जीन क्लोनिंग, कार्यात्मक पहचान, सिस्टैंच ट्यूबुलोसा से सुक्रोज सिंथेज़ का संरचनात्मक और अभिव्यक्ति विश्लेषण Ⅱ

परिणाम और विश्लेषण

1 सिस्टैंच ट्यूबुलोसा में सुक्रोज सिंथेज़ जीन का खनन और क्लोनिंग

The amino acid sequence of the identified Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 was used as a template[16], and sequence alignment was performed in the Cistanche tubulosa transcriptome database by local Blastp. At the same time, two sucrose synthase gene sequences with FPKM values greater than 10 were screened out in combination with transcriptome gene annotation and gene expression abundance data, which were named CtSus and CtSus1, respectively. The comparative transcriptome data of different parts of Cistanche (haustoria, underground parts and aerial parts) were further analyzed. The distribution of chemical components in different parts of Cistanche plants has been studied in depth. The results showed that glycoside compounds represented by phenylethanoid glycosides in Cistanche are mainly present in its underground parts, with the highest content in the haustoria[22]. In the early stage of this study, the content of phenylethanoid glycosides in plant materials used for comparative transcriptome sequencing of different parts was also determined, confirming that the content of phenylethanoid glycosides in different parts of Cistanche tubulosa was different in the following manner: haustorium>underground part>>हवाई भाग.

इसलिए, सिस्टैंच ट्यूबुलोसा के विभिन्न हिस्सों के ट्रांसक्रिप्टोम डेटा में प्रारंभिक स्क्रीनिंग में प्राप्त दो उम्मीदवार सुक्रोज सिंथेज़ जीन के अभिव्यक्ति स्तर एफपीकेएम मूल्यों को जेड-स्कोर द्वारा सामान्यीकृत किया गया था और अंतर विश्लेषण किया गया था (चित्रा 1 ए)। परिणामों से पता चला कि CtSus जीन का हाउस्टोरियम में अभिव्यक्ति स्तर उच्चतम था, और भूमिगत भाग में अभिव्यक्ति का स्तर हवाई भाग की तुलना में अधिक था, जो कि सिस्टैंच ट्यूबुलोसा के विभिन्न भागों में ग्लाइकोसाइड यौगिकों के संचय पैटर्न के अनुरूप था। जबकि हौस्टोरियम में CtSus1 जीन की अभिव्यक्ति का स्तर कम था। इसलिए, उपरोक्त परिणामों के आधार पर, CtSus जीन को बाद के अनुक्रम प्रवर्धन, बहिर्जात अभिव्यक्ति और कार्यात्मक पहचान के लिए चुना गया था। एक टेम्पलेट के रूप में सिस्टैंच ट्यूबुलोसा सीडीएनए का उपयोग करते हुए, पीसीआर प्रवर्धन (चित्रा 1 बी) के बाद ~ 2500 बीपी पर एक एकल बैंड उत्पाद प्राप्त किया गया था। पीसीआर उत्पाद को जेल से पुनर्प्राप्त किया गया और क्लोनिंग वेक्टर से जोड़ा गया, और लक्ष्य जीन की पूर्ण लंबाई कोडिंग क्षेत्र अनुक्रमण द्वारा प्राप्त किया गया था। सीटीसस अनुक्रम की लंबाई 2418 बीपी थी।

चित्र 1 सी. ट्यूबुलोसा से सीटीसस की जीन खोज और क्लोनिंग और इसके एन्कोडेड प्रोटीन का जैव सूचनात्मक विश्लेषण। ए: सी. ट्यूबुलोसा के विभिन्न भागों में सीटीसस और सीटीयूएस1 जीन के अभिव्यक्ति स्तर को उनके एफपीकेएम मूल्यों के आधार पर जेड-स्कोर के रूप में सामान्यीकृत किया गया; बी: सीटीएसयूएस का जीन प्रवर्धन; एम: डीएनए मार्कर; सी: स्मार्ट द्वारा अनुमानित सीटीसस प्रोटीन का रूढ़िवादी डोमेन; डी: अरेबिडोप्सिस थालियाना, सोलनमट्यूबेरोसम और अल्बुका ब्रैक्टीटा सहित अन्य पौधों से पहचाने गए सीटीसस और सुक्रोज सिंथेस के एकाधिक अनुक्रम संरेखण। सुक्रोज संश्लेषण डोमेन और चीनी स्थानांतरण डोमेन क्रमशः लाल और नीले बक्से द्वारा दर्शाए जाते हैं; ई: अन्य पौधों से सीटीएसयूएस और सुक्रोसेसिंथेस का फाइलोजेनेटिक विश्लेषण; एफ: ई. कोली में pCold™ I वेक्टर का उपयोग करके CtSus की विषम अभिव्यक्ति का एसडीएस-पेज विश्लेषण। लेन 1: प्रोटीन मार्कर; लेन 2: सतह पर तैरनेवाला अंश; लेन 3: अवक्षेपण। लाल तीर सीटीसस प्रोटीन को दर्शाता है। जी: एक एकल क्लोन की कॉलोनी पीसीआर जिसमें दो पुनः संयोजक प्लास्मिड शामिल हैं। एम: डीएनए मार्कर; 1: pET-28a-UGT71BD1; 2: pCold™ I-CtSus

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2 सीटीसस जीन और इसके एन्कोडेड प्रोटीन का जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण

2.1 सीटीएसयूएस के भौतिक रासायनिक गुणों का विश्लेषण और ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन संरचना की भविष्यवाणी

CtSus एन्कोडेड प्रोटीन के भौतिक रासायनिक गुणों का विश्लेषण ProtParam ऑनलाइन सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके किया गया। प्रोटीन में 805 अमीनो एसिड होते हैं, जिसका आणविक सूत्र C4189H6548N1104O1187S28 और सापेक्ष आणविक द्रव्यमान 92266.44 है; सैद्धांतिक समविद्युत बिंदु 6 है.00; अस्थिरता गुणांक II 35.45 है, जो एक स्थिर प्रोटीन है; समग्र औसत हाइड्रोफिलिसिटी (GRAVY) −0.187 है, जो एक हाइड्रोफिलिक प्रोटीन है। एमएचएमएम 2.0 का उपयोग सुक्रोज सिंथेज़ सीटीएसयूएस के ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन की भविष्यवाणी करने के लिए किया गया था, और परिणामों से पता चला कि इस जीन द्वारा एन्कोड किए गए प्रोटीन में कोई ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन नहीं है।

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2.2 सीटीएसयूएस रूढ़िवादी संरचना और अनुक्रम संरेखण की भविष्यवाणी

सीटीसस प्रोटीन के रूढ़िवादी डोमेन की भविष्यवाणी करने के लिए ऑनलाइन सॉफ्टवेयर स्मार्ट का उपयोग किया गया था (चित्रा 1सी)। प्रोटीन में दो रूढ़िवादी डोमेन होते हैं। एन-टर्मिनस (अमीनो एसिड 8 से 553) सुक्रोज सिंथेज़ डोमेन है, जो यूडीपी-ग्लूकोज और डी-फ्रुक्टोज उत्पन्न करने के लिए यूडीपी और सुक्रोज की प्रतिवर्ती प्रतिक्रिया को उत्प्रेरित कर सकता है; सी-टर्मिनस (अमीनो एसिड 557 से 739) ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़ डोमेन (चित्र 1डी) से संबंधित है। डीएनएमैन सॉफ्टवेयर का उपयोग एनसीबीआई डेटाबेस (तालिका 2) में सुक्रोज सिंथेज़ अमीनो एसिड अनुक्रम के साथ सीटीसस प्रोटीन अनुक्रम को संरेखित करने के लिए किया गया था। परिणामों से पता चला कि सीटीसस अमीनो एसिड अनुक्रम ने अन्य पौधों के सुक्रोज सिंथेज़ अनुक्रमों के साथ उच्च समानता दिखाई। सीटीसस और तिल (सेसमम इंडिकम) से सुक्रोज सिंथेज़ अनुक्रम के बीच उच्चतम समानता 94.78% थी, और अन्य पौधों से सुक्रोज सिंथेज़ अनुक्रमों के साथ समानता भी 65% से ऊपर थी, जो दर्शाता है कि पौधों से सुक्रोज सिंथेज़ में उच्च स्तर का अनुक्रम है। संरक्षण।

तालिका 2 अन्य पौधों से पहचाने गए सीटीएसयूएस और सुक्रोज सिंथेस के बीच अमीनो एसिड अनुक्रम समानताएं

2.3 फाइलोजेनेटिक विश्लेषण

MEGA सॉफ़्टवेयर द्वारा निर्मित फ़ाइलोजेनेटिक ट्री का उपयोग सिस्टैंच ट्यूबुलोसा से सुक्रोज़ सिंथेज़ CtSus और अन्य पौधों से सुक्रोज़ सिंथेज़ के बीच फ़ाइलोजेनेटिक संबंध का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। परिणाम चित्र 1ई में दिखाए गए हैं। पौधों से प्राप्त सुक्रोज सिंथेस द्विबीजपत्री (क्षेत्र I और II) और एकबीजपत्री (क्षेत्र III) में अलग-अलग विकासवादी शाखाएँ दिखाते हैं। CtSus द्विबीजपत्री शाखा में है, और CtSus से निकटता से संबंधित अनुक्रम सभी लैमियासी पौधों से हैं (सिस्टैन्चे ट्यूबुलोसा एक लैमियासी ओरोबैंचेसी पौधा है), जबकि दूसरी शाखा मुख्य रूप से सोलानेलेस पौधों से बनी है, जो उच्च संरक्षण और समरूपता को इंगित करती है पौधों के विकास में पौधों से प्राप्त सुक्रोज सिंथेज़ जीन का उसी क्रम में विकास हुआ। उनमें से, ओरोबैंचेसी पौधे के फेलिपेंचे रामोसा से सुक्रोज सिंथेज़ PrSus (AEN79500.1) CtSus के सबसे करीब है।

3 CtSus की बहिर्जात अभिव्यक्ति और गतिविधि विश्लेषण

3.1 सीटीएसयूएस जीन की बहिर्जात अभिव्यक्ति

अनुक्रमण द्वारा सत्यापित pET{0}a-CtSus, pET{2}}b-CtSus और pCold™ I-CtSus प्लास्मिड को अभिव्यक्ति सक्षम ई. कोली ट्रांसेटा (DE3) में स्थानांतरित किया गया था, और सकारात्मक क्लोन की जांच की गई थी अनुक्रमण सत्यापन के लिए कॉलोनी पीसीआर द्वारा। प्राप्त पुनः संयोजक अभिव्यक्ति उपभेदों को प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए आईपीटीजी कम तापमान से प्रेरित किया गया था, और बैक्टीरिया को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एकत्र किया गया था। सतह पर तैरनेवाला और अवक्षेप प्राप्त करने के लिए बैक्टीरिया को तोड़ने के लिए लिसीस बफर जोड़ा गया था, और पता लगाने के लिए एसडीएस-पेज का प्रदर्शन किया गया था। परिणामों से पता चला कि जब pET{7}a और pET{8}}b को अभिव्यक्ति वेक्टर के रूप में उपयोग किया गया था, तो CtSus को ई. कोली में व्यक्त नहीं किया गया था, जबकि जब pCold™ I को अभिव्यक्ति वेक्टर के रूप में उपयोग किया गया था, तो एक स्पष्ट CtSus था ~100 केडीए क्षेत्र में पुनः संयोजक प्रोटीन बैंड का पता लगाया गया था, जो इसके सैद्धांतिक रूप से अनुमानित सापेक्ष आणविक द्रव्यमान 92.2 केडीए (चित्र 1एफ) के अनुरूप था।

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3.2 संपूर्ण-कोशिका परिवर्तन

CtSus के उत्प्रेरक कार्य को प्रारंभिक रूप से सत्यापित करने के लिए, CtSus और ग्लाइकोसिलट्रांसफेरेज़ जीन UGT71BD1 का एक सह-अभिव्यक्ति स्ट्रेन का निर्माण किया गया था। UGT71BD1 को सिस्टैंच ट्यूबुलोसा से क्लोन और पहचाना गया था और यह एक यूडीपी-ग्लूकोसिलट्रांसफेरेज़ है जो व्यापक रूप से सुगंधित यौगिकों जैसे कि फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड, विभिन्न प्रकार के फ्लेवोनोइड, स्टिलबिन और कूमारिन को रिसेप्टर्स के रूप में स्वीकार कर सकता है और यूडीपी-ग्लूकोज का उपयोग करके सब्सट्रेट फेनोलिक हाइड्रॉक्सिल समूह की ग्लूकोसिलेशन प्रतिक्रिया को उत्प्रेरित कर सकता है। चीनी दाता के रूप में[18]। CtSus की शुरूआत सैद्धांतिक रूप से UGT71BD1 द्वारा उत्प्रेरित ग्लूकोसिलेशन प्रतिक्रिया के लिए अधिक पर्याप्त ग्लाइकोसिल डोनर यूडीपी-ग्लूकोज प्रदान कर सकती है, जिससे ग्लाइकोसिलेशन उत्पादों के निर्माण की ओर बढ़ने के लिए प्रतिक्रिया संतुलन को बढ़ावा मिलता है, जिससे ग्लाइकोसिलेशन उत्पादों की उपज में वृद्धि होती है। PCold™ I-CtSus प्लास्मिड और pET-28a-UGT71BD1 प्लास्मिड को एक साथ अभिव्यक्ति सक्षम ई. कोली ट्रांसेटा (DE3) में बदल दिया गया। दोनों पुनः संयोजक प्लास्मिड वाले एकल क्लोनों की कॉलोनी पीसीआर द्वारा जांच की गई, और सकारात्मक पुनः संयोजक अभिव्यक्ति उपभेदों को अनुक्रमण सत्यापन (चित्रा 1 जी) द्वारा प्राप्त किया गया। दोहरे जीन सह-अभिव्यक्ति को इन विट्रो में प्रेरित किया गया था, और pET-28aUGT71BD1 एकल जीन अभिव्यक्ति तनाव को नियंत्रण समूह के रूप में उपयोग किया गया था। यूडीपी-ग्लूकोज दाता की पीढ़ी को उत्प्रेरित करने में सीटीसस की गतिविधि को प्रारंभिक रूप से संपूर्ण कोशिका परिवर्तन द्वारा सत्यापित किया गया था। एचपीएलसी और उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री के परिणामों से पता चला है कि जब पूरे सेल परिवर्तन प्रतिक्रिया को सब्सट्रेट के रूप में एस्क्यूलेटिन 1 और रेस्वेराट्रोल 2 के साथ किया गया था, तो परिवर्तन के 24 घंटे के बाद स्पष्ट ग्लाइकोसिलेशन उत्पादों की पीढ़ी का पता चला था, जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है।

चित्र 2 सब्सट्रेट 1 या 2 का संपूर्ण-कोशिका बायोट्रांसफॉर्मेशन, क्रमशः UGT71BD1 को आश्रय देने वाले पुनः संयोजक तनाव या UGT71BD1 को आश्रय देने वाले पुनः संयोजक तनाव, CtSus के साथ युग्मन द्वारा। ए: सब्सट्रेट के पूरे सेल बायोट्रांसफॉर्मेशन के एचपीएलसीक्रोमैटोग्राम 1. पता लगाने वाली तरंग दैर्ध्य 360 एनएम थी; बी: उत्पाद 1ए का एचआरईएसआई-एमएस और एमएस2स्पेक्ट्रा; सी: सब्सट्रेट 2 के संपूर्ण-सेलबायोट्रांसफॉर्मेशन के एचपीएलसी क्रोमैटोग्राम; पता लगाने की तरंग दैर्ध्य 330 एनएम थी। डी: उत्पाद 2ए और 2बी का एचआरईएसआई-एमएस स्पेक्ट्रा

जब 1 (m/z 179.034 4 [M+H]+, आणविक सूत्र C9H6O4) का उपयोग सब्सट्रेट के रूप में किया गया था, तो उत्पाद क्रोमैटोग्राफ़िक शिखर 1a (m/z 41.{{10%) [M+H] +, अनुमानित आणविक सूत्र C15H16O9) का पता 5.39 मिनट पर लगाया गया, जो सब्सट्रेट और नियंत्रण उत्पाद के यूवी अवशोषण के अनुरूप था। उसी समय, m/z 179 के टुकड़े का शिखर। वह 1ए ग्लूकोज के एक अणु से जुड़े सब्सट्रेट 1 का उत्पाद था। रूपांतरण दर की गणना चरम क्षेत्र को एकीकृत करके की गई थी। यह पाया गया कि ग्लाइकोसिलेटेड उत्पाद 1a उत्पन्न करने के लिए सब्सट्रेट 1 को उत्प्रेरित करने वाली UGT71BD1 संपूर्ण कोशिकाओं की रूपांतरण दर 71.87% थी, जबकि CtSus के जुड़ने से प्रतिक्रिया की रूपांतरण दर 95.84% तक बढ़ गई, जो नियंत्रण समूह की तुलना में 1.3 गुना थी। जब सब्सट्रेट यौगिक 2 (m/z 227.072 5 [MH]-, आणविक सूत्र C14H12O3) था, तो उत्पाद क्रोमैटोग्राफ़िक शिखर 2a (m/z 389.123 4 [MH]-, अनुमानित आणविक सूत्र C20H22O8) और 2b (m/z 575.175 9 [M+Na]+, अनुमानित आणविक सूत्र 26H32O13) क्रमशः 10.32 और 6.52 मिनट पर पाए गए, जो सब्सट्रेट के विशिष्ट यूवी अवशोषण के अनुरूप थे और नियंत्रण उत्पाद. 227 पर एक टुकड़े की चोटी का पता चला था। साहित्य में डेटा [18] और मास स्पेक्ट्रोमेट्री भविष्यवाणी जानकारी की तुलना करके, यह निर्धारित किया गया कि उत्पाद 2बी दो ग्लूकोज अणुओं से जुड़े सब्सट्रेट 2 का उत्पाद था। एकीकृत शिखर क्षेत्र का उपयोग करके रूपांतरण दर की गणना की गई थी। यह पाया गया कि सीटीसस को जोड़ने से सब्सट्रेट 2 की ग्लाइकोसिलेशन प्रतिक्रिया की रूपांतरण दर 64.01% से 78.51% तक बढ़ सकती है, जिसमें मोनोसैकराइड उत्पाद 2ए की उपज 45.09% से बढ़कर 63.58% हो गई, और डिसैकराइड उत्पाद 2बी की उपज 18.92% से बदलकर 14.93% हो गया।

3

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3.3 सीटीएसयूएस

पुनः संयोजक प्रोटीन शुद्धि और इन विट्रो एंजाइम उत्प्रेरक गतिविधि पहचान पूरे सेल रूपांतरण प्रयोग के परिणामों ने सुझाव दिया कि सीटीसस में सक्रिय ग्लूकोज दाता यूडीपी-ग्लूकोज के उत्पादन को उत्प्रेरित करने की गतिविधि है। इन विट्रो एंजाइमेटिक कटैलिसीस के माध्यम से उत्प्रेरक गतिविधि को और अधिक सत्यापित करने के लिए, pCold™ अभिव्यक्ति प्रणाली में CtSus जीन के संलयन प्रोटीन को एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी द्वारा अलग और शुद्ध किया गया था। परिणामों से पता चला कि जब pCold™ I का उपयोग अभिव्यक्ति वेक्टर के रूप में किया गया था, तो पुनः संयोजक प्रोटीन बड़ी मात्रा में व्यक्त किया गया था, लेकिन अधिकतर अवक्षेप में। जब pCold™ TF को अभिव्यक्ति वेक्टर के रूप में उपयोग किया गया था, तो CtSus जीन को ई. कोली में बड़ी मात्रा में व्यक्त किया गया था (चित्र 3A)। इन विट्रो एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया के लिए फ्यूजन प्रोटीन को हिसट्रैप एफएफ एफिनिटी क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध किया गया था। परिणाम चित्र 3बी में दिखाए गए हैं। जब नकारात्मक नियंत्रण समूह की तुलना में सुक्रोज और यूडीपी को सब्सट्रेट के रूप में उपयोग किया गया, तो 10.32 मिनट पर एक नया उत्पाद शिखर पाया गया। इसका प्रतिधारण समय और यूवी अवशोषण यूडीपी-ग्लूकोज के अनुरूप था। मानक के साथ तुलना करने पर उत्पाद यूडीपी-ग्लूकोज साबित हुआ। हालाँकि, चूंकि pCold™ TF अभिव्यक्ति वेक्टर द्वारा व्यक्त संलयन प्रोटीन में एक बड़ा ट्रिगर कारक घुलनशील टैग होता है (टैग प्रोटीन का आकार 48 kDa है), इसका प्रोटीन की उत्प्रेरक गतिविधि पर बहुत प्रभाव पड़ेगा। इसलिए, फ़्यूज़न प्रोटीन के टैग को फ़ैक्टर Xa एंजाइम द्वारा और काट दिया गया, और बिना बहिर्जात टैग वाले CtSus प्रोटीन को शुद्ध किया गया (चित्र 3A)। प्रोटीन को इन विट्रो एंजाइमैटिक कैटेलिसिस के अधीन किया गया था, और परिणामों से पता चला कि यूडीपी-ग्लूकोज की उपज 3.53% से बढ़कर 10.66% हो गई (चित्र 3बी)। उपरोक्त परिणामों ने इन विट्रो एंजाइमेटिक कटैलिसीस के माध्यम से यूडीपी-ग्लूकोज के उत्पादन को उत्प्रेरित करने में सीटीसस की गतिविधि की पुष्टि की, और यह भी दिखाया कि एक बड़े एफ़िनिटी टैग की उपस्थिति सीटीसस की घुलनशील अभिव्यक्ति के लिए अनुकूल है, लेकिन यह इन पर भी महत्वपूर्ण प्रभाव डालेगी। एंजाइम की इन विट्रो उत्प्रेरक गतिविधि।

चित्र 3 CtSus की विषम अभिव्यक्ति और कार्यात्मक पहचान। ए: सीटीसस प्रोटीन का एसडीएस-पेज विश्लेषण। लेन 1: प्रोटीन मार्कर; लेन 2: ट्रिगर फैक्टर के साथ पुनः संयोजक सीटीएसयूएस; लेन 3: लाल तीर द्वारा लेबल किया गया सीटीसस प्रोटीन देने के लिए फैक्टर एक्सए प्रोटीज़ का उपयोग करके ट्रिगर13फैक्टर टैग क्लीवेज। बी: संदर्भ मानक यूडीपी-ग्लूकोज के साथ क्रमशः सुक्रोज और यूडीपी की उपस्थिति में यूडीपी-ग्लूकोज के संश्लेषण को उत्प्रेरित करने के लिए संलयन प्रोटीन और ट्रिगर कारक-मुक्त सीटीसस प्रोटीन का उपयोग करके इनविट्रो एंजाइमैटिक परख। उबले हुए प्रोटीन का उपयोग उन्हीं परिस्थितियों में नियंत्रण समूह के रूप में किया गया था। डिटेक्शनवेवलेंथ 260 एनएम थी