क्रोनिक किडनी रोग माउस और मैन में सेरेब्रल माइक्रोब्लीड्स बढ़ाता है

संपर्क करना:joanna.jia@wecistanche.com/ व्हाट्सएप: 008618081934791

वेई लिंग लाउ1,2 और एने सीएफ नून्स 1 और विटाली वासिल्वको3 और डेविड फ्लोरियोली4 और लॉन्ग लेर्टपैनिट 1 और जावद सवोज 1 और मारिया बंगश 1 और झिहुई याओ 1,5 और कुणाल शाह6 और समीन नकवी 1 और एनलिया पगनिनी-हिल6 और नोसरटोला डी। वज़ीरी 1 और डेविड एच क्रिब्स3 और मार्क फिशर6,7

प्राप्त: 25 अगस्त 2018 / संशोधित: 28 जनवरी 2019 / स्वीकृत: 22 फरवरी 2019 / ऑनलाइन प्रकाशित: 4 मई 2019

# लेखक (ओं) 2019

सिस्टांचेराहत दे सकता हैगुर्दे की बीमारी

सार

ब्रेन माइक्रोब्लीड्स में वृद्धि हुई हैदीर्घकालिकगुर्दाबीमारी(सीकेडी) और उनकी उपस्थिति से संज्ञानात्मक गिरावट और स्ट्रोक का खतरा बढ़ जाता है। हमने माउस और सेल कल्चर मॉडल में सीकेडी और ब्रेन माइक्रोहेमरेज (माइक्रोब्लीड्स का न्यूरोपैथोलॉजिकल सब्सट्रेट) के बीच बातचीत की जांच की और मनुष्यों से सीरियल ब्रेन इमेजिंग पर माइक्रोब्लीड बोझ की प्रगति का अध्ययन किया। माउस अध्ययन: दो सीकेडी मॉडल की जांच की गई: एडेनिन-प्रेरित ट्यूबलोइन्टरस्टीशियल नेफ्रैटिस और सर्जिकल 5/6 नेफरेक्टोमी। सेल कल्चर स्टडीज: bEnd.3 माउस ब्रेन एंडोथेलियल कोशिकाओं को संगम तक उगाया गया था, और मोनोलेयर अखंडता को 5 से 15 प्रतिशत मानव यूरीमिक सीरम या यूरिया की बढ़ती सांद्रता के संपर्क में आने के बाद मापा गया था। मानव अध्ययन: नियंत्रण, प्री-डायलिसिस सीकेडी, और डायलिसिस रोगियों से सीरियल एमआरआई पर मस्तिष्क माइक्रोब्लीड्स की प्रगति का मूल्यांकन किया गया था। 5/6 नेफरेक्टोमी मॉडल में उच्च रक्तचाप से स्वतंत्र सीकेडी के साथ चूहों में माइक्रोहेमोरेज 2-2 बढ़ गए थे। 5-गुना। सीकेडी जानवरों में आईजीजी धुंधला बढ़ गया था, जो रक्त-मस्तिष्क बाधा पारगम्यता में वृद्धि के अनुरूप है। यूरेमिक सीरम या एलिवेटेड यूरिया के साथ bEnd.3 कोशिकाओं के ऊष्मायन ने ट्रांस-एंडोथेलियल विद्युत प्रतिरोध में एक खुराक पर निर्भर गिरावट का उत्पादन किया। एलिवेटेड यूरिया प्रेरित एक्टिन साइटोस्केलेटन डिरेंजमेंट और घटी हुई क्लॉडिन -5 अभिव्यक्ति। मानव विषयों में, आयु-मिलान नियंत्रणों में 10 प्रतिशत की तुलना में दोनों सीकेडी समूहों में माइक्रोब्लीड्स का प्रसार 50 प्रतिशत था। डायलिसिस कोहोर्ट में अधिक रोगियों ने 1.5 वर्षों के बाद अनुवर्ती एमआरआई पर माइक्रोब्लीड्स में वृद्धि की थी। सीकेडी रक्त-मस्तिष्क की बाधा को बाधित करता है और चूहों में मस्तिष्क के सूक्ष्म रक्तस्राव को बढ़ाता है और मनुष्यों में माइक्रोब्लीड्स को बढ़ाता है। उन्नत यूरिया सुसंस्कृत एंडोथेलियल कोशिकाओं में एक्टिन साइटोस्केलेटन और तंग जंक्शन प्रोटीन को बदल देता है, यह सुझाव देता है कि यह तंत्र जानवरों और मानव अध्ययनों में देखे गए माइक्रोहेमोरेज और माइक्रोब्लीड्स की व्याख्या करता है (कम से कम भाग में)।

कीवर्ड क्रोनिक किडनी रोग। माइक्रोब्लीड्स। माउस मॉडल। एंडोथेलियल सेल कल्चर। ब्रेन एमआरआई

राहत देने के लिएदीर्घकालिकगुर्दाके साथ रोगसिस्टैंचे

परिचय

हाल के वर्षों में सबसे महत्वपूर्ण स्ट्रोक न्यूरोलॉजी खोजों में से एक का उद्भव हैदीर्घकालिकगुर्दाबीमारीएक प्रभाव है जो उच्च रक्तचाप और मधुमेह जैसे पारंपरिक जोखिम कारकों से परे है [10, 11]। उन्नत सीकेडी [2-4, 6, 7] के रोगियों में सेरेब्रल माइक्रोब्लीड्स और संज्ञानात्मक हानि के उच्च प्रसार (लगभग 50 प्रतिशत) को देखते हुए, यह संबंध आगे के अध्ययन के योग्य है।

सेरेब्रल माइक्रोब्लीड्स हेमोसाइडरिन के छोटे फॉसी हैं- चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) पर लोहे का प्रदर्शन, माना जाता है कि अंतर्निहित सेरेब्रल माइक्रोहेमोरेज [12, 13] को प्रतिबिंबित करता है, और स्ट्रोक के लिए बढ़ते जोखिम का संकेत देता है, दोनों हेमोरेजिक और इस्कैमिक [9, 14]। विशिष्ट एमआरआई अनुक्रम (ग्रेडिएंट इको और संवेदनशीलता-भारित इमेजिंग) मस्तिष्क पैरेन्काइमा में सिग्नल हानि के इन फोकल क्षेत्रों को 10 मिमी [12, 15] से कम या उसके बराबर मापते हैं। सेरेब्रल माइक्रोब्लीड्स उम्र पर निर्भर होते हैं, जिनकी व्यापकता 65 वर्ष की आयु तक 20 प्रतिशत तक पहुंच जाती है [16]। उम्र के अलावा, उच्च रक्तचाप और सेरेब्रल अमाइलॉइड एंजियोपैथी माइक्रोब्लीड्स [13, 17] के विकास के लिए सबसे अच्छा वर्णित जोखिम कारक हैं। सीकेडी के अंतिम चरण में, आबादी के 50 प्रतिशत तक माइक्रोब्लीड्स मौजूद हैं [2-4]।

समवर्ती रूप से, संज्ञानात्मक हानि अधिक प्रचलित है और के निचले स्तरों पर अधिक गंभीर हैगुर्दासमारोह[18], जीर्ण डायलिसिस रोगियों [6, 7] में 30-70 प्रतिशत की व्यापकता तक पहुंचना। 55 वर्ष और उससे अधिक आयु के 338 हेमोडायलिसिस रोगियों के आयु-मिलान नियंत्रण वाले क्रॉस-सेक्शनल विश्लेषण में, डायलिसिस के 34 प्रतिशत रोगियों में 12 प्रतिशत नियंत्रण [6] की तुलना में गंभीर संज्ञानात्मक हानि थी। डायलिसिस समूह के अन्य 35 प्रतिशत लोगों में मध्यम संज्ञानात्मक हानि [6] थी।

गैर-सीकेडी समूहों में कई अध्ययनों ने सेरेब्रल माइक्रोब्लीड्स और घटते संज्ञानात्मक कार्य [19-22] के बीच एक मजबूत संबंध का प्रदर्शन किया है। महामारी विज्ञान के आंकड़े एमआरआई माइक्रोब्लीड बोझ के सह-अस्तित्व और अंतिम चरण के गुर्दे की बीमारी (ईएसआरडी) के रोगियों में संज्ञानात्मक शिथिलता का समर्थन करते हैं [8, 23]। इसके अलावा, सीरियल ब्रेन एमआरआई वाले 28 क्रोनिक डायलिसिस रोगियों की एक हालिया रिपोर्ट में नए माइक्रोब्लीड्स और मिनी-मेंटल स्टेट एग्जामिनेशन (एमएमएसई) स्कोर [4] में गिरावट के बीच संबंध दिखाया गया है। इसके अलावा, ESRD रोगियों में सामान्य आबादी [5] की तुलना में इस्केमिक और रक्तस्रावी स्ट्रोक दोनों की घटनाओं की दर 3- से 4- गुना अधिक होती है। जापानी हेमोडायलिसिस रोगियों के एक समूह में, जो बेसलाइन पर स्ट्रोक-मुक्त थे, सेरेब्रल माइक्रोब्लीड्स की उपस्थिति एक 5- वर्ष की अनुवर्ती अवधि [9] के दौरान इंट्रासेरेब्रल रक्तस्राव का एक स्वतंत्र भविष्यवक्ता था।

यहां हम चूहों और सीकेडी रोगियों में अध्ययन के परिणामों की रिपोर्ट करते हैं। हमने सीकेडी चूहों में बढ़े हुए मस्तिष्क के माइक्रोहेमरेज पाए और सीकेडी परिवेश में माइक्रोहेमोरेज गठन के संभावित तंत्र के रूप में बिगड़ा एंडोथेलियल तंग जंक्शन और एक्टिन साइटोस्केलेटन व्यवधान का वर्णन किया। गैर-सीकेडी, प्री-डायलिसिस और क्रोनिक हेमोडायलिसिस विषयों से सीरियल ब्रेन एमआरआई के पूर्वव्यापी विश्लेषण ने ईएसआरडी को माइक्रोब्लीड बोझ की प्रगति के लिए एक महत्वपूर्ण जोखिम कारक के रूप में पुष्टि की।

तरीकों

चूहे प्रयोग

प्रायोगिक पशु और उपचार समूह

दो सीकेडी माउस मॉडल की जांच की गई। (1) एडेनिन ट्यूबलोइंटरस्टीशियल नेफ्रैटिस मॉडल: जैक्सन लेबोरेटरीज (बार हार्बर, एमई) से 1 0- 12 सप्ताह के नर C57BL / 6 जे चूहों को क्रोनिक इंटरस्टीशियल नेफ्रोपैथी को प्रेरित करने के लिए 18 दिनों के लिए 0.2 प्रतिशत एडेनिन युक्त आहार दिया गया था, रखा गया 2 सप्ताह के लिए नियमित चाउ पर वापस, और फिर सीकेडी (छवि 1 ए) को बनाए रखने के लिए 1 सप्ताह के लिए एडेनिन आहार के लिए फिर से उजागर। नियमित चाउ पर नियंत्रण चूहों को बनाए रखा गया था। (2) 5/6 नेफरेक्टोमी मॉडल: 10 सप्ताह की आयु के पुरुष C57बीएल / 6जे चूहों की जैक्सन लेबोरेटरीज में दो-चरण की सर्जरी हुई जिसमें बाएं आंशिक नेफरेक्टोमी शामिल थी और उसके बाद 1 सप्ताह बाद सही कुल नेफरेक्टोमी शामिल थी। जानवरों को 1 सप्ताह बाद प्रयोगशाला में पहुंचाया गया

दूसरी सर्जरी। उच्च रक्तचाप के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए इन दो मॉडलों का उपयोग किया गया था; उच्च रक्तचाप 5/6 नेफरेक्टोमी मॉडल की एक बानगी है, जबकि एडेनिन-सीकेडी गैर-उच्च रक्तचाप [24] है।

सीकेडी जानवरों को बिना लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) या एलपीएस इंजेक्शन के लिए यादृच्छिक किया गया था। (पायलट अध्ययनों में, हमने निर्धारित किया कि गैर-इलाज वाले सीकेडी जानवरों में सहज सूक्ष्म रक्तस्राव के एक उच्च बोझ का पता लगाने के लिए यूरीमिया की लंबी अवधि की आवश्यकता थी; एडेनिन आहार पर चूहों को शुरुआती 18 दिनों से परे केवल 1 0 दिनों के लिए एक्सपोजर में 3.0 ± 0.4 माइक्रोहेमरेज प्रति सेमी2 था।)

प्रारंभिक सीकेडी प्रेरण के पांच सप्ताह बाद और नियंत्रण में एक समान उम्र में, चूहों को इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) एलपीएस इंजेक्शन (साल्मोनेला एंटरिका सीरोटाइप टाइफिम्यूरियम, एल {0}} एमजी, सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ दिया गया। ) मस्तिष्क microbleeds को प्रेरित करने के लिए। एलपीएस को तीन खुराक, 1 मिलीग्राम/किलोग्राम 0, 6, और 24 घंटे [25] में प्रशासित किया गया था। एलपीएस-इलाज चूहों को एलपीएस उपचार के बाद 3 दिनों के लिए प्रति दिन दो से तीन बार चमड़े के नीचे के खारा इंजेक्शन के साथ जलयोजन दिया गया था। टेल-कफ प्लेथिस्मोग्राफी (CODA-S2 मल्टी-चैनल, केंट साइंटिफिक) के माध्यम से LPS इंजेक्शन से 2 दिन पहले रक्तचाप (BP) मापा गया था। सभी प्रयोगों को कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, इरविन संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

टिश्यू हार्वेस्ट और ब्लड केमिस्ट्री

चूहे को एलपीएस इंजेक्शन के 1 सप्ताह बाद या गैर-इलाज वाले जानवरों में समान उम्र में साँस के आइसोफ्लुरेन एनेस्थेसिया के तहत कार्डियक पंचर का उपयोग करके बहिर्गमन द्वारा इच्छामृत्यु किया गया था। एक 26-गेज सुई को प्रवेशनी के रूप में इस्तेमाल किया गया था और बाएं वेंट्रिकल में डाला गया था, और बर्फ-ठंडा पीबीएस समाधान 7–8 मिलीलीटर / मिनट की प्रवाह दर पर लागू किया गया था। बाद में

5 मिनट के लिए छिड़काव, बाएं मस्तिष्क गोलार्द्ध पश्चिमी धब्बा के लिए स्नैप-फ्रोजन था। सही मस्तिष्क गोलार्द्ध और दोनों गुर्दे 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड में रात भर तय किए गए थे और फिर सेक्शनिंग से पहले ठंडे पीबीएस में संग्रहीत किए गए थे। रक्त रसायन के लिए सीरम को अलग कर दिया गया था। रक्त यूरिया नाइट्रोजन (बीयूएन) को बायोएसे सिस्टम्स (हेवर्ड, सीए) से वर्णमिति किट का उपयोग करके मापा गया था। सीरम क्रिएटिनिन को ओ'ब्रायन किडनी रिसर्च कोर सेंटर (यूटी साउथवेस्टर्न, डलास, TX) में केशिका वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके मापा गया था।

सूक्ष्म रक्तस्राव का पता लगाना

दिमाग को 1.5 प्रतिशत agarose में रखा गया था और कोरोनल सेक्शन (4 0 माइक्रोन) उत्पन्न करने के लिए वाइब्रेटोम के साथ सेक्शन किया गया था। सूक्ष्म रक्तस्राव [26] का पता लगाने के लिए प्रशिया ब्लू स्टेनिंग के लिए हर 5वें खंड को एकत्र किया गया था। ताजा तैयार 5 प्रतिशत पोटेशियम हेक्सासायनोफेरेट-ट्राई हाइड्रेट और 10 प्रतिशत हाइड्रोक्लोरिक एसिड का उपयोग करके प्रशिया नीला धुंधलापन किया गया था। बीस मिनट बाद, वर्गों को पानी में धोया गया और परमाणु तेज लाल, निर्जलित और कवरस्लिप के साथ उलट दिया गया। माइक्रोहेमोरेज की पहचान × 20 आवर्धन पर की गई थी क्योंकि तीन इंजेक्शनों द्वारा गिने जाने वाले बैंगनी-नीले जमा को 0,6 और 24 घंटे में दिया गया था। एलपीएस इंजेक्शन के बाद 3 दिनों के लिए उपचर्म खारा जलयोजन दिया गया था। एलपीएस इंजेक्शन से पहले टेल ब्लड प्रेशर (बीपी) को मापा गया। एलपीएस इंजेक्शन के 1 सप्ताह बाद चूहे की बलि दी गई। बी प्रतिनिधि एच एंड ई दाग वाले गुर्दे वर्गों में एडेनिन-प्रेरित ट्यूबलोइंटरस्टीशियल चोट सीकेडी चूहों (दाएं पैनल) को सीटीएल जानवर (बाएं पैनल), × 20 आवर्धन से सामान्य गुर्दे की तुलना में प्रदर्शित करते हैं। स्केल बार=100 माइक्रोन

स्वतंत्र पर्यवेक्षक, और फिर माध्य की गणना की गई। देखे गए सकारात्मक रूप से सना हुआ वर्गों की छवियों को माइक्रोहेमोरेज क्षेत्र की गणना करने के लिए प्रति समूह तीन जानवरों के लिए एक फोटोमाइक्रोस्कोप (निकॉन एक्लिप्स, जापान) का उपयोग करके कैप्चर किया गया था। संपूर्ण स्लाइड छवियों को स्कैन किया गया और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (www.imagej.nih.gov/ij/) से मुफ्त ImageJ सॉफ्टवेयर (संस्करण 10.2) का उपयोग किया गया।

कुल मस्तिष्क सतह क्षेत्र की गणना करें। प्रति जानवर कुल मस्तिष्क सतह क्षेत्र में माइक्रोहेमोरेज की संख्या को सामान्य किया गया था।

पश्चिमी सोख्ता

प्रोटीन विश्लेषण के लिए मस्तिष्क गोलार्द्ध ऊतक संग्रह के समय स्नैप-फ्रोजन थे और प्रोटीज इनहिबिटर कॉकटेल (रोच एप्लाइड साइंस, इंडियानापोलिस, आईएन) के साथ पूरक बर्फ-ठंडे ऊतक निष्कर्षण अभिकर्मक I (थर्मो फिशर साइंटिफिक) में समरूप थे। प्रोटीन सांद्रता को बीसीए प्रोटीन परख किट (थर्मो फिशर साइंटिफिक) से मापा गया। एसडीएस-पेज जेल वैद्युतकणसंचलन प्रति नमूना 100 कुरूप प्रोटीन के साथ किया गया था। प्रोटीन को PVDF झिल्लियों पर स्थानांतरित किया गया और फिर के लिए अवरुद्ध कर दिया गया

टीबीएस-टी बफर (1 0 एमएम ट्रिस-एचसीएल, 150 एमएम NaCl, और 0.1 प्रतिशत ट्वीन -20) ​​में तैयार 5 प्रतिशत नॉन-फैट ड्राई स्किम दूध में 1 घंटे और क्लॉडिन को लक्षित करने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया। -5 (पतला 1:200, सिग्मा-एल्ड्रिच SAB4502981), occludin (पतला 1:200, Invitrogen 711500, थर्मो फिशर साइंटिफिक), और GAPDH आंतरिक नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत (पतला 1:10,000, Abcam, कैम्ब्रिज, एमए) 5 प्रतिशत बिना वसा वाले दूध टीबीएस-टी में रातोंरात 4 डिग्री पर। फिर कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए संबंधित एंटी-खरगोश या एंटी-माउस सेकेंडरी एंटीबॉडी के साथ धमाकों को ऊष्मायन किया गया। TBS-T से धोने के बाद, Luminescent छवि विश्लेषक LAS -3000 (Fujifilm Life Science, Stamford, CT) का उपयोग करके बैंड का पता लगाया गया।

इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री

रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) रिसाव का पता लगाने के लिए, वर्गों को बायोटिनाइलेटेड एंटी-माउस आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कमरे के तापमान (वेक्टर प्रयोगशालाओं, बर्लिंगम, सीए, यूएसए) पर 1 घंटे के लिए 1:100 पर ऊष्मायन किया गया था। पीबीएस के साथ धोने के बाद, वर्गों को 1:200 के कमजोर पड़ने पर एविडिन-बायोटिन-पेरोक्सीडेज कॉम्प्लेक्स (वेक्टर प्रयोगशालाओं) के साथ 30 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया था। क्रोमोजेन के रूप में 3′,3′-डायमिनोबेंज़िडाइन (डीएबी, वेक्टर लेबोरेटरीज) का उपयोग करके धुंधला विकसित किया गया था। गैर-एलपीएस सीटीएल और सीकेडी दिमाग में इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके आईजीजी से दागे गए प्रतिशत क्षेत्र का विश्लेषण किया गया था। सकारात्मक आईजीजी धुंधला के लिए एक सीमा को आईजीजी धुंधला के लिए एक नियंत्रण जानवर का मैन्युअल रूप से मूल्यांकन करके चुना गया था, और इस सीमा को तब सभी शामिल जानवरों के लिए समान रखा गया था [27]।

Cistanche डेजर्टिकोला गुर्दे की बीमारी को रोकता है

सेल संस्कृति प्रयोग

ब्रेन एंडोथेलियल सेल कल्चर और सीरम ट्रीटमेंट

अमर माउस bEnd.3 सेल अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (ATCC, मानस, VA) से खरीदे गए थे। वॉन विलेब्रांड कारक के लिए इम्यूनोस्टेनिंग के माध्यम से एंडोथेलियल सेल फेनोटाइप की पुष्टि की गई थी।

सेल संस्कृतियों को उच्च-ग्लूकोज पूर्ण डल्बेको के संशोधित ईगल के माध्यम (डीएमईएम, एटीसीसी 30-2002) में ऊष्मायन किया गया था जिसमें 25 मिमी ग्लूकोज 1 0 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1 प्रतिशत पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक था। 5 प्रतिशत CO2 और 95 प्रतिशत वायु के वातावरण में 37 डिग्री पर आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर। सभी प्रयोगों के लिए मार्ग 5 में कोशिकाओं का उपयोग किया गया था। कोशिकाओं को 5 × 106 घनत्व पर 12- अच्छी तरह से पॉलिएस्टर ट्रांसवेल आवेषण (0.4 माइक्रोन छिद्र, कोस्टार) पर रखा गया था और 24-48 घंटे में संगम प्राप्त किया गया था। डायलिसिस रोगियों से एफबीएस, मानव सामान्य सीरम (एचएनएस), या यूरेमिक सीरम (सीकेडी) के विभिन्न सांद्रता के लिए कोशिकाओं को उजागर करने के लिए संस्कृति माध्यम को तब बदल दिया गया था। औसत प्राप्त करने के लिए प्रति कुएं में तीन स्थानों पर EVOM2 वोल्ट/ओम मीटर (वर्ल्ड प्रिसिजन इंस्ट्रूमेंट्स, सरसोटा, FL) का उपयोग करके TEER रीडिंग को मापा गया। प्रयोग 21 दिनों तक जारी रहे, और संस्कृति माध्यम को हर 3-4 दिनों में ताज़ा किया गया। एनएचएस और यूरीमिक सीरम आईआरबी की मंजूरी और सूचित सहमति के बाद प्राप्त पहले से बैंक के नमूनों से थे।

यूरिया सेल संस्कृति प्रयोग

यूरिया के प्रभावों की जांच करने के लिए (सीकेडी में सबसे प्रचुर मात्रा में बनाए रखा विष), bEnd.3 कोशिकाओं को उच्च ग्लूकोज डीएमईएम में अकेले 10 प्रतिशत एफबीएस के साथ या मध्यम में 42 या 72 मिलीग्राम / डीएल (70 या 120 माइक्रोन) यूरिया के साथ पूरक किया गया था। सिग्मा-एल्ड्रिच)। ये यूरिया सांद्रता आमतौर पर ESRD रोगियों में पाए जाने वाले पूर्व और बाद के हेमोडायलिसिस मूल्यों का अनुमान लगाते हैं, और इन्हें चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक माना जाता है [28]। एक 24- h ऊष्मायन अवधि के समापन पर, TEER को मापा गया और कोशिकाओं को काटा गया और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए संसाधित किया गया। एक्टिन साइटोस्केलेटन के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए, bEnd.3 कोशिकाओं को कांच के कवर पर्चियों पर उगाया गया और 24 घंटे के लिए उपरोक्त यूरिया सांद्रता के संपर्क में लाया गया, ठंडा 4 प्रतिशत फॉर्मेलिन / पीबीएस में 10 मिनट के लिए तय किया गया, और फिर एक्टिस्टेन 488 फ्लोरोसेंट का उपयोग करके इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के लिए संसाधित किया गया। DAPI परमाणु दाग ​​(कैटलॉग# PHDG1-A, साइटोस्केलेटन इंक, डेनवर, CO) के साथ फैलोलाइडिन। प्रति समूह ट्रिपल स्लाइड्स किए गए थे, और डीएपीआई क्षेत्र के लिए सामान्यीकृत फैलोलाइडिन धुंधला के क्षेत्र की गणना करने के लिए इमेजजे सॉफ्टवेयर पर प्रति स्लाइड तीन फ्रेम की नकल की गई थी।

पश्चिमी सोख्ता

यूरिया प्रयोगों से bEnd.3 कोशिकाओं को पिलाया गया, फिर ऊतक निष्कर्षण अभिकर्मक I (थर्मो फिशर साइंटिफिक) में प्रोटीज इनहिबिटर कॉकटेल (Roche एप्लाइड साइंस) के साथ पूरक किया गया। प्रोटीन सांद्रता को बीसीए प्रोटीन परख किट के साथ मापा गया था, और पश्चिमी सोख्ता को क्लॉडिन -5 (पतला 1: 500) और ओग्लुडिन (पतला 1: 500) के साथ ऊपर वर्णित किया गया था, जिसे GAPDH आंतरिक नियंत्रण (पतला 1:20) के लिए सामान्यीकृत किया गया था। , 000)। प्रत्येक नमूने के लिए पश्चिमी धब्बा कम से कम तीन बार दोहराया गया।

मानव अध्ययन

पूर्वव्यापी मस्तिष्क एमआरआई चार्ट समीक्षा

कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय-इरविन मेडिकल सेंटर में 1 जनवरी, 2008 और 31 दिसंबर, 2014 के बीच इलेक्ट्रॉनिक मेडिकल रिकॉर्ड्स को आईआरबी अनुमोदन के बाद ईमानदार ब्रोकर सिस्टम और यूसीआरएक्स (कैलिफोर्निया रिसर्च एक्सचेंज विश्वविद्यालय) का उपयोग करके जांचा गया। प्री-डायलिसिस सीकेडी (एन =8) और क्रोनिक हेमोडायलिसिस रोगी (एन =9) जिनके पास अलग-अलग समय बिंदुओं पर कम से कम दो ब्रेन एमआरआई स्कैन थे, की पहचान की गई थी (शुरुआत में पहचाने गए 10 हेमोडायलिसिस रोगियों में से 1 को हटा दिया गया था) रेडियोलॉजी पैक्स सिस्टम में गुम छवियों के कारण अंतिम विश्लेषण)। सामान्य गुर्दा समारोह (एन=10) के साथ नियंत्रण मैन्युअल रूप से हेमोडायलिसिस सीकेडी रोगियों से लिंग और उम्र ± 5 वर्ष से मेल खाते थे।

सेरेब्रल माइक्रोब्लीड्स के लिए एमआरआई की समीक्षा

माइक्रोब्लीड्स की गणना एक उपस्थित न्यूरोरेडियोलॉजिस्ट (डीएफ) द्वारा की गई और समय के साथ प्रगति के लिए विश्लेषण किया गया। T2*-भारित और संवेदनशीलता-भारित इमेजिंग (SWI) और FLAIR (द्रव-क्षीणन उलटा पुनर्प्राप्ति) छवियों के साथ ब्रेन MRI 1.5T और 3T MRI स्कैनर पर किया गया। SWI अनुक्रमों के लिए परत की मोटाई 2 मिमी पर की गई थी, जिसमें इंटरलेयर अंतराल 0 था। माइक्रोब्लीड्स की गणना 2-मिमी अक्षीय SWI के आधार पर की गई। FLAIR प्रति था-

3 मिमी स्लाइस मोटाई पर सफेद पदार्थ के घावों का पता लगाने के लिए गठित, साथ ही 0 के इंटरलेयर अंतराल के साथ।

सांख्यिकीय विश्लेषण

ग्रब्स टेस्ट (अत्यधिक छात्रीकृत विचलन विधि, http://graphpad. com/quick call/grubbs1/) के साथ स्क्रीनिंग पर कोई डेटा आउटलेयर नहीं थे। चूहों और मनुष्यों में समूहों के बीच अंतर की तुलना श्रेणीबद्ध चर के लिए ची-स्क्वायर (फिशर के सटीक) परीक्षणों और निरंतर चर के लिए टी-परीक्षण और एनोवा द्वारा की गई थी। निरंतर डेटा को माध्य ± SEM के रूप में सूचित किया जाता है। माउस डेटा के लिए, हमने क्रुस्कल-वालिस गैर-पैरामीट्रिक और तुकी एचएसडी परीक्षणों के साथ एकतरफा एनोवा दोनों का प्रदर्शन किया। सीकेडी इंटरैक्शन का परीक्षण करने के लिए टू-वे एनोवा (सीकेडी-हां/नहीं और एलपीएस-हां/नहीं) का उपयोग किया गया था। समूहों के बीच अंतर को महत्वपूर्ण माना जाता था यदि P <0.05. ग्राफपैड="" प्रिज्म="" 4="" सॉफ्टवेयर="" (ग्राफपैड="" सॉफ्टवेयर,="" सैन="" डिएगो="" सीए)="" का="" उपयोग="" करके="" आंकड़े="" तैयार="" किए="" गए="">

परिणाम

एलपीएस उपचार के साथ जीवन रक्षा

एलपीएस के साथ इलाज किए गए सीकेडी चूहों की जीवित रहने की दर 80 प्रतिशत थी। एलपीएस उपचार के बाद केवल 1 सप्ताह तक जीवित रहने वाले चूहे थे

अंतिम विश्लेषण में शामिल अन्य समूहों के सभी चूहे प्रयोग के अंत तक जीवित रहे।

सीकेडी ने मस्तिष्क के सूक्ष्म रक्तस्राव में उल्लेखनीय वृद्धि की

एलपीएस उपचार के बाद बोझ

एडेनिन-प्रेरित और 5/6 नेफरेक्टोमी सीकेडी वाले जानवरों ने सीटीएल जानवरों (तालिका 1) की तुलना में काफी ऊंचा रक्त यूरिया नाइट्रोजन (बीयूएन) और सीरम क्रिएटिनिन मूल्यों को दिखाया। सीटीएल और एडेनिन-सीकेडी जानवरों (तालिका 1) की तुलना में नेफरेक्टोमी-सीकेडी जानवरों में टेल बीपी काफी अधिक था; हालांकि, दो सीकेडी समूहों में माइक्रोब्लीड की संख्या समान थी। एच एंड ई धुंधला ने सीकेडी चूहों (छवि 1 बी) से गुर्दे में एडेनिन-प्रेरित ट्यूबलोइंटरस्टीशियल चोट की पुष्टि की।

गैर-एलपीएस सीटीएल चूहों में मीन ब्रेन माइक्रोहेमरेज बोझ 2.0 ± 0.5 प्रति सेमी2 था और गैर-एलपीएस सीकेडी जानवरों (एडेनिन-) में 2-2.5-गुना बढ़ गया था। सीकेडी चूहों 4.5 ± 0.9 प्रति सेमी2;

नेफरेक्टोमी-सीकेडी चूहों 4.2 ± 1.1 प्रति सेमी2) (तालिका 1; अंजीर 2ए)। गैर-एलपीएस समूहों के लिए, सीटीएल की तुलना में एडेनिन-सीकेडी के लिए माइक्रोहेमरेज में वृद्धि महत्वपूर्ण थी, लेकिन नेफरेक्टोमी-सीकेडी के लिए नहीं। एलपीएस उपचार ने सीटीएल और सीकेडी जानवरों में माइक्रोहेमोरेज गठन को समान डिग्री तक बढ़ा दिया