सीएलआर‑एफ अभिव्यक्ति किडनी की प्रतिरक्षा और मेटाबोलिक होमियोस्टैसिस को नियंत्रित करती है Ⅲ
Nov 24, 2023
बहस
सूजन और प्रतिरक्षा कोशिका-मध्यस्थताक्षति गुर्दे की चोट और शिथिलता के विकास और प्रगति में अग्रणी भूमिका निभाती है। इस अध्ययन में, हम रखरखाव में सीएलआर-एफ की आवश्यकता की रिपोर्ट करते हैंगुर्दे का स्वास्थ्यऔर कार्यके विरुद्ध एक आंतरिक होमियोस्टैटिक नियंत्रण के रूप मेंप्रतिरक्षा- और चयापचय-मध्यस्थ गुर्दे की क्षति. हमारे निष्कर्ष सीएलआर-एफ की कमी वाले चूहों के गुर्दे में प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ, और इम्युनोग्लोबुलिन और पूरक प्रोटीन जमाव को दर्शाते हैं। सीएलआर-एफ-कमी वाले चूहों की ये प्रतिरक्षा विशेषताएं ट्यूबलर और ग्लोमेरुलर घावों की उम्र से जुड़ी उपस्थिति, एक्टोपिक लिपिड संचय और कई ट्रांसक्रिप्शनल प्रक्रियाओं के विनियमन के साथ जोड़ी जाती हैं।
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उनके आनुवंशिक रूप से जुड़े एनकेआर-पी1 रिसेप्टर्स के बीच एनकेसी के भीतर एन्कोड किए गए सीएलआर प्रोटीन, प्रतिरक्षा कोशिकाओं9,27-31 को व्यक्त करने वाले एनकेआर-पी1 द्वारा लापता-आत्म-पहचान के गैर-निरर्थक एमएचसी वर्ग I-स्वतंत्र मध्यस्थों के रूप में अध्ययन का फोकस रहे हैं। कोशिका तनाव के जवाब में चुनिंदा सीएलआर प्रोटीन की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति भी ऊतक-निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं7,12,32 की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को कार्यात्मक रूप से नियंत्रित करने की सूचना देती है। तदनुसार, आंतों के सीएलआर-एफ को निरोधात्मक एनकेआर-पी1जी रिसेप्टर-व्यक्त करने वाले इंट्रापीथेलियल लिम्फोसाइट्स7 के साथ अपनी बातचीत के माध्यम से अन्यथा अत्यधिक इम्युनोजेनिक आंत वातावरण में प्रतिरक्षा सहिष्णुता में योगदान करने के लिए प्रस्तुत किया गया था। लीबेल्ट एट अल द्वारा किया गया कार्य। पता चला कि पॉली (आई:सी) से चुनौती प्राप्त चूहों ने बढ़ी हुई सीएलआर-एफ अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया और इन विट्रो में सीएलआर-एफ/एनकेआर-पी1जी इंटरैक्शन एनकेआर-पी1जी व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के लिए दृढ़ता से निरोधात्मक हैं। साथ में इन निष्कर्षों को एक संभावित तंत्र के रूप में व्याख्या किया जा सकता है जिसके द्वारा सीएलआर-एफ आंतों के इंट्रापीथेलियल एनकेआर-पी1जी सकारात्मक उपसमुच्चय की उपकला बाधा के प्रति प्रतिक्रियाशीलता को रोक सकता है जो लगातार माइक्रोबियल उत्तेजनाओं द्वारा उकसाया जाता है।
सीएलआर-एफ-कमी वाले चूहों की पीढ़ी ने हमें इसका आकलन करने का पहला अवसर प्रदान कियाकार्यात्मक निहितार्थविवो में सीएलआर-एफ अभिव्यक्ति की और हमें गुर्दे में सीएलआर-एफ की संभावित प्रतिरक्षा होमोस्टैटिक भूमिकाओं की जांच करने की अनुमति दी गई। सीएलआर-एफ -/- चूहों में देखी गई गुर्दे की क्षति उस मॉडल के साथ संरेखित होती है जो सीएलआर-एफ का डाउनरेगुलेशन सेल तनाव और चोट के संकेतक के रूप में कार्य करता है जो एनकेआर-पी 1 जी-व्यक्त करने वाले प्रभाव कोशिकाओं पर बाधाओं को जारी करता है। सीएलआर-एफ -/- चूहों की किडनी में टी कोशिकाओं पर एनकेआर-पी1जी में वृद्धि से पता चलता है कि या तो सीएलआर-एफ की अनुपस्थिति में किडनी-निवासी टी कोशिकाओं में एनकेआर-पी1जी की अभिव्यक्ति बढ़ जाती है, या कि सीएलआर-एफ की किडनी में वृद्धि होती है। एफ-/- चूहों को एनकेआर-पी1जी-व्यक्त करने वाली टी कोशिकाओं की घुसपैठ के अधीन किया जाता है। सीएलआर-एफ -/- चूहों की आंत में एनकेआर-पी1जी-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की उपस्थिति या वितरण में पता लगाने योग्य परिवर्तन की अनुपस्थिति यह संकेत दे सकती है कि आंत में एनकेआर-पी1जी: सीएलआर-एफ इंटरैक्शन के कार्यात्मक परिणाम सीमित हैं। प्रतिरक्षा सहनशीलता के बजाय संक्रमण के संदर्भ में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाशीलता को नियंत्रित करना। वैकल्पिक रूप से, अनावश्यक इंटरैक्शन एनकेआर-पी1जी-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की गतिविधि को भी नियंत्रित कर सकते हैं। यह इस निष्कर्ष से समर्थित है कि एनकेआर-पी1जी न केवल सीएलआर-एफ से बल्कि सीएलआर-डी और सीएलआर-जी33 से भी बंधता है, जिनमें से उत्तरार्द्ध गुर्दे और आंत दोनों के ऊतकों में मध्यम रूप से व्यक्त होता है। जबकि हमारे निष्कर्ष ऑटोइम्यून किडनी क्षति से बचाने के लिए सीएलआर-एफ की आवश्यकता को प्रकट करते हैं, सीएलआर-एफ -/- चूहों की ऑटोइम्यून किडनी विकृति में एनकेआर-पी1जी-मध्यस्थता की भूमिका अधूरी है। उल्लेखनीय रूप से, हालांकि सीएलआर-एफ-/-चूहों की किडनी में एनकेआर-पी1जी-व्यक्त करने वाली टी कोशिकाओं में वृद्धि हुई है, लेकिन अंतर बहुत कम है। यह संभव है कि एक वैकल्पिक रिसेप्टर गुर्दे में सीएलआर-एफ की निगरानी में भाग लेता है। किडनी होमियोस्टैसिस में नियंत्रण की इस धुरी को पूरी तरह से संबोधित करने के लिए, आगे की जांच की आवश्यकता है
प्रतिरक्षा-मध्यस्थता वाले गुर्दे की क्षति को सूजन कोशिकाओं के अंतरालीय स्थान या ग्लोमेरुलस34 में घुसपैठ द्वारा दर्शाया जाता है। मोनोसाइट्स, बी और टी कोशिकाओं, एंटी-ग्लोमेरुलर एंटीबॉडीज, उन्नत आईएल -12 और आईएफएन साइटोकिन्स, और सीएलआर-एफ -/- चूहों में विभिन्न ग्लोमेरुलर पैथोलॉजीज का गुर्दे का संचय एलएन माउस मॉडल के ऑटोइम्यून परिदृश्य से काफी मिलता जुलता है ( यानी, एमआरएल-एफएएसएलपीआर)35-37। यद्यपि सीएलआर-एफ -/- गुर्दे संबंधित आईजीएम और आईजीजी जमाव के साथ आईजीए प्रमुख मेसेंजियल जमाव प्रदर्शित करते हैं, और सीएलआर-एफ -/- और आईजीएएन ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल के क्लस्टरिंग, यह सुझाव देना जल्दबाजी होगी कि ये फेनोटाइप एक प्रकार के संकेत हैं IgAN38 के साथ CKD. बल्कि, ये चोटें, मेसेंजियोलिसिस की उपस्थिति, जीबीएम का मोटा होना, और सीएलआर-एफ -/- किडनी में पोडोसाइट मृत्यु के साथ-साथ ट्यूबलोइंटरस्टीशियल परिवर्तन, वसा संचय, और चयापचय मार्गों में महत्वपूर्ण विकृति विभिन्न प्रकार की विकृति के लिए सामान्य तत्व हैं। प्रतिरक्षा प्रणाली37,39,40 द्वारा बढ़ाए गए चयापचय दोषों से प्राप्त। सीएलआर-एफ -/- माउस किडनी डिसफंक्शन के अंतर्निहित कारण या रोग प्रकार के बावजूद, सीएलआर-एफ एक स्पष्ट ग्लोमेरुलोनेफ्राइटिस-संबंधी विकृति विज्ञान के साथ ऑटोइम्यूनिटी के विकास के खिलाफ एक कम करने वाली भूमिका निभाता प्रतीत होता है।
Rag1-/-Clr-f-/- चूहों की हमारी जांच, Clr-f-/- चूहों की ऑटोइम्यून प्रतिक्रियाओं में T और B सेल-स्वतंत्र मध्यस्थों के प्रमुख योगदान को इंगित करती है। विशेष रूप से, टी और बी कोशिकाओं की अनुपस्थिति में पेरिग्लोमेरुलर सीडी11सी+ कोशिकाओं, एफ4/77, और एनकेपी88 कोशिकाओं का संचय और भी अधिक स्पष्ट था और ग्लोमेरुलर क्षति की एक महत्वपूर्ण उपस्थिति के साथ सहसंबद्ध था। इससे पता चलता है कि जबकि टी और बी कोशिकाएं किडनी को नुकसान पहुंचाने वाली सूजन और ऑटोएंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स में योगदान कर सकती हैं, सीएलआर-एफ -/- चूहों में ये पैथोलॉजी के केंद्रीय निर्धारक नहीं हो सकते हैं, लेकिन या तो अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं की सूजन गतिविधि में माध्यमिक योगदानकर्ता हो सकते हैं या संभावित रूप से जिन चूहों में सीएलआर-एफ की कमी होती है, उनमें प्रतिरक्षा नियामक भूमिका निभाते हैं। यह IgAN के ddY माउस मॉडल के साक्ष्य के विपरीत है जो एक मजबूत T1 ध्रुवीकृत प्रतिक्रिया दिखाता है, जिसमें IFN-उत्पादक T कोशिकाएं उम्र के साथ बढ़ती हैं और ग्लोमेरुलर चोट41 की प्रगति होती है। सीएलआर-एफ-कमी वाले चूहों में बी कोशिकाओं की गुर्दे की घुसपैठ को एसएलई42 के माउस मॉडल में भी दिखाया गया है। आज तक, यह स्पष्ट नहीं है कि गुर्दे में बी कोशिकाएं सीकेडी में हानिकारक सूजन में योगदान करती हैं या अधिक नियामक भूमिका निभाती हैं।43। बुजुर्ग रोगियों में सीकेडी के हालिया साक्ष्य से पता चला है कि बी सेल आबादी में कमी गुर्दे की बीमारी की प्रगति से जुड़ी थी।44। टी और बी दोनों कोशिकाओं के साक्ष्य से ऑटोइम्यून किडनी रोगों45,46 में प्रतिरक्षा-दमनकारी गतिविधि दिखाई गई है, और इसलिए वे किस हद तक सीएलआर-एफ -/- चूहों की विकृति में योगदान या विनियमन करते हैं, इसके लिए आगे की जांच की आवश्यकता है।
हमारे निष्कर्ष समीपस्थ घुमावदार नलिकाओं, पोडोसाइट्स और/या आंतों के उपकला के ट्यूबलर उपकला में सीएलआर-एफ अभिव्यक्ति की आवश्यकता को दर्शाते हैं। सीएलआर-एफ अभिव्यक्ति के नुकसान से एक स्पष्ट ऑटोइम्यून और सूजन कैस्केड होता है जो गुर्दे की क्षति और संबंधित वसा की ओर जाता है। सीएलआर-एफ के नुकसान से उत्पन्न प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं टी और बी-सेल-स्वतंत्र प्रतीत होती हैं। कुल मिलाकर, गुर्दे में सीएलआर-एफ की कार्यात्मक भूमिका को गुर्दे में निगरानी प्रभावक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए एक निरोधात्मक अणु के रूप में, या आंत में स्थित एक के रूप में देखा जा सकता है।ट्यूबलर सेल फ़ंक्शन का आंतरिक नियामक.
सामग्री और विधियाँ चूहे।
सभी चूहों को एक समर्पित रोगज़नक़-मुक्त वातावरण में रखा गया था। C57BL/6 (WT) और B6.129S7- Rag1tm1Mom /J (Rag1 -/-) चूहों को जैक्सन प्रयोगशाला (बार हार्बर, एमई, यूएसए) से प्राप्त किया गया था। Rag1 और Clr-f (Rag1 -/-;Clr-f -/-) में संयुक्त अशक्त उत्परिवर्तन वाले चूहों को (Rag1 -/-) चूहों के साथ Clr-f-कमी (Clr f -/-) चूहों को पार करके उत्पन्न किया गया था। . जानवरों पर किए गए सभी प्रजनन और हेरफेर विश्वविद्यालय के दिशानिर्देशों के अनुसार थे और डलहौजी विश्वविद्यालय पशु आचार समिति और ओटावा विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित थे। सभी पशु अध्ययन डिज़ाइन, प्रयोग और रिपोर्टिंग ARRIVE दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित की गईं।
सीएलआर-एफ-कमी वाले चूहों की पीढ़ी। सीएलआर-एफ-कमी (सीएलआर-एफ -/-) चूहों को एक फॉक्स्ड फॉस्फोग्लिसरेट काइनेज (पीजीके) -नियोमाइसिन कैसेट और एक्सॉन 3, 4 और एक्सॉन 5 के भाग में फैले जीनोमिक अनुक्रम वाले लक्ष्य निर्माण के समरूप पुनर्संयोजन द्वारा उत्पन्न किया गया था। सीएलआर-एफ जीन. C57BL/6 ब्रूस-4 भ्रूणीय स्टेम (ES) कोशिकाओं में विद्युतीकरण से पहले ओटावा अस्पताल अनुसंधान संस्थान (OHRI) में अनुक्रमण द्वारा संपूर्ण लक्ष्यीकरण निर्माण की पुष्टि की गई थी। G{{10}}प्रतिरोध द्वारा ES क्लोन का चयन IRCM (मॉन्ट्रियल क्लिनिकल रिसर्च इंस्टीट्यूट) ट्रांसजेनिक कोर फैसिलिटी (मॉन्ट्रियल, QC, कनाडा) द्वारा किया गया था। इस बीच, 5′ और 3′ सीएलआर-एफ जांच का परीक्षण डब्ल्यूटी बी6 माउस से थाइमिक जीनोमिक डीएनए का उपयोग करके प्रतिबंध खंड लंबाई बहुरूपता (आरएफएलपी) विश्लेषण में किया गया था, जिसे क्रमशः BAMHI और PstI के साथ पचाया गया था। पचे हुए डीएनए अंशों को 1% एगरोज़ जेल पर विघटित किया गया और नायलॉन झिल्ली ब्लॉट्स में स्थानांतरित किया गया। एनईबी लॉट किट (न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स, यूएसए) का उपयोग करके सीएलआर-एफ सीडीएनए जांच को रेडियोधर्मी 32पी-डीसीटीपी (पर्किन एल्मर, गुएल्फ़, ओएन, कनाडा) के साथ लेबल किया गया था। धब्बों की जांच 32पी-लेबल वाले सीएलआर-एफ सीडीएनए जांच के साथ एक संकरण समाधान (1 {{35 }}% (डब्ल्यू/वी) डेक्सट्रान सल्फेट; 1 एम NaCl; 1% एसडीएस) में की गई थी। रात भर 65 डिग्री पर संकरण किया गया और संकरण के बाद की धुलाई 2× एसएससी और 1% एसडीएस वाले घोल से की गई, जिसे 65 डिग्री पर पहले से गर्म किया गया था। संकरण संकेतों (चित्र S1A, S3B) को प्रकट करने के लिए टी ब्लॉट्स को फोटोग्राफिक फिल्मों के संपर्क में लाया गया। विभिन्न संकरणों के बीच 85 डिग्री पर 30 मिनट के लिए झिल्लियों को 0.2% एसएससी/0.2% एसडीएस से हटा दिया गया। दक्षिणी धब्बा विश्लेषण द्वारा नियोमाइसिन-प्रतिरोधी क्लोनों की जांच की गई, और ~15% की लक्ष्यीकरण दक्षता देखी गई। काइमेरिक सीएलआर-फ्लॉक्स संस्थापक चूहों को उत्पन्न करने के लिए चयनित ईएस क्लोनों को आईआरसीएम माइक्रोइंजेक्शन सेवा सुविधा में ब्लास्टोसिस्ट में माइक्रोइंजेक्ट किया गया था। चूहों की जांच दक्षिणी धब्बा विश्लेषण द्वारा की गई और फिर उन्हें सीएलआर-एफडब्ल्यूटी/लॉक्स विषमयुग्मजी चूहों का उत्पादन करने के लिए बी 6 मादाओं के साथ प्रजनन कराया गया। सीएलआर-फ्लॉक्स/लॉक्स चूहों को प्राप्त करने के लिए विषमयुग्मजी चूहों को आपस में जोड़ा गया। नियोमाइसिन कैसेट को हटाने के लिए, सीएलआर-फ्लॉक्स/लॉक्स चूहों को बी6 पृष्ठभूमि (जैक्सन प्रयोगशाला) पर समयुग्मजी सीएमवी-सीआरई ट्रांसजेनिक चूहों के साथ प्रजनन कराया गया। परिणामी दोहरा विषमयुग्मजी CMV-CreTg/0; सीएलआर-एफ-/+ चूहों को आपस में जोड़कर सीएलआर-एफ-/- चूहों का उत्पादन किया गया जिनमें सीएमवी-सीआरई ट्रांसजीन की कमी थी। चूहों को विशिष्ट प्राइमरों (तालिका 1, चित्र. S1B,C, और चित्र. S3C,D) का उपयोग करके जीनोटाइप किया गया था। AccuStart II Taq DNA पोलीमरेज़ (क्वांटा बायोसाइंसेज, गेथर्सबर्ग, एमडी, यूएसए) का उपयोग करके पीसीआर प्रवर्धन किया गया था। निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए पीसीआर मिश्रण तैयार किया गया था। फिनोल/क्लोरोफॉर्म निकाले गए कान के डीएनए को टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया गया था। निम्नलिखित पीसीआर साइक्लिंग मापदंडों का उपयोग किया गया: 40 सेकंड के लिए 94 डिग्री के 30 प्रवर्धन चक्र, 45 सेकंड के लिए 60 डिग्री, 60 सेकंड के लिए 72 डिग्री। डब्ल्यूटी और सीएलआर-एफ −/− लिटरमेट्स का उपयोग सभी प्रयोगों में किया गया जब तक कि अन्यथा संकेत न दिया गया हो।
सिटू हाइब्रिडाईजेशन में।
जैसा कि पहले बताया गया है, पूर्ण-लंबाई सेंस स्ट्रैंड सीडीएस और सीएलआर-एफ-स्पैनिंग एंटीसेंस स्ट्रैंड को पीजीईएम-टी ईज़ी वेक्टर में क्लोन करके सीएलआर-एफ का स्वस्थानी संकरण विश्लेषण प्राप्त किया गया था। डिगॉक्सी जेनिन-लेबल एंटीसेंस और सेंस आरएनए जांच को डीआइजी आरएनए लेबलिंग मिश्रण (रोश, बेसल, स्विट्जरलैंड) का उपयोग करके टी 7 पोलीमरेज़ के साथ सीएलआर-एफ जीन को एन्कोडिंग करने वाले रैखिक प्लास्मिड से स्थानांतरित किया गया था। ऊतकों को वयस्क बी 6 चूहों से एकत्र किया गया था और उन्हें आरटी पर 1 {{14 }}% फॉर्मेलिन में या 4 डिग्री पर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में 24 घंटे तक हल्के झटकों के साथ तय किया गया था। फिर ऊतकों को पैराफिन में एम्बेड किया गया और ग्लास स्लाइड पर 4 माइक्रोमीटर अनुभाग तैयार किए गए। ऊतक स्लाइडों को 15 मिनट के लिए 2 एन एचसीएल और 37 डिग्री पर 2 33 मिनट के लिए 3 24 μg/mL प्रोटीनएज़ K के साथ उपचार द्वारा डीकार्बोनेटेड किया गया। ऊतक को 10 मिनट के लिए 4% पीएफए में तय किया गया, इसके बाद 0.1 एम ट्राइथेनॉलमाइन में 0.25% एसिटिक एनहाइड्राइड के साथ 5 मिनट के लिए दो बार उपचार किया गया। फिर स्लाइडों को संकरण समाधान (50% (v/v) फॉर्मामाइड/5×SSC, पीएच 4.5; 2% (w/v) अवरोधक पाउडर (रोश); 0.05% (w/v) CHAPS; 5 mM के साथ पूर्व-संकरित किया गया। EDTA; 50 µg/mL हेपरिन; 1 µg/mL यीस्ट आरएनए) 58 डिग्री ओवन में कम से कम 1 घंटे के लिए, और फिर 58 डिग्री पर रात भर 500 एनजी/एमएल डिगॉक्सीजेनिन-लेबल जांच वाले संकरण समाधान के साथ इनक्यूबेट किया गया। संकरण के बाद धुलाई 50% फॉर्मामाइड/2× एसएससी, पीएच 4.5 के साथ 20 मिनट के लिए 55 डिग्री 3× पर की गई, और स्लाइड्स को ब्लॉकिंग सॉल्यूशन में 1:1000 कमजोर पड़ने पर भेड़ एंटी-डिगॉक्सिजेनिन क्षारीय फॉस्फेट-संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया। रोश)। स्लाइडों में नाइट्रो ब्लू टेट्राजोलियम/5-ब्रोमो, 4-क्लोरो, और 3-इंडॉयलफॉस्फेट (एनबीटी/ बीसीआईपी, रोश) सबस्ट्रेट्स जोड़कर रंग विकास किया गया। इष्टतम सिग्नल दिखाई देने तक स्लाइडों को आरटी पर अंधेरे में रखा गया था। नियंत्रण लेबलिंग एक सेंस-स्ट्रैंड जांच और सेंस और एंटीसेंस जांच की पुष्टि की गई विशिष्टता के साथ प्रतिस्पर्धी बाइंडिंग अध्ययनों का उपयोग करके किया गया था। फिर स्लाइडों को हल्के हरे या मिथाइल हरे रंग से रंगा गया और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे देखा गया।
आरटी-पीसीआर। उम्र और लिंग से मेल खाने वाले डब्ल्यूटी और सीएलआर-एफ -/- चूहों से गुर्दे के ऊतकों को निकाला गया, पीबीएस से धोया गया और -80 डिग्री पर जमे हुए किया गया। निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए राइबोज़ोल आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मक (एमरेस्को इंक, वेस्ट चेस्टर, पीए, यूएसए) का उपयोग करके आरएनए को जमे हुए ऊतकों से अलग किया गया था। वर्सो सीडीएनए किट (थर्मो साइंटिफिक, वाल्थम, एमए, यूएसए) का उपयोग करके लगभग 1 ग्राम आरएनए को सीडीएनए में स्थानांतरित किया गया था। विशिष्ट प्राइमरों (तालिका 1) का उपयोग करके सीडीएनए उत्पाद के 1 μL पर पीसीआर प्रवर्धन किया गया था। उपयोग की जाने वाली पीसीआर स्थितियां 30 सेकंड के लिए 94 डिग्री, 30 सेकंड के लिए 58 डिग्री, 60 सेकंड के लिए 72 डिग्री और 35 प्रवर्धन चक्र थीं। पीसीआर उत्पादों की कल्पना एथिडियम ब्रोमाइड से सना हुआ 1% एगरोज़ जेल पर की गई थी (चित्र 1C, चित्र S3A)।
इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री।
उम्र और लिंग से मेल खाने वाले डब्ल्यूटी और सीएलआर-एफ के गुर्दे के ऊतकों -/- चूहों को ज़ाइलीन में तीन 5 मिनट के ऊष्मायन, 1 {{12} 0% इथेनॉल में दो 5 मिनट के ऊष्मायन, इसके बाद 90 द्वारा डीपराफिनाइज़ किया गया। % इथेनॉल, फिर 80% इथेनॉल, और अंत में 70% इथेनॉल। स्लाइडों को आसुत जल (20 डिप्स) में धोकर पुन: हाइड्रेट किया गया, और साइट्रेट बफर (पीएच 6.0) में प्रेशर कुकर का उपयोग करके गर्मी-प्रेरित एपिटोप पुनर्प्राप्ति की गई। अंतर्जात पेरोक्सीडेस को 10 मिनट के लिए बाँझ पानी में 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ अवरुद्ध किया गया था, और प्रोटीन को बैकग्राउंड स्नाइपर (बायोकेयर मेडिकल, पाचेको, सीए, यूएसए) का उपयोग करके अवरुद्ध किया गया था। फिर अनुभागों को रात भर 4 डिग्री पर चूहे-विरोधी मोनोक्लोनल एंटी-सीएलआर-एफ एंटीबॉडी7 के साथ ऊष्मायन किया गया। अगले दिन, स्लाइड्स को 0.1 एम पीबीएस से धोया गया और माध्यमिक एंटीबॉडी में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। स्टेनिंग को गोट-ऑन-रोडेंट एचआरपी-पॉलीमर किट (बायोकेयर मेडिकल) और बीटाजॉइड डीएबी बफर (बायोकेयर मेडिकल) का उपयोग करके विकसित किया गया था, इसके बाद हेमेटोक्सिलिन काउंटर-स्टेनिंग किया गया। एंटी-एनकेपी46 (ईबायोसाइंस, सांता क्लारा, सीए, यूएसए, क्लोन 29ए1.4, सीएटी#) का उपयोग करते हुए, एनकेपी {27}} और सीडी {28}} कोशिकाओं के आईएचसी लेबलिंग के लिए गुर्दे के ऊतक अनुभाग को दागने के लिए उसी प्रक्रिया का उपयोग किया गया था। 48-3351-82) और एंटी-सीडी3 (बायोलेजेंड कैट#100,327) क्रमशः प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में। F4/80 की IHC लेबलिंग एक एंटी-F4/80 चूहे मोनोक्लोनल BM8 एंटीबॉडी का उपयोग करके जमे हुए किडनी अनुभागों पर की गई थी। एक बकरी विरोधी चूहा IgG H&L HRP-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी (Abcam, कैम्ब्रिज, UK CAT#ab97057) का उपयोग ऊपर किया गया था और IHCs विकसित किया गया था, एक हॉर्स रेडिश पेरोक्सीडेज (HRP) सब्सट्रेट का उपयोग DAB सबस्ट्रेट किट (Abcam, CAT#) किया गया था ab64238).
इम्यूनोफ्लोरेसेंस।
आयु और लिंग-मिलान वाले डब्ल्यूटी और सीएलआर-एफ -/- चूहों के गुर्दे और/या आंतों के ऊतकों को टिश्यू-टेक इष्टतम काटने वाले तापमान यौगिक (फिशर साइंटिफिक, पिट्सबर्ग, पीए, यूएसए)। 20 माइक्रोन क्रायोस्टेट अनुभागों को 16 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर धूआं हुड में एसीटोन के साथ तय किया गया था और 0.01 एम पीबीएस, पीएच 7.4 में धोने के बाद कम से कम 30 मिनट के लिए हवा में सुखाया गया था। 10% गधा सीरम के साथ गैर-विशिष्ट बंधन को अवरुद्ध किया गया था। अनुभागों को प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री पर रात भर में ऊष्मायन किया गया: एंटी-सीएलआर-एफ 7, एंटी-एनकेआर-पी 1 जी (एक चूहा विरोधी माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जो पहले वर्णित 7 है), एंटी-आईजीए (बकरी एंटी-माउस आईजीए अल्फा श्रृंखला (एबकैम, कैम्ब्रिज) , यूके कैट#एबी97235), एंटी-आईजीजी-पीई (बायोलेजेंड, सैन डिएगो, सीए, यूएसए कैट#405324, एंटी-आईजीएम-एफआईटीसी (लाइफ टेक्नोलॉजीज, कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए कैट#ए21042), कॉम्प्लीमेंट सी3 एंटी बॉडी (11एच9) ) (नोवस बायोलॉजिकल, लिटलटन, सीओ, यूएसए कैट# एनबी{{35%)), एंटी-आईएफएन -पीई (बीडी-बायोसाइंसेज, फ्रैंकलिन लेक्स, एनजे, यूएसए कैट#554411), एंटी-आईएल-12-पीई (बीडी-फार्मिंगन कैट#554479), एंटी-सीडी45-एफआईटीसी (बायोलेजेंड कैट#103108), एंटी-सीडी11सी-एफआईटीसी (ईबायोसाइंस कैट#11-0114-85), एंटी-एफ4/80- APC (BioLegend CAT#123116), और एंटी-NKp46-eFluor 450 (eBioscience, CAT#48-3351-82) 1:100 सांद्रण पर 5% सामान्य सीरम में एक आर्द्रीकृत कक्ष में। एंटी की माध्यमिक एंटीबॉडी लेबलिंग -सीएलआर-एफ और एंटी-एनकेआर-पी1जी एंटीबॉडी को एफआईटीसी संयुग्मित पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके 1 घंटे के ऊष्मायन के लिए आरटी पर प्रदर्शन किया गया था। नमूनों को 5 मिनट के लिए आरटी पर डीएपीआई परमाणु दाग दिया गया था, पीबीएस से धोया गया था, और VECTASHIELD की एक बूंद के साथ ग्लास स्लाइड पर लगाया गया था प्लस एंटीफेड माउंटिंग मीडिया (वेक्टर लेबोरेटरीज, सैन फ्रांसिस्को, सीए, यूएसए) और एक ग्लास कवरस्लिप से ढका हुआ है। ज़ीस एलएसएम 510 लेजर स्कैनिंग कन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके स्लाइडों की जांच की गई।
हिस्टोलॉजी और पैथोलॉजी स्कोरिंग।
आयु और लिंग-मिलान वाले WT, Clr-f -/-, Rag1 -/- और Rag1 -/-Clr-f -/- चूहों (3 μm) के गुर्दे के अनुभाग आवधिक एसिड-शिफ (PAS) से सने हुए थे। गुर्दे के ऊतकों का मूल्यांकन मेसेंजियल सेल्युलैरिटी (प्रति मेसेंजियल क्षेत्र में 4 या अधिक नाभिक के रूप में परिभाषित), एंडोकेपिलरी प्रसार, अर्धचंद्राकार और ग्लोमेरुलर स्केलेरोसिस के लिए किया गया था। ट्यूबलोपैथी, इंटरस्टिशियल फाइब्रोसिस, ट्यूबलर एट्रोफी और ट्यूबलोइंटरस्टिशियल सेल घुसपैठ की उपस्थिति के लिए भी अनुभागों का मूल्यांकन किया गया था। ग्लोमेरुली पैथोलॉजी स्कोरिंग के लिए ग्लोमेरुलर क्षति की डिग्री का मूल्यांकन करने के लिए अर्ध-मात्रात्मक स्कोर का उपयोग किया गया था। प्रत्येक समूह में कम से कम 50 ग्लोमेरुली की जांच की गई और घाव की गंभीरता को 0 से +3 तक वर्गीकृत किया गया: एक +1 घाव ने 30% से कम या उसके बराबर की भागीदारी का प्रतिनिधित्व किया ग्लोमेरुलस का, +2 30-60%, जबकि एक +3 घाव से संकेत मिलता है कि ग्लोमेरुलस का 60% से अधिक या उसके बराबर शामिल था। जीबीएम मोटाई का मापन छवि जे वी1.53ए47 का उपयोग करके डब्ल्यूटी और सीएलआर-एफ -/- के ग्लोमेरुलर इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ पर किया गया था। दो Rag1-/- और दो Rag1-/-Clr-f -/- चूहों से PAS-सना हुआ वृक्क ऊतक अतिरिक्त रूप से उपरोक्त रोग संबंधी विशेषताओं की उपस्थिति के लिए आँख बंद करके स्कोर किया गया था, और मात्रात्मक विशेषताओं की गणना प्रति औसत चार किडनी अनुभागों से की गई थी। चूहा।
इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी।
ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए प्रसंस्करण ऊतक ने प्रकाशित प्रोटोकॉल48 का पालन किया। संक्षेप में, सप्ताह पुराने डब्ल्यूटी और सीएलआर-एफ -/- चूहों के गुर्दे के ऊतकों के छोटे टुकड़ों को 2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड समाधान में तय किया गया और फिर 1% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड/यूरेनिल एसीटेट विधि का उपयोग करके संसाधित किया गया। रीचर्ट-जंग अल्ट्रा कट ई अल्ट्रामाइक्रोटोम का उपयोग करके काटने से पहले नमूनों को एपोन अराल्डाइट राल में एम्बेडेड किया गया था। नमूनों को जेईओएल जेईएम 1230 ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप पर देखा गया और छवियों को हमामात्सू ओआरसीए-एचआर डिजिटल कैमरे का उपयोग करके कैप्चर किया गया।
मूत्र और प्लाज्मा रासायनिक अपशिष्ट और इलेक्ट्रोलाइट माप।
सप्ताह भर के नर डब्ल्यूटी और सीएलआर-एफ -/- चूहों से लगातार 5 दिनों तक दिन के एक ही समय में प्रतिदिन लगभग 150 μL मूत्र एकत्र किया गया। मलबा हटाने के लिए मूत्र को 10,{6}} आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया और फिर -80 डिग्री पर संग्रहित किया गया। चेहरे की नस का रक्त उन्हीं चूहों से हेपरिनाइज्ड ट्यूबों में एकत्र किया गया और 5 मिनट के लिए 3000 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग किया गया और -80 डिग्री पर संग्रहीत किया गया। प्रोटीन, क्रिएटिनिन और इलेक्ट्रोलाइट एकाग्रता माप के लिए मूत्र और प्लाज्मा के नमूने Idexx प्रयोगशालाओं (मार्खम, ओंटारियो) को भेजे गए थे।
12 और 24 सप्ताह के चूहों पर रक्तचाप माप। सिस्टोलिक और डायस्टोलिक रक्तचाप (बीपी) को बीपी2000 विज़िटेक मॉडल का उपयोग करके स्थिर अवस्था में 12 और 24-सप्ताह के पुरुष डब्ल्यूटी और सीएलआर-एफ -/- चूहों पर टेल-कफ प्लीथिस्मोग्राफी द्वारा मापा गया था। लगातार 5 दिनों तक प्रतिदिन एक ही कमरे में और दिन के एक ही घंटे में बीपी मापा गया। पिछले 3 लगातार मापों के बीपी मूल्यों का उपयोग औसत बीपी मूल्य की गणना करने के लिए किया गया था क्योंकि पहले 2 दिनों को चूहों के अनुकूलन के लिए आवश्यक माना जाता था।
Kidney RNA sequencing. For kidney RNA-seq, total RNA was isolated from freshly frozen kidneys of three age- and sex-matched WT and Clr-f −/− mice at 7, 13, and 24 weeks of age using TRIzol (Thermo Fisher Scientific) and RNA Clean & Concentrator-5 kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA). RNA samples were sent to Genome Quebec Innovation Centre, McGill University, Montreal, QC for library preparation and RNA-seq. RNA-seq was performed on the Illumina HiSeq 4000 platform, with paired-end reads, at>प्रति नमूना 30×106 पढ़ने की गहराई।
RNA‑seq analysis. Te quality of the sequencing reads was inspected using FastQC tool V0.11.5 (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) and reads with a Phred quality score of 30 over 90% of the reads were retained utilizing the Fastx-toolkit V0.0.13 (http://hannonlab.cshl.edu/). Next, the high-quality reads were mapped to the mouse GENCODE M25 annotation database (GRCm38.p6)49 using the STAR aligner V2.7.5a50. STAR aligner was then used to remove duplicates, create transcriptome hits count tables, and generate wiggle fles. Subsequently, DESeq2 package V1.28.151 was used to remove hits with CPM values less than 1 and calculate differentially expressed genes with FDR-transformed P-value>{{0}}.05 और लॉग फोल्ड चेंज कटऑफ 1.5। सभी समय बिंदुओं और नमूनों के लिए एफपीकेएम मान प्रदान किए गए हैं (पूरक डेटासेट फ़ाइल 1)। कार्यात्मक संवर्धन विश्लेषण. जीन ऑन्टोलॉजी और कार्यात्मक संवर्धन विश्लेषण जी का उपयोग करके किया गया था: प्रोफाइलर (संस्करण ई 102_उदाहरण के लिए 49_पी15_7ए9बी4डी6) जी के साथ: एससीएस एकाधिक परीक्षण सुधार विधि 0.05 की महत्व सीमा को लागू करते हुए (https: //biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost) 52 और फिशर के सटीक परीक्षण और एफडीआर सीमा के साथ पैंथर वर्गीकरण प्रणाली<0.05 (http://pantherdb.org/citePanther.jsp) 53.
मस्क मस्कुलस (जीआरसीएम38. पी6) के लिए जीओ जैविक प्रक्रियाओं (जीओ: बीपी) के जीन सेट का उपयोग करके कार्यात्मक संवर्धन नेटवर्क बनाए गए थे। बायोमार्ट रिलीज: 2020-12-08 जी से डाउनलोड किया गया: प्रोफाइलर (https://biit.cs.ut.ee) /gprofiler/gost). जीन सेट संवर्धन विश्लेषण (जीएसईए) एफडीआर पर आधारित नेटवर्क संवर्धन का उपयोग करके जीएसईए V4.0354,55 का उपयोग करके किया गया था।<0.05. Networks were assembled, curated, and visualized using Cytoscape V3.7.156. Heatmaps were generated and clustered by Euclidian distance using Morpheus (https://sofware.broadinstitute.org/morpheus).
पेट और एक्टोपिक लिपिड विश्लेषण। वसा संचय का निर्धारण व्यक्तिगत चूहों से विच्छेदित पेट की वसा के वजन से किया गया था। वसा निष्कर्षण से पहले शरीर का वजन माप लिया गया। ऑयल रेड ओ (ओआरओ) धुंधलापन के लिए, जमे हुए गुर्दे के हिस्सों को क्रायोस्टेट का उपयोग करके 10 माइक्रोन पर काटा गया और फिर 30 मिनट के लिए हवा में सुखाया गया। ओआरओ स्टेनिंग को 60% आइसोप्रोपेनॉल के 3 वॉश के साथ अनुभागों को ठीक करके किया गया था, उन्हें 15 मिनट के लिए ओआरओ समाधान (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) स्टेनिंग के कामकाजी एकाग्रता (66%) के साथ इनक्यूबेट किया गया था। फिर स्लाइडों को 60% आइसोप्रोपेनॉल से जल्दी से धोया गया, नाभिक को उजागर करने के लिए मेयर के हेमेटोक्सिलिन के साथ जल्दी से दाग दिया गया, और फिर वेक्टामाउंट एक्यू एक्वियस माउंटिंग मीडिया (वेक्टर प्रयोगशालाओं) का उपयोग करके माउंट किया गया।
पैथोटाइप विश्लेषण. q के साथ विभेदक रूप से व्यक्त जीन (DEGs) का उपयोग करके पैथोटाइप विश्लेषण किया गया था<0.05 identified from RNA-seq of WT and Clr-f −/− 13-week-old mouse kidneys. Signifcant Clr-f −/− DEGs with identifiable ENSEMBL human orthologs were compared with DEGs of 15 human kidney disease expression sets (disease versus healthy kidney)57–64 downloaded from Nephroseq database at (http://www.nephroseq.org) (Supplementary Dataset File 2)65. Clr-f −/− mouse and human kidney disease DEG sets were hierarchically clustered by Euclidean distance and graphed in a similarity matrix using the Morpheus software (https://sofware.broad institute.org/morpheus). Functional enrichment using g: Profler, (using parameters described above) was performed on four groups of expression clusters with corresponding increased and decreased DEGs and non-corresponding DEGs from the compared expression profiles of Clr-f −/− and IgA nephropathy (IgAN) kidney disease. Flow cytometry. Kidneys from age- and sex-matched WT and Clr-f −/− mice were harvested, homogenized in a Petri dish on ice with RPMI media containing collagenase type 4 (2 mg/mL) (Fisher), and incubated at 37 °C for 30 min with gentle agitation.
पचे हुए ऊतक को एक 70-μm नायलॉन फिल्टर के माध्यम से पारित किया गया, पीबीएस धोया गया, और शेष लाल कोशिकाओं को बर्फ पर 5 मिनट के लिए ACK लाइसिंग बफर के साथ लाइज़ किया गया। किडनी की प्रतिरक्षा कोशिकाओं को 40% पेरकोल में 30 मिनट के लिए 2000 आरपीएम पर आरटी सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग किया गया था। सेल गोली को पीबीएस में फिर से निलंबित कर दिया गया और हेमोसाइटोमीटर द्वारा सेल गिनती प्राप्त की गई। कोशिका-सतह प्रोटीन अभिव्यक्ति को सत्यापित करने के लिए विभिन्न mAbs का उपयोग किया गया था, फ्लोरोक्रोम-लेबल वाले माउस एंटीबॉडी के साथ फ़ॉ साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए कोशिकाओं को दाग दिया गया था: एंटी-सीडी 45 (ईबायोसाइंस, क्लोन 30-F11), एंटी-टीसीआर (ईबायोसाइंस, क्लोन एच { {12}}), एंटी-एनके1.1 (ईबायोसाइंस, क्लोन पीके136), एंटी-सीडी19 (बायोलेजेंड, क्लोन 1डी3/सीडी19), एंटी-सीडी11बी (बायोलेजेंड, क्लोन एम1/70), एंटी-एफ4/80 (बायोलेजेंड, क्लोन बीएम8), एंटी-एमएचसीआईआई(आईए/आईई) (बायोलेजेंड, क्लोन एम5/114.15.2), एंटी-एलवाई6जी (बायोलेजेंड, क्लोन 1ए8), एंटी-एनकेपी46 (ईबायोसाइंस, क्लोन 29ए1.4), और आइसोटाइप नियंत्रण। सेल व्यवहार्यता एक फिक्स सक्षम व्यवहार्यता डाई (ईबायोसाइंस, कैट# 65-0865-14) का उपयोग करके निर्धारित की गई थी। डब्ल्यूटी और सीएलआर-एफ -/- किडनी में प्रतिरक्षा सेल आबादी की पहचान करने और मात्रा निर्धारित करने के लिए, सेल-विशिष्ट मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके मल्टीपैरामीट्रिक फ़ॉ साइटोमेट्री विश्लेषण का उपयोग न्यूट्रोफिल (सीडी 11 बी + एलवाई 6 जी +), मैक्रोफेज (सीडी 11 बी + एलवाई 6 जी - एफ 4 / {) की पहचान करने के लिए किया गया था। {57}}MHCII+), NK कोशिकाएँ (CD11bloLy6G−TCR −NK1.1+), और NKp46+ कोशिकाएँ (CD11bloLy6G−TCR −NKp46+), T कोशिकाएँ (Ly6G−NK1 .1−TCR +) और B सेल (CD11b−Ly6G−TCR −CD19+)। सभी नमूने बीडी-फोर्टेसा फ़ॉउ साइटोमीटर पर प्राप्त किए गए थे।
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