ष एलिसा का प्रदर्शन किया है। भविष्य में, एचपीवी: एचआईवी वीएलपी के भीतर पी18आई10 या टी20 एंटीजन संरचनात्मक स्थानीयकरण और संगठन को प्रदर्शित करने के लिए प्रतिरक्षा-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी एक अतिरिक्त दृष्टिकोण भी हो सकता है।

सेल्फ-असेंबली एचपीवी16 एल1 वीएलपी की इन विट्रो स्थिरता का एक प्रतिनिधि सूचकांक है। यह ज्ञात है कि पीएच, आयनिक शक्ति, तापमान [52], और रेडॉक्स वातावरण सभी एचपीवी16 एल1 कैप्सिड प्रोटीन [53] के डाइसल्फ़ाइड बांड से संबंधित हैं। पेपिलोमावायरस वीएलपी पर पहले के कार्यों ने एल1 प्रमुख कैप्सिड सेल्फ-असेंबली [68,69] के लिए डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड के महत्व का सुझाव दिया था। डाइसल्फ़ाइड गठन ने उचित ज्यामिति [53] में एल1 कैप्सिड प्रोटीन के उच्च सिस्टीन का संकेत दिया। ये डाइसल्फ़ाइड क्रॉस-लिंक अवशेष 175 और 428 (एचपीवी16 के लिए) को जोड़ते हैं जो एचपीवी विषाणुओं और वीएलपी को स्थिर करते हैं [70]। इस अध्ययन में, हमने अपने L1:P18I10 और L1:T20 कैप्सिड प्रोटीन को साबित करने के लिए अप्रत्यक्ष साक्ष्य के रूप में इंटरमॉलिक्युलर डाइसल्फ़ाइड क्रॉस-लिंकिंग पैटर्न का विश्लेषण किया, जो इन विट्रो में स्व-इकट्ठा होते हैं। चित्र 3ए में, हमने दिखाया कि शुद्ध एल1:पी18आई10 और एल1:टी20 वीएलपी समान पीएच, आयनिक शक्ति और थर्मल स्थितियों के तहत एचपीवी16 एल1 वीएलपी के समान अंतर-आणविक डाइसल्फ़ाइड क्रॉस-लिंकिंग पैटर्न प्रस्तुत करते हैं। चित्र 3बी में, हमने आगे दिखाया कि शुद्ध एल1:पी18आई10 और एल1:टी20 प्रोटीन इन विट्रो में बड़े कणों (एल1 पेंटामर मेगावाट 280 केडीए से बड़े) में स्वयं-संयोजन करने में सक्षम थे। इसलिए, चित्र 4 में देखे गए रूपात्मक स्व-संयोजन वीएलपी पैटर्न (हालांकि इकोसाहेड्रल संरचना काफी अच्छी नहीं थी) के साथ, हमने निष्कर्ष निकाला कि हमारा शुद्ध काइमेरिक एचपीवी: एचआईवी वीएलपी इन विट्रो में स्थिर है। वीएलपी स्थिरता के अलावा, कई अन्य महत्वपूर्ण कारक जो काइमेरिक एचपीवी की इम्युनोजेनेसिटी को प्रभावित कर सकते हैं: एचआईवी वीएलपी पर विचार किया जाना चाहिए, जैसे कि वीएलपी के विभिन्न लूपों के बीच इम्युनोजेन सम्मिलन साइट [71], खुराक, प्राइम-बूस्ट अंतराल और प्रशासन मार्ग [22] , वगैरह।

HIV-1 gp120 V3 लूप से प्राप्त P18I10 पेप्टाइड्स एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं में प्रमुख हिस्टोकम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स (MHC-I) वर्ग I अणुओं [26] द्वारा प्रस्तुत किए जाते हैं। सीडी8+, साइटोटॉक्सिक टी लिम्फोसाइट्स (सीटीएल), एमएचसी-आई-प्रतिबंधित पी18आई10 एंटीजन को पहचान सकता है और एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं को खत्म करने के लिए आईएफएन- जैसे विभिन्न प्रकार के साइटोकिन्स का स्राव कर सकता है [72-75]। पुनः संयोजक वायरल या प्लास्मिड डीएनए मेजबान कोशिकाओं में P18I10 पेप्टाइड्स को व्यक्त करने और MHC-I मार्ग [76-79] के माध्यम से P18I 10- विशिष्ट सेलुलर प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए अच्छे वैक्सीन वाहन हैं। उदाहरण के लिए, डीएनए प्राइम और संशोधित वैक्सीनिया वायरस अंकारा (एमवीए) बूस्ट का एक संयुक्त आहार पी18आई10 एपिटोप [79] के खिलाफ आईएफएन- और सीटीएल प्रतिक्रियाओं को शामिल करने के लिए पर्याप्त था। इसके विपरीत, बहिर्जात P18I10 पेप्टाइड्स को MHC-I मार्ग [80,81] द्वारा सीडी 8+ टी-कोशिकाओं के समक्ष कुशलता से प्रस्तुत नहीं किया जाता है और इसके लिए उपयुक्त सहायक [82-85] या एंटीजन वाहकों की भागीदारी की आवश्यकता होती है, जैसे कि वीएलपी. उदाहरण के लिए, टी-हेल्पर निर्धारकों [82-85] की अनुपस्थिति के कारण सहायक पदार्थों के साथ पूरक सिंथेटिक पी18आई10 पेप्टाइड्स की इम्युनोजेनेसिटी मामूली थी। यह पहले बताया गया है कि एचआईवी -1 गैग वीएलपी [86], हेपेटाइटिस बी सतह एंटीजन (एचबीएसएजी) वीएलपी [87], पार्वोवायरस वीपी2 वीएलपी [88], और पेपिलोमावायरस एल1 वीएलपी [17-19] विवो में एमएचसी-आई-प्रतिबंधित सीटीएल एपिटोप प्रस्तुति के लिए डिलीवरी वैक्टर के रूप में कार्य कर सकता है। यद्यपि वीएलपी-प्रेरित एमएचसी-आई-प्रतिबंधित टी-सेल प्रतिक्रियाओं का तंत्र अभी भी अस्पष्ट है, वीएलपी की कण संरचना मैक्रोफेज या डेंड्राइटिक कोशिकाओं के एंडोसाइटिक अवशोषण को लाभ पहुंचा सकती है, इस प्रकार साइटोसोल तक पहुंच सकती है और बाद में विशिष्ट एमएचसी-आई मार्ग में प्रवेश कर सकती है [89, 90]। इसके अलावा, MHC-I-प्रतिबंधित P18I10 निर्धारक को MHC-II मार्ग [91,92] के माध्यम से सीडी 4+ सहायक टी-सेल प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए देखा गया। हाइब्रिड BPV1 L1 VLP का उपयोग MHC-I और MHC-II पथों [17,19] के माध्यम से चिकित्सीय वायरस-विशिष्ट CTL प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करने के लिए एंटीजेनिक एपिटोप वाहक के रूप में किया जा सकता है, जो वायरल संक्रमण को नियंत्रित करने के लिए वैक्सीन डिजाइन के लिए एक आशाजनक रणनीति प्रदान करता है। कुछ शुरुआती अध्ययनों से यह भी पता चला है कि बीपीवी एल1 वीएलपी एचपीवी16 ई7 एपिटोप या एचआईवी के पी18आई10 एपिटोप को व्यक्त करता है। पिछले अध्ययनों के अनुरूप, हमने प्रारंभिक रूप से प्रदर्शित किया है कि हमारे काइमेरिक एचपीवी: एचआईवी (एल1:पी18आई10) वीएलपी पी18आई10 पेप्टाइड के साथ स्प्लेनोसाइट उत्तेजना के बाद बीएएलबी/सी चूहों में एचआईवी-विशिष्ट टी-सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित कर सकते हैं। इसके अलावा, बीसीजी.एचआईवीए प्राइमिंग ने चूहों में एचआईवी विशिष्ट टी-सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को बढ़ाया। हालाँकि, L1:P18I10 वीएलपी द्वारा प्रेरित बहुक्रियाशील टी-सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को आगे प्रतिरक्षाविज्ञानी अध्ययन की आवश्यकता होगी।

एकाधिक संरक्षित सीटीएल एपिटोप्स के खिलाफ व्यापक सीडी 8+ टी-सेल प्रतिक्रियाएं एचआईवी -1 आनुवंशिक विविधता पर काबू पाने और [7,93-100] से बचने के लिए फायदेमंद हैं। एचआईवी के तर्कसंगत डिज़ाइन में टी-सेल इम्युनोजेन, जैसे कि एचआईवी, में कई सीटीएल एपिटोप्स पर प्रतिक्रिया करने की क्षमता होनी चाहिए [34]। डॉ. टॉमस हैंके द्वारा डिज़ाइन किया गया एचआईवी -1 एचआईवी इम्युनोजेन, सी-टर्मिनस [34] पर पी18आई10 एपिटोप्स सहित कई सीटीएल एपिटोप्स के साथ संयुक्त पूर्ण-लंबाई एचआईवी -1 गैग प्रोटीन से बना है। डीएनए, एमवीए और आरबीसीजी को एचआईवीए इम्युनोजेन डिलीवरी वाहनों के रूप में चुना गया था और माउस और गैर-मानव प्राइमेट (एनएचपी) मॉडल [34,101] में विषम प्राइम-बूस्ट शासनों का उपयोग करके सीटीएल एपिटोप-विशिष्ट सेलुलर प्रतिक्रियाओं की उच्च परिमाण और चौड़ाई को प्रेरित किया गया था। हमारे पूर्व अध्ययनों से पता चला है कि MVA.HIVA के साथ संयोजन में BCG.HIVA प्राइम ने BALB/c चूहों [31-33,102] में एचआईवी -1- विशिष्ट IFN-उत्पादक सीडी 8+ टी-कोशिकाओं को बढ़ावा दिया है। दिलचस्प बात यह है कि वीएलपी आरबीसीजी [29,30] या डीएनए टीके [103,104] के साथ विषम टीकाकरण में एचआईवी-विशिष्ट सेलुलर प्रतिक्रियाओं को बढ़ाने के लिए एक संभावित बूस्टर हो सकता है। उदाहरण के लिए, एचआईवी को व्यक्त करने वाला आरबीसीजी गैग प्रोटीन एनएचपी मॉडल [29,30] में गैग वीएलपी के साथ बढ़ावा देने के लिए टी-सेल प्रतिरक्षा प्रणाली को प्रभावी ढंग से तैयार कर सकता है। वर्तमान अध्ययन में, हमने दिखाया है कि बीसीजी.एचआईवीए प्राइमिंग एचपीवी: एचआईवी (एल1:पी18आई10) वीएलपी द्वारा प्रेरित टी-सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा दे सकता है। हम आगे इस आरबीसीजी प्राइम और वीएलपी बूस्ट शासन द्वारा उत्पन्न पॉलीफ़ंक्शनल सीडी 4+, सीडी 8+ और मेमोरी टी-सेल प्रतिक्रियाओं के परिमाण की जांच करेंगे।

Cistanche deserticola-improve immunity -

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा-प्रतिरक्षा प्रणाली में सुधार

वर्तमान में, हमारा अनुसंधान समूह आशाजनक आरबीसीजी के विकास पर ध्यान केंद्रित कर रहा है: एचआईवी टीके जो उपन्यास एचआईवी को व्यक्त करते हैं -1 टी-सेल इम्युनोजेन, जैसे कि tHIVconsvX और HIVACAT (HTI) टी-सेल इम्युनोजेन, एचआईवी को बेहतर बनाने के लिए। वैरिएंट मिलान और टी-सेल प्रतिक्रिया चौड़ाई। दूसरी पीढ़ी के HIVconsvX इम्युनोजेन को समूह एम संरक्षित क्षेत्रों को फिर से परिभाषित करके और वैश्विक वेरिएंट के साथ वैक्सीन में संभावित 9-मेर ​​टी-सेल एपिटोप्स के मैच को अधिकतम करने के लिए एक द्विसंयोजक मोज़ेक डिजाइन का उपयोग करके डिजाइन किया गया था [64]। एचटीआई इम्युनोजेन को टी-सेल लक्ष्यों को कवर करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जिसके विरुद्ध टी-सेल प्रतिक्रियाएं मुख्य रूप से एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों में देखी जाती हैं, जिनमें कम एचआईवी -1 वायरल लोड होता है [65,66]। क्योंकि पैपिलोमा वीएलपी कई सीटीएल एपिटोप वाहक साबित हुए हैं [17], हमारा लक्ष्य व्यापक रूप से प्रेरित करने के लिए आरबीसीजी व्यक्त थिवकॉन्सवीएक्स या एचटीआई टी-सेल इम्युनोजेन के साथ संयोजन में कई संरक्षित एचआईवी ले जाने वाले काइमेरिक एचपीवी16 एल1 वीएलपी का निर्माण करना है। एचआईवी के विरुद्ध सीटीएल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएँ-1। काइमेरिक एचपीवी पर प्रस्तुत एचआईवी -1 सीटीएल एपिटोप की उच्च घनत्व और कई प्रतियां: एचआईवी वीएलपी प्रतिरक्षा प्रणाली में एंटीजन वितरण में सुधार कर सकती हैं और सीटीएल प्रतिक्रियाओं की उच्च आवृत्ति को प्रेरित कर सकती हैं। इसके विपरीत, विवो में धीमी प्रतिकृति के कारण पुनः संयोजक बीसीजी सीटीएल प्रतिक्रियाओं की कम आवृत्ति उत्पन्न करने की अधिक संभावना है। क्योंकि बीसीजी का टी कोशिकाओं के विभेदन पर एक विशिष्ट प्रभाव होता है, जिसका अर्थ है कि बीसीजी सीडी 8+ टी-कोशिकाओं की भागीदारी के माध्यम से सीडी-सहायक कोशिकाओं [105] की स्मृति को प्रेरित कर सकता है, यह प्रतिरक्षाजन्य गुण है। बीसीजी को विषम प्राइम-बूस्ट रेजिमेंस में प्राइमिंग एजेंट के रूप में उपयुक्त बना सकता है। इस प्रकार, हमें उम्मीद थी कि हमारे एचपीवी: एचआईवी वीएलपी एचआईवी के परिमाण और चौड़ाई को बढ़ाने के लिए एक आशाजनक बूस्टर साबित हो सकते हैं। .

T20 पेप्टाइड में अत्यधिक संरक्षित रैखिक एपिटोप 2F5 (ELDKWA) होता है। लंबे समय तक एचआईवी संक्रमित रोगियों से एकत्र किए गए 2F5 एंटीबॉडी में मोटे तौर पर प्रभावकारिता को निष्क्रिय करने की सूचना दी गई थी [106,107]। जीपी41 के एमपीईआर को खराब इम्युनोजेनिक माना जाता है, शायद यह सेलुलर और वायरल फॉस्फोलिपिड बाईलेयर के करीब इसके स्थान से संबंधित है [108]। लिपिड वातावरण में एमपीईआर पेश करने वाले डीएनए वैक्टर का उपयोग जीपी 41- विशिष्ट एनएबीएस [109-111] को प्रेरित करने के लिए फायदेमंद है। उदाहरण के लिए, डॉ. ब्रिटा वॉरेन द्वारा डिज़ाइन किए गए एचआईवी -1 टी 20- एन्कोडिंग डीएनए टीके, क्रॉस-क्लैड न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी (एनएबी) प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए प्रदर्शित किए गए हैं [109]। इसके विपरीत, पेप्टाइड या सबयूनिट वैक्सीन रणनीतियों का उपयोग करके जीपी41 को लक्षित करने वाले एनएबीएस को प्रेरित करने के कई शुरुआती प्रयास विफल रहे हैं [112-116]। हाल ही में, कुछ अध्ययनों से पता चला है कि बीपीवी एल1 वीएलपी जो 2एफ5 एपिटोप या एचआईवी के एमपीईआर को व्यक्त करते हैं -1 जीपी41 प्रेरित 2एफ{27}} चूहों में विशिष्ट एंटीबॉडी के परिणामस्वरूप क्रॉस-क्लैड न्यूट्रलाइजेशन हुआ [20,21]। एक समान इम्युनोजेनेसिटी पैटर्न तब पाया गया जब हेपेटाइटिस बी सतह एंटीजन (एचबीएसएजी) को एचआईवी -1 2एफ5 एपिटोप या एमपीईआर [59,117-119] के साथ जोड़ा गया था। यहां, हमने दिखाया कि हमारे काइमेरिक एचपीवी16 एल1 वीएलपी में एचआईवी टी20 और पी18आई10 पेप्टाइड की प्रस्तुति एचआईवी और एचपीवी16 के खिलाफ एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को प्रेरित कर सकती है। एचआईवी कार्यात्मक स्पाइक्स या वीएलपी जैसे गठनात्मक मचान पर स्थिर किए गए एपिटोप्स को निष्क्रिय करना, व्यापक तटस्थ एंटीबॉडी (बीएनएबीएस) प्राप्त करने के लिए बी-सेल इम्युनोजेन डिजाइन की मुख्यधारा हो सकता है [93]। हालाँकि, अधिकांश नवीन बीएनएबी एपिटोप्स (लगभग 90%) गैर-निरंतर और गठित क्षेत्र हैं जिन्हें 3-आयामी विन्यास [120] में एक साथ लाया गया है। यद्यपि एक प्रोटीन मचान पर असंतत एपिटोप्स की प्रस्तुति की भविष्यवाणी कम्प्यूटेशनल मॉडलिंग [121] द्वारा की जा सकती है, इन बीएनएबी एपिटोप्स को एक गैर-लिफाफा एचपीवी16 एल1 प्रोटीन मचान में एम्बेड करने के लिए चुनौती दी जा सकती है। इसके विपरीत, एचआईवी के अल्पसंख्यक बी-सेल इम्युनोजेन्स, जैसे एचआईवी के एमपीईआर (2एफ5) जीपी41 या जीपी120 के वी3 लूप (पी18आईआईबी) में रैखिक तटस्थ एपिटोप्स होते हैं और इसके लिए उपयुक्त हो सकते हैं। एचपीवी: एचआईवी प्रोटीन रीढ़ की हड्डी। इसलिए, हमने रैखिक 2F5 न्यूट्रलाइज़िंग एपिटोप का चयन किया है जो -हेलिक्स गठन [122] के लिए अनुकूल संरचना के संदर्भ में एचआईवी -1 एमपीईआर के विस्तारित टी20 पेप्टाइड में शामिल है। यदि 2F5 एपिटोप का मूल विन्यास प्रस्तुत किया जा सकता है, तो टी20 पेप्टाइड्स को एल1 कैप्सिड मचान पर संलयन और स्थिर किया जा सकता है ताकि एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को निष्क्रिय किया जा सके। इस अध्ययन में, हमने पाया कि 2F5 nAbs इन विट्रो में काइमेरिक एचपीवी: एचआईवी (एल1:टी20) वीएलपी से बंधे थे। इसके अलावा, L1:T20 VLPs BALB/c चूहों में T20-विशिष्ट बाइंडिंग एंटीबॉडीज़ को भी प्रेरित कर सकते हैं। इस बात के प्रमाण बढ़ रहे हैं कि एचआईवी -1 फ्यूजन इनहिबिटरी (टी20) पेप्टाइड-प्रेरित एंटीबॉडी में एचआईवी-विरोधी फ्यूजन पेप्टाइड एनफ्यूवर्टाइड के समान गुण होते हैं, जो जीपी41 के एमपीईआर में स्थित हाइड्रोफोबिक ट्रांस-मेम्ब्रेन टी20 अवशेषों को बांधते हैं। एचआईवी-1 संलयन और वायरल नियंत्रण में योगदान [109,123,124]। हमारी पिछली समीक्षाओं के अनुसार, एचपीवी और एचआईवी-विशिष्ट न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी और सीटीएल प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए काइमेरिक वीएलपी-आधारित टीकों के तर्कसंगत डिजाइन पर हमेशा इम्यूनोजेन चयन, एंटीजन डिलीवरी वैक्टर और प्राइम-बूस्ट शासन के संदर्भ में विचार करने की आवश्यकता होगी। निष्कर्ष में, इस अध्ययन ने काइमेरिक एचपीवी: एचआईवी वीएलपी को इंजीनियर करने के लिए एक वैकल्पिक स्तनधारी कोशिका-आधारित अभिव्यक्ति मंच और एक स्केलेबल क्रोमैटोग्राफिक शुद्धि विधि दिखाई है। हम मानते हैं कि हमारी नई शुद्धिकरण विधियां औद्योगिक उत्पादन की क्षमता में वृद्धि करते हुए समय, लागत और श्रम को कम करने के लक्ष्य के साथ स्तनधारी कोशिकाओं से एंटीजेनिक एचपीवी: एचआईवी वीएलपी को पुनर्प्राप्त करने में सहायता करेंगी। इसके अतिरिक्त, हमने दिखाया कि एचपीवी 16 एल 1 वीएलपी एक के रूप में काम कर सकते हैं। एचआईवी को ले जाने के लिए डिलीवरी प्लेटफ़ॉर्म -1 पेप्टाइड एंटीजन क्योंकि एचपीवी16 एल1 कैप्सिड प्रोटीन के डीई लूप में पी18आई10 या टी20 पेप्टाइड्स के सम्मिलन ने काइमेरिक एचपीवी की इन विट्रो स्थिरता, स्व-संयोजन और आकृति विज्ञान को प्रभावित नहीं किया: एचआईवी वीएलपी और किया एचपीवी16 एल1-विवो में विशिष्ट एंटीबॉडी प्रेरण में हस्तक्षेप न करें। दूसरी ओर, काइमेरिक एचपीवी: एचआईवी वीएलपी दोनों वायरस के खिलाफ एचपीवी16 और एचआईवी-विशिष्ट बी और टी-सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्राप्त कर सकते हैं। इस रिपोर्ट में एचआईवी व्यक्त करने वाले पुनः संयोजक बीसीजी इम्युनोजेन और एचपीवी: एचआईवी वीएलपी के आधार पर एचआईवी टीके विकसित करने की संभावना का पता लगाया गया है, जिसका उपयोग बचपन के एचआईवी टीकाकरण के लिए किया जा सकता है। चूंकि एचपीवी16 और एचआईवी के खिलाफ एक प्रभावी काइमेरिक वैक्सीन का विकास अभी भी एक चुनौती है, इसलिए यह काम नए काइमेरिक एचपीवी के विकास की दिशा में एक कदम है: एचपीवी16 और एचआईवी को नियंत्रित करने के लिए एचआईवी वीएलपी-आधारित वैक्सीन प्लेटफॉर्म। }} संक्रमण, जिसकी विकासशील और औद्योगिक देशों में तत्काल आवश्यकता है।

संदर्भ

1. यूएनएड्स वैश्विक एचआईवी और एड्स सांख्यिकी -2018 तथ्य पत्रक। 2019. ऑनलाइन उपलब्ध: http://www.unaids.org/en/resources/fact शीट (15 जून 2020 को एक्सेस किया गया)।

2. बैटन, जेएम एचआईवी के लिए तैयारी: साक्ष्य के लिए ग्रेड ए लेकिन प्रभाव के लिए लंबित। नेट. आदरणीय उरोल। 2019, 16, 570-571। [क्रॉसरेफ]

3. रर्क्स-नगार्म, एस.; पिटिसुटिथम, पी.; नितायफन, एस.; केवकुंगवाल, जे.; चिउ, जे.; पेरिस, आर.; प्रेमश्री, एन.; नामवत, सी.; डी सूजा, एम.; एडम्स, ई.; और अन्य। थाईलैंड में एचआईवी संक्रमण को रोकने के लिए एएलवीएसी और एड्सवैक्स के साथ टीकाकरण। एन. इंजी. जे मेड. 2009, 361, 2209-2220। [क्रॉसरेफ]

4. न्गुनी, टी.; चसारा, सी.; एनधलोवु, जेडएम एचआईवी वैक्सीन विकास में प्रमुख वैज्ञानिक बाधाएँ: ऐतिहासिक परिप्रेक्ष्य और भविष्य की दिशाएँ। सामने। इम्यूनोल. 2020, 11, 590780। [क्रॉसरेफ]

5. रॉबिन्सन, एचएल एचआईवी/एड्स टीके: 2018. क्लिन। फार्माकोल. वहाँ. 2018, 104, 1062-1073। [क्रॉसरेफ]

6. वांग, क्यू.; झांग, एल. एचआईवी संक्रमण के खिलाफ व्यापक रूप से निष्क्रिय एंटीबॉडी और वैक्सीन डिजाइन। सामने। मेड. 2020, 14, 30-42। [क्रॉसरेफ]

7. कोलिन्स, डीआर; गैहा, जीडी; वॉकर, बीडी सीडी8+ एचआईवी नियंत्रण, इलाज और रोकथाम में टी कोशिकाएं। नेट. रेव. इम्यूनोल. 2020, 20, 471-482। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

8. पोलार्ड, ए.जे.; बिज्कर, ईएम ए गाइड टू वैक्सीनोलॉजी: बुनियादी सिद्धांतों से लेकर नए विकास तक। नेट. रेव. इम्यूनोल. 2021, 21, 83-100। [क्रॉसरेफ]

9. एचआईवी वैक्सीन विकसित करने के प्रयासों से सामान्य वैक्सीनोलॉजी अनुसंधान के लिए शापिरो, एसजेड पाठ। वैक्सीन 2019, 37, 3400-3408। [क्रॉसरेफ]

10. अहमद, एचजी; बेन्सुमाइडिया, एसएच; अलशम्मारी, एफडी; एलेनाज़ी, एफएसएच; अलमुतलक, बीए; अल्तुर्कस्तानी, एमजेड; अलादानी, आईए सर्वाइकल कैंसर से पीड़ित यमनी रोगियों में मानव पैपिलोमावायरस उपप्रकार 16 और 18 की व्यापकता। एशियाई प्रशांत जे. कैंसर पिछला. 2017, 18, 1543-1548। [क्रॉसरेफ]

11. ओल्सेसी, वीए; चेन, वाई.; श्लेगल, आर.; युआन, एच. एक प्रकार-विशिष्ट, गठनात्मक एपिटोप के निर्माण में एचपीवी16 एल1 लूप डोमेन की विशेषता। बीएमसी माइक्रोबायोल। 2004, 4, 29. [क्रॉसरेफ]

12. डुपुय, सी.; बुज़ोनी-गेट, डी.; टौज़े, ए.; ले कैन, पी.; बाउट, डी.; कौरसागेट, पी. एचपीवी 16 एल1 वायरस जैसे कणों द्वारा चूहों में प्रेरित कोशिका-मध्यस्थ प्रतिरक्षा। सूक्ष्म जीव। पाथोग. 1997, 22, 219-225। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

13. शिलर, जे.; लोवी, डी. एचपीवी रोगनिरोधी टीकों की उच्च क्षमता के लिए स्पष्टीकरण। वैक्सीन 2018, 36, 4768-4773। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

14. मार्कोविट्ज़, एलई; शिलर, जेटी ह्यूमन पैपिलोमावायरस टीके। जे. संक्रमित. डिस. 2021, 224, एस367-एस378। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

15. चेन, सीडब्ल्यू; सौबी, एन.; जोसफ़-मुन्ने, जे. वायरस जैसे कण-आधारित एचआईवी -1 टीकों की डिज़ाइन अवधारणाएँ। सामने। इम्यूनोल. 2020, 11, 573157। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

16. ईटो, वाई.; सौबी, एन.; फेरर, पी.; जोसेफ, जे. मानव पेपिलोमावायरस और एचआईवी के लिए काइमेरिक वायरस जैसे कण-आधारित टीके डिजाइन करना: सीखे गए सबक। एड्स रेव. 2019, 21, 218-232। [क्रॉसरेफ]

17. लियू, डब्ल्यूजे; लियू, एक्सएस; झाओ, केएन; लेगट, जीआर; एकाधिक साइटोटॉक्सिक टी सेल एपिटोप्स की डिलीवरी के लिए फ्रेज़र, आईएच पैपिलोमावायरस वायरस जैसे कण। वायरोलॉजी 2000, 273, 374-382। [क्रॉसरेफ]

18. लियू, एक्सएस; अब्दुल-जब्बार, आई.; क्यूई, वाईएम; फ़्रेज़र, आईएच; झोउ, जे. पेपिलोमावायरस वायरस जैसे कणों के साथ म्यूकोसल टीकाकरण चूहों में प्रणालीगत और म्यूकोसल प्रतिरक्षा उत्पन्न करता है। वायरोलॉजी 1998, 252, 39-45। [क्रॉसरेफ]

19. पेंग, एस.; फ़्रेज़र, आईएच; फर्नांडो, जीजे; झोउ, जे. पैपिलोमावायरस वायरस जैसे कण एमएचसी वर्ग I मार्ग में परिभाषित सीटीएल एपिटोप्स प्रदान कर सकते हैं। वायरोलॉजी 1998, 240, 147-157। [क्रॉसरेफ]

20. झाई, वाई.; झोंग, ज़ेड.; ज़रीफर्ड, एम.; भाला, जीटी; क़ियाओ, एल. बोवाइन पेपिलोमावायरस जैसे कण एचआईवी के झिल्ली-समीपस्थ बाहरी क्षेत्र से संरक्षित एपिटोप पेश करते हैं -1 जीपी41 प्रेरित म्यूकोसल और प्रणालीगत एंटीबॉडी। वैक्सीन 2013, 31, 5422-5429। [क्रॉसरेफ]

21. झांग, एच.; हुआंग, वाई.; फयाद, आर.; भाला, जीटी; क़ियाओ, एल. बोवाइन पैपिलोमावायरस-एचआईवी-1 जीपी41 काइमेरिक वायरस जैसे कणों के साथ मौखिक टीकाकरण द्वारा मानव इम्युनोडेफिशिएंसी वायरस टाइप 1 (एचआईवी-1) के खिलाफ म्यूकोसल और सिस्टमिक न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडीज का प्रेरण। जे. विरोल. 2004, 78, 8342-8348। [क्रॉसरेफ]

22. जिओ, एसएल; वेन, जेएल; कोंग, एनजेड; यू, एचएल; लेगट, जी.; फ्रेज़र, आईएच काइमेरिक बीपीवी1 वीएलपी के प्रशासन का मार्ग प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के चरित्र को निर्धारित करता है। इम्यूनोल. सेल बायोल. 2002, 80, 21-29. [क्रॉसरेफ]

23. किर्नबाउर, आर.; ताउब, जेनेट; ग्रीनस्टोन, हीदर; रॉडेन, रिचर्ड; डर्स्ट, एम.; गिस्मान, एल.; लोवी, डीआर; शिलर, जेटी ने ह्यूमन पैपिलोमावायरस टाइप 16 एलआई और एल1-एल2 का वायरस जैसे कणों में कुशल स्व-संयोजन किया। जे. विरोल. 1993, 67, 6929-6936। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

24. झाओ, क्यू.; पॉटर, सीएस; कैराघेर, बी.; लैंडर, जी.; स्वोरेन, जे.; टाउने, वी.; अब्राहम, डी.; डंकन, पी.; वॉशबॉघ, मेगावाट; सिट्रिन, आरडी क्रायो ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा GARDASIL® में वायरस जैसे कणों का लक्षण वर्णन। गुंजन। टीके इम्यूनोदर। 2014, 10, 734-739। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

25. अचौर, ए.; लेम्हामेडी, एस.; पिकार्ड, ओ.; म'बिका, जेपी; ज़ागुरी, जेएफ; मौक्रिम, ज़ेड.; विलर, ए.; बेक्स, एफ.; बर्नी, ए.; ज़ागुरी, डी. एचआईवी के लिए विशिष्ट साइटोटॉक्सिक टी लिम्फोसाइट्स -1 जीपी160 एंटीजन और एचएलए-ए 11- प्रतिरक्षित व्यक्ति में सिंथेटिक पी18IIIबी पेप्टाइड। एड्स रेस. गुंजन। रेट्रोवायरस 1994, 10, 19-25। [क्रॉसरेफ]

26. नाकागावा, वाई.; किकुची, एच.; ताकाहाशी, एच. एकल डी-अमीनो एसिड प्रतिस्थापन के साथ पी18-आई10-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स का उपयोग करके टीसीआर और पेप्टाइड/एमएचसी इंटरैक्शन का आणविक विश्लेषण। बायोफिज़। जे. 2007, 92, 2570-2582। [क्रॉसरेफ]

27. किउ, जेड.; चोंग, एच.; याओ, एक्स.; सु, वाई.; कुई, एस.; वह, वाई. एचआईवी के एन-ट्रिमर पर एक सबपॉकेट की पहचान और लक्षण वर्णन -1 जीपी41: वायरल प्रवेश और दवा लक्ष्य के लिए निहितार्थ। एड्स 2015, 29, 1015-1024। [क्रॉसरेफ]

28. पीटर्स, बीएस; चिंग्सोंग-पोपोव, आर.; कैलो, डी.; फॉक्सॉल, आर.; पटौ, जी.; हॉजकिन, के.; वेबर, जेएन स्पर्शोन्मुख एचआईवी सेरोपॉजिटिव विषयों में एचआईवी पी17/पी24:वीएलपी (पी24-वीएलपी) की सुरक्षा और प्रतिरक्षात्मकता का एक पायलट चरण II अध्ययन। जे. संक्रमित. 1997, 35, 231-235। [क्रॉसरेफ]

29. चेगे, जीके; बर्गर, WA; स्टुट्ज़, एच.; मेयर्स, एई; चैपमैन, आर.; किरावु, ए.; बंजुन, आर.; शेफर्ड, ईजी; जैकब्स, डब्ल्यूआर; रयबिकी, ईपी; और अन्य। एक गैर-मानव प्राइमेट मॉडल में ऑक्सोट्रोफिक माइकोबैक्टीरियम बोविस बीसीजी-वीएलपी प्राइम-बूस्ट एचआईवी वैक्सीन उम्मीदवार के लिए मजबूत प्रतिरक्षा। जे. विरोल. 2013, 87, 5151-5160। [क्रॉसरेफ]

30. चेगे, जीके; थॉमस, आर.; शेफर्ड, ईजी; मेयर्स, ए.; बॉर्न, डब्ल्यू.; विलियमसन, सी.; मैकलीन, जे.; ग्रे, सीएम; रयबिकी, ईपी; विलियमसन, एएल एचआईवी टाइप 1 उपप्रकार सी पर आधारित पुनः संयोजक बीसीजी और पीआर55गैग वायरस जैसे कण टीकों का उपयोग करके एक प्राइम-बूस्ट टीकाकरण आहार बबून में गैग-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं को सफलतापूर्वक प्राप्त करता है। वैक्सीन 2009, 27, 4857-4866। [क्रॉसरेफ]

31. जोसेफ, जे.; सौबी, एन.; मैं, ईजे; फर्नांडीज-लोरिस, आर.; गिल, ओ.; कार्डोना, पीजे; गैटेल, जेएम; हैंके, टी. नवजात चूहों का बीसीजी.एचआईवीए के साथ टीकाकरण 222 + एमवीए.एचआईवीए एचआईवी {{3} विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को बढ़ाता है: उम्र और टीकाकरण मार्गों का प्रभाव। क्लिन. देव. इम्यूनोल. 2011, 2011, 516219. [क्रॉसरेफ]

32. सौबी, एन.; गिया-मैलोरक्वी, ई.; फेरर, पी.; हर्टाडो, सी.; सांचेज़-उबेडा, एस.; ईटो, वाई.; गैटेल, जेएम; हैंके, टी.; जोसेफ, जे. बीसीजी के लाइसिन ऑक्सोट्रॉफ़ द्वारा संचालित एचआईवी-टीबी बाल चिकित्सा वैक्सीन के लिए इंजीनियरिंग नई माइकोबैक्टीरियल वैक्सीन डिज़ाइन। मोल. वहाँ. तरीके क्लिन. देव. 2014, 1, 14017. [क्रॉसरेफ]

33. महंत, ए.; सौबी, एन.; ईटो, वाई.; गिटार्ट, एन.; गैटेल, जेएम; हैंके, टी.; जोसेफ, जे. एचआईवी-टीबी बाल चिकित्सा वैक्सीन के लिए BCG.HIVA2auxo.int का प्रीक्लिनिकल विकास, एक एकीकृत अभिव्यक्ति वेक्टर का उपयोग करना। स्थिरता और विशिष्ट एचआईवी -1 टी-सेल प्रतिरक्षा में वृद्धि। गुंजन। टीके इम्यूनोदर। 2017, 13, 1798-1810। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

34. हैंके, टी.; मैकमाइकल, ए.जे. केन्या में एक साल के क्लिनिकल परीक्षण के लिए प्रायोगिक एचआईवी -1 वैक्सीन का डिजाइन और निर्माण। नेट. मेड. 2000, 6, 951-955। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

35. ड्यूरोचर, वाई.; पेरेट, एस.; कामेन, ए. निलंबन-बढ़ती मानव 293-ईबीएनए1 कोशिकाओं के क्षणिक अभिकर्मक द्वारा उच्च-स्तरीय और उच्च-थ्रूपुट पुनः संयोजक प्रोटीन उत्पादन। न्यूक्लिक एसिड रेस. 2002, 30, ई9. [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

36. किम, एचजे; किम, एसवाई; लिम, एसजे; किम, जेवाई; ली, एसजे; किम, एचजे सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया से मानव पैपिलोमावायरस प्रकार 16 एल1 प्रोटीन का एक-चरण क्रोमैटोग्राफिक शुद्धिकरण। प्रोटीन एक्सप्र. शुद्धि. 2010, 70, 68-74. [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

37. ईटो, वाई.; सौबी, एन.; फेरर, पी.; जोसेफ-मुन्ने, जे. पिचिया पास्टोरिस में काइमेरिक एचपीवी-एचआईवी प्रोटीन एल1पी18 की अभिव्यक्ति; वायरस जैसे कणों की शुद्धि और लक्षण वर्णन। फार्मास्यूटिक्स 2021, 13, 1967। [क्रॉसरेफ]

38. जीई. मानव पैपिलोमा वायरस जैसे कणों के शुद्धिकरण में CaptoTM Core 700 और Capto Q ImpRes का उपयोग। जे. एशिया का फार्म. बायोफार्मा। इंडस्ट्रीज़ 2014, 1-4।

39. मैकलीन, सीएस; चर्चर, एमजे; मीन्के, जे.; स्मिथ, जीएल; हिगिंस, जी.; स्टेनली, एम.; मिंसन, एसी पुनः संयोजक वैक्सीनिया वायरस का उपयोग करके मानव पैपिलोमावायरस प्रकार 16 के लिए एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उत्पादन और लक्षण वर्णन। जे. क्लिन. पैथोल. 1990, 43, 488-492। [क्रॉसरेफ]

40. मर्क कनाडा इंक. उत्पाद मोनोग्राफ गार्डासिल®। उत्पादन. मोनोग्र. मोनोप्रिल उत्पाद. मोनोग्र. 2015, 1-71.

41. अचौर, ए.; पर्सन, के.; हैरिस, आरए; सुंडबैक, जे.; सेंटमैन, सीएल; लिंडक्विस्ट, वाई.; श्नाइड्स, जी.; कैरे, के. एच-2डी(डी) एमएचसी वर्ग I की क्रिस्टल संरचना 2.4 Å रिजॉल्यूशन पर एचआईवी-1- व्युत्पन्न पेप्टाइड पी18-110 के साथ जटिल हो गई: टी सेल और एनके सेल के लिए निहितार्थ मान्यता। प्रतिरक्षा 1998, 9, 199-208। [क्रॉसरेफ]

42. पैंग, डब्ल्यू.; टॉम, एससी; झेंग, वाईटी वर्तमान पेप्टाइड एचआईवी प्रकार -1 संलयन अवरोधक। एंटीवायर. रसायन. रसायनमाता. 2009, 20. [क्रॉसरेफ]

43. चेन, एक्सएस; गार्सिया, आरएल; गोल्डबर्ग, आई.; कैसिनी, जी.; हैरिसन, एससी मानव पैपिलोमावायरस के एल1 प्रोटीन से एकत्रित छोटे वायरस जैसे कणों की संरचना 16. मोल। सेल 2000, 5, 557-567। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

44. दिन, पीएम; वीज़बर्ग, एएस; थॉम्पसन, सीडी; ह्यूजेस, एमएम; वेदना, YY; लोवी, डीआर; शिलर, जेटी ह्यूमन पैपिलोमावायरस 16 कैप्सिड संक्रमण के दौरान परमाणु प्रवेश में मध्यस्थता करते हैं। जे. विरोल. 2019, 93, ई00454-19। [क्रॉसरेफ]

45. झोउ, जे.; डोरबार, जे.; सन, एक्सवाई; क्रॉफर्ड, एल.वी.; मैकलीन, सीएस; फ़्रेज़र, IH मानव पेपिलोमावायरस प्रकार 16 L1 प्रोटीन के परमाणु स्थानीयकरण संकेत की पहचान। वायरोलॉजी 1991, 185, 625-632। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

46. ​​वीएलपीएस, ए.; मिडलबर्ग, एपीजे; लुआ, एलएचएल वायरस-जैसे कण बायोप्रोसेसिंग: चुनौतियां और अवसर। फार्म. बायोप्रोसेस। 2013, 1, 407-409।

47. बौसारघिन, एल.; टौज़े, ए.; कॉम्बिटा-रोजास, एएल; कौरसागेट, पी. मानव पेपिलोमावायरस प्रकार 16 कैप्सिड प्रोटीन के सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए अनुक्रम हेपरान सल्फेट रिसेप्टर के माध्यम से लक्ष्य कोशिकाओं में जीन स्थानांतरण में मध्यस्थता करने के लिए पर्याप्त हैं। जे जनरल विरोल। 2003, 84, 157-164। [क्रॉसरेफ]

48. ससगावा, टी.; पुष्को, पी.; स्टीयर्स, जी.; जीस्चमीस्नर, एसई; नासिर हाजीबागेरी, एमए; फिंच, जे.; क्रॉफर्ड, एल.; टोमासिनो, एम. विखंडन खमीर शिज़ोसैक्रोमाइसेस पोम्बे में मानव पेपिलोमावायरस टाइप 6 और टाइप 16 के वायरस जैसे कणों का संश्लेषण और संयोजन। वायरोलॉजी 1995, 206, 126-135। [क्रॉसरेफ]

49. बायमेल्ट, एस.; सोनेवाल्ड, यू.; गैलम्बाकर, पी.; विलमित्ज़र, एल.; मुलर, एम. ट्रांसजेनिक पौधों में ह्यूमन पैपिलोमावायरस टाइप 16 वायरस जैसे कणों का उत्पादन। जे. विरोल. 2003, 77, 9211-9220। [क्रॉसरेफ]

50. ज़ाहिन, एम.; जोह, जे.; खनाल, एस.; हस्क, ए.; मेसन, एच.; वारज़ेचा, एच.; घिम, एसजे; मिलर, डीएम; माटोबा, एन.; जेनसन, एबी तंबाकू की पत्तियों से एचपीवी16 एल1 प्रोटीन और वीएलपी का स्केलेबल उत्पादन। प्लस वन 2016, 11, e0160995। [क्रॉसरेफ]

51. आयर्स, केए; सियानसियारुल्लो, एएम; कार्नेइरो, एसएम; विला, एलएल; बोकार्डो, ई.; पेरेज़-मार्टिनेज़, सी.; पेरेज़-अरेल्लानो, आई.; ओलिवेरा, एमएलएस; हो, पीएल पुनः संयोजक लैक्टोबैसिलस कैसी कोशिकाओं द्वारा मानव पैपिलोमावायरस प्रकार 16 एल1 वायरस जैसे कणों का उत्पादन। आवेदन. पर्यावरण. माइक्रोबायोल. 2006, 72, 745-752। [क्रॉसरेफ]

52. शैंक-रेट्ज़लाफ़, एमएल; झाओ, क्यू.; एंडरसन, सी.; हैम, एम.; उच्च, के.; गुयेन, एम.; वांग, एफ.; वांग, एन.; वांग, बी.; वांग, वाई.; और अन्य। गार्डासिल® की थर्मल स्थिरता का मूल्यांकन। गुंजन। टीका। 2006, 2, 147-154। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

53. मुखर्जी, एस.; थोरस्टिन्सन, एमवी; जॉनसन, एलबी; डीफिलिप्स, पीए; ज़्लोटनिक, ए. मानव पैपिलोमावायरस 16 वायरस-जैसे कणों की इन विट्रो असेंबली का एक मात्रात्मक विवरण। जे. मोल. बायोल. 2008, 381, 229-237। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

54. मैक्कार्थी, एमपी; व्हाइट, WI; पामर-हिल, एफ.; कोएनिग, एस.; सुज़िच, जेए इन विट्रो में ह्यूमन पैपिलोमावायरस टाइप 11 वायरस जैसे कणों की मात्रात्मक पृथक्करण और पुनर्संयोजन। जे. विरोल. 1998, 72, 32-41. [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

55. किर्नबाउर, आर.; बोय, एफ.; चेंग, एन.; लोवी, डीआर; शिलर, जेटी पैपिलोमावायरस एल1 प्रमुख कैप्सिड प्रोटीन वायरस जैसे कणों में स्व-संयोजन करता है जो अत्यधिक इम्युनोजेनिक होते हैं। प्रोक. नेटल. अकाद. विज्ञान. यूएसए 1992, 88, 12180-12184। [क्रॉसरेफ]

56. पटेल, एमसी; पाटकर, केके; बसु, ए.; मोहनदास, केएम; मुखोपाध्याय, आर. इम्युनोजेनिक ह्यूमन पेपिलोमावायरस का उत्पादन -16 प्रमुख कैप्सिड प्रोटीन व्युत्पन्न वायरस जैसे कण। इंडियन जे. मेड. रेस. 2009, 130, 213-218.

57. शि, एल.; सान्याल, जी.; नी, ए.; लुओ, जेड.; दोशना, एस.; वांग, बी.; ग्राहम, टीएल; वांग, एन.; वोल्किन, डीबी गैर-आयनिक सर्फेक्टेंट द्वारा मानव पैपिलोमावायरस वायरस जैसे कणों का स्थिरीकरण। जे फार्म. विज्ञान. 2005, 94, 1538-1551। [क्रॉसरेफ]

58. कार्टर, जे जे; विप्फ, जीसी; बेन्की, एसएफ; क्रिस्टेंसेन, एनडी; गैलोवे, डीए एक मानव पैपिलोमावायरस प्रकार की पहचान 16-मेजर कैप्सिड प्रोटीन एल1 के सी-टर्मिनल आर्म पर विशिष्ट एपिटोप। जे. विरोल. 2003, 77, 11625-11632। [क्रॉसरेफ]

59. वॉन ब्रून, ए.; ब्रांड, एम.; रीचहुबर, सी.; मोरिस-वोर्टमैन, सी.; डीनहार्ड्ट, एफ.; श्डेल्ट, एफ. हेपेटाइटिस बी कोर कणों की सतह पर व्यक्त होने पर एचआईवी-आई का प्रिंसिपल न्यूट्रलाइजिंग डोमेन अत्यधिक इम्युनोजेनिक होता है। वैक्सीन 1993, 11, 817-824। [क्रॉसरेफ]

60. डेनिसन, एसएम; अनास्ती, के.; स्कियर्स, आरएम; सदरलैंड, एल.; पार्क्स, आर.; ज़िया, एस.-एम.; लियाओ, एच.-एक्स.; गोर्नी, एमके; ज़ोला-पाज़नर, एस.; हेन्स, बीएफ; और अन्य। नॉन-न्यूट्रलाइजिंग एचआईवी -1 जीपी41 लिफाफा क्लस्टर II मानव मोनोक्लोनल एंटीबॉडीज फॉस्फोलिपिड्स और प्रोटीन ऑटोएंटीजन से जुड़ने के लिए पॉलीरिएक्टिविटी दिखाते हैं। जे. विरोल. 2011, 85, 1340-1347। [क्रॉसरेफ]

61. ट्रकोला, ए.; कस्टर, एच.; रुसेर्ट, पी.; जोस, बी.; फिशर, एम.; लीमन, सी.; मैनरिक, ए.; ह्यूबर, एम.; रेहर, एम.; ऑक्सेनियस, ए.; और अन्य। मानव निष्क्रिय एंटीबॉडी के निष्क्रिय हस्तांतरण के माध्यम से एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी की समाप्ति के बाद एचआईवी के दोबारा बढ़ने में देरी। नेट. मेड. 2005, 11, 615-622। [क्रॉसरेफ]

62. शैंक-रेट्ज़लाफ़, एम.; वांग, एफ.; मॉर्ले, टी.; एंडरसन, सी.; हैम, एम.; ब्राउन, एम.; रोलैंड, के.; पंकारी, जी.; ज़ोर्मन, जे.; निचला।; और अन्य। मानव पैपिलोमावायरस टाइप 16 वायरस जैसे कणों और गार्डासिल वैक्सीन नमूनों के लिए माउस पोटेंसी और इन विट्रो रिलेटिव पोटेंसी के बीच सहसंबंध। गुंजन। टीका। 2005, 1, 191-197। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]

63. किल्पेलैनेन, ए.; माया-होयोस, एम.; सौबी, एन.; सोटो, सीवाई; जोसेफ मुन्ने, जे. पुनः संयोजक माइकोबैक्टीरियम बोविस बीसीजी-आधारित एचआईवी वैक्सीन विकास में प्रगति और चुनौतियाँ: सीखे गए सबक। विशेषज्ञ रेव. टीके 2018, 17, 1005-1020। [क्रॉसरेफ] [पबमेड]




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