ट्रांस्क्रिप्टोम असेंबली और सिस्टैंच डेजर्टिकोला मांसल तने की जीन खोज-Ⅰ

पृष्ठभूमि

सिस्टैंच डेजर्टिकोला एक पूरी तरह से गैर-प्रकाश संश्लेषक परजीवी पौधा है जिसका औषधीय महत्व है और यह मुख्य रूप से उत्तर पश्चिमी चीन के रेगिस्तान में वितरित किया जाता है। इसका सूखा मांसल तना एक महत्वपूर्ण टॉनिक हैपारंपरिक चीनी चिकित्सामुख्य रूप से पुरुष यौन क्रिया में सुधार और प्रतिरक्षा को मजबूत करने की भूमिका के साथ, लेकिन जीनोमिक और ट्रांसक्रिप्टोमिक संसाधनों की कमी के कारण आंशिक रूप से कुछ यंत्रवत अध्ययन आयोजित किए गए हैं।

प्राकृतिक सिस्टान्चे ट्यूबुलोसा चीनी पारंपरिक चिकित्सा पीएचजीएस75% ईसीएच 30% अधिनियम 12%

परिणाम

इस अध्ययन में, हमने सी. डेजर्टिकोला के मांसल तने में गहरी ट्रांसक्रिपटोम अनुक्रमण किया, और HiSeq2000 प्लेटफ़ॉर्म पर इलुमिना जोड़ी-अंत अनुक्रमण का उपयोग करके लगभग 8 0 मिलियन रीड उत्पन्न किए गए। ट्रिनिटी असेंबलर का उपयोग करके, हमने 200bp से 15,698bp तक ट्रांसक्रिप्ट लंबाई के साथ 95,787 ट्रांसक्रिप्ट अनुक्रम प्राप्त किए, जिनकी औसत लंबाई 950 बेस और N50 लंबाई 1,519 बेस थी। 63,957 प्रतिलेखों की पहचान 0.5 से अधिक या उसके बराबर एफपीकेएम के साथ सक्रिय रूप से व्यक्त की गई थी, जिसमें 30,098 प्रतिलेखों को कई सार्वजनिक डेटाबेस (एनसीबीआई, और केईजीजी में यूनिप्रोट, एनआर, और एनटी) के अनुक्रम समानता विश्लेषण द्वारा जीन विवरण या जीन ऑन्टोलॉजी शर्तों के साथ एनोटेट किया गया था। . इसके अलावा, हमने लिग्निन और फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स (पीएचजी) के जैवसंश्लेषण में शामिल प्रमुख एंजाइम जीन की पहचान की, जिन्हें प्राथमिक सक्रिय तत्व माना जाता है। चार फेनिलएलनिन अमोनिया-लायस (पीएएल) जीन, लिग्निन और पीएचजी जैवसंश्लेषण में पहला प्रमुख एंजाइम, अनुक्रम तुलना और फ़ाइलोजेनेटिक विश्लेषण के आधार पर पहचाने गए थे। पीएचजी के दो जैवसंश्लेषण मार्ग भी पहली बार प्रस्तावित किए गए थे।

निष्कर्ष

कुल मिलाकर, हमने आरएनए-सीक्यू तकनीक का उपयोग करके सी. डेजर्टिकोला मांसल स्टेम ट्रांसक्रिप्टोम का वैश्विक विश्लेषण पूरा किया। लिग्निन और फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड के जैवसंश्लेषण से संबंधित एंजाइम जीन के एक संग्रह की पहचान इकट्ठे और एनोटेट किए गए प्रतिलेखों से की गई थी, और पीएएल के जीन परिवार की भी भविष्यवाणी की गई थी। इस अध्ययन से अनुक्रम डेटा इस महत्वपूर्ण औषधीय पौधे में भविष्य के फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड जैवसंश्लेषण अनुसंधान और कार्यात्मक जीनोमिक अध्ययन आयोजित करने के लिए एक मूल्यवान संसाधन प्रदान करेगा।

परिचय

सी. डेजर्टिकोला ओरोबैंचेसी परिवार के बारहमासी रेगिस्तानी पौधों की एक विश्वव्यापी प्रजाति है और यह पूरी तरह से गैर-प्रकाश संश्लेषक प्रजाति है और आमतौर पर भूमिगत होलोपैरासिटिक पौधा उगता है। यह सैमोफाइट हेलोक्सिलॉन अमोडेंड्रोन (चेनोपोडियासी) की जड़ों पर परजीवी होता है, जो सूखे और लवणता के प्रति उच्च सहनशीलता के कारण मुख्य रूप से रेगिस्तान और अर्ध-रेगिस्तान में निवास करता है। सी. डेजर्टिकोला कठोर पर्यावरणीय परिस्थितियों के प्रति मजबूत प्रतिरोध दिखाता है और मुख्य रूप से उत्तर-पश्चिमी चीन, विशेष रूप से इनर मंगोलिया, गांसु और झिंजियांग में वितरित किया जाता है। हाल के वर्षों में मनुष्यों द्वारा इसकी बढ़ती खपत के कारण इसे एक लुप्तप्राय जंगली प्रजाति माना जाता है। सी. डेजर्टिकोला जिसे अक्सर डेजर्ट जिनसेंग कहा जाता है, आमतौर पर डेजर्ट-ब्रूमरेप के रूप में जाना जाता है और सूखे मांसल तने का उपयोग कई वर्षों से चीन और जापान में पारंपरिक रूप से महत्वपूर्ण टॉनिक के रूप में किया जाता रहा है। इसे शुरू में लगभग 1800 साल पहले शेन नोंग बेन काओ जिंग (चीनी मटेरिया मेडिका का शब्दकोश, 1977) में दर्ज किया गया था और इसे के मुख्य स्रोतों में से एक माना जाता था।चीनी औषधीय जड़ी बूटी सिस्टैंच.

यौन क्रिया में सुधार के लिए प्राकृतिक सिस्टान्चे ट्यूबुलोसा PHGS75% ECH 30% ACT 12%

सी. डेजर्टिकोला के अर्क में औषधीय कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला होती है, विशेष रूप से यौन क्रिया में सुधार, गुर्दे को स्वस्थ बनाने, यकृत की रक्षा करने, एपेरेंट गतिविधि, स्मृति बढ़ाने, इम्यूनोमॉड्यूलेटरी, एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि, एंटी-इंफ्लेमेटरी, एंटीवायरल गतिविधि आदि में उपयोग के लिए। सी. डेजर्टिकोला के प्रमुख जैव सक्रिय घटक फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स (PheGs, PhGs) हैं। आज तक, सी.डेसर्टिकोला के रसीले तने से 20 से अधिक फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड अलग किए गए हैं। उनमें से,एक्टियोसाइड और इचिनाकोसाइडमहत्वपूर्ण औषधीय गतिविधियों वाले दो मुख्य घटक हैं और चीनी फार्माकोपिया (2005 और 2010 संस्करण) में सी. डेजर्टिकोला के गुणवत्ता मानकों के रूप में प्रलेखित हैं। पीएचजी के तीन रासायनिक घटक कार्बनिक अम्ल, सैकराइड और फेनिलएथेनॉइड हैं, हालांकि, सी.डेसर्टिकोला में फेनिलएथेनॉइड बायोसिंथेटिक मार्गों से संबंधित विवरण खराब समझे जाते हैं।

सी.डेसर्टिकोला के व्यावसायिक और औषधीय महत्व के बावजूद, इस प्रजाति का जीनोमिक और ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा बहुत सीमित है। एनसीबीआई डेटाबेस में कोई ईएसटी उपलब्ध नहीं है और क्लोरोप्लास्ट जीनोम अनुक्रम को छोड़कर इस प्रजाति की संपूर्ण जीनोम जानकारी अनुपलब्ध है। सीमित ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा पीएचजी बायोसिंथेटिक तंत्र के अध्ययन में बाधा डालता है। आरएनए-सीक्यू तकनीक लक्षित जीनोम के व्यक्त भागों के अनुक्रम उत्पन्न कर सकती है और एनजीएस प्रौद्योगिकी प्लेटफार्मों (जैसे एप्लाइड बायोसिस्टम्स एसओएलआईडी, इलुमिना हाईसेक और रोश 454) का उपयोग करके जीन की पहचान कर सकती है [18]। यह ट्रांसक्रिप्टोम डे नोवो असेंबली में तेजी से लोकप्रिय हो रहा है, क्योंकि यह उच्च रिज़ॉल्यूशन और व्यापक गतिशील रेंज के साथ एक लागत प्रभावी और शक्तिशाली दृष्टिकोण है, खासकर जब से कम-बहुतायत ट्रांसक्रिप्ट का पता लगाने में इसका फायदा होता है। विभिन्न लाभों के कारण, RNA-seq सीमित आनुवंशिक संसाधनों वाले गैर-मॉडल जीवों के लिए विशेष रूप से आकर्षक है। हालाँकि, RNA-seq द्वारा C. डेजर्टिकोला ट्रांसक्रिप्टोम पर कोई विस्तृत शोध नहीं है।

इस अध्ययन में, हमने इलुमिना हिसेक2000 प्लेटफॉर्म का उपयोग करके सी. डेजर्टिकोला के लिए विश्व स्तर पर स्टेम ट्रांसक्रिप्टोम को अनुक्रमित किया और 7.9जी कच्चा डेटा प्राप्त किया। असेंबली और एनोटेशन द्वारा, हमने पीएचजी के जैवसंश्लेषण में शामिल जीन और संपूर्ण लिग्निन जैवसंश्लेषण के लिए जिम्मेदार जीन का खनन किया। हमारे आरएनए-सीक्यू विश्लेषण ने पहला सी. डेजर्टिकोला सर्वसम्मति प्रतिलेख उत्पन्न किया और सी. डेजर्टिकोला के औषधीय मूल्य की व्यापक समझ में नई अंतर्दृष्टि प्रदान की। इसके अतिरिक्त, यहां वर्णित विधि को बहुत सीमित जीनोमिक संसाधनों के साथ किसी अन्य औषधीय पौधे में विशिष्ट औषधीय घटक जैवसंश्लेषण मार्गों में शामिल जीन की खोज की सुविधा के लिए प्रोफाइल ट्रांसक्रिप्टोम पर व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है।

सामग्री और तरीके

पौध सामग्री संग्रह

उत्खनन चरण में सी. डेजर्टिकोला के लिए ताजा रसीला तना उत्तर-पश्चिमी चीन के भीतरी मंगोलिया में अल्क्सा लीग के बायनहॉट शहर में एक पौधे के आधार से एकत्र किया गया था। संग्रहण परमिट प्लांट बेस के मालिक (हांगकुई कांग्रॉन्ग ग्रुप) से प्राप्त किया गया था। वाउचर नमूना बीजिंग इंस्टीट्यूट ऑफ जीनोमिक्स, चाइनीज एकेडमी ऑफ साइंसेज में कोर जीनोमिक सुविधा में जमा किया गया था। सफाई के बाद, रसीले तने के ऊतकों को छोटे टुकड़ों में काटा गया और तुरंत तरल नाइट्रोजन में जमा दिया गया, और फिर आगे की प्रक्रिया तक -80 डिग्री पर संग्रहीत किया गया।

आरएनए निष्कर्षण, सीडीएनए पुस्तकालय निर्माण, और इलुमिना अनुक्रमण

निर्माता के निर्देशों के अनुसार TRIzol Reagent (Invitrogen Inc., कैलिफ़ोर्निया, USA) का उपयोग करके रसीले तने से कुल RNA निकाला गया। किसी भी जीनोमिक डीएनए को हटाने के लिए परिणामी नमूनों को DNase I से उपचारित किया गया। निकाले गए आरएनए को एगिलेंट 21 0 0 बायोएनालाइज़र (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज) का उपयोग करके मात्राबद्ध किया गया था और एथिडियम ब्रोमाइड धुंधलापन के साथ डिनेचरिंग एगरोज़ जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करके अखंडता की जांच की गई थी। 1.9 और 2.1 के बीच A260/A280 अनुपात, 1.0 से अधिक RNA 28S:18S अनुपात, और RNA अखंडता संख्या (RIN) -8.5 वाले RNA नमूनों का उपयोग बाद के विश्लेषणों में किया गया।

आरएनए-सीक लाइब्रेरी इलुमिना ट्रूसेक आरएनए नमूना तैयारी किट का उपयोग करके तैयार की गई थी। निर्माता के निर्देशों के अनुसार पॉली (ए)+ आरएनए को डायनाल लिगो (डीटी) 25 मोतियों का उपयोग करके कुल आरएनए से अलग किया गया था। शुद्धिकरण के बाद, एमआरएनए को छोटे टुकड़ों में तोड़ने के लिए एक विखंडन बफर जोड़ा गया था। सुपरस्क्रिप्ट III रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और एन 6 रैंडम हेक्सामर प्राइमर के साथ, इन छोटे टुकड़ों को टेम्पलेट के रूप में उपयोग करके प्रथम-स्ट्रैंड सीडीएनए को संश्लेषित किया गया था। दूसरे-स्ट्रैंड सीडीएनए को फिर बफर, डीएनटीपी, आरएनएएसएच, और डीएनए पोलीमरेज़ I का उपयोग करके संश्लेषित किया गया था। परिणामी डबल-स्ट्रैंडेड सीडीएनए को टी 4 डीएनए पोलीमरेज़, डीएनए पोलीमरेज़ I क्लेनो टुकड़ा, और टी 4 पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेज का उपयोग करके अंत-मरम्मत के अधीन किया गया था, और लिगेट किया गया था T4 डीएनए लिगेज का उपयोग करने वाले एडेप्टर। एडेप्टर-लिगेटेड टुकड़ों को QiaQuick पीसीआर निष्कर्षण किट का उपयोग करके शुद्ध किया गया और EB बफर के साथ शुद्ध किया गया। एगरोज़ जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके विश्लेषण के बाद, पीसीआर प्रवर्धन के लिए उपयुक्त टुकड़ों को टेम्पलेट के रूप में चुना गया था। परिणामी सीडीएनए लाइब्रेरी का अनुक्रमण इलुमिना हाईसेक 2000 प्रणाली के साथ किया गया था।

ट्रांस्क्रिप्ट डे नोवो असेंबली और जीन अभिव्यक्ति मात्रा का ठहराव

अनुक्रमण से उत्पन्न कच्चे रीड्स को इन-हाउस विधि का उपयोग करके एडाप्टर अनुक्रमों (ATCTCGTATGCCGTC) को हटाकर साफ किया गया था। फिर हमने एक कठोर निम्न गुणवत्ता वाली फ़िल्टरिंग प्रक्रिया अपनाई। सबसे पहले, 20 से कम फ़्रेड गुणवत्ता स्कोर वाले आधारों को अनुक्रम के 3'अंत से ट्रिम किया जाएगा, जब तक कि उच्च गुणवत्ता (20 से अधिक या उसके बराबर) के साथ एक आधार में न चला जाए। यदि पढ़ने की लंबाई 50बीपी से कम थी, तो इसे खारिज कर दिया जाएगा। दूसरे, रीड्स को इस मानदंड के आधार पर फ़िल्टर किया जाएगा कि एक रीड में 70% आधारों में उच्च गुणवत्ता वाले स्कोर (20 से अधिक या उसके बराबर) हों। तीसरा, आगे की असेंबली के लिए केवल युग्मित-अंत रीड्स का उपयोग किया गया था। डे नोवो ट्रांस्क्रिप्ट असेंबली ट्रिनिटी रिलीज {{10 }} [30] का उपयोग करके आयोजित की गई थी जिसमें तीन क्रमिक सॉफ्टवेयर मॉड्यूल शामिल थे: इंचवर्म, क्रिसलिस और बटरफ्लाई। असेंबली पैरामीटर निम्नानुसार सेट किए गए थे: -seqType fq-JM 300G -min_contig_लंबाई {{18}CPU 20-इंचवर्म_cpu {{21} }bflyCPU 20.

प्रतिलेख बहुतायत को निर्धारित करने के लिए, अनुक्रमित जोड़ी-अंत रीड्स को ट्रिनिटी में एक स्क्रिप्ट का उपयोग करके इकट्ठे प्रतिलेखों में फिर से संरेखित किया गया था। मैप किए गए रीड्स का उपयोग आरएसईएम (एक्सपेक्टेशन मैक्सिमाइजेशन द्वारा आरएनए-सेक) सॉफ्टवेयर द्वारा परिमाणीकरण के लिए किया गया था। जीन या आइसोफॉर्म प्रचुरता को प्रति मिलियन फ्रैगमेंट मैप्ड (एफपीकेएम) मान के प्रति किलोबेस प्रतिलेख के टुकड़े द्वारा दर्शाया गया था, उन प्रतिलेखों को एफपीकेएम मान के बराबर या उससे अधिक 0.05 के साथ व्यक्त के रूप में परिभाषित किया गया था।

व्यक्त प्रतिलेखों का कार्यात्मक एनोटेशन

क्लोरोप्लास्ट जीनोम [1] को छोड़कर सी. डेजर्टिकोला का कोई जीन एनोटेशन सेट नहीं है। हमने व्यक्त प्रतिलेखों को जेनबैंक एनटी, जेनबैंक एनआर, और टीएआईआर 10_ पेप {{2} से तुलना करके ब्लास्ट प्रोग्राम (ई) का उपयोग करके अलग से अपडेट किए गए डेटासेट की व्याख्या की।< = 1e-20). Meanwhile, all expressed transcripts were translated into potential proteins according to ORF prediction by TransDecoder and predicated for the conserved domains based on the Pfam database.

जीन ओन्टोलॉजी और केईजीजी पाथवे एनोटेशन यूनिप्रोट डेटाबेस के अनुक्रम समानता संरेखण द्वारा (सभी इकट्ठे प्रतिलेखों का जीन ओन्टोलॉजी (जीओ) एनोटेशन (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/) से डाउनलोड की गई एसोसिएशन फ़ाइल का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। डेटाबेस/GO/goa/UNIPROT/gene{{0}एसोसिएशन। Goa_uniprot.gz) व्यक्त जीनों की GO शर्तों का क्लस्टरिंग कस्टम स्क्रिप्ट का उपयोग करके किया गया था, और हमने इसके लिए चौथे स्तर पर जीनों को एनोटेट किया था सीसी, बीपी और एमएफ श्रेणियां अलग से।

ऑनलाइन टूल केएएएस (केईजीजी स्वचालित एनोटेशन सर्वर) [34] का उपयोग करके सभी अनुमानित प्रोटीन अनुक्रमों के लिए केईजीजी मार्ग की जानकारी सौंपी गई थी। फास्टा प्रारूप में अनुक्रम केएएएस अनुरोध के लिए प्रस्तुत किए गए थे, और सी. डेजर्टिकोला स्टेम ट्रांसक्रिप्टोम से संबंधित सभी पथों की जानकारी की परिणामी फाइलें डाउनलोड की गईं थीं। केईजीजी में 13 पौधों के जीवों के जीन डेटा सेट का उपयोग बीबीएच (द्वि-दिशात्मक सर्वश्रेष्ठ हिट) विधि का उपयोग करके एनोटेशन के लिए किया गया था।

प्राकृतिक सिस्टांचे ट्यूबुलोसा सिस्टांचे अर्क पीएचजीएस75% ईसीएच 30% अधिनियम 12%

आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण

DNase I के साथ पाचन के बाद, कुल RNA का लगभग 5ug ऑलिगो (dT) 15 प्राइमरों और GoScript रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन सिस्टम (Promega) के साथ रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया के माध्यम से पहले-स्ट्रैंड cDNA में परिवर्तित किया गया था। वास्तविक समय पीसीआर में टेम्पलेट के रूप में उपयोग करने से पहले सीडीएनए उत्पादों को न्यूक्लीज-मुक्त विआयनीकृत पानी से 10- गुना पतला किया गया था। विशिष्ट सीडीएनए को GoTaq 2-स्टेप RT-qपीसीआर सिस्टम (Promega) द्वारा 20 ul की मात्रा में प्रवर्धित किया गया था। निर्माता के निर्देशों के अनुसार 7500 रियल-टाइम पीसीआर डिटेक्शन सिस्टम (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) के साथ 60 डिग्री के एनीलिंग तापमान पर पीसीआर प्रवर्धन किया गया था। सापेक्ष प्रतिलेख बहुतायत की गणना 7500 मैनेजर सॉफ्टवेयर का उपयोग करके आंतरिक मानक के रूप में जीन "comp{13}}c0" के साथ तुलनात्मक चक्र थ्रेशोल्ड विधि द्वारा की गई थी।

आरटी-पीसीआर के लिए प्राइमर जोड़े ऑनलाइन सॉफ्टवेयर (http://primer3.ut.ee/) के आधार पर डिजाइन किए गए थे और एस1 डेटासेट में सूचीबद्ध हैं।

परिणाम

आरएनए अनुक्रमण और सी. डेजर्टिकोला मांसल स्टेम की डे नोवो ट्रांस्क्रिप्टोम असेंबली

सी. डेजर्टिकोला के तने का उपयोग कई वर्षों से चीन और जापान में पारंपरिक रूप से महत्वपूर्ण टॉनिक के रूप में बड़े पैमाने पर किया जाता रहा है। सी. डेजर्टिकोला मांसल तने में जीन अभिव्यक्ति का वैश्विक अवलोकन प्राप्त करने के लिए, हमने क्रमशः 2013 और 2014 में उसी पौधे के आधार के सी. डेजर्टिकोला स्टेम नमूने एकत्र किए। कुल आरएनए निकाले गए और युग्मित-अंत आरएनए-सीक पुस्तकालयों के निर्माण के लिए पॉलीए+ आरएनए को शुद्ध किया गया। अनुक्रम के लगभग 8 अरब और 8.6 अरब आधारों के अनुरूप 79,433,734 और 86,019,176 जोड़ी-अंत रीड्स इलुमिना हाईसेक 2000 अनुक्रमण का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे।

2013-वर्ष और 2014-वर्ष के नमूनों में प्लेटफ़ॉर्म (तालिका 1)। एडॉप्टर अनुक्रमों को हटाने और निम्न-गुणवत्ता वाले रीड्स को फ़िल्टर करने के बाद (विधियों में विवरण देखें), 2013-वर्ष के नमूने में 64,831,040 उच्च-गुणवत्ता वाले जोड़ी-अंत रीड्स का उपयोग डे नोवो ट्रांसक्रिप्टोम असेंबली के लिए किया गया था। ट्रिनिटी अनुक्रम असेंबलर [30] का उपयोग करते हुए, 51,719 जीन और 95,787 प्रतिलेख अनुक्रम 200 बीपी से 15,698 बीपी तक की प्रतिलेख लंबाई के साथ उत्पन्न किए गए थे। इकट्ठे प्रतिलेखों की औसत लंबाई 950 आधार है और N50 की लंबाई 1,519 आधार है। विभिन्न लंबाई में प्रतिलेखों की संख्या से पता चला कि एकत्रित प्रतिलेखों में से 57.32% लगभग 500 बीपी या उससे अधिक लंबे थे (चित्र 1ए)। वर्ष के नमूने में उच्च-गुणवत्ता वाले जोड़ी-अंत पाठों को इकट्ठे ट्रांस्क्रिप्टोम में मैप किया गया था। इसके अलावा, हमने पाया कि प्रत्येक इकट्ठे जीन के लिए प्रतिलेख संख्या अलग-अलग थी और 69% जीन एक व्यक्त आइसोफॉर्म के साथ थे, जबकि 31% जीन दो या दो से अधिक प्रतिलेख व्यक्त करते थे (चित्र 1बी)।

इकट्ठे प्रतिलेखों की अभिव्यक्ति मात्रा का ठहराव और कार्यात्मक एनोटेशन

आरएसईएम पैकेज का उपयोग करके जीन या ट्रांसक्रिप्ट बहुतायत को निर्धारित किया गया था, जिसमें अनुक्रमित रीड्स को बॉटी का उपयोग करके इकट्ठे जीन या ट्रांस्क्रिप्ट अनुक्रमों में फिर से संरेखित किया गया था, और उन मैप किए गए रीड्स का उपयोग परिमाणीकरण के लिए किया गया था। प्रत्येक जीन या प्रतिलेख के लिए एफपीकेएम मूल्य की गणना की गई, और अंत में, हमने 2{17} में सी. डेजर्टिकोला मांसल स्टेम नमूनों में 63,957 और 52,857 सक्रिय रूप से व्यक्त प्रतिलेख (एफपीकेएम मूल्य 0.5 से अधिक या उसके बराबर) की पहचान की। }क्रमशः 13 और 2014। 44,776 प्रतिलेख (2013- वर्ष के नमूने में 70.01%, 2014- वर्ष के नमूने में 84.71%) आमतौर पर दो प्रतिकृतियों में व्यक्त किए गए थे, और उनके अभिव्यक्ति डेटा का सहसंबंध (पियर्सन सहसंबंध गुणांक: 0.91979) था S1 चित्र में दिखाया गया है। अनुक्रमित कच्चा डेटा एनसीबीआई एसआरए डेटाबेस (परिग्रहण संख्या: SRX857402 और SRX858938) पर अपलोड किया गया था। हमने आगे के विश्लेषण के लिए वर्ष के नमूने में पहचाने गए व्यक्त जीन का उपयोग किया। सभी व्यक्त प्रतिलेखों के लिए कार्यात्मक एनोटेशन जानकारी दो तरीकों का उपयोग करके प्राप्त की गई थी। सबसे पहले, सभी व्यक्त प्रतिलेखों को BLAST एल्गोरिदम द्वारा अलग-अलग ज्ञात न्यूक्लियोटाइड (जेनबैंक एनटी) और पेप्टाइड अनुक्रम डेटाबेस (जेनबैंक एनआर और अरेबिडोप्सिस पेप्टाइड) से जोड़ा गया था। 63,957 व्यक्त प्रतिलेखों में से,

29,220 (45.7%) को एनोटेट किया गया और ई-वैल्यू कटऑफ 1e-20 के साथ तीन विषय डेटाबेस में से किसी में अनुक्रमों की समरूपता दिखाई गई। इस बीच, सभी व्यक्त प्रतिलेख अनुक्रमों के लिए उम्मीदवार कोडिंग क्षेत्रों की भविष्यवाणी ट्रांसडिकोडर सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके की गई थी, और प्रत्येक प्रतिलेख के लिए सबसे लंबे ओआरएफ का उपयोग Pfam डोमेन खोज के लिए किया गया था। परिणामस्वरूप, Pfam डेटाबेस के आधार पर 21,358 (33.4%) प्रतिलेखों को एनोटेट किया गया। कुल मिलाकर, उपरोक्त दो तरीकों को मिलाकर 30,098 (47.1%) प्रतिलेखों का सार्वजनिक डेटाबेस में ज्ञात जीन से महत्वपूर्ण रूप से मिलान किया गया। फ़ंक्शन एनोटेशन के साथ संपूर्ण व्यक्त प्रतिलेख सूची पूरक डेटा (S2 डेटासेट) में दिखाई गई थी।

हमने सभी अनुक्रमणों के 18.99% के अनुरूप शीर्ष 20 सबसे अधिक व्यक्त प्रतिलेखों (तालिका 2) का सर्वेक्षण किया, और पाया कि उनमें से अधिकांश अजैविक प्रतिक्रिया देने वाले जीन हैं

तनाव उत्तेजना. डिहाइड्रिन (डीएचएन), हाइड्रोफिलिक और थर्मोस्टेबल स्ट्रेस प्रोटीन का एक वर्ग है जिसमें उच्च संख्या में चार्ज किए गए अमीनो एसिड होते हैं जो ग्रुप II लेट एम्ब्रियोजेनेसिस एबंडेंट (एलईए) परिवार से संबंधित हैं, सबसे उच्च रूप से व्यक्त जीन है। मांसल तनों में अत्यधिक अभिव्यक्त तीन अलग-अलग डेहिरिन प्रतिलेख (COMP28713_c0_seq1/2/4) पाए गए, जो सूखे के तनाव से होने वाली क्षति से कोशिकाओं की रक्षा करने में शामिल हो सकते हैं। अन्य तनाव-संबंधित जीन जैसे हीट शॉक प्रोटीन, रोगज़नक़-संबंधित प्रोटीन और मेटालोथायोनिन भी अत्यधिक व्यक्त पाए गए, जो इसके गंभीर अस्तित्व के वातावरण से संबंधित हो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, 26एस राइबोसोमल आरएनए जीन (कॉम्प22329_सी2_seq1), ऑक्सिन-दमित/सुप्तावस्था-संबद्ध प्रोटीन (कॉम्प20999_c0_seq1), सहित कुछ संवैधानिक जीन ADP-राइबोसाइलेशन फ़ैक्टर (COMP20499_ c0_seq1) को भी अत्यधिक प्रतिलेखित किया गया था।

प्रतिरक्षा में सुधार के लिए प्राकृतिक सिस्टान्चे ट्यूबुलोसा PHGS75% ECH 30% ACT 12%