मानव गुर्दे में मिनरलो-ऑर्गेनिक नैनोकणों का पता लगाना और उनका लक्षण वर्णन

त्सुई-यिन वोंग^1,2,*, चेंग-येउ वू^1,2,3,* और अन्य

एक्टोपिक कैल्सीफिकेशन विभिन्न मानव रोगों से जुड़ा हुआ है, जिसमें एथेरोस्क्लेरोसिस, कैंसर,दीर्घकालिकगुर्दाबीमारी, तथामधुमेहमेलिटस। यद्यपि कैल्सीफाइड रक्त वाहिकाओं में खनिज नैनोकणों का पता लगाया गया है, मानव शरीर में इन कणों की प्रकृति और भूमिका स्पष्ट नहीं है। यहां हम पहली बार दिखाते हैं कि मानवगुर्दाअंतिम चरण से प्राप्त ऊतकदीर्घकालिकगुर्दाबीमारीया गुर्दे के कैंसर के रोगियों में 50 से 1,500 एनएम के गोल, बहुस्तरीय खनिज कण होते हैं, जबकि स्वस्थ नियंत्रण में कोई कण नहीं देखा जाता है। खनिज कण मुख्य रूप से घुमावदार नलिकाओं के आस-पास के बाह्य मैट्रिक्स में पाए जाते हैं, हेनले के नलिकाओं और लूपों के साथ-साथ ट्यूबल-डिलाइनिंग कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य के भीतर, और हड्डियों और एक्टोपिक कैल्सीफिकेशन में पाए जाने वाले खनिज के समान पॉलीक्रिस्टलाइन कैल्शियम फॉस्फेट से मिलकर होते हैं।गुर्दाखनिज नैनोकणों में कई सीरम प्रोटीन होते हैं जो शरीर के तरल पदार्थों में एक्टोपिक कैल्सीफिकेशन को रोकते हैं, जिसमें एल्ब्यूमिन, भ्रूण-ए और एपोलिपोप्रोटीन ए 1 शामिल हैं। चूंकि खनिज-कार्बनिक नैनोकण न केवल कैल्सीफाइड जमा के भीतर पाए जाते हैं, बल्कि सूक्ष्म कैल्सीफिकेशन से रहित क्षेत्रों में भी पाए जाते हैं, हमारी टिप्पणियों से संकेत मिलता है कि नैनोकण मनुष्यों में कैल्सीफिकेशन और गुर्दे की पथरी के अग्रदूतों का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं।

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एक्टोपिक कैल्सीफिकेशन एथेरोस्क्लेरोसिस, कैंसर से जुड़ा हुआ है,दीर्घकालिकगुर्दाबीमारी, और मधुमेह मेलिटस1-3। हाल के अध्ययनों से संकेत मिलता है कि एथेरोस्क्लेरोसिस औरदीर्घकालिकगुर्दाबीमारीसंवहनी कैल्सीफिकेशन के लक्षण वाले रोगियों में रुग्णता और मृत्यु दर में वृद्धि हुई है, यह सुझाव देता है कि एक्टोपिक कैल्सीफिकेशन मानव स्वास्थ्य के लिए हानिकारक है। उम्र बढ़ने वाले व्यक्तियों में अवांछित कैल्सीफिकेशन भी देखा जाता है और 60 वर्ष से अधिक उम्र के अधिकांश लोग संवहनी कैल्सीफिकेशन के लक्षण दिखाते हैं। इन कारणों से, एक्टोपिक कैल्सीफिकेशन को प्रेरित करने वाले कारकों को समझना और प्रभावी उपचार विकसित करना महत्वपूर्ण लक्ष्यों का प्रतिनिधित्व करता है।

एक्टोपिक कैल्सीफिकेशन को शरीर में कैल्सीफिकेशन के अवरोधकों और प्रेरकों के बीच असंतुलन के रूप में परिभाषित किया जा सकता है। कैल्सीफिकेशन इनहिबिटर्स में सीरम प्रोटीन जैसे एल्ब्यूमिन, भ्रूण-ए, ओस्टियोपोन्ट, और मैट्रिक्स जीएलए प्रोटीन के साथ-साथ पाइरोफॉस्फेट जैसे छोटे यौगिक शामिल हैं, जबकि हाइपरफोस्फेटेमिया और सूजन कैल्सीफिकेशन के प्रमुख संकेतकों का प्रतिनिधित्व करते हैं। हाल के अध्ययनों से संकेत मिलता है कि कैल्सीफिकेशन इंड्यूसर संवहनी कैल्सीफिकेशन के दौरान हड्डी के गठन के समान एक सेलुलर प्रक्रिया को सक्रिय करते हैं। हड्डियों के विकास में खनिजकरण को प्रेरित करने वाले मैट्रिक्स वेसिकल्स को भी कैल्सीफाइड नरम ऊतकों में पाया गया है। ये मैट्रिक्स वेसिकल्स संभवतः संवहनी चिकनी पेशी कोशिकाओं द्वारा जारी किए जाते हैं जो ऑस्टियोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं में अंतर करते हैं, जो कैल्सीफिकेशन को प्रेरित करते हैं।

एक्टोपिक कैल्सीफिकेशन के लक्षण दिखाने वाले नरम ऊतकों में खनिज नैनोकणों (एनपी) का पता चला है। मूल्य एट अल। पाया गया कि चूहों का सीरम या तो बिसफ़ॉस्फ़ोनेट एटिड्रोनेट या विटामिन डी हार्बर मिनरल-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के साथ इलाज किया जाता है जिसमें कैल्सीफिकेशन इनहिबिटर भ्रूण-ए और मैट्रिक्स जीएलए प्रोटीन होता है। इसी तरह, जाह्नन-डेचेंट एट अल। ने देखा कि कैल्सीफाइंग पेरिटोनिटिस वाले रोगियों के जलोदर द्रव में भ्रूण-ए युक्त खनिज परिसरों, जिन्हें कैल्सीप्रोटीन कण (सीपीपी) कहा जाता था, का पता लगाया जा सकता है। बर्टाज़ो एट अल द्वारा हाल ही में एक अध्ययन। एथेरोस्क्लोरोटिक और आमवाती बुखार के रोगियों दोनों की महाधमनी वाल्व और कोरोनरी धमनियों में खनिज एनपी की उपस्थिति का प्रदर्शन किया। जबकि खनिज कणों के निर्माण पर अध्ययन ने आमतौर पर मानव हृदय प्रणाली पर ध्यान केंद्रित किया है, यह स्पष्ट नहीं है कि क्या कण अन्य ऊतकों में पाए जा सकते हैं और क्या ये संस्थाएं स्वास्थ्य या बीमारी में भूमिका निभाती हैं।

हमने पहले देखा कि खनिज-जैविक एनपीएस मानव और पशु शरीर के तरल पदार्थ 14-28 में अनायास बनते हैं। इन खनिज एनपी को शुरू में नैनोबैक्टीरिया (एनबी) के रूप में वर्णित किया गया था और माना जाता था कि यह न केवल पृथ्वी पर सबसे छोटी कोशिकाएं हैं, बल्कि अल्जाइमर रोग, एथेरोस्क्लेरोसिस, कैंसर सहित कई बीमारियों का संभावित संक्रामक कारण भी हैं।गुर्दापथरीगठन, पॉलीसिस्टिकगुर्दाबीमारी, और प्रोस्टेटाइटिस30-32। हालांकि, हमारे परिणामों से पता चला है कि एनबी वास्तव में निर्जीव खनिज एनपी है जो उनके आकारिकी, विकास, प्रसार और उप-संस्कृति के संदर्भ में आम बैक्टीरिया की नकल करते हैं। संभावना है कि तथाकथित एनबी के समान खनिज कण मानव ऊतकों में पाए जा सकते हैं और क्या ये कण बीमारी में भूमिका निभाते हैं या नहीं, इसकी जांच की जानी बाकी है।

वर्तमान अध्ययन में, हमने रोगग्रस्त मानव में खनिज-जैविक एनपी का पता लगाने और उनका विश्लेषण करने के लिए एक नैनोमटेरियल दृष्टिकोण विकसित किया हैगुर्दाऊतकों. हम दिखाते हैं कि किडनी के अंतिम चरण के क्रोनिक किडनी रोग और गुर्दे के कैंसर के रोगियों में बायोमिमेटिक खनिज कणों के समान मल्टीलैमेलर मिनरल एनपी होते हैं जो इन विट्रो में शरीर के तरल पदार्थों में अनायास ही अवक्षेपित हो जाते हैं। हमारे परिणाम जैव रासायनिक संरचना, गठन के तंत्र, और इन खनिज-कार्बनिक कणों के जैविक कार्य से संबंधित महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रकट करते हैं और वे मानव शरीर में एक्टोपिक कैल्सीफिकेशन और रोग की शुरुआत के तंत्र पर प्रकाश डालते हैं।

परिणाम

हमने अंतिम चरण के क्रोनिक किडनी रोग (n=2) या गुर्दे के कैंसर (n=18; तालिका 1 देखें; गुर्दे के कैंसर के नमूनों के लिए, हमने गैर- -ऊतक का कैंसरयुक्त भाग)। स्वस्थ नियंत्रण के रूप में, हमने आघात या हेमेटोमा वाले रोगियों से प्राप्त गुर्दे की बायोप्सी का अध्ययन किया, लेकिन जिनका कोई पूर्व असामान्य गुर्दे का कार्य नहीं था (n=2; तालिका 1)।

स्वस्थ व्यक्तियों के गुर्दे के ऊतकों ने सामान्य हिस्टोलॉजिकल विशेषताएं दिखाईं, और वॉन कोसा धुंधला (छवि 1 ए, बी) के बाद कोई एक्टोपिक कैल्सीफिकेशन नहीं देखा गया। दूसरी ओर, रोगग्रस्त व्यक्तियों से प्राप्त गुर्दे के ऊतकों और हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) से सना हुआ, ऊतक क्षति (छवि 2 ए-सी, तीरों द्वारा इंगित) के सबूत दिखाते हैं, और 80 प्रतिशत रोगग्रस्त ऊतकों की जांच में खनिज जमा के रूप में पता चला है। वॉन कोसा धुंधला द्वारा (चित्र। 1C-T, अंजीर। 2E, F, कैल्सीफिकेशन काले तीरों द्वारा इंगित काली सामग्री के रूप में दिखाई देता है; तालिका 1 भी देखें)। कॉर्टेक्स और मेडुला में कैल्सीफाइड जमा देखे गए थे, जिसमें डिस्टल कन्फ्यूज्ड नलिकाओं के आसपास के बाह्य स्थान, समीपस्थ घुमावदार नलिकाएं, हेनले के नलिकाओं और लूपों को इकट्ठा करने के साथ-साथ नलिकाओं और नलिकाओं को चित्रित करने वाली कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म (चित्र। 1C-T और अंजीर) शामिल हैं। 2ई, एफ)। वृक्क कोषिका (चित्र 2D) में कोई कैल्सीफिकेशन नहीं पाया गया।

खनिज अवक्षेप की प्रकृति की जांच करने के लिए, हमने संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) द्वारा अवलोकन के लिए अति पतली गुर्दा अनुभाग तैयार किए। सूक्ष्म खनिज जमा वाले नमूनों में, खनिज कणों या कणिकाओं का पता वृक्क उपकला कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य में, तहखाने की झिल्ली के नीचे बाह्य मैट्रिक्स में, और समीपस्थ और बाहर के घुमावदार नलिकाओं के लुमेन के भीतर पाया गया (चित्र 3 ए, बी, कण बढ़े हुए हैं) पैनल A1-A4 और B1-B4 में)। खनिज एनपी भी हेनले के छोरों को अस्तर और नलिकाओं को इकट्ठा करने वाली कोशिकाओं के भीतर देखे गए थे (चित्र। 3C, D, पैनल C1, C2, और D1 में बढ़े हुए)। कुछ कण वृक्क कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर पुटिकाओं के भीतर पाए गए (चित्र 3ए, पैनल ए1 और ए2)। यहां इस्तेमाल किए गए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण ने हमें खनिज कणों के आंतरिक भाग की कल्पना करने की अनुमति दी; कुछ कणों ने इलेक्ट्रॉन-घने रिंगों को प्रकाश, इलेक्ट्रॉन-ल्यूसेंट परतों (छवि 3 ए, पैनल ए 3 और ए 4, चित्र 3 सी, पैनल सी 1) के साथ बारी-बारी से परेशान किया। कई रक्त वाहिकाएं, जैसे वासा रेक्टा रेंट (गुर्दे की सीधी धमनियां), हम बड़ी संख्या में खनिज एनपी (छवि 3 डी, पैनल डी 1) से घिरे हैं। इस प्रकार खनिज एनपी सभी मानव गुर्दे के ऊतकों में विभिन्न स्थानों पर एक्टोपिक कैल्सीफिकेशन के लक्षण दिखाते हुए पाए गए, जबकि स्वस्थ नियंत्रण की जांच में कोई कण नहीं पाया गया।

गुर्दे के ऊतकों में पाए जाने वाले खनिज कण हमारे पिछले अध्ययनों में शरीर के तरल पदार्थों में अनायास बनने वाले मिनरलो-ऑर्गेनिक एनपी के समान प्रतीत होते हैं (और जिसे हमने बायोन कहा है)। इस संभावना को सत्यापित करने के लिए, हमने एक वर्षा विधि का उपयोग करके खनिज कार्बनिक एनपी (या बायोन) तैयार किया, जैसा कि हमने पहले वर्णित किया था। इस विधि में कैल्शियम और फॉस्फेट जैसे अवक्षेपित आयनों को एक सेल कल्चर माध्यम (Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम या DMEM) में जोड़ना शामिल है, जिसमें मानव सीरम (HS) जैसे शरीर के तरल पदार्थ होते हैं, इसके बाद सेल कल्चर स्थितियों में ऊष्मायन होता है (तरीके देखें)। इस तरह से उत्पन्न कण (HS-NPS) या तो गोलाकार या दीर्घवृत्ताकार थे और एक चिकनी या क्रिस्टलीय खनिज सतह (चित्र 4A-E) दिखाते थे, जो पहले शरीर के तरल पदार्थ में वर्णित कणों के समान 22,23 के साथ-साथ मानव जलोदर में भी थे। कैल्सीफाइड धमनियां13. खनिज कण उनके समग्र आकारिकी, बहुपरत संरचना और सतह विशेषताओं (छवि 4F-J) के संदर्भ में गुर्दे के ऊतकों में देखे गए खनिज एनपी या कणिकाओं के समान थे। एचएस-व्युत्पन्न कणों और गुर्दे के कणिकाओं का आकार भी तुलनीय था, व्यास में 50 से 1,500 एनएम (चित्र। 4ए-ई, एफ-जे) से भिन्न। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, कुछ गुर्दा कणिकाओं को एक लिपिड झिल्ली से घिरा हुआ था, संभवतः इंट्रासेल्युलर कार्गो पुटिकाओं या बाह्य झिल्ली पुटिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं (चित्र। 4H,I, झिल्ली को तीरों द्वारा दर्शाया गया है); इन विट्रो में तैयार किए गए एचएस-एनपी नमूनों में ऐसी झिल्लीदार संरचनाएं अनुपस्थित थीं (चित्र 4ए-ई)। इन टिप्पणियों से पता चलता है कि गुर्दे के दाने सीरम में इकट्ठे हुए मिनरलो-ऑर्गेनिक एनपी के समान हैं।

चयनित क्षेत्र इलेक्ट्रॉन विवर्तन विश्लेषण का उपयोग करते हुए, हमने देखा कि इन विट्रो में पूर्व-परेड एचएस-एनपी के खनिज चरण में एक पॉलीक्रिस्टलाइन नैनोमटेरियल (छवि 4 ई, इनसेट; बेहोश संकेंद्रित छल्ले नोटिस) शामिल थे। इसी तरह के परिणाम गुर्दे के कणिकाओं (छवि 4J, इनसेट) और हड्डियों और एक्टोपिक कैल्सीफिकेशन के लिए प्राप्त किए गए थे जैसा कि पिछले अध्ययनों में वर्णित है।

हमने ऊर्जा-फैलाने वाले एक्स-रे स्पेक्ट्रोस्कोपी (EDX) का उपयोग करके HS-NPs और किडनी कणिकाओं की रासायनिक संरचना का अध्ययन किया। HS-NPs ने कैल्शियम फॉस्फेट खनिज की उपस्थिति के अनुरूप कार्बन (C), कैल्शियम (Ca), ऑक्सीजन (O), और फास्फोरस (P) (चित्र 4K) की प्रमुख चोटियों को दिखाया। HS-NPs (चित्र 4K) में सिलिकॉन (Si) का एक निचला शिखर भी नोट किया गया था, जो संभवतः एक छोटे कण घटक का प्रतिनिधित्व करता है। गुर्दे के कणिकाओं ने कार्बन, कैल्शियम, ऑक्सीजन और फास्फोरस की चोटियों को भी दिखाया, जो कैल्शियम फॉस्फेट खनिज का संकेत है, साथ ही सिलिकॉन और लोहे (Fe) (चित्र। 4L) की अतिरिक्त चोटियों के साथ। यूरेनियम चोटियों (यू) को नमूना तैयार करने के दौरान एक विपरीत अभिकर्मक के रूप में उपयोग किए जाने वाले यूरेनिल एसीटेट के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था (किडनी कणिकाओं जैसे खनिज कणों के कुछ नमूनों में यूरेनियम की उपस्थिति और अंजीर में नियंत्रण ऊतक में इसकी अनुपस्थिति। 4M को उच्च के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है) फॉस्फेट के लिए यूरेनियम की आत्मीयता, जैसा कि पहले बताया गया है)। कणों के आसपास के गुर्दे के ऊतकों के नियंत्रण ईडीएक्स स्पेक्ट्रा ने कार्बन और ऑक्सीजन (छवि 4M) की चोटियों को दिखाया, यह सुझाव देते हुए कि कैल्शियम और फास्फोरस मुख्य रूप से खनिज कणों में पाए जाते थे।

कैल्शियम: फास्फोरस (Ca:P) HS-NPs और गुर्दा कणिकाओं का अनुपात 0.65 से 1.18 तक भिन्न होता है। ये अनुपात स्टोइकोमेट्रिक हाइड्रॉक्सीपैटाइट के लिए देखे गए 1.67 के सैद्धांतिक मूल्य से भिन्न हैं, लेकिन अभी भी कैल्शियम फॉस्फेट और एपेटाइट क्रिस्टल के लिए पहले देखी गई सीमा के भीतर हैं जो क्रिस्टलीकरण के विभिन्न डिग्री पर देखे गए हैं। साथ में, ये निष्कर्ष इस बात की पुष्टि करते हैं कि गुर्दे के दानों में कैल्शियम फॉस्फेट एनपी होते हैं।

विभिन्न प्रोटीनों को 36,37 शरीर में एक व्यवस्थित तरीके से एक्टोपिक कैल्सीफिकेशन को बाधित करने के लिए पाया गया है। इसके अलावा, सिंथेटिक एनपी की सतह पर पाए जाने वाले प्रोटीन कोरोना को विवो 38,39 में कोशिकाओं पर कणों के जैव वितरण और प्रभावों को निर्धारित करने के लिए माना जाता है। दूसरी ओर, मानव गुर्दे के ऊतकों में पाए जाने वाले मिनरलो-ऑर्गेनिक एनपी की प्रोटीन संरचना अपूर्ण रूप से समझी जाती है। हमने पहले पाया कि एल्ब्यूमिन, भ्रूण-ए, और एपोलिपोप्रोटीन-ए 1 (एपीओ-ए 1) मुख्य प्रोटीन का प्रतिनिधित्व करते हैं जो शरीर के तरल पदार्थ में बनने वाले मिनरलो-ऑर्गेनिक एनपी के साथ बातचीत करते हैं। यहां हमने गुर्दे के कणिकाओं के भीतर इन प्रोटीनों की उपस्थिति और अवसंरचनात्मक स्थान की जांच करने के लिए इम्युनोगोल्ड लेबलिंग का उपयोग किया।

हमने एचएस-एनपी और गुर्दे के कणिकाओं में सीरम प्रोटीन की उपस्थिति की जांच करने के लिए मानव सीरम एल्ब्यूमिन (एचएसए), मानव सीरम भ्रूण-ए (एचएसएफ), मानव एपीओ -1 ए, और पूरे एचएस के खिलाफ पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया। पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी की विशिष्टता (पहले वर्णित के रूप में तैयार) को वेस्टर्न ब्लॉटिंग (चित्र 5) का उपयोग करके सत्यापित किया गया था। पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी में से प्रत्येक ने इन विट्रो में तैयार एचएस-एनपी के साथ-साथ मानव गुर्दे के ऊतकों में पाए जाने वाले खनिज कणिकाओं (छवि 6 ए, बी, पैनल ए 1-ए 3 और बी 1-बी 3; ब्लैक डॉट्स) के साथ सकारात्मक प्रतिक्रिया व्यक्त की। एंटीबॉडी ने मुख्य रूप से इलेक्ट्रॉन-घने परतों या HS-NPs के डार्क कोर और किडनी ग्रेन्यूल्स (छवि 6A, B) के साथ प्रतिक्रिया की, यह दर्शाता है कि इन अंधेरे क्षेत्रों में इलेक्ट्रॉन-ल्यूसेंट क्षेत्रों की तुलना में प्रोटीन का उच्च स्तर हो सकता है। प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना किए गए नकारात्मक नियंत्रणों ने कोई प्रतिक्रिया नहीं की (छवि 6 ए, बी, पैनल ए 4 और बी 4, नियंत्रण)। हमने निष्कर्ष निकाला कि किडनी के दाने एचएस-एनपी के समान मिनरलो-ऑर्गेनिक एनपी का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो न केवल उनकी आकृति विज्ञान और खनिज संरचना पर आधारित है, बल्कि सीरम में मौजूद प्रमुख कैल्सीफिकेशन अवरोधकों के लिए उनके बंधन पर भी आधारित है।

रोगग्रस्त मानव गुर्दे में एचएसए और एचएसएफ युक्त खनिज कणिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया गया था। इस तकनीक का उपयोग करके, मानव गुर्दे के ऊतकों ने दिखाया

विभिन्न क्षेत्रों में दो प्रोटीनों के लिए सकारात्मक धुंधलापन, जिसमें वृक्क नलिकाओं के आसपास के इंटरस्टिटियम के साथ-साथ ट्यूबल-डिलाइनिंग कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म (चित्र। 7A, पैनल A1 और A2) शामिल हैं। इन क्षेत्रों में एल्ब्यूमिन और भ्रूण-ए दोनों वाले प्रोटीन समुच्चय भी देखे गए थे, हालांकि एकल प्रोटीन (छवि 7 ए और पैनल ए 3, पीले रंग में विलय) के धुंधला होने की तुलना में कम मात्रा में। विशेष रूप से, हमने देखा कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा पता लगाया गया प्रोटीन धुंधला वॉन कोसा धुंधला (छवि 7 ए, बी, कैल्सीफिकेशन बी में तीरों द्वारा इंगित काली सामग्री के रूप में दिखाई देता है) का उपयोग करके देखे गए एक्टोपिक कैल्सीफिकेशन के पैटर्न के साथ बारीकी से ओवरलैप किया गया है। ये परिणाम जांचे गए मानव गुर्दे के ऊतकों में मिनरलो-ऑर्गेनिक कणों की उपस्थिति के लिए और सहायता प्रदान करते हैं।

बहस

जबकि सिंथेटिक एनपी और मानव कोशिकाओं के बीच बातचीत की हमारी समझ में प्रगति हुई है, हम मिनरलो-ऑर्गेनिक एनपी के प्रभावों के बारे में काफी कम जानते हैं जो शरीर के तरल पदार्थों में अनायास बनते हैं। हमारे पिछले अध्ययनों से पता चला है कि ये कण जैविक तरल पदार्थों में बनते हैं जब कैल्शियम और फॉस्फेट की सांद्रता संतृप्ति से अधिक हो जाती है। हमने यह भी देखा कि इन कणों को प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा आंतरिक किया जाता है, लेकिन केवल बड़े कण ही ​​प्रो-भड़काऊ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करते हैं। हालांकि, इन कणों का मानव ऊतकों में वितरण और क्या वे शरीर में कोई शारीरिक या रोग संबंधी भूमिका निभाते हैं, इसकी अभी तक जांच नहीं की गई है।

वर्तमान अध्ययन में, हमने पहली बार मानव रोगियों के गुर्दे में मिनरलो-ऑर्गेनिक एनपी का पता लगाया जो या तो अंतिम चरण के गुर्दे की बीमारी या गुर्दे के कैंसर से पीड़ित थे। पाए गए मिनरलो-ऑर्गेनिक एनपी में अस्थि खनिज के समान खराब क्रिस्टलीकृत कैल्शियम फॉस्फेट, साथ ही एल्ब्यूमिन, भ्रूण-ए, और एपीओ-ए 1 होते हैं जो शरीर के तरल पदार्थों में प्रणालीगत कैल्सीफिकेशन अवरोधक के रूप में कार्य करते हैं। हमारे परिणाम पिछली रिपोर्टों के अनुरूप हैं, जिसमें संवहनी ऊतकों और शरीर के तरल पदार्थों में खनिज-प्रोटीन परिसरों की उपस्थिति का वर्णन किया गया है। चूंकि हमने जिन कणों का अवलोकन किया, वे बिना सूक्ष्म कैल्सीफिकेशन वाले क्षेत्रों में पाए गए, हमारी टिप्पणियों से पता चलता है कि कण मानव ऊतकों में एक्टोपिक कैल्सीफिकेशन के अग्रदूतों का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। इस संभावना को देखते हुए कि मिनरलो-ऑर्गेनिक एनपी धीरे-धीरे आकार में बढ़ सकते हैं और अनुकूल परिस्थितियों में कण-से-फिल्म रूपांतरण से गुजर सकते हैं, जैसा कि हमारे पिछले अध्ययनों में वर्णित है, यहां प्रस्तुत टिप्पणियों से पता चलता है कि खनिज अग्रदूत बड़े गठन का कारण बन सकते हैं। विवो में खनिज जमा, जैसे रान्डेल की पट्टिका और गुर्दे की पथरी।

हमारे अवलोकन कि खनिज एक्टोपिक कैल्सीफिकेशन और मिनरलो-ऑर्गेनिक एनपी गुर्दे की विभिन्न शारीरिक संरचनाओं में पाए जाते हैं, इस अंग में एक्टोपिक कैल्सीफिकेशन के पिछले निष्कर्षों के अनुरूप हैं। इवान एट अल। के अवलोकनों ने संकेत दिया कि नेफ्रोलिथियासिस वाले रोगियों के गुर्दे में खनिजकरण शुरू हो सकता है और मुख्य रूप से हेनले के छोरों के अंतरालीय ऊतक में 40,42 हो सकता है। इन लेखकों ने देखा कि इस क्षेत्र में बनने वाले खनिज जमा यूरोटेलियम के बेसल पक्ष से निकल सकते हैं और गुर्दे की पथरी का निर्माण कर सकते हैं। हमारी टिप्पणियों से पता चलता है कि, हेनले के छोरों के अलावा, अन्य गुर्दे के क्षेत्रों में खनिज एनपी हो सकते हैं जो अंततः मानव गुर्दे में बड़े खनिज जमा करने के लिए विकसित हो सकते हैं। हम इस संभावना की भी जांच कर रहे हैं कि रक्त परिसंचरण में बनने वाले खनिज एनपी गुर्दे के ऊतकों में बदल सकते हैं और गुर्दे में एक्टोपिक कैल्सीफिकेशन और पत्थर के गठन को प्रेरित कर सकते हैं।

वर्तमान अध्ययन में पाए गए कई गुर्दा कणिकाओं इंट्रासेल्युलर या बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं (छवि 4H, I) के भीतर पाए जाते हैं और ये हड्डियों और दांतों में कैल्सीफिकेशन को प्रेरित करने के लिए दिखाए गए मैट्रिक्स पुटिकाओं के समान हैं। हमने हाल ही में देखा है कि मानव और पशु सीरम से अलग किए गए पुटिका खनिज एनपी के गठन को प्रेरित करते हैं और इन विट्रो में सूक्ष्म अवक्षेपण करते हैं। Schlieper et al.34 ने यह भी देखा कि धमनियों में पाए जाने वाले खनिज कण झिल्ली संरचनाओं से जुड़े होते हैं और प्रस्तावित किया गया है कि मैट्रिक्स वेसिकल्स या एपोप्टोटिक निकाय इन ऊतकों में खनिज कणों के न्यूक्लियेटर का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। इसी तरह, खान एट अल। ने बताया कि अज्ञातहेतुक गुर्दे की पथरी वाले मानव रोगियों के गुर्दे में पाए जाने वाले कैल्शियम फॉस्फेट जमा कोलेजन फाइबर और मैट्रिक्स वेसिकल्स से जुड़े होते हैं। इन परिणामों से पता चलता है कि गुर्दे के ऊतकों में पाए जाने वाले मिनरलो-ऑर्गेनिक एनपी झिल्ली पुटिकाओं से जुड़े तंत्र के माध्यम से बन सकते हैं, जो एथेरोस्क्लोरोटिक धमनियों में देखी गई स्थिति के अनुरूप है। दूसरी ओर, एक हालिया अध्ययन से पता चला है कि महिलाओं की स्तन धमनियों में पाया जाने वाला एक्टोपिक कैल्सीफिकेशन ओस्टोजेनिक या एपोप्टोटिक सेल मार्करों से जुड़ा नहीं था, यह सुझाव देता है कि कैल्सीफिकेशन का तंत्र शामिल अंग या जैविक संदर्भ के लिए विशिष्ट हो सकता है। इसके अलावा, मिनरलो-ऑर्गेनिक एनपी जैसे कि यहां वर्णित मानव गुर्दे के ऊतक भी आयनों (जैसे, कैल्शियम और फॉस्फेट) और कैल्सीफिकेशन इनहिबिटर (जैसे, एल्ब्यूमिन, भ्रूण-ए, और एपीओ) की शारीरिक सांद्रता को बनाए रखने में विफलता के कारण बन सकते हैं। -A1) मानव शरीर के तरल पदार्थों में।

हमारे परिणाम बताते हैं कि इलेक्ट्रॉन-सघन परत और खनिज-कार्बनिक एनपी के कोर में कणों के इलेक्ट्रॉन-ल्यूसेंट क्षेत्रों (छवि 6 ए, बी) की तुलना में उच्च स्तर के प्रोटीन और कार्बनिक अणु हो सकते हैं। ये इलेक्ट्रॉन-सघन परतें TEM के तहत इस सामग्री की क्रिस्टलीय प्रकृति द्वारा देखी गई खनिजयुक्त प्रतीत होती हैं (चित्र 4A-J देखें)। Ryall41 और Evan et al.44 सहित अन्य लेखकों ने प्रस्तावित किया है कि इलेक्ट्रॉन-ल्यूसेंट परत खनिजों का प्रतिनिधित्व कर सकती है जबकि इलेक्ट्रॉन-सघन परतें कार्बनिक अणुओं के अनुरूप हो सकती हैं। ये व्याख्याएं कम से कम उस तरीके के कारण हो सकती हैं जिस तरह से नमूनों को संसाधित किया गया था और प्रत्येक अध्ययन में जांच की गई थी और साथ ही इस्तेमाल किए गए शुरुआती ऊतकों की प्रकृति भी थी।

एक्टोपिक कैल्सीफिकेशन में भूमिका निभाने के अलावा, खनिज-कार्बनिक कण गुर्दे के ऊतकों में सूजन पैदा कर सकते हैं। हमने हाल ही में दिखाया है कि जबकि मिनरलो-ऑर्गेनिक एनपी मानव मैक्रोफेज द्वारा प्रो-इंफ्लेमेटरी इंटरल्यूकिन -1 के स्राव को प्रेरित करने में विफल रहते हैं, 1 माइक्रोन से बड़े खनिज समुच्चय ऐसा करने में सक्षम हैं। क्रिस्टलीय सामग्री के जवाब में इंटरल्यूकिन -1 की रिहाई को इंट्रासेल्युलर आणविक परिसरों की सक्रियता पर भरोसा करने के लिए दिखाया गया है, जिसे इन्फ्लामासोम्स कहा जाता है। इसके अलावा, ट्यूमर को शरण देने वाले गुर्दे में खनिज कणों का पता चला था और कैंसर और सूजन के बीच संबंध अब अच्छी तरह से पहचाना जाता है। संभावना है कि एकत्रित खनिज कण एक सूजन को सक्रिय कर सकते हैं और गुर्दे या अन्य ऊतकों में सूजन और कैंसर के विकास में योगदान कर सकते हैं, इसकी जांच की जानी बाकी है।

एक्टोपिक कैल्सीफिकेशन के अलावा, यहां वर्णित खनिज कणिकाओं अन्य रोग प्रक्रियाओं में भाग ले सकते हैं। उदाहरण के लिए, हमने पहले प्रस्तावित किया है कि खनिज एनपी शरीर के तरल पदार्थों में विभिन्न प्रोटीनों को बांध सकते हैं और इन कार्बनिक अणुओं को शरीर के तरल पदार्थ से 20,26 समाप्त कर सकते हैं। दूसरी ओर, मानव शरीर कैल्सीफिकेशन इनहिबिटर और रेटिकुलोएन्डोथेलियल सिस्टम (यानी, मैक्रोफेज) की उपस्थिति पर भरोसा करके सामान्य परिस्थितियों में खनिज एनपी के गठन और संचय को रोक सकता है। खनिज एनपी इस प्रकार केवल एक बार जमा हो सकते हैं जब प्रणालीगत या स्थानीय कैल्शियम होमियोस्टेसिस गड़बड़ा जाता है और जब मानव शरीर में सुरक्षात्मक तंत्र विफल हो जाते हैं।

हम प्रस्ताव करते हैं कि यहां विकसित नैनोमटेरियल दृष्टिकोण का उपयोग जानवरों और मानव ऊतकों में मिनरलो-ऑर्गेनिक एनपी के गठन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एल्ब्यूमिन, भ्रूण-ए, और एपीओ-ए1 जैसे कैल्सीफिकेशन अवरोधक प्रोटीन के खिलाफ उठाए गए एंटीबॉडी का उपयोग खनिज विश्लेषण के साथ संयोजन में किया जा सकता है ताकि जानवरों के मॉडल के ऊतकों में मिनरलो-ऑर्गेनिक एनपी के गठन का पता लगाया जा सके। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके प्राप्त परिणामों को मानव शरीर के तरल पदार्थों पर किए गए नैदानिक ​​मापों पर लागू किया जा सकता है ताकि जैविक मापदंडों की पहचान की जा सके जो शरीर में खनिज कण गठन और एक्टोपिक कैल्सीफिकेशन की स्थिति को दर्शाते हैं। हम उम्मीद करते हैं कि इस ज्ञान से मानव रोगों और एक्टोपिक कैल्सीफिकेशन से जुड़ी स्थितियों को रोकने और उनका इलाज करने के लिए उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों का विकास हो सकता है।

तरीकों

गुर्दे के ऊतक।मानव ऊतकों के उपयोग और इस अध्ययन में किए गए प्रयोगों को चांग गंग मेमोरियल अस्पताल के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था; विधियों और प्रयोगों को अनुमोदित दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था। रोगियों से लिखित सूचित सहमति प्राप्त की गई थी। गुर्दे की बीमारी के इतिहास के बिना आघात और हेमेटोमा रोगियों की बायोप्सी से स्वस्थ गुर्दे के ऊतकों को नियंत्रित किया गया था (एन=2); गुर्दे के ऊतकों को गुर्दे के कैंसर के रोगियों (n=20) और अंतिम चरण के गुर्दे की बीमारी के रोगियों (n=2) से भी प्राप्त किया गया था, जिनकी किडनी को प्रत्यारोपण सर्जरी (तालिका 1) के दौरान हटा दिया गया था या बायोप्सी किया गया था। वर्तमान अध्ययन में गुर्दे के कैंसर के ऊतकों के लिए, ऊतक के गैर-कैंसर वाले हिस्से को विच्छेदित और विश्लेषण किया गया था।

हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण।गुर्दे के ऊतकों को पैराफिन ब्लॉकों पर रखा गया था। पैराफिन को हटाने के लिए ब्लॉकों को विभाजित किया गया था और ऊतक के स्लाइस को 30 मिनट के लिए 70 डिग्री पर गर्म प्लेट पर गर्म किया गया था। शेष पैराफिन को पूरी तरह से हटाने के लिए वर्गों को 15 मिनट के लिए तीन बार xylene के ताजा घोल में डुबोया गया। प्रत्येक बार 5 मिनट के लिए वर्गों को 95 प्रतिशत, 80 प्रतिशत और 70 प्रतिशत इथेनॉल के साथ पुनर्जलीकरण किया गया था। निर्जलित नमूनों को 5 मिनट के लिए दोहरे आसुत जल (ddH2O) से धोया गया। सेल नाभिक को 8 मिनट के लिए हेमटॉक्सिलिन के साथ दाग दिया गया था। डाई को नमूनों से 10 मिनट के लिए गर्म पानी से हटा दिया गया था। गुर्दे के नमूनों को ddH2O में धोया गया और 95 प्रतिशत इथेनॉल में 10 बार डुबोया गया। इथेनॉल-उपचारित नमूनों को 1 मिनट के लिए ईओसिन वाई के साथ काउंटर-दाग किया गया था। नमूनों को हर बार 10 मिनट के लिए 95 प्रतिशत और 100 प्रतिशत इथेनॉल के साथ निर्जलित किया गया, इसके बाद 10 मिनट के लिए जाइलीन में निर्जलीकरण कदम उठाया गया। अंतिम निर्जलित गुर्दे के नमूनों को 50 प्रतिशत ग्लिसरॉल के साथ कांच की स्लाइड पर रखा गया था और एक डिजिटल कैमरे से लैस एक हल्के सूक्ष्मदर्शी के तहत देखा गया था।

एच एंड ई धुंधला के लिए वर्णित के रूप में डी-पैराफिनाइज्ड और पुनर्जलीकरण नमूने तैयार किए गए थे। निर्जलित वर्गों को सिल्वर नाइट्रेट (5 प्रतिशत) के साथ दाग दिया गया, इसके बाद 20 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के संपर्क में आया। घोल को 15 मिनट के लिए ddH2O से धोया गया। 5 मिनट के लिए वर्गों को सोडियम थायोसल्फेट (5 प्रतिशत) के साथ दाग दिया गया, इसके बाद 15 मिनट के लिए डीडीएच 2 ओ से धोया गया। 5 मिनट के लिए वर्गों को परमाणु तेज लाल (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमआई) के साथ दाग दिया गया था। 10 मिनट के लिए xylene में निर्जलीकरण से पहले, दाग नमूनों को क्रमशः 95 प्रतिशत और 10 मिनट के लिए 100 प्रतिशत इथेनॉल के साथ निर्जलित किया गया था। गुर्दे के नमूनों को कांच की स्लाइड्स पर रखा गया था और ऊपर वर्णित अनुसार जांच की गई थी।

इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और ईडीएक्स विश्लेषण।एलजीपीएस विच्छेदन माइक्रोस्कोप (ओलिंप, टोक्यो, जापान) का उपयोग करके गुर्दे के नमूनों को 1 मिमी से कम छोटे टुकड़ों में काट दिया गया था। ऊतकों को 2.5 प्रतिशत ग्लूटाराल्डिहाइड और 1 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ 0 .1 एम कैकोडायलेट बफर रात भर 4 डिग्री पर तय किया गया था। स्थिर नमूनों को 10 मिनट के लिए बर्फ पर 8 प्रतिशत सुक्रोज (पीएच 7.2) में 0 .1 एम कैकोडायलेट बफर से तीन बार धोया गया। धोए गए ऊतकों को फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस; 137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 10 मिमी Na2HPO4) में ऊष्मायन किया गया था जिसमें बर्फ पर 2 घंटे के लिए 1 प्रतिशत ऑस्मियम टेट्रोक्साइड और 1.5 प्रतिशत पोटेशियम फेरोसाइनाइड होता है। ऊतकों को 10 मिनट बर्फ पर ddH2O से तीन बार धोया गया। बर्फ पर ddH2O के साथ तीन बार धोने से पहले धुले हुए ऊतकों को 1 घंटे के लिए ddH2O में 1 प्रतिशत uranyl एसीटेट के साथ बर्फ पर दाग दिया गया था। गुर्दे के ऊतकों को हर बार 10 मिनट के लिए 30, 50, 70, 80, और 90 प्रतिशत इथेनॉल के साथ निर्जलित किया गया था, सिवाय जब इथेनॉल 70 प्रतिशत तक पहुंच गया, इस मामले में नमूने रातोंरात 4 डिग्री पर संग्रहीत किए गए थे। 5 मिनट के लिए 95 प्रतिशत इथेनॉल के साथ निर्जलीकरण से पहले, 15 मिनट के लिए 95 प्रतिशत इथेनॉल में 1 प्रतिशत फॉस्फोटुंगस्टिक एसिड के साथ ऊतकों को दाग दिया गया था। नमूनों को 40, 57, 67, और हर बार 10 मिनट के लिए इथेनॉल में 100 प्रतिशत पर प्रोपलीन ऑक्साइड में डुबोया गया, इसके बाद 5 मिनट के लिए 100 प्रतिशत प्रोपलीन ऑक्साइड में एक और विसर्जन किया गया। गुर्दे के ऊतकों को हर बार 1 घंटे के लिए 50, 70, और 100 प्रतिशत एपोनेट 812 (टेड पेला, रेडिंग, सीए) के साथ घुसपैठ किया गया था। एपोनेट 812-एम्बेडेड किडनी के नमूने दो बार 100 प्रतिशत एपोनेट में इनक्यूबेट करके तैयार किए गए थे। राल पोलीमराइजेशन की अनुमति देने के लिए एंबेडेड नमूनों को रातोंरात 60 डिग्री पर ओवन में डाला गया।

ऊपर के रूप में प्राप्त धुले HS-NP छर्रों को ddH2O में ग्लूटाराल्डिहाइड (2.5 प्रतिशत) और पैराफॉर्मलडिहाइड (1 प्रतिशत) के साथ 4 डिग्री पर 4 घंटे के लिए तय किया गया था। फिक्स्ड छर्रों को हर बार 10 मिनट के लिए तीन बार ddH2O से धोया गया। छर्रों को लगातार ऊष्मायन के साथ 30, 50, 70, 80, 90, 95, और 100 प्रतिशत इथेनॉल में हर बार 10 मिनट के लिए निर्जलित किया गया था, सिवाय जब इथेनॉल 70 प्रतिशत तक पहुंच गया, जिसमें छर्रों को रात भर 4 डिग्री पर संग्रहीत किया गया था। अन्य इथेनॉल समाधान केवल 10 मिनट के लिए छर्रों के संपर्क में रखे गए थे। निर्जलित छर्रों को एलआर सफेद एम्बेडिंग माध्यम (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी साइंसेज, हैटफील्ड, पीए) के साथ 30 मिनट के लिए इथेनॉल और एलआर माध्यम (3: 1, 1: 1, और 1: 3) के विभिन्न अनुपातों का उपयोग करके घुसपैठ किया गया था। पोलीमराइजेशन से पहले छर्रों को रात भर ताजा एलआर माध्यम (100 प्रतिशत) के साथ घुसपैठ किया गया था। एलआर माध्यम से घुसपैठ किए गए छर्रों को राल पोलीमराइजेशन की अनुमति देने के लिए 2 दिनों के लिए 60 डिग्री पर ओवन में ऊष्मायन किया गया था। रीचर्ट अल्ट्राकट एस माइक्रोटोम (लीका, वेट्ज़लर, जर्मनी) का उपयोग करके 70-100 एनएम की मोटाई के साथ स्लाइस का उत्पादन करने के लिए किडनी और एचएस-एनपी के ब्लॉक को विभाजित किया गया था। 100 kV पर संचालित JEM 1230 ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (JEOL, टोक्यो, जापान) के तहत विज़ुअलाइज़ेशन से पहले ऊतक वर्गों को 4 प्रतिशत uranyl एसीटेट के साथ दाग दिया गया था। उसी प्रणाली का उपयोग करके इलेक्ट्रॉन विवर्तन पैटर्न प्राप्त किए गए थे। निकल ग्रिड को समर्थन के रूप में इस्तेमाल किया गया था।

ईडीएक्स विश्लेषण के लिए, गुर्दे के ऊतकों के पतले वर्गों को यूरेनिल एसीटेट के साथ दाग दिया गया था और ऊपर के रूप में डीडीएच 2 ओ से धोया गया था, इसके बाद इलेक्ट्रॉनिक डेसीकेटर कैबिनेट में सुखाया गया था। 120 kV पर संचालित एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन JEM 2100 ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (JEOL) के तहत नमूने देखे गए। EDX स्पेक्ट्रा को INCA एनर्जी EDS सिस्टम (ऑक्सफोर्ड इंस्ट्रूमेंट्स, एबिंगडन, यूके) का उपयोग करके तीन प्रतियों में प्राप्त किया गया था। एचएस-एनपी के पतले वर्गों को बिना धुंधला हुए देखा गया।

मिनरलो-ऑर्गेनिक एनपी की तैयारी।सभी प्रारंभिक समाधानों को पीएच 7.4 में समायोजित किया गया और उपयोग करने से पहले 0 .2μm झिल्ली के माध्यम से निस्पंदन द्वारा निष्फल किया गया। एक पारंपरिक वेनिपंक्चर तकनीक का उपयोग करके स्वस्थ मानव स्वयंसेवकों से एचएस प्राप्त किया गया था। इस अध्ययन में मानव जैविक तरल पदार्थों के उपयोग को लिंको चांग गंग मेमोरियल अस्पताल के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था और स्वयंसेवकों से लिखित सूचित सहमति प्राप्त की गई थी। HS-NPs को DMEM (गिब्को, कार्ल्सबैड, CA) में प्रत्येक में 3 mM CaCl2 और Na2HPO4 जोड़कर तैयार किया गया था, जिसमें 10 प्रतिशत HS था, इसके बाद सेल कल्चर स्थितियों (37 डिग्री, 5 प्रतिशत CO2, आर्द्र हवा) में एक सप्ताह के लिए ऊष्मायन किया गया था। कणों को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा 16, 000 × g पर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री पर पिलाया गया और एक ही सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके दो बार HEPES बफर (20 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl) से धोया गया।

एसडीएस-पेज और वेस्टर्न ब्लॉटिंग।एसडीएस-पेज और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण अनिवार्य रूप से पहले की तरह ही किया गया था। संक्षेप में, 0.2 कुरूप (चित्र 5ए,डी) या 1.2 कुरूप (चित्र 5बी,सी) एचएस प्रोटीन, 47 कुरूप (चित्र 5ए,बी,डी) या 590ug HS-NP प्रोटीन (चित्र 5C), 0.1ug HSA (चित्र 5A-D), और 0.6ug (चित्र 5A, C, D) या {{23} }.15ug HSF (चित्र 5B) को 5× "लोडिंग बफर" (0.313 M Tris-HCl pH 6.8, 10 प्रतिशत SDS, 0.05 प्रतिशत ब्रोमोफेनॉल नीला, 50 प्रतिशत ग्लिसरॉल, 12.5 प्रतिशत - में भंग कर दिया गया था - मर्कैप्टोएथेनॉल) 1 × की अंतिम सांद्रता के लिए, 5 मिनट के लिए 95 डिग्री पर गर्म करने से पहले और मिनी-जेल सिस्टम (होफर, हॉलिस्टन, एमए) का उपयोग करके 10 प्रतिशत एसडीएस-पेज पर शर्तों को कम करने और कम करने के तहत अलग करना। एनपी नियंत्रण (चित्र 5ए-डी के लेन 1 में प्रयुक्त) में डीएमईएम (1ml की अंतिम मात्रा) में प्रत्येक में 3 मिमी CaCl2 और Na2HPO4 जोड़कर तैयार खनिज एनपी शामिल थे, इसके बाद सेल संस्कृति स्थितियों में एक दिन के लिए ऊष्मायन किया गया था; कणों को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा 16, 000 × g पर 15 मिनट के लिए पिलाया गया, दो बार HEPES बफर से धोया गया, और HEPES बफर के 50ul में फिर से जोड़ा गया। ऊपर के रूप में एसडीएस-पेज के लिए 20ul resuspended कणों के एक विभाज्य को संसाधित किया गया था। PVDF झिल्लियों को कमरे के तापमान पर 5 प्रतिशत (w/v) वसायुक्त दूध में 1 घंटे के लिए अवरुद्ध किया गया था। 25 से पहले वर्णित के रूप में घर में उत्पन्न प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग 1:1, 000 (-एपीओ-ए1 और -एचएस-एनपी), 1:3, 000 (-एचएसएफ) के कमजोर पड़ने पर किया गया था। , या 1:6,000 ( -HSA)। बकरी विरोधी खरगोश हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग निर्माता (मिलिपोर, बिलरिका, एमए) द्वारा दिए गए निर्देशों के आधार पर किया गया था। बढ़े हुए रसायनयुक्त रसायन (एमर्शम बायोसाइंसेज, एमर्सहम, यूके) और ऑटोरैडियोग्राफिक फिल्मों का उपयोग करके धमाकों का खुलासा किया गया था।

इम्युनोगोल्ड लेबलिंग।टीईएम अवलोकन के लिए नमूने तैयार किए गए थे। HS-NP ब्लॉकों को 7 0 एनएम से कम मोटे स्लाइस में विभाजित किया गया था। ग्रिड पर नमूना वर्गों को 25 मिनट के लिए 1% मछली जिलेटिन (सिग्मा) के साथ 0 .1 एम HEPES बफर (पीएच 8.0) के साथ अवरुद्ध किया गया था। ग्रिड को निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया था: -HSA, 1:30; -एचएसएफ, 1:50; -एपीओ-ए1, 1:30; -एचएस-एनपी, 1:60। नकारात्मक नियंत्रण में कोई प्राथमिक एंटीबॉडी (HEPES बफर में 1 प्रतिशत मछली जिलेटिन) नहीं था। ऊष्मायन वर्गों को 15 मिनट के लिए HEPES बफर से रिंस किया गया था। 20 मिनट के लिए HEPES बफर में 1 प्रतिशत मछली जिलेटिन के साथ रिंस किए गए वर्गों को अवरुद्ध कर दिया गया था। नमूनों को 1 घंटे के लिए द्वितीयक 5- एनएम-सोना-संयुग्म बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी के साथ इलाज किया गया था। नमूनों को 10 मिनट के लिए ddH2O से धोने से पहले 10 मिनट के लिए HEPES बफर से धोया गया था। टीईएम अवलोकन ऊपर के रूप में किए गए थे।

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी।ऊपर के रूप में तैयार किए गए हिस्टोलॉजिकल किडनी ऊतक स्लाइड को कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 1 प्रतिशत गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन के साथ अवरुद्ध किया गया था। स्लाइड्स को 1:4, 000 के कमजोर पड़ने पर प्राथमिक पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया था। चरणों को धोने के बाद, नमूने माध्यमिक एंटीबॉडी बकरी विरोधी खरगोश-एफआईटीसी (492/520 एनएम) और बकरी विरोधी खरगोश-टीआरआईटीसी (550/570 एनएम) (जैक्सन इम्यूनो रिसर्च, वेस्ट ग्रोव, पीए) के साथ 1:100 पर लगाए गए थे। 1ह. 15 मिनट के लिए परिसरों को PBST से धोया गया। फ्लोरोसेंट दाग 4′, 6-डायमिडीनो-2-फेनिलइंडोल (डीएपीआई) का उपयोग 15 मिनट के लिए 10 कुरूप/एमएल पर किया गया था। डीएपीआई-सना हुआ नमूनों को 10 मिनट के लिए 95 और 100 प्रतिशत इथेनॉल के साथ निर्जलित किया गया था, इसके बाद 10 मिनट के लिए ज़ाइलिन में निर्जलीकरण किया गया था। निर्जलित गुर्दे के नमूनों को वेक्टाशील्ड प्रतिदीप्ति एच -1000 बढ़ते माध्यम (वेक्टर प्रयोगशालाओं, बर्लिंगम, सीए) के साथ रखा गया था और स्पॉट फ्लेक्स कैमरे से लैस एक मुखर माइक्रोस्कोप (LSM510 मेटा; Zeiss, ओबेरोचेन, जर्मनी) के तहत देखा गया था।

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संदर्भ

1. गियाचेली, सीएम एक्टोपिक कैल्सीफिकेशन: सॉफ्ट टिश्यू मिनरलाइजेशन के बारे में कठिन तथ्य एकत्र करना। एम जे पैथोल 154, 671-675 (1999)।

2. एबेडिन, एम।, टिंटट, वाई। और डेमर, एलएल वैस्कुलर कैल्सीफिकेशन: तंत्र और नैदानिक ​​​​प्रभाव। धमनीकाठिन्य थ्रोम्ब वास्क बायोल 24, 1161-1170 (2004)।

3. एलेक्सोपोलोस, एन। और रग्गी, पी। एथेरोस्क्लेरोसिस में कैल्सीफिकेशन। नेट रेव कार्डियोल 6, 681–688 (2009)।

4. एलीसन, एमए, क्रिकी, एमएच और राइट, सीएम पैटर्न और प्रणालीगत कैल्सीफाइड एथेरोस्क्लेरोसिस के लिए जोखिम कारक। धमनीकाठिन्य थ्रोम्ब वास्क बायोल 24, 331–336 (2004)।

5. केटेलर, एम। एट अल। डायलिसिस रोगियों में कैल्शियम-नियामक प्रोटीन की कमी: यूरीमिया में कार्डियोवैस्कुलर कैल्सीफिकेशन की एक उपन्यास अवधारणा। किडनी इंट सप्ल 84, S84-87 (2003)।

6. कपुस्टिन, ए। और शानहन, सीएम संवहनी कैल्सीफिकेशन को लक्षित करना: एक कठिन लक्ष्य को नरम करना। कर्र ओपिन फार्माकोल 9, 84-89 (2009)।

7. कपुस्टिन, एएन और शानहन, सीएम कैल्शियम रेगुलेशन ऑफ वैस्कुलर स्मूथ मसल सेल-व्युत्पन्न मैट्रिक्स वेसिकल्स। ट्रेंड्स कार्डियोवास्क मेड 22, 133-137 (2012)।

8. डोहर्टी, टीएम एट अल। एथेरोस्क्लेरोसिस में कैल्सीफिकेशन: धमनी चौराहे पर अस्थि जीव विज्ञान और पुरानी सूजन। प्रोक नेटल एकेड साइंस यूएसए 100, 11201–11206 (2003)।

9. खान, एसआर, रोड्रिग्ज, डीई, गॉवर, एलबी और मोंगा, एम। एसोसिएशन ऑफ रान्डेल प्लाक विद कोलेजन फाइबर और मेम्ब्रेन वेसिकल्स। जे उरोल 187, 1094-1100 (2012)।

10. मूल्य, पीए, गुयेन, टीएम और विलियमसन, एमके सीरम भ्रूण-खनिज परिसर का जैव रासायनिक लक्षण वर्णन। जे बायोल केम 278, 22153-22160 (2003)।

11. मूल्य, पीए, विलियमसन, एमके, गुयेन, टीएम और थान, टीएन भ्रूण-खनिज परिसर के सीरम स्तर चूहे में धमनी कैल्सीफिकेशन से संबंधित हैं। जे बायोल केम 279, 1594-1600 (2004)।

12. हेस, ए एट अल। कैल्शियम फॉस्फेट कणों के निर्माण और स्थिरीकरण में भ्रूण-ए और अम्लीय सीरम प्रोटीन की श्रेणीबद्ध भूमिका। जे बायोल केम 283, 14815–14825 (2008)।

13. बर्टाज़ो, एस। एट अल। नैनो-विश्लेषणात्मक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी से मानव हृदय ऊतक कैल्सीफिकेशन में मौलिक अंतर्दृष्टि का पता चलता है। नेट मेटर 12, 576-583 (2013)।

14. मार्टेल, जे. एंड यंग, ​​जेडी ने मानव रक्त में कैल्शियम कार्बोनेट नैनोकणों के रूप में नैनोबैक्टीरिया को परपोर्ट किया। प्रोक नेटल एकेड साइंस यूएसए 105, 5549-5554 (2008)।

15. यंग, ​​​​जेडी एट अल। पुटेटिव नैनोबैक्टीरिया सामान्य कैल्शियम होमियोस्टेसिस के शारीरिक अवशेष और संस्कृति उप-उत्पादों का प्रतिनिधित्व करते हैं। प्लस वन 4, ई4417 (2009)।

16. यंग, ​​​​जेडी एट अल। सीरम में कैल्शियम और एपेटाइट के ग्रैन्यूलेशन की विशेषता प्लेमॉर्फिक मिनरलो-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के रूप में और पुटीय नैनोबैक्टीरिया के अग्रदूत के रूप में। प्लस वन 4, ई5421 (2009)।

17. वू, सीवाई, मार्टेल, जे।, यंग, ​​​​डी। एंड यंग, ​​​​जेडी फेटुइन-ए / एल्ब्यूमिन-मिनरल कॉम्प्लेक्स सीरम कैल्शियम ग्रेन्यूल्स और पुटेटिव नैनोबैक्टीरिया से मिलते-जुलते हैं: एक दोहरी अवरोध-सीडिंग अवधारणा का प्रदर्शन। प्लस वन 4, ई8058 (2009)।

18. यंग, ​​​​जेडी और मार्टेल, जे। नैनोबैक्टीरिया का उदय और पतन। विज्ञान एम 302, 52-59 (2010)।

19. मार्टेल, जे., वू, सीवाई एंड यंग, ​​जेडी क्रिटिकल इवैल्यूएशन ऑफ गामा-विकिरणित सीरम का प्रयोग फीडर के रूप में कल्चरल एंड डेमोंस्ट्रेशन ऑफ पुटेटिव नैनोबैक्टीरिया और कैल्सीफाइंग नैनोपार्टिकल्स में किया जाता है। प्लस वन 5, ई10343 (2010)।

20. मार्टेल, जे। एट अल। मानव शरीर के तरल पदार्थों से प्राप्त खनिज नैनोकणों का व्यापक प्रोटिओमिक विश्लेषण और तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया। गुदा बायोकेम 418, 111-125 (2011)।