रेटिनोइक एसिड रिसेप्टर रिस्पॉन्डर1 ग्लोमेरुलर रोगों के विकास को बढ़ावा क्यों दे सकता है?

रेटिनोइक एसिड रिसेप्टर रिस्पॉन्डर1 न्यूक्लियर फैक्टर-केबी सिग्नलिंग पाथवे के माध्यम से ग्लोमेरुलर रोगों के विकास को बढ़ावा देता है

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काटजा मोएलर-हैकबर्थ1,2, दीना डाबाघी1,2, इमैनुएल चारिन1,2, सोनिया ज़ाम्ब्रानो1,2, गुइलम जेनोव, 1,3, ज़िदान ली1,3, अन्निका वर्नरसन4, मार्क लाल5 और जाक्को पत्रका1,2

1 केआई/एजेड इंटीग्रेटेड कार्डियो मेटाबोलिक सेंटर, करोलिंस्का यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल, हडिंग, स्टॉकहोम, स्वीडन में करोलिंस्का इंस्टिट्यूट; 2 प्रयोगशाला चिकित्सा विभाग, पैथोलॉजी विभाग, करोलिंस्का विश्वविद्यालय अस्पताल में करोलिंस्का इंस्टिट्यूट, हडिंग, स्टॉकहोम, स्वीडन; 3 डिपार्टमेंट ऑफ मेडिसिन हडिंग, करोलिंस्का इंस्टिट्यूट, करोलिंस्का यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल, हडिंग, स्टॉकहोम, स्वीडन में; 4 नैदानिक ​​विज्ञान विभाग, हस्तक्षेप और प्रौद्योगिकी, गुर्दे की चिकित्सा विभाग, करोलिंस्का इंस्टिट्यूट, स्टॉकहोम, स्वीडन; और 5 बायोसाइंस रेनल, रिसर्च, और अर्ली डेवलपमेंट कार्डियोवास्कुलर, रीनल एंड मेटाबॉलिज्म (सीवीआरएम), आर एंड डी बायोफार्मास्युटिकल्स, एस्ट्राजेनेका, गोथेनबर्ग, स्वीडन

किडनी इंटरनेशनल (2021) 100, 809-823; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2021.05.036

कॉपीराइट 2021, इंटरनेशनल सोसाइटी ऑफ नेफ्रोलॉजी। Elsevier Inc. द्वारा प्रकाशित। यह CC BY लाइसेंस के तहत एक ओपन-एक्सेस लेख है

पत्राचार: जाक्को पत्राक्का, प्रयोगशाला चिकित्सा विभाग, पैथोलॉजी विभाग, करोलिंस्का इंस्टिट्यूट, ब्लिकागनजेन 6, एसई -141 57 हडिंग, स्वीडन। ई-मेल: jaakko.patrakka@ki.se 27 जुलाई 2020 को प्राप्त हुआ; संशोधित 11 मई 2021; 20 मई 2021 को स्वीकार किया गया; ऑनलाइन प्रकाशित 18 जून 2021

कीवर्ड: ग्लोमेरुलरअन्तःस्तरीय कोशिका; एनएफ-केबी; पोडोसाइट; दुर्लभ1

ज्वलनशील मार्ग अधिकांश में सक्रिय होते हैंग्लोमेरुलर रोगलेकिन गुर्दे के ऊतकों में उन्हें चलाने वाले आणविक तंत्र बहुत कम ज्ञात हैं। हमने पहचानारेटिनोइक अम्लरिसेप्टर रिस्पॉन्डर 1 (Rarres1) स्वस्थ किडनी में अत्यधिक पॉडोसाइट-समृद्ध प्रोटीन के रूप में। पॉडोसाइट-विशिष्ट नॉकआउट जानवरों के अध्ययन ने संकेत दिया कि ग्लोमेरुलस निस्पंदन बाधा के सामान्य विकास या रखरखाव के लिए Rarres1 की आवश्यकता नहीं थी और ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस के एक मॉडल में गुर्दे की बीमारी के परिणाम को संशोधित नहीं किया। दिलचस्प बात यह है कि हमने IgA और डायबिटिक किडनी रोग के साथ-साथ ANCA से जुड़े वास्कुलिटिस में ग्लोमेरुलर और पेरिटुबुलर केशिका एंडोथेलियल कोशिकाओं में Rarres1 अभिव्यक्ति के शामिल होने का पता लगाया। सार्वजनिक रूप से उपलब्ध आरएनए डेटा सेटों के विश्लेषण से पता चला है कि पुरानी किडनी रोगों में Rarres1 अभिव्यक्ति का समावेश एक सामान्य आणविक तंत्र था। एक सशर्त नॉक-इन माउस लाइन, विशेष रूप से एंडोथेलियल कोशिकाओं में Rarres1 को ओवरएक्सप्रेस करते हुए, कोई स्पष्ट किडनी फेनोटाइप नहीं दिखा। हालांकि, ओवरएक्प्रेशन ने ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस के एक मॉडल में गुर्दे की क्षति की प्रगति को बढ़ावा दिया। इसके अनुरूप, एंडोथेलियल कोशिकाओं में Rarres1 की कमी वाले सशर्त नॉक-आउट चूहों को आंशिक रूप से रोग मॉडल में संरक्षित किया गया था। यंत्रवत् रूप से, Rarres1 ने रिसेप्टर टाइरोसिन किनसे एक्सल को सक्रिय करके प्रतिलेखन कारक न्यूक्लियर फैक्टर-केबी सिग्नलिंग मार्ग के माध्यम से सूजन और फाइब्रोसिस को बढ़ावा दिया। इस प्रकार, एंडोथेलियल कोशिकाओं में Rarres1 अभिव्यक्ति का समावेश मानव ग्लोमेरुलोपैथियों में एक प्रचलित आणविक तंत्र है और ऐसा लगता है कि न्यूक्लियर फैक्टर-केबी सिग्नलिंग मार्ग के माध्यम से सूजन और फाइब्रोसिस को चलाने में एक रोगजनक भूमिका है।

अनुवाद संबंधी वक्तव्य

हमने . के अपग्रेडेशन की पहचान कीरेटिनोइक अम्लआम मानव ग्लोमेरुलोपैथियों के एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसीएस) में रिसेप्टर रिस्पॉन्डर प्रोटीन 1 (Rarres1)। ऐसा लगता है कि प्रेरण में रोगजनक भूमिका होती हैग्लोमेरुलर रोगजैसा कि ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस की प्रगति (i) विशेष रूप से ईसीएस में एक माउस ओवरएक्सप्रेसिंग Rarres1 में बढ़ गई थी, और (ii) एक ईसी-विशिष्ट Rarres1 नॉकआउट लाइन में संशोधित। गुर्दे की बीमारियों में सूक्ष्म संवहनी क्षति और संभावित रूप से एक उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्य का पता लगाने के लिए Rarres1 एक बायोमार्कर हो सकता है।

ग्लोमेरुलर रोगप्रक्रियाएं अंतिम चरण के गुर्दे की बीमारी का एक प्रमुख कारण हैं। मधुमेह अपवृक्कता (डीएन) विश्व स्तर पर अंत-चरण गुर्दे की बीमारी का सबसे आम कारण है, जबकि आईजीए नेफ्रोपैथी (आईजीएएन) सबसे प्रचलित प्राथमिक ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस (जीएन) है। 1,2 हिस्टोलॉजिकल रूप से, इन सामान्य विकारों में ग्लोमेरुलर क्षति बहुत समान रूप से प्रकट होती है। फ़ैशन। इसमें ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (जीईसी) की सक्रियता, बाह्य मैट्रिक्स का विस्तार, मेसेंजियल कोशिकाओं का प्रसार, पॉडोसाइट क्षति, और अंततः पॉडोसाइट हानि शामिल है।

मानव गुर्दे की बायोप्सी में वैश्विक ट्रांसक्रिप्ट प्रोफाइलिंग अध्ययनों ने ग्लोमेरुलर विकारों में एक मजबूत भड़काऊ हस्ताक्षर दिखाया है, 4–7 और माउस अध्ययनों से पता चला है कि परमाणु कारक-केबी (एनएफ-केबी) की सक्रियता और विकास कारक-बी (टीजीएफ-बी) को बदलना। रोग की प्रगति में सिग्नलिंग मार्ग की महत्वपूर्ण भूमिका होती है। 8,9 महत्वपूर्ण रूप से, एनएफ-केबी मार्ग के फार्मास्युटिकल लक्ष्यीकरण का पशु मॉडल में पुन: सुरक्षात्मक प्रभाव पड़ता है, यह दर्शाता है कि मार्ग उपचार के लिए एक संभावित लक्ष्य है।ग्लोमेरुलर रोग.10,11 पोडोसाइट्स में, हमने हाल ही में जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर वर्ग सी समूह 5 सदस्य बी को एनएफ-केबी-मध्यस्थता सूजन प्रतिक्रिया के एक न्यूनाधिक के रूप में पहचाना। हालांकि, ग्लोमेरुलोपैथियों में सूजन वाले मार्गों की सक्रियता संभवतः कई सेल प्रकारों द्वारा संचालित होती है। . वास्तव में, कई मानव गुर्दे की बीमारियों में जीईसी में एनएफ-केबी सिग्नलिंग मार्ग की सक्रियता का पता चला है। 13,14 जीईसी में एनएफ-केबी सक्रियण में शामिल आणविक तंत्र को खराब तरीके से समझा जाता है।

रेटिनोइक एसिड रिसेप्टर रिस्पॉन्डर1 के विकास को बढ़ावा दे सकता हैग्लोमेरुलर रोग

इस अध्ययन में, हमने मानव के आणविक हस्ताक्षरों का विश्लेषण कियाग्लोमेरुलर रोगऔर के प्रेरण की पहचान कीरेटिनोइक अम्लजीईसी में डीएन, आईजीएएन, और एंटी-न्यूट्रोफिल साइटोप्लाज्मिक ऑटोएंटीबॉडी (एएनसीए) से जुड़े वास्कुलिटिस में एक सामान्य आणविक हस्ताक्षर के रूप में रिसेप्टर रिस्पॉन्डर 1 (रार्रेस 1) अभिव्यक्ति। एंडोथेलियल कोशिकाओं (ECs) में Rarres1 अभिव्यक्ति के सक्रियण/निष्क्रियता के साथ माउस लाइनों में अध्ययन से पता चलता है कि इस प्रेरण की GN के माउस मॉडल में एक रोगजनक भूमिका है। यंत्रवत् रूप से, Rarres1 रिसेप्टर tyrosine kinase Axl को सक्रिय करता है, जिससे NF-kB सिग्नलिंग मार्ग का सक्रियण होता है। हम Rarres1 को माइक्रोवैस्कुलर क्षति के एक नए बायोमार्कर के रूप में प्रस्तावित करते हैं जो के लिए एक आकर्षक चिकित्सीय लक्ष्य हो सकता हैग्लोमेरुलर रोगभड़काऊ प्रतिक्रियाओं को संशोधित करके प्रक्रियाएं।

चित्र 1|(जारी) (सी) बैकस्पिन विश्लेषण विशेष रूप से मुराइन किडनी ऊतक के आरएनएसेक डेटा में पॉडोसाइट्स (पीडी) में Rarres1 अभिव्यक्ति दिखा रहा है (वोरोनिएका एट अल। 6 से डेटा)। (डी) मानव नमूनों से पृथक टब और ग्लोम में Rarres1 के सापेक्ष mRNA स्तर। टब के साथ तुलना में डेटा को ग्लोम में Rarres1 अभिव्यक्ति के गुना परिवर्तन के रूप में व्यक्त किया जाता है। *पी < 0.05="" बनाम="" टब।="" (ई)="" सामान्य="" विषयों="" से="" मानव="" ग्लोमेरुली="" में="" पोडोसाइट्स="" द्वारा="" rarres1="" अभिव्यक्ति="" (हरा)="" की="" प्रतिनिधि="" confocal="" fl="" फ्लोरोसेंट="" सूक्ष्म="" छवि।="" (च)="" मानव="" विषयों="" से="" पोडोसाइट्स="" में="" rarres1="" की="" अभिव्यक्ति="" दिखाने="" वाले="" प्रतिनिधि="" मुखर="" सूक्ष्म="" चित्र;="" विमिन="" का="" उपयोग="" प्रमुख="" प्रक्रियाओं="" के="" लिए="" एक="" मार्कर="" के="" रूप="" में="" और="" नेफ्रिन="" को="" पॉडोसाइट्स="" की="" पैर="" प्रक्रियाओं="" के="" लिए="" एक="" मार्कर="" के="" रूप="" में="" किया="" गया="" था।="" cd31="" का="" उपयोग="" एंडोथेलियल="" कोशिकाओं="" के="" लिए="" एक="" मार्कर="" के="" रूप="" में="" किया="" गया="" था,="" और="" चिकनी="" पेशी="" एक्टिन="" (⍺sma)="" का="" उपयोग="" मेसेंजियल="" सेल="" मार्कर="" के="" रूप="" में="" किया="" गया="" था।="" बार्स="50/10" मिमी।="" डेटा="" को="" माध्य="" ±="" sem="" के="" रूप="" में="" व्यक्त="" किया="" जाता="" है।="" छात्र="" के="" टी-टेस्ट="" को="" 2="" समूहों="" के="" बीच="" तुलना="" के="" लिए="" नियोजित="" किया="" गया="" था।="" इस="" छवि="" को="" देखने="" का="" अनुकूलन="" करने="" के="" लिए,="" कृपया="" इस="" लेख="" का="" ऑनलाइन="" संस्करण="" www.kidney-international.org="" पर="">

विधि

आरएनए निष्कर्षण और वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन

ग्लोमेरुली को पहले वर्णित के रूप में अलग किया गया था। 15 आरएनए को TRIzol अभिकर्मक (Invitrogen) और RNeasy Kit (Qiagen Inc.) का उपयोग करके निकाला गया था। सीडीएनए उत्पन्न करने के लिए iScript cDNA सिंथेसिस किट का उपयोग किया गया था। मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन SsoAdvanced Universal SYBR ग्रीन सुपरमिक्स (बायो-रेड) के साथ CFX96 टच रियल-टाइम पीसीआर डिटेक्शन सिस्टम का उपयोग करके किया गया था। उपयोग किए गए प्राइमरों को पूरक तालिका S1 में सूचीबद्ध किया गया है। सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तरों की गणना 2-डीडीसीटी पद्धति का उपयोग करके की गई थी।

कोश पालन

Human podocytes were cultured as described.16 JetPEI transfection reagent (Polyplus-transfection SA) was used for stable transfection of pRP[Exp]-CMV>hRARRES1 [ORF011242]: T2A: बीएसडी - प्लास्मिड (वेक्टरबिल्डर इंक। क्लोनों का विस्तार पौरोमाइसिन (मर्क केजीए) चयन के तहत हुआ है। एक्सल / रेरेस 1 के लिए शॉर्ट इंटरफेरिंग आरएनए (siRNA) का ट्रांसफ़ेक्शन ओरिजिन से siRNA का उपयोग करके किया गया था। कोशिकाओं को 30 एनएम के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। टीजीएफ-बी1 उत्तेजनाओं के साथ या बिना टीजीएफ-बी1 उत्तेजनाओं (संस्कृति माध्यम में 10 एनजी/एमएल) के साथ जेटपीईआई अभिकर्मक अभिकर्मक (पॉलीप्लस-ट्रांसफेक्शन एसए) के साथ जटिलता के बाद सीआरएनए। एक्सल-अवरोधक R428 (सेलेक केमिकल्स) उपचार से 1 घंटे पहले जोड़ा गया था (3 मिमीोल / एल)।

क्यों रेटिनोइक एसिड रिसेप्टर रिस्पॉन्डर1 के विकास को बढ़ावा दे सकता हैग्लोमेरुलर रोग?

पश्चिमी धब्बा

कोशिकाओं को प्रोटीज / फॉस्फेटस निषेध कॉकटेल (Roche) द्वारा पूरक RIPA lysis बफर के साथ lysed किया गया था। न्यूक्लियर एक्सट्रैक्ट किट (एक्टिव मोटिफ यूरोप) का उपयोग करके परमाणु अंशों के प्रोटीन को अलग किया गया। लिसेट्स को 4 प्रतिशत -12 प्रतिशत ट्रिस-ग्लाइसिन सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल (इनविट्रोजन) पर अलग किया गया और पॉलीविनाइलिडिन डिफ़्लुओराइड झिल्ली (बायो-रेड) में स्थानांतरित कर दिया गया। झिल्लियों को 5 प्रतिशत गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (मर्क) के साथ अवरुद्ध किया गया था। प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन रात भर किया गया (पूरक तालिका S2 में एंटीबॉडी)। संकेतों का पता लगाने के लिए हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी और क्लैरिटी वेस्टर्न ईसीएल सबस्ट्रेट (बायो-रेड) का उपयोग किया गया था। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण कम से कम दो बार किया गया।

स्वस्थानी संकरण में आरएनए

RNAscope विश्लेषण निर्माता के प्रोटोकॉल (ACD) के अनुसार पैराफिन-एम्बेडेड मानव गुर्दे में किया गया था। एनपीएचएस1 - कैट नंबर 416071-C2, PECAM1 - कैट नंबर 487381-C3, और RARRES1 - न्यूक्लियोटाइड्स को लक्षित करने वाली अनुकूलित जांच {{8 }}.

गुर्दे की चोट का आकलन

माउस एल्ब्यूमिन एलिसा किट (ऑलबुवेल एम; एथोस बायोसाइंसेज) और क्वांटिक्रोम क्रिएटिनिन परख किट (बायोएसे सिस्टम) का उपयोग करके मूत्र एल्ब्यूमिन और क्रिएटिनिन अनुपात का मूल्यांकन किया गया था। गुर्दे के ऊतकों को 10 प्रतिशत तटस्थ बफर फॉर्मेलिन समाधान में तय किया गया और पैराफिन में एम्बेडेड किया गया, इसके बाद काटने और आवधिक एसिड-शिफ धुंधला हो गया। 2.5 प्रतिशत ग्लूटाराल्डिहाइड में तय किए गए नमूनों में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का प्रदर्शन किया गया।

immunostaining

पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक 24 घंटे के लिए फॉर्मेलिन में तय किए गए थे। ट्रिस-एथिलीनडायमाइन टेट्राएसेटिक एसिड बफर (1 0 एमएम ट्रिस बेस, 1 एमएम एथिलीनडायमिनेटेट्राएसेटिक एसिड बफर सॉल्यूशन, 0। 0 5 प्रतिशत ट्वीन में पांच-माइक्रोमीटर वर्गों को चित्रित और माइक्रोवेव-उपचार किया गया था। 20, पीएच 9.0) या सोडियम साइट्रेट बफर (10 मिमी सोडियम साइट्रेट, 0.05 प्रतिशत ट्वीन 20, पीएच 6.0), इसके बाद 0.3 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100 के साथ पारगम्यीकरण और अवरुद्ध 10 प्रतिशत सामान्य बकरी सीरम, 3 प्रतिशत हाइड्रोजन पेरोक्साइड, और वेक्टर ब्लॉकिंग किट (वेक्टर लेबोरेटरीज) के साथ। स्लाइड्स को डीएबी पेरोक्सीडेज (हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज) सब्सट्रेट किट, 3, 30 -डायमिनोबेंज़िडाइन (वेक्टर लेबोरेटरीज) का उपयोग करके विकसित किया गया था।

जमे हुए वर्गों के लिए, एसीटोन-फिक्स्ड वर्गों को 0.1 प्रतिशत ट्वीन 20 के साथ पारगम्य किया गया था और 10 प्रतिशत सामान्य बकरी सीरम के साथ अवरुद्ध किया गया था। उपयोग किए जाने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी को पूरक तालिका S1 में सूचीबद्ध किया गया है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए एलेक्सा-फ्लोर माध्यमिक एंटीबॉडी आणविक जांच (लाइफ टेक्नोलॉजीज) से प्राप्त किए गए थे। लीका एसपी 8 कन्फोकल माइक्रोस्कोप (लीका माइक्रोसिस्टम्स) का उपयोग करके छवियां प्राप्त की गईं।

मानव नमूने

करोलिंस्का विश्वविद्यालय अस्पताल (स्टॉकहोम, स्वीडन) से गुर्दे की बायोप्सी प्राप्त की गई थी। ट्यूमर नेफरेक्टोमी से गुजरने वाले व्यक्तियों के स्वस्थ किडनी पोल से नियंत्रण के नमूने प्राप्त किए गए थे। स्थानीय नैतिक समिति ने अध्ययन को मंजूरी दी (अनुमोदन संख्या 2010/579-31/1, स्टॉकहोम, स्वीडन)।

बनाम नियंत्रण (Ctrl.) या ***P < {{0}}.001="" बनाम="" सी-नकारात्मक="" नियंत्रण="" (हाथापाई)="" (rarres1,="" n="6" ;="" सीरार्रेस1,="" एन="4)।" (="" c="" )="" प्रतिनिधि="" पश्चिमी="" धब्बा="" दस्तावेज़="" और="" सारांशित="" डेटा="" 1="" 0="" एनजी="" एमएल="" टीजीएफ-बी="" 1="" के="" साथ="" इलाज="" किए="" गए="" पॉडोसाइट्स="" के="" पृथक="" परमाणु="" अंशों="" में="" पीपी="" 65="" के="" सापेक्ष="" प्रोटीन="" स्तर="" को="" दर्शाता="" है।="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< {{40}}.001="" बनाम="" कंट्रोल="" पॉडोसाइट्स="" (ctrl.="" )="" (एन="3)।" (="" डी="" )="" प्रतिनिधि="" पश्चिमी="" धब्बा="" दस्तावेज="" और="" 10="" एनजी="" एमएल="" टीजीएफ-बी="" 1="" ±="" 3="" मिमीोल="" एल="" आर="" 428,="" एन="2" के="" साथ="" इलाज="" किए="" गए="" पोडोसाइट्स="" के="" पृथक="" परमाणु="" अंशों="" में="" पीपी="" 65="" के="" सापेक्ष="" प्रोटीन="" स्तर="" को="" दर्शाने="" वाले="" सारांशित="" डेटा।="" (ई)="" प्रतिनिधि="" पश्चिमी="" धब्बा="" दिखा="" रहा="" है="" कि="" rarres1="" का="" ओवरएक्प्रेशन="" एक्सल="" को="" संवैधानिक="" रूप="" से="" सक्रिय="" करता="" है।="" *="" पी=""><0.05 (एन="2)।" (एफ)="" पॉडोसाइट्स="" में="" ईएमटी="" से="" संबंधित="" जीन="" के="" सापेक्ष="" एमआरएनए="" स्तर="" rarres1="" (rarres1)="" या="" नियंत्रण="" पॉडोसाइट्स="" (ctrl।)="" को="" एक्सल="" (siaxl),="" सी-नकारात्मक="" नियंत्रण="" (हाथापाई),="" ##p=""><0.01, ##="" के="" लिए="" sirna="" के="" साथ="" ट्रांसफ़ेक्ट="" करते="" हैं।="" #p=""><0.001 बनाम="" हाथापाई,="" n="3," या="" 3="" mmol/l="" r428="" से="" उपचारित।="" ##p=""><0.01, ###p=""><0.001 बनाम="" ctrl।,="" **p=""><0.01, ***p=""><0.001 बनाम="" rarres1,="" *p=""><0.05 बनाम="" rarres1,="" n="4।" डेटा="" को="" ±="" एसडी="" के="" रूप="" में="" व्यक्त="" किया="" जाता="" है।="" छात्र="" के="" t="" -est="" को="" 2="" समूहों="" के="" बीच="" तुलना="" के="" लिए="" नियोजित="" किया="" गया="" था।="" यूटी,="">

चित्र 3|पॉडोसाइट-विशिष्ट Rarres1 नॉकआउट (CreD/Rarres1flfl/flfl) चूहों की स्थापना। (ए) सशर्त नॉकआउट चूहों की पीढ़ी जिसमें आरई-लोक्सपी पुनर्संयोजन प्रणाली का उपयोग करके विशेष रूप से पॉडोसाइट्स में रैरेस 1 को समाप्त कर दिया गया है। Exon 3 को NPHS2-Cre-मध्यस्थता पुनर्संयोजन पर हटा दिया जाता है। (बी) 4 सप्ताह की उम्र में पूंछ की तैयारी और पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन द्वारा जीनोटाइपिंग की पुष्टि की गई थी। (जारी)

चित्र 3|(जारी) (ग) प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा पॉडोसाइट-विशिष्ट Rarres1 नॉकआउट (Creþ/Rarres1flfl/flfl) चूहों से पृथक ग्लोमेरुली में Rarres1 की घटी हुई अभिव्यक्ति को दर्शाता है। (डी) Rarres1 का पोडोसाइट-विशिष्ट नुकसान नेफ्रोटॉक्सिक सीरम (एनटीएस) के साथ इलाज किए गए चूहों में एल्ब्यूमिन्यूरिया के स्तर को प्रभावित नहीं करता है, जैसा कि चूहों के विभिन्न समूहों में मूत्र एल्ब्यूमिन-टू-क्रिएटिनिन अनुपात द्वारा विश्लेषण किया गया है (एनटीएस-सीटीएल।, एन {{1 {{ 15}}}}–7; एनटीएस-रार्रेस1_सीकेओ, एन - 7)। (ई) चूहों के विभिन्न समूहों में विशिष्ट ग्लोमेरुलर संरचना परिवर्तन दिखाने वाले फोटोमाइक्रोग्राफ और मात्रा का ठहराव। आवधिक एसिड-शिफ-दाग वाले वर्गों में ग्लोमेरुलर घावों की पहचान की गई थी। #P < 0.0001="" बनाम="" अनुपचारित="" नियंत्रण="" (ctrl।)="" (ctrl।,="" n="" -="" 6;="" nts-ctrl।,="" n="" -="" 9;="" एनटीएस-रार्रेस1_सीकेओ,="" एन="9)।" (="" च="" )="" ट्रांसमिशन="" इलेक्ट्रॉन="" माइक्रोस्कोपी="" विश्लेषण="" द्वारा="" चूहों="" के="" विभिन्न="" समूहों="" में="" माध्य="" ग्लोमेरुलर="" बेसमेंट="" मेम्ब्रेन="" (gbm)="" मोटाई="" के="" प्रतिनिधि="" फोटोमिकोग्राफ="" और="" परिमाणीकरण="" और="" प्रति="" मिमी="" gbm="" स्लिट्स="" की="" संख्या।="" ##p=""><0.01, ###p=""><0.001, ####p=""><0.0001 बनाम="" अनुपचारित="" नियंत्रण="" (ctrl।,="" n="3;" nts-ctrl।,="" n="4;" nts-rarres{="" {33}}सीकेओ,="" एन="6)।" डेटा="" को="" माध्य="" ±="" sem="" के="" रूप="" में="" व्यक्त="" किया="" जाता="" है।="" कई="" तुलनाओं="" के="" लिए="" तुकी="" के="" बाद="" के="" परीक्षण="" के="" बाद="" विचरण="" का="" एकतरफा="" विश्लेषण="" 3="" या="" अधिक="" के="" समूहों="" के="" लिए="" उपयोग="" किया="" गया="" था।="" इस="" छवि="" को="" देखने="" का="" अनुकूलन="" करने="" के="" लिए,="" कृपया="" इस="" लेख="" का="" ऑनलाइन="" संस्करण="" www.kidney-international.org="" पर="">

माउस लाइन्स

C57Bl/6J बैकग्राउंड (Rarres1flfl/flfl; Cyagen) के साथ फ्लक्स किए गए Rarres1 चूहों में पॉडोसिन (B6.Cg-Tg [NPHS2-cre] 295Lbh/J; जैक्सन लेबोरेटरी) और Tie2 cre चूहों (B6.Cg-Tg) थे। Tek-cre)12Flv/J) सेल-विशिष्ट नॉकआउट चूहों को उत्पन्न करने के लिए। GT(ROSA)26Sortm1(CAG-Rarres1-T2A EGFP)/J चूहों को विशेष रूप से ECs में Rarres1 अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के लिए एक टाई 2-cre लाइन के साथ पार किया गया था। 17 प्रजनन और जीनोटाइपिंग मानक के अनुसार किए गए थे। प्रक्रियाएं। सभी जानवरों का अध्ययन प्रीक्लिनिकल लेबोरेटरी (कारोलिंस्का इंस्टिट्यूट) में प्रासंगिक दिशानिर्देशों और विनियमों के अनुसार किया गया था और एथिकल कमेटी ऑन रिसर्च एनिमल केयर (लिंकोपिंग्स djurförsöksestiska nämd; DNR 1336) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

नेफ्रोटॉक्सिक सीरम (एनटीएस) - चूहों में प्रेरित नेफ्रोपैथी

सात- से 9-सप्ताह के चूहों को 50 मिली कंप्लीट फ्रायंड्स एडजुवेंट (मर्क) एससी प्राप्त हुआ, इसके बाद एनटीएस इंजेक्शन (iv; 6 मिली/किलोग्राम शरीर का वजन; प्रोबेटेक्स इंक।) दिन 4.18 पर मूत्र एकत्र किया गया 3, 7 , इंजेक्शन के 10 और 14 दिन बाद, और चूहों को 14 दिन में मार दिया गया।

सांख्यिकीय विश्लेषण

प्रिज्म 9.0 सॉफ्टवेयर (ग्राफपैड) का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया था।

डेटा को पहले सामान्यता (शापिरो-विल्क परीक्षण) के लिए जांचा गया था। जब वितरण गाऊसी था, तो डेटा का विश्लेषण एक पैरामीट्रिक परीक्षण (2 समूहों के लिए छात्र का टी-टेस्ट, और 2 से अधिक समूहों के लिए तुकी के पोस्ट-टेस्ट के साथ विचरण का विश्लेषण) का उपयोग करके किया गया था। जब वितरण गाऊसी नहीं था, गैर-पैरामीट्रिक परीक्षण (2 से अधिक समूहों के लिए डन के पोस्ट-टेस्ट के साथ फ्राइडमैन परीक्षण और 2 समूहों के लिए मान-व्हिटनी यू परीक्षण) का उपयोग किया गया था। P < 0.05="" पर="" अंतर="" को="" महत्वपूर्ण="" माना="">

परिणाम

Rarres1 पोडोसाइट्स द्वारा व्यक्त किया जाता है

हमने पहले murine और मानव गुर्दे के ऊतकों में Rarres1 के अभिव्यक्ति पैटर्न का आकलन किया। पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन विश्लेषण से पता चला है कि Rarres1 ग्लोमेरुलर में माउस रीनल कॉर्टेक्स (चित्रा 1 ए और बी 6) के ट्यूबलोइन्टरस्टीशियल अंश की तुलना में काफी अधिक है। मुराइन किडनी ऊतक के एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण विश्लेषण से पता चला कि Rarres1 विशेष रूप से पॉडोसाइट्स (चित्र 1c) द्वारा व्यक्त किया गया है। मनुष्यों में, Rarres1 को ग्लोमेरुलर ऊतक (चित्र 1d) में भी समृद्ध किया गया था। सामान्य मानव गुर्दे के ऊतक के इम्यूनोफ्लोरेसेंस में, Rarres1 ने ग्लोमेरुली (चित्र 1e) में एक उच्च संकेत दिखाया। डबल स्टेनिंग से पता चला कि Rarres1 केशिका छोरों में "बाहर" नेफ्रिन प्रतिक्रियाशीलता में स्थित था, जो पॉडोसाइट अभिव्यक्ति (चित्रा 1 एफ) का सुझाव देता है। Vimentin के साथ कोलोकलाइज़ेशन ने प्रमुख प्रक्रियाओं के लिए स्थानीयकरण का संकेत दिया। EC मार्कर CD31 या मेसेंजियल मार्कर -स्मूथ मसल एक्टिन (चित्र 1f) के लिए कोई अतिव्यापी प्रतिक्रियाशीलता नहीं देखी गई।

Rarres1 रिसेप्टर tyrosine kinase Axl के माध्यम से NF-kB और TGF-b1 सिग्नलिंग को बढ़ावा देता है

पॉडोसाइट्स में Rarres1 की भूमिका को स्पष्ट करने के लिए, हमने अमर मानव पोडोसाइट्स में इसकी अभिव्यक्ति के स्तर में हेरफेर किया। 16 Rarres1 स्तरों को महत्वपूर्ण रूप से मानव Rarres1 cDNA के साथ ट्रांसफ़ेक्ट पॉडोसाइट्स में अपग्रेड किया गया और Rarres के साथ ट्रांसफ़ेक्शन के बाद डाउन-रेगुलेटेड 1- siRNA (चित्र) को लक्षित किया गया। 2ए)। Rarres1 के ओवरएक्प्रेशन ने उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण-संबंधी जीन की अभिव्यक्ति को बढ़ा दिया, जबकि अंतर्जात Rarres1 के डाउनग्रेडेशन का विपरीत प्रभाव (चित्र 2 बी) था। चूंकि NF-kB सिग्नलिंग की उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण में महत्वपूर्ण भूमिका होती है, जिससे GN में फाइब्रोसिस और सूजन हो जाती है, हमने इन विट्रो में TGF-b1- प्रेरित NF-kB सिग्नलिंग सक्रियण को मापा। Rarres1 overexpression ने बेसलाइन पर और TGF-b1 उत्तेजना (चित्रा 2c) के बाद NF-kB मार्ग की सक्रियता को बढ़ा दिया। जैसा कि Rarres1 को रिसेप्टर टाइरोसिन किनसे Axl को सक्रिय करने के लिए सूचित किया गया है, और इस तरह से भड़काऊ स्तन कैंसर में NF-kB सिग्नलिंग मार्ग को बढ़ावा देता है, हमने मूल्यांकन किया कि क्या Axl गुर्दे के ऊतकों में Rarres1 का एक संभावित कार्यात्मक भागीदार है। TGF-b1- प्रेरित NF-kB सक्रियण को R428 द्वारा बाधित किया जा सकता है, Axl kinase21,22 (चित्र 2d) का एक चयनात्मक छोटा-अणु अवरोधक, और Rarres1 का ओवरएक्प्रेशन, Axl kinase (चित्र 2e) के संवैधानिक सक्रियण के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबद्ध है। R428 के साथ एक्सल गतिविधि का ह्रास, लेकिन siRNA द्वारा एक्सल की जीन साइलेंसिंग नहीं, एपिथेलियल-मेसेनकाइमल संक्रमण-संबंधित जीन की प्रेरित अभिव्यक्ति को कम कर सकती है, जैसा कि mRNA स्तर (चित्रा 2f) में कमी के रूप में प्रकट होता है। ध्यान दें, गैर-विहित NF-kB पथों की कोई सक्रियता नहीं पाई गई (पूरक चित्रा S1)। इस प्रकार, Rarres1 ने Axl kinase की सक्रियता के माध्यम से सुसंस्कृत पॉडोसाइट्स में NF-kB सिग्नलिंग को बढ़ावा दिया।

रेटिनोइक एसिड रिसेप्टर रिस्पॉन्डर1 ग्लोमेरुलर रोगों के विकास को बढ़ावा क्यों दे सकता है?

पॉडोसाइट्स में Rarres1 के निष्क्रिय होने से ग्लोमेरुलर असामान्यताएं नहीं होती हैं या एक एंटी-ग्लोमेरुलर बेसमेंट मेम्ब्रेन (GBM) GN मॉडल में नेफ्रोपैथी के परिणाम को संशोधित नहीं करता है।

विवो में पोडोसाइट्स में Rarres1 की भूमिका का विश्लेषण करने के लिए, हमने एक उपन्यास Rarres1flfl/flfl (floxed) माउस लाइन तैयार की और इसे Podocin-Cre चूहों के साथ पार करके Podocin-Cre Rarres1flfl/flfl चूहों (Creþ/Rarres1flfl/flfl) (चित्र 3a) का उत्पादन किया। ) फ्लक्स्ड / आरई एलील्स के जीनोटाइप की पहचान ईयर जीनोटाइपिंग (चित्रा 3 बी) द्वारा की गई थी। ट्यूबलोइंटरस्टीशियल और ग्लोमेरुलर अंशों के पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन विश्लेषण, साथ ही साथ यकृत ऊतक, ने विशेष रूप से ग्लोमेरुलस (सप्लीमेंट्री फिगर S2A) में एक्सॉन 3 को हटाने की पुष्टि की, और Creþ / Rarres1flfl / flfl चूहों से ग्लोमेरुली में Rarres1 प्रोटीन का स्तर कम हो गया। 3सी)।

चित्र 4|क्रोनिक किडनी रोग के रोगियों में ग्लोमेरुलर और पेरिटुबुलर केशिका एंडोथेलियल कोशिकाओं में Rarres1 का अपग्रेडेशन। (ए) मधुमेह अपवृक्कता (डीएन), वास्कुलिटिस, आईजीए नेफ्रोपैथी (आईजीएएन), और नियंत्रण (सीटीआरएल) विषयों के रोगियों से पृथक ग्लोमेरुली के माइक्रोएरे डेटा में रैरेस1, कोलेजन1ए2 (सीओएल1ए2), और नेफ्रिन (एनपीएचएस1) जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण। 4,6,24–26 *पी < 0.05,="" **पी="">< 0.01,="" ***पी="">< 0="" .001="" बनाम="" नियंत्रण="" विषय।="" (बी)="" डीएन="" (एन="5)" और="" नियंत्रण="" (एन="5)" के="" रोगियों="" से="" पृथक="" ग्लोमेरुली="" में="" रार्रेस1,="" सीओएल1ए2="" और="" एनपीएचएस1="" जीन="" के="" लिए="" मात्रात्मक="" पोलीमरेज़="" चेन="" रिएक्शन="" विश्लेषण।="" **p="">< 0.01,="" ***p=""><0.001 बनाम="" नियंत्रण="" विषय।="" (="" c="" )="" dn,="" वास्कुलिटिस,="" igan="" और="" नियंत्रण="" रोगियों="" से="" पृथक="" ट्यूबलर="" अंश="" के="" माइक्रोएरे="" डेटा="" में="" rarres1="" और="" col1a2="" जीन="" अभिव्यक्ति="" का="" विश्लेषण।="" *="" पी=""><0.05, **="" पी=""><0.01, ***="" पी=""><0.001 बनाम="" नियंत्रण="" विषय।="" (डी)="" डीएन="" (एन="5)," एंटी-न्यूट्रोफिल="" साइटोप्लाज्मिक="" ऑटोएंटीबॉडी="" (एएनसीए)="" वास्कुलिटिस="" (एन="4)," और="" आईजीएएन="" के="" साथ="" नियंत्रण="" और="" रोगियों="" से="" मानव="" गुर्दे="" के="" कॉर्टिकल="" ऊतक="" में="" रर्रेस="" 1="" इम्यूनोहिस्टोकेमिकल="" धुंधला="" के="" प्रतिनिधि="" फोटोमिकोग्राफ।="" एन="5)।" तीर="" रेरेस="" 1-सकारात्मक="" पॉडोसाइट्स="" (नियंत्रण)="" और="" एंडोथेलियल="" कोशिकाओं="" (ईसीएस)="" (डीएन,="" आईजीएएन,="" और="" वास्कुलिटिस)="" को="" इंगित="" करते="" हैं।="">

चित्र 4|(जारी) (ई) डीएन के साथ रोगियों के ग्लोमेरुली में Rarres1 की अभिव्यक्ति दिखाने वाले प्रतिनिधि मुखर सूक्ष्म चित्र। CD31 का उपयोग ECs के लिए एक मार्कर के रूप में किया गया था। बार्स=50/10 मिमी। ( च ) आरएनएस्कोप के प्रतिनिधि कन्फोकल एफएल फ्लोरोसेंट चित्र पीईसीएएम में Rarres1 जीन अभिव्यक्ति दिखा रहे हैं 1- डीएन के साथ रोगियों के ट्यूबलर अंश में कोशिकाओं को सह-व्यक्त करते हैं। डेटा को माध्य ± SEM के रूप में व्यक्त किया जाता है। छात्र के टी-टेस्ट को 2 समूहों के बीच तुलना के लिए नियोजित किया गया था। बार्स=50/10 मिमी। इस छवि को देखने का अनुकूलन करने के लिए, कृपया इस लेख का ऑनलाइन संस्करण www.kidney-international.org पर देखें।

Creþ/Rarres1flfl/flfl चूहों का जन्म एक अपेक्षित मेंडेलियन वंशानुक्रम अनुपात में हुआ था और वे व्यवहार्य और उपजाऊ थे (डेटा नहीं दिखाया गया)। नियमित प्रकाश और इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म परीक्षा (सप्लीमेंट्री फिगर S2B और C) द्वारा विश्लेषण के अनुसार गुर्दे नियंत्रण लिटमेट्स (Cre- / Rarres1flfl / flfl) से अप्रभेद्य थे। इसके अलावा, Creþ/Rarres1flfl/flfl चूहों (सप्लीमेंट्री फिगर S2D) में पॉडोसाइट प्रोटीन नेफ्रिन और सिनैप्टोपोडिन का वितरण अप्रभावित था।

विवो में गुर्दे की चोट में Rarres1 की भूमिका को स्पष्ट करने के लिए, Creþ/Rarres1flfl/flfl को NTS के साथ इलाज किया गया जिससे GBM में IgG जमा होता है, एल्बुमिनुरिया, और प्रगतिशील GN.23 एल्बुमिनुरिया का स्तर Creþ/Rarres1flfl/flfl और नियंत्रण दोनों में समान था। चूहों (चित्रा 3 डी)। प्रकाश सूक्ष्म परीक्षण से प्रभावित ग्लोमेरुली (चित्र 3e) के अनुपात में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ने जीबीएम या पैर प्रक्रिया के क्षरण की मोटाई में कोई अंतर नहीं दिखाया, और जीईसी दोनों समूहों (चित्रा 3 एफ) में समान रूप से प्रभावित हुए। पोडोसाइट मार्कर नेफ्रिन, Wt1 और सिनैप्टोपोडिन दोनों समूहों (सप्लीमेंट्री फिगर S3A) में समान रूप से प्रभावित हुए थे। इसके अलावा, सीडी 31 का उपयोग करने वाले ईसीएस के लिए धुंधला हो जाना समूहों (पूरक चित्रा एस 3 बी और सी) के बीच ग्लोमेरुली या पेरिटुबुलर केशिकाओं में कोई अंतर नहीं दिखाता है। इसके अलावा, एनटीएस (सप्लीमेंट्री फिगर एस 4) के साथ इलाज किए गए दोनों समूहों में फाइब्रोसिस और सूजन-संबंधी जीन की अभिव्यक्ति को समान रूप से ऊंचा किया गया था।

Rarres1 अभिव्यक्ति क्रोनिक किडनी रोग (CKD) में ग्लोमेरुलर और पेरिटुबुलर केशिका ईसीएस में प्रेरित है

CKD में Rarres1 की भूमिका का पता लगाने के लिए, हमने सार्वजनिक रूप से उपलब्ध RNA डेटा सेट में इसकी अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया। हमने DN, ANCA से जुड़े वास्कुलिटिस, और IgAN (चित्र 4a), 4,6, 24-26 के रोगियों से पृथक ग्लोमेरुली में उल्लेखनीय रूप से उन्नत Rarres1 स्तर देखा, जबकि अन्य पॉडोसाइट-जुड़े जीन, उदाहरण के लिए, नेफ्रिन, महत्वपूर्ण रूप से डाउनग्रेड या अपरिवर्तित थे। . DN (n=5) के रोगियों से पृथक ग्लोमेरुली के हमारे मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन विश्लेषण ने Rarres1 अभिव्यक्ति (चित्र 4b) के शामिल होने की पुष्टि की। पॉडोसाइट्स के नुकसान के कारण, पॉडोसाइट जीन की अभिव्यक्ति आमतौर पर प्रगतिशील में कम हो जाती हैग्लोमेरुलर रोग, 6 और ग्लोमेरुलर Rarres1 से नेफ्रिन अभिव्यक्ति के अनुपात में DN बनाम स्वस्थ ग्लोमेरुली (चित्र 4 बी) में लगभग 20- गुना वृद्धि हुई थी। Rarres1 की अभिव्यक्ति को DN, ANCA से जुड़े वास्कुलिटिस और IgAN (चित्र 4c) में ट्यूबलोइंटरस्टीशियल टिशू डेटा सेट में भी अपग्रेड किया गया था। 8–11

इसके बाद, हमने DN (n 5), IgAN (n 5), और ANCA से जुड़े वास्कुलिटिस (n 4) के रोगियों से गुर्दे की बायोप्सी में प्रतिरक्षात्मक रूप से Rarres1 अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया। रोगग्रस्त ग्लोमेरुली में, Rarres1 धुंधला GECs के लिए स्थानीयकृत लग रहा था जैसा कि केशिका दीवारों (चित्रा 4d, इनसेट्स) के आंतरिक चेहरे पर प्रतिरक्षण द्वारा दिखाया गया है, जबकि पॉडोसाइट्स से संकेत कमजोर दिखाई दिया। ट्यूबलोइंटरस्टीशियल स्पेस में, ईसी अभिव्यक्ति का सुझाव देते हुए पेरिटुबुलर केशिकाओं (चित्रा 4 डी, इनसेट्स) में धुंधलापन का पता चला था। CD31 के साथ डबल इम्यूनोलेबलिंग ने ग्लोमेरुली और पेरिटुबुलर केशिकाओं (चित्र 4e) दोनों में ईसीएस के स्थानीयकरण को मान्य किया। इसी तरह, डबल RNAscope प्रयोगों ने DN (चित्र 4f) में PECAM1 mRNA के साथ Rarres1 mRNA के कोलोकलाइज़ेशन को दिखाया। एक साथ लिया गया, ग्लोमेरुलर और पेरिटुबुलर केशिका ईसी में Rarres1 अभिव्यक्ति का समावेश सीकेडी में एक सामान्य घटना थी।

ECs में Rarres1 को ओवरएक्सप्रेस करने वाली माउस लाइन का निर्माण और लक्षण वर्णन

जैसा कि Rarres1 मानव CKD में प्रेरित है, हमने एक उपन्यास ट्रांसजेनिक माउस लाइन उत्पन्न की जिसमें Rarres1 cDNA को CAG प्रमोटर के तहत Rosa26 ठिकाने में पेश किया गया था, 27 ब्याह स्वीकर्ता साइटों (चित्र 5a) के बीच एक lox-STOP-lox कैसेट के साथ। रार्रेस 1_ टाई 2_ KI चूहों को उत्पन्न करने के लिए लाइन को एक टाई 2- cre लाइन के साथ पार किया गया था, और चूहों को नॉकिन और Cre एलील्स (चित्र 5a) के लिए कान जीनोटाइपिंग द्वारा पहचाना गया था। रेर्रेस 1_टाई2_केआई चूहों ने गुर्दे के ऊतकों (चित्रा 5बी) में Rarres1 प्रोटीन के महत्वपूर्ण रूप से बढ़े हुए स्तर को दिखाया, और FACS-सॉर्ट किए गए GFP-पॉजिटिव में Rarres1 mRNA अभिव्यक्ति के विश्लेषण द्वारा सफल नॉकिन रणनीति को और अधिक मान्य किया गया। GECs (चित्र 5c)।

हमने रेर्रेस के गुर्दे को फेनोटाइप किया1_टाई2_KI चूहों और आयु-मिलान समूहों में चूहों को नियंत्रित करते हैं। हल्के सूक्ष्म परीक्षण से, गुर्दे की आकृति विज्ञान रार्रेस में अप्रभेद्य था 1_ टाई 2_ नियंत्रण लिटमेट्स (चित्रा 5 डी) से केआई चूहों। इसी तरह, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ने एक अपरिवर्तित जीबीएम मोटाई और पॉडोसाइट फुट प्रक्रिया चौड़ाई (चित्रा 5e) दिखाई। इसके अलावा, पॉडोसाइट मार्करों नेफ्रिन और सिनैप्टोपोडिन की अभिव्यक्ति Rarres1 ओवरएक्सप्रेसिंग ग्लोमेरुली (चित्र 5f) में अप्रभावित लग रही थी। ध्यान दें, अन्य प्रमुख अंगों ने मैक्रोस्कोपिक या सूक्ष्म रूप से कोई स्पष्ट असामान्यताएं नहीं दिखाईं (डेटा नहीं दिखाया गया)।

चित्र 5|एंडोथेलियल सेल-विशिष्ट Rarres1 नॉकिन (Rarres1_टाई2_KI) चूहों की स्थापना। (ए) सशर्त नॉकिन चूहों की एक पीढ़ी जिसमें आरआर-लोक्सपी पुनर्संयोजन प्रणाली का उपयोग करके विशेष रूप से एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसीएस) में Rarres1 अभिव्यक्ति को प्रेरित किया जाता है। टाई 2- Cre चूहों को लक्ष्य वेक्टर (Rarres 1_ कैसेटþ) को व्यक्त करने वाले चूहों के साथ पार किया गया था, जिसमें ब्याह के बीच एक lox-STOP-lox कैसेट था (जारी)

चित्र 5|(जारी) स्वीकर्ता साइट और सीएजी प्रमोटर के तहत Rarres1 cDNA, जिसे Rosa26 ठिकाने में पेश किया गया था, की पहचान ईयर जीनोटाइपिंग द्वारा की गई थी। 4 सप्ताह की उम्र में कान की तैयारी और पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) द्वारा जीनोटाइपिंग की पुष्टि की गई थी। (बी) प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा ईसी-विशिष्ट Rarres1 नॉकिन (Rarres1_टाई2_KI) चूहों से वृक्क प्रांतस्था में Rarres1 की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति को दर्शाता है। **P < 0.01="" बनाम="" नियंत्रण="" (ctrl.;="" cre-="" arres1_टाई2_ki,="" n="5," मान-व्हिटनी="" u="" परीक्षण)।="" (सी)="" पृथक="" ईसी="" में="" rarres1="" के="" लिए="" मात्रात्मक="" पीसीआर।="" **p=""><0.01 बनाम="" नियंत्रण="" (cre-="" arres1_टाई2_ki,="" n="3," छात्र="" का="" t-परीक्षण)।="" (डी)="" चूहों="" के="" विभिन्न="" समूहों="" में="" विशिष्ट="" ग्लोमेरुलर="" संरचनाओं="" को="" दिखाने="" वाले="" आवधिक="" एसिड-शिफ-दाग="" वाले="" वर्गों="" के="" प्रतिनिधि="" फोटोमिकोग्राफ।="" (ई)="" मीन="" ग्लोमेरुलर="" बेसमेंट="" मेम्ब्रेन="" (जीबीएम)="" मोटाई="" के="" प्रतिनिधि="" फोटोमिकोग्राफ="" और="" परिमाणीकरण,="" और="" ट्रांसमिशन="" इलेक्ट्रॉन="" माइक्रोस्कोपी="" एनालिसिस="" (स्टूडेंट्स="" टी-टेस्ट)="" द्वारा="" चूहों="" के="" विभिन्न="" समूहों="" में="" प्रति="" मिमी="" जीबीएम="" स्लिट्स="" की="" संख्या।="" (="" च="" )="" ईसी-विशिष्ट="" rarres1="" नॉक-इन="" चूहों="" (rarre="" 1_टाई2_ki)="" और="" ctrl="" में="" पॉडोसाइट-विशिष्ट="" मार्कर="" सिनैप्टोपोडिन="" और="" नेफ्रिन="" की="" अभिव्यक्ति="" दिखाने="" वाले="" प्रतिनिधि="" मुखर="" सूक्ष्म="" चित्र।="" चूहे।="" बार्स="10" मिमी।="" डेटा="" को="" माध्य="" ±="" sem="" के="" रूप="" में="" व्यक्त="" किया="" जाता="" है।="" इस="" छवि="" को="" देखने="" का="" अनुकूलन="" करने="" के="" लिए,="" कृपया="" इस="" लेख="" का="" ऑनलाइन="" संस्करण="" www.kidney-international.org="" पर="">

ECs में Rarres1 का प्रेरण NF-kB सिग्नलिंग मार्ग और नेफ्रोपैथी के परिणाम को Axl सक्रियण को विनियमित करके नियंत्रित करता है।

मूल्यांकन करने के लिए कि क्या ईसीएस में Rarres1 अभिव्यक्ति रोग की प्रगति को नियंत्रित करती है, हमने एनटीएस के एक इंजेक्शन के साथ ट्रांसजेनिक चूहों और उनके लिटरमेट्स में जीएन को प्रेरित किया। रेर्रेस1_- टाई2_केआई चूहों ने 3 दिनों के बाद नियंत्रण की तुलना में महत्वपूर्ण रूप से उच्च एल्बुमिनुरिया स्तर विकसित किया, जबकि एल्ब्यूमिन्यूरिया में कोई महत्वपूर्ण अंतर 7, 10 और 14 दिनों (चित्रा 6ए) में नहीं देखा गया था। प्रेरण के 14 दिन बाद हिस्टोलॉजिक विश्लेषण से पता चला कि रेरेस 1_ टाई 2_ केआई चूहों में अधिक ग्लोमेरुलर परिवर्तन नहीं थे, जैसे कि स्क्लेरोटिक और अर्धचंद्र घाव (चित्रा 6 बी)। हालांकि, इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म मूल्यांकन से पता चला है कि रेर्रेस 1_टाई2_केआई चूहों (चित्रा 6सी) में एक महत्वपूर्ण रूप से मोटा जीबीएम और अधिक पैर प्रक्रिया का क्षरण। इसके अलावा, रेर्रेस 1_टाई2_केआई चूहों ने किडनी कॉर्टेक्स (चित्रा 6डी) में -स्मूथ मसल एक्टिन के बढ़े हुए स्तर को दिखाया। पॉडोसाइट मार्करों नेफ्रिन, सिनैप्टोपोडिन और डब्ल्यूटी1 के विश्लेषण से पता चला है कि समर्पण और पॉडोसाइट्स का एक महत्वपूर्ण नुकसान (चित्रा 6 डी) का सुझाव देते हुए एक गहन कमी आई है। महत्वपूर्ण रूप से, रैरेस 1_टाई2_केआई ग्लोमेरुली ने नियंत्रण जानवरों की तुलना में कम डब्ल्यूटी1-पॉजिटिव पॉडोसाइट्स दिखाया, यह दर्शाता है कि ईसी-व्यक्त रार्रेस1 पॉडोसाइट क्षति को बढ़ावा दे रहा था। इसके अलावा, रेर्रेस 1_टाई2_केआई ग्लोमेरुली (चित्र 6e) में अधिक फाइब्रिन थ्रोम्बी का पता चला था। इसके अनुरूप, विभिन्न सूजन, फाइब्रोसिस, और वृक्क ट्यूबलर चोट से संबंधित जीनों की अभिव्यक्ति को रैरेस 1_- टाई 2_ केआई चूहों में महत्वपूर्ण रूप से अपग्रेड किया गया, जैसा कि इल के लिए वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन विश्लेषण द्वारा दिखाया गया है। -1बीटा, Col1a1, TGF-b1, और गुर्दे की चोट के अणु -128 किडनी कॉर्टेक्स ऊतक (चित्र 6f) में। हालांकि, समूहों (चित्रा 6 जी) के बीच रक्त यूरिया नाइट्रोजन और एस-क्रिएटिनिन मूल्यों में कोई अंतर नहीं पाया गया। इसके अलावा, सीडी 31 का उपयोग करते हुए ईसीएस के लिए धुंधला हो जाना समूहों (पूरक चित्रा एस 5 ए और बी) के बीच ग्लोमेरुली या पेरिटुबुलर केशिकाओं में कोई अंतर नहीं दिखाता है। एक साथ लिया गया, Rarres1 अभिव्यक्ति के ईसी-विशिष्ट प्रेरण ने एनटीएस-प्रेरित नेफ्रोपैथी में ग्लोमेरुलर विकृति को बढ़ा दिया।

यंत्रवत् रूप से, हमने विश्लेषण किया कि क्या ईसीएस में Rarres1 ओवर-एक्सप्रेशन ने विवो में एक्सल और एनएफ-केबी सिग्नलिंग की सक्रियता को बढ़ावा दिया, हमारे इन विट्रो अवलोकनों (चित्रा 2) के समान। दोनों रार्रेस 1_ टाई 2_ एनटीएस के साथ इलाज किए गए केआई और नियंत्रण चूहों ने एक्सल सिग्नलिंग मार्ग की सक्रियता को प्रदर्शित किया जैसा कि एक्सल फास्फोरिलीकरण (चित्रा 6h) में वृद्धि द्वारा दिखाया गया है। हालाँकि, यह सक्रियण रार्रेस 1_- टाई 2_ KI चूहों (चित्र 6h) में अधिक महत्वपूर्ण था। इसके अनुरूप, इन चूहों में NF-kB पाथवे सक्रियण को बढ़ावा दिया गया था जैसा कि ग्लोमेरुली (चित्र 6i) में pP 65- सकारात्मक नाभिक की संख्या द्वारा दिखाया गया है। जब पश्चिमी सोख्ता द्वारा pP65 के स्तर को मापा गया, तो हमने NF-kB पाथवे सक्रियण के लिए एक समान प्रवृत्ति का पता लगाया, हालांकि यह महत्वपूर्ण नहीं था, संभवतः एक बाहरी (सप्लीमेंट्री फिगर S5C) के कारण।

ECs में Rarres1 को निष्क्रिय करने से GBM विरोधी ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस मॉडल में ग्लोमेरुलर क्षति कम हो जाती है

CKD में EC-व्युत्पन्न Rarres1 की रोगजनक भूमिका को मान्य करने के लिए, हमने एक माउस लाइन उत्पन्न की जिसमें Rarres1 को ECs में टाई 2- Cre (चित्र 7a) का उपयोग करके हटा दिया गया था। फ्लक्स्ड और आरई एलील्स के जीनोटाइप की पहचान ईयर जीनोटाइपिंग (चित्रा 7 बी) द्वारा की गई थी। NTS- उपचारित चूहों में Rarres1 के अपग्रेडेशन की प्रवृत्ति थी, जिसे Rarres 1_टाई2_KO चूहों (चित्र 7c) में समाप्त कर दिया गया था। चूहों ने कोई स्पष्ट गुर्दे की असामान्यताएं नहीं दिखाईं (डेटा नहीं दिखाया गया)। एनटीएस के इंजेक्शन ने रेर्रेस 1_टाई2_केओ और नियंत्रण (चित्रा 7डी)में इसी तरह के एल्बुमिनुरिया को प्रेरित किया। हालांकि, प्रेरण के 14 दिन बाद हिस्टोलॉजिक विश्लेषण ने रेरेस 1_- टाई 2_ केओ चूहों (चित्रा 7e) में कम ग्लोमेरुलर परिवर्तन दिखाया। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में, रार्रेस 1_टाई2_KO चूहों ने जीबीएम (चित्रा 7एफ) के पैर की प्रक्रिया में कमी और मोटा होना दिखाया। इम्यूनोस्टेनिंग ने एएसएमए, नेफ्रिन या सिनैप्टोपोडिन (चित्रा 7 जी) के लिए कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया। हालाँकि, WT1-सकारात्मक पॉडोसाइट्स की संख्या रार्रेस में काफी अधिक थी1_टाई2_KO चूहों (चित्र 7g)। pP65 के लिए धुंधला होने से रार्रेस 1_ टाई 2_ KO ग्लोमेरुली में NF-kB सिग्नलिंग पाथवे (चित्र 7h) की भागीदारी का सुझाव देते हुए सकारात्मक नाभिक की संख्या में कमी देखी गई।

चित्र 6|(जारी) माध्य ग्लोमेरुलर बेसमेंट मेम्ब्रेन (GBM) मोटाई की मात्रा का ठहराव और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा चूहों के विभिन्न समूहों में प्रति मिमी GBM स्लिट्स की संख्या अनुभागों का विश्लेषण करती है (Ctrl।, n=4; NTS-ctrl।, n { {3}}; NTS-Rarres1_टाई2_KI, n=12)। ( d ) चूहों के विभिन्न समूहों से गुर्दे में नेफ्रिन, सिनैप्टोपोडिन, -चिकनी पेशी एक्टिन (⍺Sma), और WT1 की अभिव्यक्तियों को दर्शाने वाले प्रतिनिधि मुखर सूक्ष्म चित्र। बार्स {{10}}/10 मिमी। Sma-पॉजिटिव क्षेत्र को प्रति कॉर्टिकल क्रॉस-सेक्शन में गिना जाता था, और WT1 को प्रति ग्लोमेरुलस (Ctrl।, n=2; NTS-ctrl।, n=3; NTS-Rarres {{18}) में गिना जाता था। }टाई2_केआई, एन {{20}})। (ई) ट्राइकोम स्टेनिंग (प्रति ग्लोमेरुलर क्रॉस-सेक्शन की गणना) द्वारा पता चला ग्लोमेरुली में फाइब्रिन थ्रोम्बी की उपस्थिति (Ctrl।, n=3; NTS-ctrl।, n=4; NTS-Rarres{{ 26}}टाई2_केआई, एन=5)। (च) एनटीएस-उपचारित चूहों (Ctrl।, n=4; NTS-ctrl।, n=6 के वृक्क प्रांतस्था में विभिन्न सूजन, फाइब्रोसिस, और वृक्क ट्यूबलर चोट से संबंधित जीन के सापेक्ष mRNA स्तर। -10; NTS-Rarres1_टाई2_KI, n=6-10)। (छ) एनटीएस-सीटीआरएल में सीरम क्रिएटिनिन और रक्त यूरिया नाइट्रोजन (बीयूएन) का स्तर। (n=3) और NTS-Rarres1_टाई2_KI (n=3) चूहे। (एच) प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा दस्तावेज और एनटीएस-उपचारित चूहों (एनटीएस-सीटीआरएल।, एन=4; एनटीएस-रार्रेस 1_) के विभिन्न समूहों में वृक्क प्रांतस्था में पैक्सिल के सापेक्ष प्रोटीन स्तर को दर्शाने वाले सारांशित डेटा। टाई 2_केआई, एन=5)। (i) एनटीएस-उपचारित चूहों के विभिन्न समूहों से वृक्क कॉर्टिकल ऊतक में pP65 इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला के प्रतिनिधि फोटोमिकोग्राफ। पीपी 65- प्रति ग्लोमेरुली सकारात्मक नाभिक चूहों के विभिन्न समूहों (Ctrl।, n=7; NTS-ctrl।, n=8; NTS-Rarres 1_) में निर्धारित किए गए थे। 2_केआई, एन=14)। EC-विशिष्ट Rarres1 नॉक-इन चूहों (Rarres1_टाई2_KI चूहों); Rarres1 कैसेट के साथ और बिना Cre अभिव्यक्ति (Ctrl।) के चूहों को नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। #P <0.05, ##p=""><0.01, ###p=""><0.001 बनाम="" अनुपचारित="" नियंत्रण="" (ctrl।),="" *p=""><0.05 बनाम="" nts-="" उपचारित="" नियंत्रण="" (nts-ctrl।)।="" डेटा="" को="" माध्य="" ±="" sem="" के="" रूप="" में="" व्यक्त="" किया="" जाता="" है।="" छात्र="" के="" टी-टेस्ट="" को="" 2="" समूहों="" के="" बीच="" तुलना="" के="" लिए="" नियोजित="" किया="" गया="" था।="" कई="" तुलनाओं="" के="" लिए="" तुकी="" के="" बाद="" के="" परीक्षण="" के="" बाद="" विचरण="" का="" एकतरफा="" विश्लेषण="" 3="" या="" अधिक="" के="" समूहों="" के="" लिए="" उपयोग="" किया="" गया="" था।="" इस="" छवि="" को="" देखने="" का="" अनुकूलन="" करने="" के="" लिए,="" कृपया="" इस="" लेख="" का="" ऑनलाइन="" संस्करण="" www.kidney-international.org="" पर="">

बहस

Rarres1 को पहली बार tazarotene29 के साथ इलाज किए गए त्वचा बेड़ा संस्कृतियों में पहचाना गया था और प्रोस्टेट कैंसर सेल लाइनों में एक आक्रमण दमनकर्ता के रूप में कार्य करने के लिए दिखाया गया है। 30 सूजन वाले स्तन कैंसर में, Rarres1 इन विट्रो में एक्सल सिग्नलिंग मार्ग की मध्यस्थता के माध्यम से कैंसर कोशिकाओं के आक्रमण को नियंत्रित करता है। . विस्तार से, Rarres1 एक्सल के प्रोटीसम-निर्भर डिग्रेडेशन को रोककर एक्सल को स्थिर करता है। इसके अलावा, SUM149 कोशिकाओं में Rarres1 की कमी Axl अभिव्यक्ति को कम कर देती है और NF-kB को निष्क्रिय कर देती है, जिससे सूजन वाले स्तन कैंसर कोशिकाओं के आक्रमण में कमी आती है। इसके अलावा, Rarres1 अभिव्यक्ति उन्नत फाइब्रोसिस वाले रोगियों में प्रेरित होती है, और Rarres1 की एक प्रोफाइब्रोटिक भूमिका रही है। एक चूहे के फेफड़े के फाइब्रोसिस मॉडल में और यकृत स्टैलेट कोशिकाओं के फाइब्रोजेनिक सक्रियण के दौरान सुझाव दिया गया। 31 एक साथ लिया गया, पिछले इन विट्रो अध्ययनों में फाइब्रोसिस, सूजन और कैंसर के आक्रमण में Rarres1 की भूमिका का सुझाव दिया गया है।

प्रारंभ में, Rarres1 ने हमारी रुचि बढ़ाई क्योंकि यह पॉडोसाइट कोशिकाओं में अत्यधिक समृद्ध था। हम दिखा सकते हैं कि Rarres1 ने एक्सल की मध्यस्थता वाले NF-kB पाथवे सक्रियण के माध्यम से पोडोसाइट्स में सूजन और प्रोफाइब्रोटिक सिग्नलिंग को बढ़ावा दिया। दूसरी ओर, पॉडोसाइट-विशिष्ट नॉकआउट जानवर स्वस्थ परिस्थितियों में नियंत्रण के साथ-साथ जीएन के माउस मॉडल की तुलना में कोई स्पष्ट अंतर दिखाने में विफल रहे। यह प्रतिपूरक तंत्र के कारण हो सकता है क्योंकि NF-kB सिग्नलिंग मार्ग कई अणुओं और जैविक प्रक्रियाओं द्वारा नियंत्रित होता है।

मधुमेह के रोगियों की आणविक रूपरेखा ने संकेत दिया कि Rarres1 डीएन में ग्लोमेरुलर और पेरिटुबुलर केशिका ईसी में प्रेरित था। महत्वपूर्ण रूप से, मधुमेह रोगियों में नेफ्रोपैथी के बिना ईसीएस में Rarres1 अभिव्यक्ति का पता नहीं चला था। इसलिए, हम अनुमान लगाते हैं कि Rarres1 डायबिटिक माइक्रोवस्कुलर रोग के लिए एक नया मार्कर हो सकता है, और प्लाज्मा और मूत्र के नमूनों में अध्ययन को गैर-इनवेसिव बायोमार्कर के रूप में Rarres1 की व्यवहार्यता का पता लगाने के लिए संकेत दिया गया है। हमने IgAN और वास्कुलिटिस के रोगियों में भी Rarres1 को शामिल करने की पहचान की। यह अनुमान लगाना आकर्षक है कि इन ग्लोमेरुलोपैथियों में Rarres1 की रोगजनक भूमिका है और रोग की प्रगति में योगदान देता है। कार्यात्मक रूप से, हमने दिखाया कि EC में Rarres1 को शामिल करने से GN के एक murine मॉडल में गुर्दे की चोट में वृद्धि हुई, जबकि ECs में Rarres1 की निष्क्रियता ने चोट को कम कर दिया। फेनोटाइपिकल विश्लेषण से पता चला है कि ECs में Rarres1 को ओवरएक्सप्रेस करने वाले चूहों में पॉडोसाइट्स प्रभावित हुए थे। यह रेरेस1 का पॉडोसाइट्स पर सीधा प्रभाव हो सकता है क्योंकि रेरेस के घुलनशील रूप का वर्णन किया गया है। 32 वैकल्पिक रूप से, पॉडोसाइट चोट ग्लोमेरुलस निस्पंदन बाधा के नुकसान के लिए माध्यमिक हो सकती है।

पहले, एंडोथेलियल एनएफ-केबी सक्रियण को वास्कुलिटिस में गुर्दे की बीमारी के विकास में एक रोगजनक भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है। विशेष रूप से, अर्धचंद्राकार जीएन के एक मॉडल में एंडोथेलियल एनएफ-केबी मार्ग के निषेध ने प्रगति को निरस्त कर दिया। एक्सल इनहिबिटर को प्रायोगिक एंटी-जीबीएम नेफ्रैटिस में फायदेमंद दिखाया गया है। सबसे चयनात्मक छोटे-अणु अवरोधक, R428 के साथ इलाज किए गए चूहे ने गुर्दे के कार्य का महत्वपूर्ण संरक्षण दिखाया और भड़काऊ साइटोकिन उत्पादन में कमी आई। 33 यह इंगित करता है कि मार्ग एक चिकित्सीय विकल्प हो सकता हैग्लोमेरुलर रोगप्रक्रियाएं। हालांकि, चूंकि एक्सल और एनएफ-केबी दोनों ही पूरे शरीर में कई अलग-अलग सेलुलर प्रक्रियाओं को संशोधित कर रहे हैं, इसलिए सीकेडी में फार्मास्युटिकल लक्ष्यीकरण के लिए यह एक अच्छा उम्मीदवार होने की संभावना नहीं है। Rarres1 किडनी से जुड़े अधिक लक्ष्य प्रदान कर सकता है।

टाई2-Cre को हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं के एक उप-जनसंख्या में अभिव्यक्ति को चलाने के लिए दिखाया गया है। इनमें से कुछ कोशिकाएं एनटीएस-प्रेरित मॉडल में सूजन प्रतिक्रिया को संशोधित कर सकती हैं, और इसलिए हम यह नहीं छोड़ सकते हैं कि हेमटोपोइएटिक सेल-व्युत्पन्न Rarres1 योगदान देता है टाई 2-Cre लाइनों में रोग की प्रगति। हालाँकि, जैसा कि हमने प्रतिरक्षा कोशिकाओं में घुसपैठ करने में किसी भी स्पष्ट Rarres1 अभिव्यक्ति का पता नहीं लगाया, हमें लगता है कि इसकी संभावना कम है।

जब यह पांडुलिपि तैयार की जा रही थी, चेन एट अल.32 ने Rarres1 के घुलनशील रूप की सूचना दी जो बढ़ावा देता हैग्लोमेरुलर रोगप्रगति। उन्होंने हमारी तरह, सामान्य मानव ग्लोमेरुलर रोगों में Rarres1 के अपग्रेडेशन की पहचान की। अध्ययन हमारी खोज का समर्थन करता है कि बढ़ी हुई Rarres1 अभिव्यक्ति गुर्दे की कार्यक्षमता में गिरावट के साथ संबंधित हैमानव ग्लोमेरुलर रोग. हालाँकि, हमारे परिणामों के विपरीत, उन्होंने निष्कर्ष निकाला कि Rarres1 का अपगमन पॉडोसाइट्स में अतिसक्रियता के कारण था। हम उस संभावना को बाहर नहीं कर सकते हैं, लेकिन हमने मानव रोगों में ईसी में Rarres1 अभिव्यक्ति के एक अलग प्रेरण का पता लगाया है। हमारे निष्कर्षों की व्याख्या करने वाला एक तंत्र यह हो सकता है कि पॉडोसाइट्स द्वारा उत्पादित Rarres1 का घुलनशील रूप GECs द्वारा लिया जाता है। हालाँकि, परिणाम जो हमने स्वस्थानी संकरण द्वारा ECs में Rarres1 mRNA का पता लगाया और यह कि Rarres1 को पेरिटुबुलर केशिका ईसी में भी प्रेरित किया गया था, इस विचार का दृढ़ता से समर्थन करते हैं कि गुर्दे की बीमारियों में Rarres1 की अभिव्यक्ति मुख्य रूप से एंडोथेलियल मूल की है।

चित्र 7|Rarres1 का एंडोथेलियल-विशिष्ट पृथक्करण नेफ्रोटॉक्सिक सीरम (NTS)-उपचारित चूहों में गुर्दे की चोट को दर्शाता है। ( ए ) सशर्त नॉकआउट चूहों की पीढ़ी जिसमें आरआर-लोक्सपी पुनर्संयोजन प्रणाली का उपयोग करके एंडोथेलियल कोशिकाओं में रेर्रेस 1 को विशिष्ट रूप से पृथक किया जाता है। Exon 3 को टाई2-Cre-मध्यस्थता पुनर्संयोजन पर हटा दिया जाता है। (बी) पूंछ की तैयारी और पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन द्वारा जीनोटाइपिंग की पुष्टि की गई थी (जारी)

चित्र 7|(जारी) 4 सप्ताह की आयु। (सी) प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा दस्तावेज़ और एनटीएस-उपचारित चूहों (एनटीएस-सीटीआरएल।, एन=4; एनटीएस-रार्रेस {{7}) के विभिन्न समूहों में वृक्क प्रांतस्था में Rarres1 के सापेक्ष प्रोटीन स्तर को दर्शाने वाले सारांशित डेटा। टाई 2_KO, n=4) और अनुपचारित चूहों (नियंत्रण [Ctrl।], n {{1 0}})। **पी < 0.01.="" (डी)="" एनटीएस="" उपचार="" पर="" चूहों="" के="" विभिन्न="" समूहों="" में="" यूएसीआर="" (मूत्र="" एल्ब्यूमिन-से-क्रिएटिनिन="" अनुपात)="" (ctrl।,="" n="7-11;" दुर्लभ="" 1_टाई2_ko,="" n="" {="" {19}}–8)।="" (ई)="" चूहों="" के="" विभिन्न="" समूहों="" में="" विशिष्ट="" ग्लोमेरुलर="" संरचना="" परिवर्तन="" दिखाने="" वाले="" फोटोमाइक्रोग्राफ="" और="" मात्रा="" का="" ठहराव।="" ग्लोमेरुलर="" घावों="" की="" पहचान="" आवधिक="" एसिड-शिफ-दाग="" वाले="" वर्गों="" (ctrl।,="" n="3;" nts-="" उपचार="" नियंत्रण="" [nts-ctrl।],="" n="12;" nts="" दुर्लभ="" 1_टाई{)="" में="" की="" गई="" थी।="" {27}}केओ,="" एन="8)।" (च)="" मीन="" ग्लोमेरुलर="" बेसमेंट="" मेम्ब्रेन="" (gbm)="" मोटाई="" के="" प्रतिनिधि="" फोटोमिकोग्राफ="" और="" परिमाणीकरण="" और="" ट्रांसमिशन="" इलेक्ट्रॉन="" माइक्रोस्कोपी="" द्वारा="" चूहों="" के="" विभिन्न="" समूहों="" में="" प्रति="" मिमी="" gbm="" स्लिट्स="" की="" संख्या="" अनुभागों="" का="" विश्लेषण="" करती="" है="" (ctrl।,="" n="6;" nts-ctrl।="" ,="" एन="13;" एनटीएस-रार्रेस1_टाई2_ko,="" n="16)।" (छ)="" चूहों="" के="" विभिन्न="" समूहों="" से="" गुर्दे="" में="" नेफ्रिन,="" सिनैप्टोपोडिन,="" -स्मूथ="" मसल="" एक्टिन="" (sma),="" और="" wt1="" के="" भावों="" को="" दर्शाने="" वाले="" प्रतिनिधि="" मुखर="" सूक्ष्म="" चित्र।="" बार्स="50/10" मिमी।="" sma-पॉजिटिव="" क्षेत्र="" को="" प्रति="" कॉर्टिकल="" क्रॉस-सेक्शन="" (nts-ctrl।,="" n="8;" nts-rarres="" 1_टाई2_ko,="" n="4)" में="" गिना="" जाता="" था।="" (="" ज="" )="" एनटीएस-उपचारित="" चूहों="" के="" विभिन्न="" समूहों="" से="" वृक्क="" कॉर्टिकल="" ऊतक="" में="" pp65="" इम्यूनोहिस्टोकेमिकल="" धुंधला="" के="" प्रतिनिधि="" फोटोमिकोग्राफ।="" pp="" 65-प्रति="" ग्लोमेरुली="" सकारात्मक="" नाभिक="" चूहों="" के="" विभिन्न="" समूहों="" (nts-ctrl।,="" n="7;" nts-rarres="" 1_टाई="" 2_="" ko,="" n="" {{="" में="" निर्धारित="" किए="" गए="" थे।="" 56}})।="" ####p=""><0.001 बनाम="" अनुपचारित="" ctrl।,="" *p=""><0.05 बनाम="" nts-ctrl।="" डेटा="" को="" माध्य="" ±="" sem="" के="" रूप="" में="" व्यक्त="" किया="" जाता="" है।="" छात्र="" के="" टी-टेस्ट="" को="" 2="" समूहों="" के="" बीच="" तुलना="" के="" लिए="" नियोजित="" किया="" गया="" था।="" कई="" तुलनाओं="" के="" लिए="" तुकी="" के="" बाद="" के="" परीक्षण="" के="" बाद="" विचरण="" का="" एकतरफा="" विश्लेषण="" 3="" या="" अधिक="" के="" समूहों="" के="" लिए="" उपयोग="" किया="" गया="" था।="" इस="" छवि="" को="" देखने="" का="" अनुकूलन="" करने="" के="" लिए,="" कृपया="" इस="" लेख="" का="" ऑनलाइन="" संस्करण="" www.kidney-international.org="" पर="">

इस अध्ययन में कुछ सीमाएँ हैं जिन्हें स्वीकार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, इन विट्रो अध्ययन पोडोसाइट्स में किया गया है, जबकि विवो में हमने ईसीएस में अभिव्यक्ति में हेरफेर किया है। इसलिए, हम सीधे Rarres1 को ECs में Axl सक्रियण से नहीं जोड़ सकते। दूसरा, जबकि हम पॉडोसाइट्स में एनएफ-केबी सिग्नलिंग के एक रेरेस 1- प्रेरित (एक्सल-आश्रित) सक्रियण की पहचान कर सकते हैं, हमने इस प्रक्रिया के पीछे आणविक तंत्र की जांच नहीं की। पिछली खोज का पता लगाने के लिए और अधिक अध्ययनों की आवश्यकता है कि Rarres1 अपने प्रोटीसम-आश्रित गिरावट को रोककर एक्सल सक्रियण को बढ़ावा देता है। अंत में, हमने अपने नॉकआउट/-इन जानवरों को केवल एनटीएस-प्रेरित नेफ्रोपैथी मॉडल के साथ चुनौती दी। इसलिए, पशु मॉडल में अधिक अध्ययनों को यह देखने के लिए संकेत दिया गया है कि क्या अन्य रोग प्रक्रियाओं में भी Rarres1 की रोगजनक भूमिका है।

संक्षेप में, हमारे अध्ययन से पता चलता है कि आम मानव ग्लोमेरुलोपैथियों में, पोडोसाइट-समृद्ध प्रोटीन Rarres1 ईसीएस में प्रेरित होता है, जिससे सूजन, पॉडोसाइट चोट और फाइब्रोसिस होता है। रिसेप्टर टाइरोसिन किनसे एक्सल (चित्र 7) के सक्रियण के माध्यम से एनएफ-केबी सिग्नलिंग मार्ग को बढ़ाकर इसकी संभावित मध्यस्थता की जाती है। Rarres1 माइक्रोवस्कुलर चोट का एक नया बायोमार्कर है और संभावित रूप से CKD में सूजन और फाइब्रोसिस को दबाने के लिए एक उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्य हो सकता है

खुलासा

एमएल एस्ट्राजेनेका, गोथेनबर्ग, स्वीडन का कर्मचारी है। जेपी के शोध को एस्ट्राजेनेका का समर्थन प्राप्त है। अन्य सभी लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी हित घोषित नहीं किया।

आभार

इस अध्ययन को केएम-एच ने डायबिटीज वेलनेस सेवरिज से और जेपी को केआई/एजेड इंटीग्रेटेड मेटाबोलिक सेंटर, मैरिएन ओच मार्कस वॉलेनबर्ग फाउंडेशन, स्वीडिश डायबिटीज फाउंडेशन, स्वीडिश किडनी फाउंडेशन और सेंटर फॉर इनोवेटिव मेडिसिन से समर्थन दिया था।

लेखक का योगदान

केएम-एच, एमएल, और जेपी ने अनुसंधान को डिजाइन किया; केएम-एच, डीडी, ईसी, एसजेड, और जीजी ने शोध किया; KM-H और XL ने डेटा का विश्लेषण किया; AW ने मानव नमूने प्रदान किए; और केएम-एच और जेपी ने पेपर लिखा।

रेटिनोइक एसिड रिसेप्टर रिस्पॉन्डर1 ग्लोमेरुलर रोगों के विकास को बढ़ावा क्यों दे सकता है?

पूरक सामग्री

अनुपूरक फ़ाइल (पीडीएफ)

तालिका S1। इस अध्ययन में वास्तविक समय आरटी-पीसीआर के लिए लक्ष्य जीन के प्राइमर जोड़े का उपयोग किया गया था।

तालिका S2। इस अध्ययन में एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया गया था। अनुपूरक फ़ाइल (पावरपॉइंट)

चित्रा S1। Rarres1 overexpression गैर-विहित NF-kB सिग्नलिंग मार्ग को सक्रिय नहीं करता है। प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा दस्तावेज़ और सारांशित डेटा दिखा रहा है कि Rarres1 का ओवरएक्प्रेशन 10 एनजी / एमएल टीजीएफ-बी 1 (एन=2) के साथ इलाज किए गए पॉडोसाइट्स में p100 / p52 को सक्रिय नहीं करता है। डेटा को ± एसडी के रूप में व्यक्त किया जाता है। छात्र के टी-टेस्ट को दो समूहों के बीच तुलना के लिए नियोजित किया गया था। यूटी, अनुपचारित।

चित्रा S2। पॉडोसाइट-विशिष्ट Rarres1 नॉकआउट (Creþ/Rarres1flfl/flfl) चूहों की स्थापना। (ए) ट्यूबलर और ग्लोमेरुलर अंशों के साथ-साथ यकृत ऊतक में पारंपरिक पीसीआर विश्लेषण। (बी) Cre-/Rarres1flfl/flfl और Creþ/Rarres1flfl/flfl चूहों में गुर्दे की विकृति का ऊतकीय परीक्षण (PAS-धुंधला)। (सी) प्रतिनिधि संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ (टीईएम) और माध्य ग्लोमेरुलर बेसमेंट मेम्ब्रेन (जीबीएम) मोटाई का परिमाणीकरण और चूहों के विभिन्न समूहों में प्रति मिमी जीबीएम स्लिट्स की संख्या (एन=3)। (डी) पॉडोसाइट-विशिष्ट Rarres1 नॉकआउट (Creþ/Rarres1flfl/flfl) और नियंत्रण (Cre- /Rarres1flfl/flfl) चूहों में पॉडोसाइट-विशिष्ट मार्करों, सिनैप्टोपोडिन और नेफ्रिन की अभिव्यक्ति दिखाने वाले प्रतिनिधि मुखर सूक्ष्म चित्र। बार=10 मिमी।

चित्रा S3। एनटीएस-उपचारित चूहों के गुर्दे में पॉडोसाइट मार्करों और सीडी31 की अभिव्यक्ति का स्तर। (ए) एनटीएस-उपचारित रार्रेस1 पॉडोसाइट-विशिष्ट नॉकआउट चूहों (Creþ/Rarres1flfl/flfl) से पोडोसाइट्स में नेफ्रिन, WT -1, और सिनैप्टोपोडिन की अभिव्यक्ति दिखाने वाले प्रतिनिधि मुखर सूक्ष्म चित्र और लिटरमेट्स को नियंत्रित करते हैं (Cre- /Rarres1flfl/ एफएलएफएल)। बार=10 मिमी (NTS Cre- /Rarres1flfl/flfl, n=4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl, n=5)। (बी) पेरिटुबुलर क्षेत्रों में सीडी 31-सकारात्मक केशिकाओं का अनुपात। प्रति माउस तीस पेरिटुबुलर क्षेत्रों का मूल्यांकन किया गया था। (NTS Cre- /Rarres1flfl/flfl, n= 4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl, n=4)। छात्र का टी टेस्ट। (सी) ग्लोमेरुली में सीडी31 सिग्नल की अर्धमात्रात्मक स्कोरिंग: 0=कोई सिग्नल नहीं, 1=कमजोर सिग्नल, 2=मध्यम सिग्नल, 3=मजबूत सिग्नल। प्रत्येक माउस से दस ग्लोमेरुली का मूल्यांकन किया गया (NTS Cre–/ Rarres1flfl/flfl, n=4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl, n=4)। छात्र का टी टेस्ट।

चित्रा S4। एनटीएस-उपचारित चूहों के गुर्दे में फाइब्रोसिस, सूजन और ट्यूबलर चोट के मार्करों के लिए अभिव्यक्ति का स्तर। (ए) एनटीएस-उपचारित रार्रेस1 पॉडोसाइट-विशिष्ट नॉकआउट चूहों (Creþ/Rarres1flfl/flfl) और नियंत्रण लिटरमेट्स (Cre- /Rarres1flfl/flfl) से गुर्दे में -Sma की अभिव्यक्तियों को दर्शाने वाले प्रतिनिधि मुखर सूक्ष्म चित्र। बार=100 मिमी। (बी) एनटीएस इलाज चूहों के गुर्दे प्रांतस्था में विभिन्न सूजन-, फाइब्रोसिस-, और गुर्दे ट्यूबलर चोट से संबंधित-जीन के सापेक्ष एमआरएनए स्तर। #P < 0.05,="" ##p=""><0.01 बनाम="" नियंत्रण="" (ctrl.);="" डेटा="" को="" माध्य="" ±="" sem="" के="" रूप="" में="" व्यक्त="" किया="" जाता="" है।="" छात्र="" के="" टी-टेस्ट="" को="" 2="" समूहों="" (शम="" n="2;" nts–="" cre–="" arres1flfl/flfl,="" n="3;" nts-creþ/rarres1flfl/flfl,="" n="3)" के="" बीच="" तुलना="" के="" लिए="" नियोजित="" किया="" गया="" था।="">

चित्रा S5। NTS- उपचारित किडनी में C31 और सक्रिय P65 की अभिव्यक्ति। (ए) पेरिटुबुलर क्षेत्रों में सीडी 31-सकारात्मक केशिकाओं का अनुपात। प्रति माउस तीस पेरिटुबुलर क्षेत्रों का मूल्यांकन किया गया (NTS Cre–/ Rarres1flfl/flfl, n=4; NTS Creþ/Rarres1flfl/flfl, n=4)। छात्र का टी-टेस्ट। (बी) ग्लोमेरुली में सीडी 31 संकेत का अर्धमात्रात्मक स्कोरिंग: 0=कोई संकेत नहीं, 1=कमजोर संकेत, 2=मध्यम संकेत, 3 =मजबूत संकेत। प्रत्येक माउस से दस ग्लोमेरुली का मूल्यांकन किया गया (NTS Cre -/Rarres1flfl/flfl, n =4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl, n= 4)। छात्र का टी-टेस्ट। (सी) प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा दस्तावेज और एनटीएस उपचारित चूहों और अनुपचारित नियंत्रणों (सीटीआरएल) के विभिन्न समूहों में वृक्क प्रांतस्था में पीपी65 के सापेक्ष प्रोटीन स्तर को दर्शाने वाले सारांशित डेटा (सीटीएल।, एन=3; एनटीएस-सीटीआरएल। , एन=9; एनटीएस-रार्रेस1_टाई2_केआई, एन=10)। डेटा को माध्य ± SEM के रूप में व्यक्त किया जाता है। छात्र के टी-टेस्ट को 2 समूहों के बीच तुलना के लिए नियोजित किया गया था।

प्रतिक्रिया दें संदर्भ

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