सिस्टैंच ग्लाइकोसाइड्स MiRNA‑483‑3p को विनियमित करके सौम्य प्रोस्टेट हाइपरप्लासिया में प्रोस्टेटिक फाइब्रोसिस को कम करते हैं

 

अमूर्त

उद्देश्य:सौम्य प्रोस्टेटिक हाइपरप्लासिया (बीपीएच) में प्रोस्टेटिक फाइब्रोसिस पर सिस्टैंच ग्लाइकोसाइड के सुधारात्मक प्रभावों और माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए)-483-3पी के नियमन से जुड़े तंत्र की जांच करना।

तरीके:नर चूहों को यादृच्छिक रूप से पांच समूहों को सौंपा गया था: सामान्य नियंत्रण, बीपीएच मॉडल नियंत्रण, फ़िनास्टराइड, सिस्टैंच ग्लाइकोसाइड्स, और सिस्टैंच ग्लाइकोसाइड्स + miRNA‑483‑3p प्रतिपक्षी। बीपीएच मॉडल द्विपक्षीय ऑर्किएक्टोमी द्वारा स्थापित किया गया था जिसके बाद टेस्टोस्टेरोन प्रोपियोनेट के दैनिक चमड़े के नीचे इंजेक्शन लगाया गया था। 30 दिनों के बाद, मैसन के ट्राइक्रोम और सीरियस रेड स्टेनिंग द्वारा प्रोस्टेटिक कोलेजन जमाव का मूल्यांकन किया गया, और हाइड्रॉक्सीप्रोलाइन (हाइप) सामग्री को मापा गया। परिवर्तनकारी वृद्धि कारक-1 (टीजीएफ-1), माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन काइनेज 2 (एमके2), और माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन काइनेज काइनेज 6 (एमकेके6) के प्रोस्टेटिक एमआरएनए स्तर, साथ ही miRNA-483-3पी स्तर, मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूपीसीआर) द्वारा निर्धारित किए गए थे। TGF‑1, MK2, फॉस्फोराइलेटेड MK2 (p‑MK2), MKK6, और फॉस्फोराइलेटेड MKK6 (p‑MKK6) के प्रोस्टेटिक प्रोटीन स्तर का मूल्यांकन वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा किया गया था। लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर परख का उपयोग करके miRNA‑483‑3p से MK2 के सीधे बंधन की जांच की गई।

परिणाम:सामान्य नियंत्रण समूह के सापेक्ष, बीपीएच मॉडल नियंत्रण समूह ने प्रोस्टेटिक कोलेजन जमाव में काफी वृद्धि देखी; टीजीएफ‑ 1, एमके2 और एमकेके6 का ऊंचा एमआरएनए स्तर; और TGF‑1, p‑MK2, और p‑MKK6 (सभी P <0.01) का उच्च प्रोटीन स्तर, जबकि miRNA‑483‑3p स्तर काफी कम हो गया था (P <0.01)। बीपीएच मॉडल नियंत्रण समूह की तुलना में, सिस्टैंच ग्लाइकोसाइड्स ने miRNA‑483‑3p को अपग्रेड किया, TGF‑ 1, MK2, और MKK6 के mRNA स्तर को कम किया, TGF‑ 1, p‑MK2, और p‑MKK6 के प्रोटीन स्तर को कम किया, और प्रोस्टेटिक कोलेजन जमाव को कम किया। विशेष रूप से, सिस्टैंच ग्लाइकोसाइड्स के साथ miRNA‑483‑3p एंटागोमिर के सह-प्रशासन में miRNA‑483‑3p में काफी कमी आई, कोलेजन जमाव में वृद्धि हुई, और TGF‑ 1, MK2, और MKK6 के mRNA स्तर के साथ-साथ TGF‑ 1, p‑MK2, और p‑MKK6 के प्रोटीन स्तर में भी वृद्धि हुई। अकेले सिस्टैंच ग्लाइकोसाइड्स (सभी पी <0.01)। लूसिफ़ेरेज़ परख ने प्रदर्शित किया कि miRNA‑483‑3p सीधे MK2 को लक्षित करता है।

निष्कर्ष: सिस्टैंच ग्लाइकोसाइड्स miRNA‑483‑3p को विनियमित करके और MK2 सिग्नलिंग को रोककर BPH में प्रोस्टेटिक फाइब्रोसिस को कम करते हैं।

कीवर्ड: सिस्टैंच ग्लाइकोसाइड्स; miRNA‑483‑3p; पौरुष ग्रंथि;फाइब्रोसिस; प्रॉस्टैट ग्रन्थि का मामूली बड़ना

 

 

 

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परिचय

सौम्य प्रोस्टेटिक हाइपरप्लासिया (बीपीएच)मध्यम आयु वर्ग और वृद्ध पुरुषों में यह एक सामान्य स्थिति है, उम्र के साथ इसका प्रचलन बढ़ता जा रहा है। रिपोर्टों से पता चलता है कि 50 वर्ष से अधिक उम्र के पुरुषों में बीपीएच का प्रसार 50% से अधिक है। बीपीएच और संबंधित निचले मूत्र पथ के लक्षण (एलयूटीएस) जीवन की गुणवत्ता और दीर्घकालिक स्वास्थ्य देखभाल लागत पर काफी बोझ डालते हैं। चिकित्सकीय रूप से, रिडक्टेस इनहिबिटर और एड्रीनर्जिक रिसेप्टर ब्लॉकर्स को फार्माकोथेरपी की सिफारिश की जाती है। हालाँकि, ‑ब्लॉकर्स प्रोस्टेट की मात्रा को कम नहीं करते हैं, और 25-30% रोगियों में रिडक्टेस इनहिबिटर के साथ एलयूटीएस में कोई सुधार नहीं दिखता है; इसके अलावा, 5-7% और भी खराब हो सकते हैं। यद्यपि थ्यूलियम लेजर प्रोस्टेटेक्टॉमी जैसे सर्जिकल नवाचारों का उपयोग प्रोस्टेट के ट्रांसयूरथ्रल रिसेक्शन की तुलना में तेजी से किया जा रहा है, पोस्टऑपरेटिव एलयूटीएस अभी भी 23% से अधिक दर पर होता है।

वर्तमान साक्ष्य बीपीएच में तीन प्रमुख पैथोबायोलॉजिकल प्रक्रियाओं का सुझाव देते हैं: ग्रंथि संबंधी हाइपरप्लासिया, चिकनी मांसपेशी संकुचन, और प्रोस्टेटिक फाइब्रोसिस। ये प्रक्रियाएँ नैदानिक ​​प्रगति को आगे बढ़ाने के लिए स्वतंत्र रूप से या सहक्रियात्मक रूप से कार्य करती हैं। बीपीएच आमतौर पर (हालांकि हमेशा नहीं) एलयूटीएस के साथ सह-अस्तित्व में रहता है; फाइब्रोसिस, जो अत्यधिक बाह्यकोशिकीय मैट्रिक्स जमाव की विशेषता है, प्रोस्टेट के भीतर मूत्रमार्ग के लचीलेपन से समझौता करता है और मूत्र रुकावट में योगदान देता है। फिर भी, विशेष रूप से अंग फाइब्रोसिस को लक्षित करने वाले चिकित्सीय विकल्प सीमित हैं।

सिस्टैंच (सिस्टैन्चे एसपीपी.) एक पारंपरिक औषधीय और पोषण संबंधी पौधा है। इसके विशिष्ट फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स (सामूहिक रूप से यहां सिस्टैंच ग्लाइकोसाइड्स के रूप में संदर्भित, जैसे इचिनाकोसाइड और एक्टियोसाइड) रोगाणुरोधी, हाइपोलिपिडेमिक, एंटीएलर्जिक, कार्डियोटोनिक, एंटीडायबिटिक, एंटीट्यूमर, न्यूरोप्रोटेक्टिव, एंटीऑक्सिडेंट और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी प्रभाव सहित व्यापक जैव सक्रियता प्रदर्शित करते हैं। एकत्रित साक्ष्य गुर्दे, फेफड़े, हृदय और यकृत जैसे अंगों में इन ग्लाइकोसाइड्स की एंटी-फाइब्रोटिक क्रियाओं को इंगित करते हैं। हालाँकि, प्रोस्टेटिक फाइब्रोसिस पर उनके प्रभाव की सूचना नहीं दी गई है। इस अध्ययन ने प्रोस्टेटिक फाइब्रोसिस पर सिस्टैंच ग्लाइकोसाइड्स के प्रभाव की जांच की और बाह्य मैट्रिक्स रीमॉडलिंग के लिए प्रासंगिक miRNA‑483‑3p/MK2 अक्ष पर ध्यान केंद्रित करते हुए अंतर्निहित तंत्र का पता लगाया।

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सामग्री और तरीके

सामग्री

 

miRNA‑483‑3p एंटागोमिर (रासायनिक रूप से संशोधित): शंघाई जीनफार्मा कंपनी लिमिटेड (बैच नंबर: 12953) से खरीदा गया।

टेस्टोस्टेरोन प्रोपियोनेट इंजेक्शन: टियांजिन जिन्याओ फार्मास्युटिकल कंपनी लिमिटेड (बैच संख्या: 150822)।

सिस्टैंच ग्लाइकोसाइड्स: शंघाई अलादीन बायोकेमिकल टेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड (शुद्धता 98% से अधिक या उसके बराबर, बैच संख्या: एम14062)। न्यूट्रास्युटिकल डेवलपर्स के लिए नोट: सामग्री मानकीकृत फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड अंश से मेल खाती है; एचपीएलसी सामग्री (उदाहरण के लिए, कुल पीईजीएल, इचिनाकोसाइड/एक्टोसाइड) द्वारा विशिष्टता सुनिश्चित करें।

फिनास्टराइड टैबलेट: एमएसडी (हांग्जो) फार्मास्युटिकल कंपनी लिमिटेड (बैच संख्या: यू011856; 5 मिलीग्राम/टैबलेट)।

लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर परख किट (बैच संख्या: E2920) और psiCHECK‑2 वेक्टर (बैच संख्या: C8021): क्रोमेगा (यूएसए)।

क्यूपीसीआर डिटेक्शन किट: केएपीए बायोसिस्टम्स (बैच नंबर: KM4101)।

हाइड्रोक्सीप्रोलाइन (हाइप) परख किट: नानजिंग जियानचेंग बायोइंजीनियरिंग इंस्टीट्यूट (बैच संख्या: 20190626)।

टीजीएफ‑ 1, एमके2 और एमकेके6 के लिए प्राइमरों को वुहान तियानयी हुइयुआन बायोटेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड द्वारा संश्लेषित किया गया था।

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पशु

सात सप्ताह पुराने विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त (एसपीएफ़) नर C57BL/6 चूहों (22-24 ग्राम) को हुआज़ोंग कृषि विश्वविद्यालय (उत्पादन लाइसेंस संख्या: SCXK हुबेई 2015‑0019) से प्राप्त किया गया था। जानवरों को 23 ± 2 डिग्री, 50 ± 5% आर्द्रता, 12 घंटे प्रकाश/12 घंटे अंधेरे चक्र के तहत रखा गया था।

 

उपकरण

 

स्टेपवनप्लस रीयल-टाइम पीसीआर सिस्टम (एप्लाइड बायोसिस्टम्स, यूएसए)।

ल्यूमिनोस्कैन 5200110 माइक्रोप्लेट ल्यूमिनोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूएसए)।

प्रायोगिक डिजाइन और बीपीएच मॉडल
अनुकूलन के 1 सप्ताह के बाद, चूहों को यादृच्छिक रूप से (यादृच्छिक संख्या तालिका) पांच समूहों (n=6 प्रति समूह) में आवंटित किया गया था: सामान्य नियंत्रण, बीपीएच मॉडल नियंत्रण, फ़िनास्टराइड, सिस्टैंच ग्लाइकोसाइड्स, और सिस्टैंच ग्लाइकोसाइड्स + miRNA‑483‑3p एंटागोमिर। बीपीएच मॉडल को सर्जिकल कैस्ट्रेशन और 30 दिनों के लिए 7.5 मिलीग्राम·किग्रा⁻¹ पर टेस्टोस्टेरोन प्रोपियोनेट के दैनिक चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा प्रेरित किया गया था। फ़िनास्टराइड समूह को मौखिक फ़िनास्टराइड 1 mg·kg⁻¹ प्रतिदिन (0.5% CMC‑Na में घुलित) प्राप्त हुआ। सिस्टैंच ग्लाइकोसाइड्स समूह को प्रतिदिन 100 mg·kg⁻¹ मौखिक सिस्टैंच ग्लाइकोसाइड्स प्राप्त हुए। संयोजन समूह को निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए प्रतिदिन 100 mg·kg⁻¹ मौखिक सिस्टैंच ग्लाइकोसाइड और प्रत्येक 5 दिनों में 10 mg·kg⁻¹ miRNA‑483‑3p एंटागोमिर का टेल वेन इंजेक्शन प्राप्त हुआ। सामान्य और BPH मॉडल नियंत्रण समूहों को मौखिक रूप से 0.5% CMC‑Na की समान मात्रा प्राप्त हुई।

30 दिनों के बाद, चूहों को सोडियम पेंटोबार्बिटल (80 mg·kg⁻¹) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा एनेस्थेटाइज़ किया गया और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा इच्छामृत्यु दी गई। प्रोस्टेट को एक्साइज किया गया; भागों को मैसन के ट्राइक्रोम और सीरियस रेड स्टेनिंग के लिए तय और एम्बेड किया गया था, और ताजा ऊतकों को क्यूपीसीआर, वेस्टर्न ब्लॉटिंग और जैव रासायनिक परख के लिए संसाधित किया गया था। पशु प्रक्रियाएं प्रयोगशाला पशु प्रबंधन पर हुबेई प्रांतीय विनियमों (संचालक योग्यता संख्या: TY20190784) का अनुपालन करती हैं।

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प्रोस्टेटिक फाइब्रोसिस का आकलन

कोलेजन जमाव का मूल्यांकन सीरियस रेड और मैसन के ट्राइक्रोम स्टेनिंग द्वारा किया गया था। किट के निर्देशों के अनुसार प्रोस्टेट ऊतक में हाइप सामग्री की मात्रा निर्धारित की गई थी। प्रत्येक स्लाइड के लिए, सकारात्मक दाग वाले क्षेत्र के प्रतिशत की गणना करने के लिए इमेज‑प्रो प्लस 6.0 का उपयोग करके तीन यादृच्छिक फ़ील्ड का विश्लेषण किया गया था।

एमके2 पाथवे गतिविधि का मूल्यांकन

क्यूपीसीआर: एमके2, टीजीएफ‑1 और एमकेके6 के प्रोस्टेटिक एमआरएनए स्तर मापे गए। प्राइमर अनुक्रम:

एमके2 (264 बीपी) फॉरवर्ड 5'-जीजीएएजीटीजीसीसीटीजीसीटीजीएटी-3', रिवर्स 5'-एजीटीटीजीटीजीएक्टजीजीटीजीजीटीटीटी-3';

टीजीएफ‑ 1 (153 बीपी) आगे 5'-AGGAGACGGAATACAGGG-3', रिवर्स 5'-ATGAGGAGCAGGAAGGG-3';

MKK6 (146 bp) फॉरवर्ड 5'-CCTCAGACAGTTCCAC-3', रिवर्स 5'-CGCATCTTCTCCACCA-3'।

वेस्टर्न ब्लॉट: टीजीएफ‑1, एमके2, पी‑एमके2, एमकेके6 और पी‑एमकेके6 का प्रोटीन स्तर पहले से स्थापित प्रोटोकॉल के बाद निर्धारित किया गया था।

miRNA‑483‑3p का मापन
miRNA‑483‑3p प्राइमर: फॉरवर्ड 5'-GGGTCACTCCTCCCCT-3', रिवर्स 5'-AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3'; आरटी प्राइमर 5'-CTCAAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAAGACGGG-3'। किट निर्देशों के अनुसार क्यूपीसीआर का प्रदर्शन किया गया।

 

लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर परख

वाइल्ड-टाइप (डब्ल्यूटी) और उत्परिवर्ती (एमयूटी) रिपोर्टर प्लास्मिड के निर्माण के लिए एमके 2 3'यूटीआर को psiCHECK‑2 वेक्टर में क्लोन किया गया था। HEK-293T कोशिकाओं को miRNA-483-3p और रिपोर्टर प्लास्मिड के साथ लिपोफ़ेक्टामाइन 3000 का उपयोग करके सह-ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था; नियंत्रण कोशिकाओं को खाली वेक्टर प्राप्त हुआ। 24 घंटे के बाद, किट प्रोटोकॉल के अनुसार लूसिफ़ेरेज़ गतिविधि को मापा गया।

सांख्यिकीय विश्लेषण
SPSS 17.0 का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया। भिन्नता की सामान्यता और एकरूपता की पुष्टि के बाद एक-तरफ़ा एनोवा लागू किया गया था। परिणाम माध्य ± एसडी के रूप में व्यक्त किए जाते हैं। एलएसडी पोस्ट हॉक परीक्षणों का उपयोग कई तुलनाओं के लिए किया गया था। P <0.05 पर अंतर को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना गया।

 

परिणाम

सामान्य नियंत्रण समूह की तुलना में, बीपीएच मॉडल नियंत्रण समूह ने प्रोस्टेटिक कोलेजन जमाव में उल्लेखनीय वृद्धि प्रदर्शित की; TGF‑ 1, MK2, और MKK6 की उन्नत mRNA अभिव्यक्तियाँ; और टीजीएफ‑1, पी‑एमके2, और पी‑एमकेके6 (सभी पी <0.01) का उच्च प्रोटीन स्तर। miRNA‑483‑3p का स्तर काफी कम हो गया (P <0.01)।

बीपीएच मॉडल नियंत्रण के सापेक्ष, सिस्टैंच ग्लाइकोसाइड्स ने miRNA‑483‑3p को महत्वपूर्ण रूप से अपग्रेड किया, TGF‑ 1, MK2 और MKK6 के mRNA स्तर को कम किया, TGF‑ 1, p‑MK2 और p‑MKK6 के प्रोटीन स्तर को कम किया, और प्रोस्टेटिक कोलेजन जमाव को कम किया।

अकेले सिस्टैंच ग्लाइकोसाइड्स की तुलना में, miRNA‑483‑3p एंटागोमिर के साथ सिस्टैंच ग्लाइकोसाइड्स के संयोजन से miRNA‑483‑3p में काफी कमी आई और कोलेजन जमाव में वृद्धि हुई, साथ ही TGF‑ 1, MK2, और MKK6 के mRNA स्तर, साथ ही TGF‑ 1, p‑MK2 और प्रोटीन स्तर में वृद्धि हुई। p‑MKK6 (सभी P <0.01)।

लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर परख ने पुष्टि की कि miRNA‑483‑3p सीधे MK2 को लक्षित करता है।

 

चर्चा (संक्षिप्त, न्यूट्रास्युटिकल-केंद्रित)

इस अध्ययन से संकेत मिलता है कि सिस्टैंच ग्लाइकोसाइड्स miRNA‑483‑3p को अपग्रेड करके और TGF‑ सिग्नलिंग के डाउनस्ट्रीम MK2 पाथवे गतिविधि को दबाकर कैस्ट्रेशन/टेस्टोस्टेरोन-प्रेरित BPH मॉडल में प्रोस्टेटिक फाइब्रोसिस को कम करते हैं। फ़ाइब्रोटिक रीमॉडलिंग को संबोधित करने में वर्तमान बीपीएच फार्माकोथेरपी की सीमाओं को देखते हुए, सिस्टैंच ग्लाइकोसाइड्स बाह्य मैट्रिक्स संतुलन के उद्देश्य से एक पूरक न्यूट्रास्युटिकल रणनीति का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं।

आहार अनुपूरक विकास के लिए, निम्नलिखित बातों पर विचार किया जाना चाहिए:

मानकीकरण: कुल फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड और मार्कर यौगिकों को परिभाषित करें (उदाहरण के लिए, इचिनाकोसाइड 20% से अधिक या उसके बराबर, एक्टियोसाइड एचपीएलसी द्वारा 10% से अधिक या उसके बराबर)।

खुराक अनुवाद: चूहों में 100 mg·kg⁻¹ शरीर की सतह क्षेत्र स्केलिंग का उपयोग करके लगभग 8-12 mg·kg⁻¹ मानव समतुल्य खुराक (HED), 60-70 किलोग्राम वयस्क के लिए लगभग 500-800 मिलीग्राम/दिन; नैदानिक ​​सत्यापन आवश्यक है.

गुणवत्ता और सुरक्षा: पहचान सुनिश्चित करें (वानस्पतिक स्रोत, संदूषक, भारी धातु, कीटनाशक), और -ब्लॉकर्स या 5 -रिडक्टेस अवरोधकों के साथ संभावित बातचीत का आकलन करें।

दावे: संरचना/कार्य संबंधी दावों को "मूत्र प्रवाह और प्रोस्टेट ऊतक संतुलन का समर्थन" पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए और नैदानिक ​​​​साक्ष्य के बिना रोग-उपचार भाषा से बचना चाहिए।

 

निष्कर्ष

सिस्टैंच ग्लाइकोसाइड्सmiRNA‑483‑3p को विनियमित करके और MK2 सिग्नलिंग को रोककर BPH में प्रोस्टेटिक फाइब्रोसिस को कम करें। ये निष्कर्ष प्रोस्टेट स्वास्थ्य के लिए सहायक न्यूट्रास्यूटिकल्स के रूप में मानकीकृत सिस्टैंच अर्क पर आगे के अनुवाद संबंधी शोध का समर्थन करते हैं।

 

स्वीकृतियाँ

इस कार्य को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या. 81703594) द्वारा समर्थित किया गया था।

लेखक सूचना
यांग चूहाओ (1991-), महिला, वुहान, हुबेई, क्लिनिकल फार्मासिस्ट, एमएस; मुख्य अनुसंधान क्षेत्र: क्लिनिकल फार्मेसी। ORCID: 0000-0002-8921-5758; दूरभाष: +86-27-82440854.