सिस्टैंच ट्यूबुलोसा एपोप्टोसिस और ग्लियाल सेल-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक फैक्टर के विनियमन के माध्यम से डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की रक्षा करता है: विवो और विट्रो में-Ⅰ

परिचय

पार्किंसंस रोग (पीडी) बुजुर्ग लोगों में होने वाली एक सामान्य न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारी है, जिसमें अध: पतन के कारण मूल नाइग्रा (एसएन) में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के नुकसान की रोग संबंधी अभिव्यक्तियाँ होती हैं। रोग की गंभीरता एसएन में डोपामाइन (डीए) न्यूरोनल कोशिका हानि से संबंधित है, जो इस दृष्टिकोण के अनुरूप है कि किसी भी लक्षण के प्रकट होने से पहले न्यूरोडीजेनेरेटिव प्रक्रिया कई वर्षों तक आगे बढ़ती है (सावले और मायर्स, 1993). रोग की प्रगतिशील प्रकृति अंतर्निहित न्यूरोडीजेनेरेटिव प्रक्रिया को अवरुद्ध करके चिकित्सीय हस्तक्षेप की दिलचस्प संभावनाओं का सुझाव देती है। इसलिए डीए न्यूरॉन अस्तित्व पर न्यूरोट्रॉफिक कारकों की चिकित्सा-प्रेरित शक्तिशाली और विशिष्ट क्रियाओं की खोज काफी रुचि रखती है।

डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स PHGS75% ECH 30% ACT 12% की सुरक्षा के लिए प्राकृतिक सिस्टान्चे ट्यूबुलोसा

न्यूरोट्रॉफिक कारक आवश्यक प्रोटीन हैं, जिनमें तंत्रिका विकास कारक (एनजीएफ), मस्तिष्क-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक (बीडीएनएफ), और ग्लियाल सेल-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक (जीडीएनएफ) शामिल हैं, जो तंत्रिका विकास, न्यूरोलॉजिकल विकास, एक्सोनल मार्गदर्शन और न्यूरोनल फ़ंक्शन को बढ़ावा देते हैं। डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की रक्षा और मरम्मत को बढ़ावा देने वाले सभी न्यूरोट्रॉफिक कारकों में से, जीडीएनएफ का सबसे मजबूत प्रभाव होता है (हांग एट अल., 2008; रंगासामी एट अल., 2010; एलन एट अल., 2013)। जीडीएनएफ को इन विट्रो में डीए न्यूरॉन्स (लिन एट अल., 1993) पर शक्तिशाली न्यूरोट्रॉफिक प्रभाव और विवो में न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव डालने के लिए दिखाया गया है। जीडीएनएफ को चूहों में सर्जिकल या विष-प्रेरित एक्सोटॉमी के बाद घाव-प्रेरित कोशिका मृत्यु से नाइग्रल डीए न्यूरॉन्स को बचाने के लिए दिखाया गया है (बेक एट अल।, 1995; किर्न्स एंड गश, 1995; सॉयर एट अल।, 1995) और आंशिक रूप से इसके बाद भी का प्रणालीगत प्रशासनएन-मिथाइल-4-फेनिल-1,2,3,6-टेट्राहाइड्रोपाइरीडीन (एमपीटीपी)चूहों में (टॉमैक एट अल., 1995)। न्यूरोनल एपोप्टोसिस की बढ़ती घटना और न्यूरोट्रॉफिक कारकों के कम सुरक्षात्मक प्रभाव, संभावित रूप से विभिन्न रोग संबंधी कारकों से उत्पन्न, डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के अध: पतन का कारण बनते हैं (होल्डन एट अल।, 2006)।

सी. ट्यूबुलोसा एक हर्बल औषधि है जो सिस्टैंच जीनस के कई पौधों से उत्पन्न होती है। यह गुर्दे की कमी सिंड्रोम के लिए एक प्रमुख चिकित्सीय विकल्प है जो पारंपरिक चीनी चिकित्सा (टीसीएम) में एण्ड्रोजन हार्मोन से निकटता से संबंधित है। आज तक, सी. ट्यूबुलोसा पर बहुत सारे नैदानिक ​​और बुनियादी शोध ने न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों की गतिविधियों को दिखाया है। पीडी उपचार में टीसीएम किडनी-टोनिफाइंग नुस्खे की पहचान इस प्रकार पीडी के लिए एक वैकल्पिक नैदानिक ​​​​उपचार प्रदान कर सकती है।इचिनाकोसाइड (ईसीएच)औषधीय जड़ी बूटी सी. ट्यूबुलोसा में पाया जाने वाला एक प्रमुख जैव सक्रिय घटक है। अध्ययनों ने सिस्टैंच और ईसीएच के ग्लाइकोसाइड्स के चिकित्सीय प्रभाव दिखाए हैं,verbascoside(वीईआर), और अल्जाइमर रोग (एडी), पीडी, और अन्य संवहनी मनोभ्रंश रोगियों पर इकारिन (आईसीए) (यूरानो और तोहदा, 2010; वांग एट अल., 2013; वू एट अल., 2014)। वू एट अल. (2014) ने सुझाव दिया कि सी. ट्यूबुलोसा अर्क जिसमें पर्याप्त ईसीएच और एक्टियोसाइड शामिल थे, एमाइलॉइड जमाव को अवरुद्ध करने और कोलीनर्जिक और हिप्पोकैम्पस डोपामिनर्जिक न्यूरोनल फ़ंक्शन को उलटने के माध्यम से ए -42 के कारण होने वाली संज्ञानात्मक शिथिलता में सुधार करते हैं। ताओ एट अल. (2015) वह पाया गयाफेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्ससी. ट्यूबुलोसा (Ph Gs-Ct) से चूहे के मॉडल के मस्तिष्क के ऊतकों में AQP4 की प्रोटीन और mRNA अभिव्यक्ति को कम करके उच्च ऊंचाई वाले मस्तिष्क शोफ को रोका गया।

प्राकृतिक सिस्टान्चे ट्यूबुलोसा एक्स्ट्रैक्ट स्नैक्स याददाश्त में सुधार करते हैं PHGS75% ECH 30% ACT 12%

पिछले अध्ययनों से पता चला है कि चीनी हर्बल यौगिकों, जिनमें सी. ट्यूबुलोसा, एपिमेडियम और राइज़ोमा पॉलीगोनाटी के तीन तत्व शामिल हैं, न्यूरोट्रॉफिक कारकों की अभिव्यक्ति को विनियमित करके डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स को होने वाले नुकसान और डोपामाइन के बढ़े हुए स्तर को कम करते हैं (वू एट अल।, 2013)। इस प्रकार, यह अभी तक ज्ञात नहीं है कि क्या सी. ट्यूबुलोसा-प्रेरित न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव लंबे समय तक चलने वाले हैं और जीडीएनएफ के प्रशासन द्वारा नाइग्रल डीए न्यूरॉन्स का बचाव किस हद तक पीडी जानवरों के रोगसूचकता के लिए प्रासंगिक मोटरिक व्यवहार के महत्वपूर्ण संरक्षण को वहन कर सकता है। इस अध्ययन में टीसीएम किडनी-टोनिफाइंग रेसिपी, सी. ट्यूबुलोसा नैनोपाउडर का उपयोग किया गया, जिसे चीन में एक राष्ट्रीय पेटेंट (पेटेंट संख्या: 2011103028541) प्राप्त हुआ है और पहले पीडी में एक निश्चित चिकित्सीय प्रभाव दिखाया गया है। इसलिए, वर्तमान अध्ययन को सी. ट्यूबुलोसा उपचार के न्यूरोप्रोटेक्टिव और पुनर्योजी प्रभावों की जांच करने और एमईएस23.5 कोशिकाओं और व्यवहारिक निश्चित चूहों पर एपोप्टोसिस की जांच करने और लक्ष्य परीक्षणों की बैटरी द्वारा मापा गया जीडीएनएफ के विनियमन के लिए डिज़ाइन किया गया था। .

सामग्री और तरीके

सामग्री, अभिकर्मक और उपकरण

सी. ट्यूबुलोसा को बीजिंग टोंग रेन टैंग ग्रुप, कंपनी लिमिटेड, बीजिंग, चीन से खरीदा गया था। ECH, VER, और ICA राष्ट्रीय खाद्य एवं औषधि नियंत्रण संस्थान, चीन से आए हैं। एमईएस23.5 डोपामिनर्जिक न्यूरोनल सेल लाइन प्रोफेसर बियाओ चेन, न्यूरोबायोलॉजी प्रयोगशाला, कैपिटल मेडिकल यूनिवर्सिटी, बीजिंग, चीन का एक उपहार था। पचास C57BL/6 नर चूहे (प्रत्येक का वजन 20-25 ग्राम) शंघाई SLAC प्रयोगशाला पशु कंपनी लिमिटेड (लाइसेंस संख्या: SCXK2012-0002), शंघाई, चीन से खरीदे गए थे।

एमपीपी+, एमटीटी, और ग्लूटामाइन सिग्मा-एल्ड्रिच (कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) से खरीदे गए थे; DMEM/F12 मध्यम और भ्रूण गोजातीय सीरम गिब्को कंपनी (लाइफ टेक्नोलॉजीज, कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) से खरीदा गया था; और एमपीटीपी, डीए मानक और होमोवैनिलिक एसिड (एचवीए) मानक सिग्मा-एल्ड्रिच (कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) से खरीदे गए थे। -एक्टिन, बैक्स, बीसीएल2, जीडीएनएफ, जीडीएनएफ परिवार रिसेप्टर अल्फा (जीएफआर 1) और रिट एंटीबॉडी सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी, इंक. (बेवर्ली, एमए, यूएसए) से खरीदे गए थे; 3,3'-डायमिनोबेंज़िडाइन (डीएबी) स्टेनिंग अभिकर्मक किट फ़ूज़ौ मैक्सिन बायोटेक, लिमिटेड (फ़ुज़ियान, चीन) से खरीदी गई थी; और एसडीएस-पेज जेल नमूना तैयारी किट, अल्ट्रासेंसिटिव एन्हांस्ड केमिलुमिनसेंस (ईसीएल) डिटेक्शन किट और बाइसीनकोनिक एसिड (बीसीए) परख को बायोटाइम इंस्टीट्यूट ऑफ बायोटेक्नोलॉजी (बीजिंग, चीन) से खरीदा गया था।

इस अध्ययन में निम्नलिखित उपकरणों का उपयोग किया गया: ELX800 माइक्रोप्लेट रीडर (बायो टेक विनोस्की, वीटी, यूएसए); CO2 इनक्यूबेटर (हेरियस, हनाउ, जर्मनी); जेल डीओसी 2000 जेल इमेजिंग विश्लेषण प्रणाली, वैद्युतकणसंचलन सेल और वैद्युतकणसंचलन टैंक (बायो-रेड, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए); डीयू-650 प्रोटीन विश्लेषक (बेकमैन कूल्टर, इंक., फुलर्टन, सीए, यूएसए); 5417R हाई-स्पीड रेफ्रिजेरेटेड सेंट्रीफ्यूज (एप्पेंडॉर्फ, हैम्बर्ग, जर्मनी); एसएक्सक्यूएम डुअल प्लैनेटरी बॉल मिल (चांग्शा, टेनकन पाउडर टेक्नोलॉजी कंपनी, लिमिटेड, हुनान, चीन); MM400 मिक्सर मिल (रेत्श जीएमबीएच, हान, जर्मनी); एगिलेंट 1200 उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी; एगिलेंट टेक्नोलॉजीज, सांता क्लारा, सीए, यूएसए); पावरपैक बेसिक इलेक्ट्रोफोरेसिस, पावरपैक बेसिक ट्रांसमेम्ब्रेन ट्रांसफर सिस्टम, यूनिवर्सल हुड II केमिलुमिनसेंस इमेजर, एस1000 थर्मल साइक्लर आरएनए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन सिस्टम (बायो-रेड); मोटिक मेड 6.0 ऊतक और कोशिका छवि विश्लेषण प्रणाली (मोटिक चाइना ग्रुप, कं, लिमिटेड, ज़ियामेन, चीन)।

की तैयारीसी. ट्यूबुलोसानैनोपाउडर

सी. ट्यूबुलोसा का वजन किया गया, फिर शुद्ध और निर्जलित किया गया। पारंपरिक चूर्णीकरण के बाद, सी. ट्यूबुलोसा महीन पाउडर को एक जालीदार छलनी से गुजारा गया और फ्रीज में सुखाया गया। सी. ट्यूबुलोसा नैनोपाउडर तैयार करने के लिए एक तापमान-नियंत्रित वैक्यूम और उच्च-ऊर्जा बॉल मिल का उपयोग किया गया था। सबसे पहले, कच्चे सी. ट्यूबुलोसा नैनोपाउडर को एक वैक्यूम बॉल-मिलिंग टैंक में रखा गया था जो कार्बाइड पीसने वाली गेंदों से भरा हुआ था। पीसने वाली गेंदों और सी. ट्यूबुलोसा नैनोपाउडर के बीच का अनुपात 15:1 से 5:1 तक था। महीन पाउडर प्राप्त करने के लिए, उच्च-ऊर्जा बॉल मिल की गति और अवधि क्रमशः 300 आरपीएम और 20 मिनट निर्धारित की गई थी। बारीक पाउडर को नैनोस्केल सामग्रियों के प्रसंस्करण के लिए तौला गया और मिक्सर मिल में 25/एस की आवृत्ति और तीन पुनरावृत्तियों के लिए 20s के दोलन के साथ संसाधित किया गया। पीबीएस का उपयोग 25 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान को भंग करने और तैयार करने के लिए किया गया था, इसके बाद 30 मिनट का अल्ट्रासोनिकेशन, ऑटोक्लेविंग और अंत में -20◦C पर भंडारण किया गया था।

के सक्रिय घटकों का गुणवत्ता नियंत्रणसी. ट्यूबुलोसाएचपीएलसी द्वारा

ईसीएच और वीईआर में भराव के रूप में ऑक्टाडेसीसिलेन-बॉन्ड सिलिका, मोबाइल चरण ए के रूप में मेथनॉल और मोबाइल चरण बी के रूप में 0.1% फॉर्मिक एसिड समाधान के साथ ग्रेडिएंट रेफरेंस शामिल था। पता लगाने की तरंग दैर्ध्य 330 एनएम थी। आईसीए में फिलर के रूप में ऑक्टाडेसीसिलेन-बॉन्ड सिलिका और मोबाइल चरण के रूप में एसीटोनिट्राइल-पानी (30:70) के साथ ग्रेडिएंट इलुशन शामिल था। पता लगाने की तरंग दैर्ध्य 270 एनएम थी। परीक्षण के लिए नमूना, नियंत्रण और नकारात्मक नियंत्रण प्रत्येक को 10 µL के रूप में मापा गया था।

एमपीपी की व्यवहार्यता को मापने के लिए सेल कल्चर और एमटीटी परख+-उपचारित कोशिकाएं

MES23.5 कोशिकाओं को 5% भ्रूण बछड़ा सीरम, 1% ग्लूटामाइन, 2% 5 {{11} उन्हें संतृप्त आर्द्रता के साथ 5% CO2 इनक्यूबेटर में 37◦C पर इनक्यूबेट किया गया था। कोशिकाओं को अलग किया गया और 0.25% ट्रिप्सिन के साथ पारित किया गया और सेल निलंबन को लॉगरिदमिक विकास चरण में काटा गया। 1 × 105 के घनत्व वाली पृथक कोशिकाओं को पॉलीलिसिन-लेपित 96-वेल प्लेटों में डाला गया, इसके बाद अलग-अलग अंतिम सांद्रता (6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 और 800 μmol/L) को जोड़ा गया। ) एमपीपी+ मीडिया का। एमईएस23.5 कोशिकाएं जिन्हें 24 घंटे और 48 घंटे के लिए सामान्य संस्कृति माध्यम से ऊष्मायन किया गया था, इन विट्रो प्रयोगों में नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था। विभिन्न उपचार समूहों की कोशिकाओं को 4 घंटे के लिए एमटीटी अभिकर्मक के साथ ऊष्मायन किया गया था। कुओं में समाधान को बाद में त्याग दिया गया और 150 μL डीएमएसओ जोड़ा गया और 10 मिनट के लिए दोलन किया गया। 570 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर प्रत्येक नमूने का अवशोषण एक स्वचालित माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके मापा गया था। सेल व्यवहार्यता का प्रतिशत (%)=प्रयोगात्मक समूह का औसत अवशोषण/नकारात्मक नियंत्रण समूह का औसत अवशोषण × 100%।

इन विट्रो कल्चर के समान दृष्टिकोण का उपयोग करके एमईएस23.5 कोशिकाओं में 24- घंटे के उपचार के लिए एमपीपी+ माध्यम की प्रासंगिक सांद्रता जोड़ी गई थी। उपचार के बाद घोल को कुएं में फेंक दिया गया। सी. ट्यूबुलोसा नैनोपाउडर की विभिन्न सांद्रता (10, 50, 100, 200, 250, 500, और 1000 µg/mL) वाले मीडिया को विभिन्न कुओं में MES23.5 कोशिकाओं में जोड़ा गया और 24 घंटे और 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करने के लिए छोड़ दिया गया। एमईएस23.5 कोशिकाएं जिन्हें 24 घंटे और 48 घंटे के लिए सामान्य संस्कृति माध्यम से ऊष्मायन किया गया था, उन्हें नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था। एमईएस23.5 कोशिकाएं जिन्हें एमपीपी+ माध्यम से इनक्यूबेट किया गया था, वाहन के रूप में उपयोग की गईं। प्रत्येक नमूने के लिए माप तीन प्रतियों में किया गया था। सेल व्यवहार्यता की गणना करने के लिए संबंधित उपचार और नियंत्रण समूहों के अवशोषण को मापा गया था।

प्राकृतिक सिस्टान्चे ट्यूबुलोसा अर्क एंटी थकान पीएचजीएस75% ईसीएच 30% अधिनियम 12%

टीएच अभिव्यक्ति इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री द्वारा मापी गई

जब सी. ट्यूबुलोसा नैनोपाउडर 100, 200, और 250 µg/ml में था, तो कोशिका जीवित रहने की दर में उल्लेखनीय वृद्धि हुई (चित्र 2G)। इस प्रकार, बाद के प्रयोगों में, हमने तीन सांद्रता का परीक्षण किया: कम खुराक, मध्यम खुराक और उच्च खुराक समूह। प्रत्येक सी. ट्यूबुलोसा समूह के लिए तीन प्रतिकृतियों का परीक्षण किया गया। निष्फल, पॉलीलीसिन-लेपित कवरस्लिप्स को 6-अच्छी प्लेटों में रखा गया था। इसके बाद, 5 × 104 कोशिकाओं को प्रत्येक कुएं में डाला गया और 24 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया। पारंपरिक ताज़ा माध्यम को सामान्य नियंत्रण समूह में बदल दिया गया था और 100 µmol/L MPP+ माध्यम की अंतिम सांद्रता को 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करने के लिए शेष उपचार समूहों में बदल दिया गया था। फिर पारंपरिक ताजा मीडिया को सामान्य नियंत्रण और वाहन समूहों में बदल दिया गया, और 100, 200, और 250 μg/एमएल सी की अंतिम सांद्रता दी गई। ट्यूबुलोसा नैनोपाउडर को कम, मध्यम और उच्च खुराक में 24 घंटे के लिए कोशिकाओं के साथ जोड़ा गया। सी. ट्यूबुलोसा उपचार समूह, क्रमशः। विभिन्न समूहों में एमईएस23.5 कोशिकाओं को सतह पर तैरनेवाला हटाने के लिए पीबीएस में तीन बार धोया गया और 15 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में स्थिर किया गया। पीबीएस से धोने के बाद, कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए 37◦C पर पेरोक्सीडेज अवरोधक के साथ ऊष्मायन किया गया और फिर पीबीएस के साथ फिर से धोया गया। 10 मिनट के लिए सेल पारगम्यीकरण के लिए 0.2% ट्राइटन एक्स -100 समाधान का उपयोग किया गया, इसके बाद पीबीएस से धोया गया। प्रत्येक नमूने में सामान्य बकरी सीरम मिलाया गया और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखा गया। फिर सामान्य बकरी सीरम को हटा दिया गया और पीबीएस में 1:400 पतला प्राथमिक एंटीबॉडी को प्रत्येक नमूने में जोड़ा गया और रात भर 4◦C पर इनक्यूबेट किया गया। नकारात्मक नियंत्रण समूह की कोशिकाओं को रात भर 4◦C पर पीबीएस के साथ ऊष्मायन किया गया। पीबीएस से धोने के बाद, कोशिकाओं को 20 मिनट के लिए 37◦C पर नमी कक्ष में बायोटिन-लेबल वाले माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया था। फिर प्रत्येक नमूने को पीबीएस में धोया गया और 20 मिनट के लिए 37◦C पर हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज-स्ट्रेप्टाविडिन कंजुगेट्स (कार्यशील समाधान सी) के साथ लेबल किया गया। पीबीएस से धोने के बाद, कोशिकाओं को लगभग 1-10 मिनट के लिए अंधेरे में डीएबी अभिकर्मक से रंग दिया गया और हल्के माइक्रोस्कोपी के तहत भूरे रंग के विकास की निगरानी की गई। फिर प्रत्येक नमूने को 1-2 मिनट के लिए आसुत जल में दो बार धोया गया और नाभिक को 0.5-1 मिनट के लिए हेमेटोक्सिलिन समाधान के साथ प्रतिरंजित किया गया। प्रत्येक नमूने को पानी में अच्छी तरह से धोने के बाद, कोशिकाओं को विभेदन के लिए 1% हाइड्रोक्लोरिक एसिड अल्कोहल और 1% जलीय अमोनिया में डुबोया गया, इसके बाद कोशिकाओं को पानी में अच्छी तरह से धोया गया। प्रत्येक नमूने की कोशिकाओं को 2 मिनट के लिए 70% इथेनॉल, 2 मिनट के लिए 80% इथेनॉल, 2 मिनट के लिए 90% इथेनॉल दो बार, 2 मिनट के लिए 95% इथेनॉल और 2 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में दो बार निर्जलित किया गया। फिर कोशिकाओं को दो बार 2 मिनट के लिए जाइलीन घोल में डुबोया गया और तटस्थ रेजिन के साथ एक ग्लास स्लाइड पर लगाया गया। प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत, भूरे कणों की तीव्रता से संकेतित डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स में चयनित प्रोटीन की अभिव्यक्ति निर्धारित करने और औसत ग्रे मूल्य द्वारा प्रोटीन सामग्री को अर्ध-मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रत्येक नमूने में छवि कैप्चरिंग और 5-10 प्रभावी दृश्य क्षेत्रों का यादृच्छिक चयन किया गया। .

एमईएस23.5 कोशिकाओं की एपोप्टोसिस दर फ्लो साइटोमेट्री द्वारा मापी गई

अनुवर्ती कोशिकाओं को एक बार पीबीएस से धोया गया। कोशिका अलगाव के लिए, कमरे के तापमान पर उचित मात्रा में ईडीटीए-मुक्त ट्रिप्सिन समाधान जोड़ा गया था और आसन्न कोशिकाओं को अलग करने की अनुमति देने के लिए समाधान को धीरे से पिपेट किया गया था। फिर ट्रिप्सिनाइजेशन को रोकने के लिए एक सेल कल्चर माध्यम जोड़ा गया। मिश्रण को एक नई सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित किया गया और फिर पृथक कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए 1500 आरपीएम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया। सतह पर तैरनेवाला को हटाने के बाद, सेल गोली को पीबीएस का उपयोग करके धीरे से फिर से निलंबित कर दिया गया, और कोशिकाओं की गिनती की गई। लगभग 1 × 105 से 5 × 105 पुनर्निलंबित कोशिकाओं को 1500 आरपीएम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया और सतह पर तैरनेवाला हटा दिया गया। कोशिकाओं को धीरे से फिर से निलंबित करने के लिए सेल गोली में एनेक्सिन वी-एफआईटीसी बाइंडिंग समाधान के पांच माइक्रोलीटर जोड़े गए थे। एनेक्सिन वी-एफआईटीसी का एक और 5 μL जोड़ा गया और अच्छी तरह मिलाया गया। प्रोपिडियम आयोडाइड घोल के पांच माइक्रोलीटर का उपयोग फ्लो साइटोमेट्री से कुछ समय पहले 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करके सेल स्टेनिंग के लिए किया गया था।

वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण के लिएकृत्रिम परिवेशीय

कोशिकाओं को सामान्य समूह, एमपीपी+ उपचार समूह, कम खुराक में विभाजित किया गया थासी. ट्यूबुलोसाउपचार समूह, मध्यम खुराक सी. ट्यूबुलोसा उपचार समूह, और उच्च खुराक सी. ट्यूबुलोसा उपचार समूह। प्रत्येक में Bcl2 और Bax की अभिव्यक्ति मापी गई। सेल हार्वेस्टिंग से पहले प्रत्येक समूह में मॉडलिंग और उपचार के लिए 6-वेल प्लेट में प्रति कुएं कुल 1 × 105 कोशिकाओं का उपयोग किया गया था। आरआईपीए बफर, प्रोटीज़ इनहिबिटर और फॉस्फेटेज़ इनहिबिटर युक्त एक मिश्रित लाइसेट को बर्फ पर 3{19}} मिनट तक कोशिकाओं को लाइज़ करने के लिए जोड़ा गया था। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, प्रोटीन विश्लेषण के लिए सतह पर तैरनेवाला का उपयोग किया गया था। बीसीए परख का उपयोग करके कुल प्रोटीन की मात्रा निर्धारित की गई और 10% एसडीएस-पेज द्वारा अलग किया गया। अलग किए गए प्रोटीन को एक झिल्ली में स्थानांतरित किया गया और 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 5% स्किम दूध-अवरुद्ध बफर के साथ ऊष्मायन किया गया। फिर झिल्ली को रात भर 4◦C पर प्राथमिक एंटीबॉडी (Bcl-2 0.34 mg/ml, Bax 0.11 mg/ml, 1:200 तनुकरण) में इनक्यूबेट किया गया। धोने के चरण के बाद, झिल्ली को एक माध्यमिक एंटीबॉडी (0.5 मिलीग्राम / एमएल, 1: 5000 कमजोर पड़ने) में 1 घंटे के लिए 4◦C पर और फिर पारंपरिक विकास के लिए 2 मिनट के लिए ईसीएल डेवलपर में ऊष्मायन किया गया था। प्रोटीन अभिव्यक्ति के अर्ध-मात्रात्मक विश्लेषण के लिए क्वांटिटी वन सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया था।

थकान रोधी लीवर की सुरक्षा के लिए प्राकृतिक सिस्टान्चे ट्यूबुलोसा PHGS75% ECH 30% ACT 12%

प्रायोगिक पशु मॉडलिंग और औषधि प्रशासन

पचास विशिष्ट-रोगज़नक़ मुक्त 8-सप्ताह के नर चूहों को यादृच्छिक रूप से पांच समूहों में विभाजित किया गया था: एक सामान्य समूह, एमपीटीपी उपचार समूह (वाहन), कम खुराक सी. ट्यूबुलोसा उपचार समूह, मध्यम खुराक सी. ट्यूबुलोसा उपचार समूह, और उच्च खुराक सी. ट्यूबुलोसा उपचार समूह। जानवरों को भोजन और पानी की मुफ्त सुविधा के साथ 20-22◦C पर रखा गया था। सामान्य समूह के चूहों को लगातार सात दिनों तक समान मात्रा में सामान्य सेलाइन का इंजेक्शन इंट्रापेरिटोनियल तरीके से दिया गया। अन्य उपचार समूहों में चूहों को वाहन स्थापित करने के लिए लगातार सात दिनों तक एमपीटीपी (30 मिलीग्राम/किग्रा/दिन) का इंजेक्शन लगाया गया।

पीडी मॉडलिंग के दौरान, कम-खुराक, मध्यम-खुराक और उच्च-खुराक सी. ट्यूबुलोसा उपचार समूहों में चूहों को इंट्रागैस्ट्रिक रूप से 4 ग्राम/किलो/दिन, 8 ग्राम/किलो/दिन, और 16 ग्राम/के बराबर नैदानिक ​​​​मात्रा दी गई। किग्रा/दिसी. ट्यूबुलोसा नैनोपाउडर, क्रमशः, लगातार 14 दिनों तक। नियंत्रण और वाहन समूहों में चूहों को लगातार 14 दिनों तक सामान्य खारा मात्रा के बराबर मात्रा में इंट्रागैस्ट्रिक रूप से प्रशासित किया गया था। सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं को टीसीएम के फ़ुज़ियान विश्वविद्यालय की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और प्रयोगशाला पशु उपयोग और देखभाल के लिए अंतरराष्ट्रीय स्तर पर स्वीकृत सिद्धांतों के अनुसार प्रदर्शन किया गया था। इस अध्ययन में जानवरों की पीड़ा को कम करने के लिए सभी प्रयास किए गए।