गर्भावस्था के दौरान सिस्टीन के साथ आहार अनुपूरक नर चूहे की संतानों में मातृ क्रोनिक किडनी रोग-प्रेरित उच्च रक्तचाप से बचाता है: हाइड्रोजन सल्फाइड और माइक्रोबायोटा-व्युत्पन्न ट्रिप्टोफैन मेटाबोलाइट्स का प्रभाव

अमूर्त

मातृ क्रोनिक किडनी रोग (सीकेडी) संतान के उच्च रक्तचाप से जुड़ा हुआ है। आंत माइक्रोबायोम और इसके ट्रिप्टोफैन मेटाबोलाइट्स, नाइट्रिक ऑक्साइड (एनओ), और रेनिन-एंजियोटेंसिन सिस्टम (आरएएस) उच्च रक्तचाप के विकास से निकटता से संबंधित हैं। हाइड्रोजन सल्फाइड (H2S) ने उच्च रक्तचाप-विरोधी प्रभाव दिखाया है। हमारा उद्देश्य यह परीक्षण करना था कि क्या गर्भावस्था में एल- या डी-सिस्टीन अनुपूरण वयस्क संतानों में मातृ सीकेडी द्वारा प्रोग्राम किए गए उच्च रक्तचाप को रोक सकता है और सुरक्षात्मक तंत्र का पता लगाना था। सीकेडी को गर्भवती स्प्रैग डावले चूहों में 3 सप्ताह के लिए 0.5 प्रतिशत एडेनिन आहार द्वारा प्रेरित किया गया था। गर्भावस्था के दौरान L- या D-सिस्टीन को 8 mmol/kg शरीर के वजन/दिन पर पूरक किया गया था। 12 सप्ताह की आयु में नर संतानों की बलि दे दी गई (n=8 प्रति समूह)। मातृ सीकेडी-प्रेरित उच्च रक्तचाप को इसी तरह एल- या डी-सिस्टीन अनुपूरण द्वारा रोका गया था। एल- और डी-सिस्टीन के सुरक्षात्मक प्रभाव ऑक्सीडेटिव तनाव को कम करने, आरएएस को पुनर्संतुलित करने और आंत माइक्रोबायोम को दोबारा आकार देने से संबंधित हैं। एल-सिस्टीन थेरेपी ने वयस्क संतानों को उच्च रक्तचाप से बचाया और एच2एस उत्पादन में वृद्धि, एनओ जैवउपलब्धता की बहाली, लाभकारी जेनेरा ओस्सिलीबैक्टर और ब्यूटिरीकोकस की वृद्धि, इंडोल-उत्पादक जेनेरा एलिस्टिप्स और अक्करमेनसिया की कमी और कई इंडोल मेटाबोलाइट्स की कमी से जुड़ा था। डी-सिस्टीन उपचार से कियूरेनिन मार्ग में कियूरेनिक एसिड, हाइड्रॉक्सीकिन्यूरेनिन और ज़ैंथुरेनिक एसिड में वृद्धि हुई, सेरोटोनिन मार्ग में हाइड्रॉक्सीट्रिप्टोफैन और सेरोटोनिन में कमी आई और बैक्टेरॉइड्स और ओडोरिबैक्टर की प्रचुरता बढ़ी। संक्षेप में, इन परिणामों से पता चलता है कि एल- और डी-सिस्टीन मातृ सीकेडी-प्रेरित संतान उच्च रक्तचाप से रक्षा करते हैं, संभवतः एच2एस उत्पादन को बढ़ाकर, आंत माइक्रोबायोटा और इसके व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स को संशोधित करके, और एनओ और आरएएस की बहाली से।

कीवर्ड

दीर्घकालिक वृक्क रोग; सिस्टीन; उच्च रक्तचाप; स्वास्थ्य और रोग की विकासात्मक उत्पत्ति (DOHaD); रेनिन-एंजियोटेंसिन प्रणाली; आंत माइक्रोबायोटा; हाइड्रोजन सल्फाइड; इण्डोल.

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परिचय

आंकड़ों का बढ़ता समूह गर्भावस्था और स्तनपान को एक महत्वपूर्ण अवधि के रूप में उजागर करता है, जिस पर मातृ अपमान परिणामी संतानों में स्वास्थ्य और बीमारी को आकार दे सकता है, जिसे अब स्वास्थ्य और रोग के विकासात्मक मूल (डीओएचएडी) [1] के रूप में जाना जाता है। क्रोनिक किडनी रोग (सीकेडी) से पीड़ित महिलाओं को न केवल गर्भावस्था संबंधी, बल्कि संतान संबंधी प्रतिकूल परिणामों का भी खतरा होता है [2]। हमारे पूर्व शोध में बताया गया था कि मातृ एडेनिन-प्रेरित सीकेडी वयस्क संतानों में रक्तचाप (बीपी) को बढ़ाता है, जो आंत माइक्रोबायोटा संरचना में परिवर्तन, व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स में परिवर्तन और यूरेमिक विषाक्त पदार्थों में वृद्धि के साथ मेल खाता है [3]।

गर्भावस्था के दौरान, आवश्यक अमीनो एसिड ट्रिप्टोफैन भ्रूण के विकास और प्लेसेंटल प्रोटीन संश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है [4]। ट्रिप्टोफैन चयापचय आंत में तीन प्रमुख मार्गों से होकर गुजरता है, जिससे कियूरेनिन, सेरोटोनिन और इंडोल डेरिवेटिव होते हैं [5]। इंडोल का निर्माण एंजाइम ट्रिप्टोफैनेज़ [6] की क्रिया के माध्यम से होता है। ट्रिप्टोफैन के इंडोल मेटाबोलाइट्स (यानी, इंडोक्सिल सल्फेट और इंडोलेसिटिक एसिड) आंत माइक्रोबायोटा-व्युत्पन्न यूरेमिक विषाक्त पदार्थों का एक प्रमुख समूह हैं, जो सीकेडी के रोगजनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं [6]। ट्रिप्टोफैन-व्युत्पन्न यूरेमिक विषाक्त पदार्थ एनएडीपीएच ऑक्सीडेज के सक्रियण और एंटीऑक्सीडेंट रक्षा तंत्र के निषेध के माध्यम से ऑक्सीडेटिव तनाव उत्पन्न करने के लिए एरिल हाइड्रोकार्बन रिसेप्टर्स (एएचआर) को सक्रिय कर सकते हैं [6,7]। यह सर्वविदित है कि ऑक्सीडेटिव तनाव सीकेडी के रोगजनन और विकासात्मक उत्पत्ति में उच्च रक्तचाप में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है [8]। ट्रिप्टोफैन चयापचय मार्गों की जटिलता को ध्यान में रखते हुए, ट्रिप्टोफैन-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स के विविध गुण कई रोगों के पैथोफिज़ियोलॉजी से जुड़े हैं [5,6,9]। हालाँकि, इस बारे में बहुत कम जानकारी मौजूद है कि क्या ट्रिप्टोफैन-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स वयस्क संतानों में मातृ सीकेडी-प्रेरित उच्च रक्तचाप के लिए फायदेमंद या हानिकारक हैं।

हाल के शोध से पता चलता है कि रिप्रोग्रामिंग रणनीति के रूप में हाइड्रोजन सल्फाइड (H2S) के कुछ स्वास्थ्य लाभ हो सकते हैं, जिसमें एंटी-हाइपरटेंसिव प्रभाव भी शामिल है [10,11]। इसके बीपी-कम करने वाले प्रभावों के पीछे कई तंत्र बताए गए हैं [12,13], जिसमें नाइट्रिक ऑक्साइड (एनओ) की जैवउपलब्धता को बढ़ाना, रेनिन-एंजियोटेंसिन सिस्टम (आरएएस) को संशोधित करना और ऑक्सीडेटिव तनाव को कम करना शामिल है। हमने पहले दिखाया था कि 4 से 6 सप्ताह की उम्र के बीच उच्च नमक-उपचारित अनायास उच्च रक्तचाप से ग्रस्त चूहों (एसएचआर) को एल- या डी-सिस्टीन, एच2एस के पूर्ववर्ती, के साथ पूरक देने पर 12 सप्ताह की उम्र में उच्च रक्तचाप विकसित नहीं हुआ था [14]। एच2एस पीढ़ी के अलावा, एल-सिस्टीन कम ग्लूटाथियोन (जीएसएच) अग्रदूत के रूप में कार्य करता है; जीएसएच एक प्रसिद्ध एंटीऑक्सीडेंट है [15]। तदनुसार, एल- या डी-सिस्टीन में ऑक्सीडेटिव तनाव के प्रतिसंतुलन के रूप में एंटीऑक्सीडेंट गुण होते हैं। क्योंकि H2S में वासोडिलेटर गुण होते हैं और H2S माइक्रोबियल ट्रिप्टोफैनेज गतिविधि को नियंत्रित कर सकता है [10,16], हमारा लक्ष्य यह जांचना है कि क्या मातृ एल- या डी-सिस्टीन अनुपूरण मातृ सीकेडी से प्रेरित उच्च रक्तचाप के खिलाफ संतान चूहों के लिए सुरक्षा प्रदान कर सकता है और फोकस के साथ अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट कर सकता है। आंत माइक्रोबायोटा और ट्रिप्टोफैन-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स पर।

सामग्री और तरीके

1. पशु देखभाल और प्रायोगिक डिजाइन

अध्ययन की शुरुआत में वर्जिन स्प्रैग डावले (एसडी) चूहों का उपयोग किया गया था (8 सप्ताह की आयु, बायोलास्को ताइवान कंपनी लिमिटेड, ताइपेई, ताइवान से खरीदा गया)। आगमन पर, चूहों को हमारी AAALAC पूर्ण-मान्यता पशु सुविधा में रखा गया था। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली प्रक्रियाएं राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के नियमों और चांग गंग मेमोरियल अस्पताल के आईएसीयूसी (परमिट # 2020073102) के अनुसार आयोजित की गईं।

सिस्टैंच अनुपूरक

सीकेडी मॉडल को प्रेरित करने के लिए, मादा एसडी चूहों को हमारे पिछले काम में 3 सप्ताह के लिए 0.5 प्रतिशत एडेनिन के साथ नियमित चाउ (एन {{0}}) या चाउ पूरक प्राप्त हुआ [3]। संभोग होने तक मादा चूहों को नर चूहों के साथ पिंजरे में रखा गया। मैथुन संबंधी प्लग की उपस्थिति से संभोग की पुष्टि के बाद, बांधों को व्यक्तिगत रूप से और यादृच्छिक रूप से चार समूहों में विभाजित किया गया: नियंत्रण, सीकेडी (एडेनिन-उपचारित चूहे), एलसी (एडेनिन-उपचारित चूहों को 8 मिमीोल / किग्रा पर एल-सिस्टीन पूरक प्राप्त हुआ) गर्भावस्था के दौरान शरीर का वजन/दिन), और डीसी (एडेनिन-उपचारित चूहों को गर्भावस्था के दौरान 8 मिमीओल/किग्रा शरीर के वजन/दिन पर डी-सिस्टीन पूरक प्राप्त हुआ)। यहां इस्तेमाल की गई एल-सिस्टीन और डी-सिस्टीन की खुराक चूहों पर किए गए हमारे पिछले अध्ययन पर आधारित है [14]। कूड़े के आकार का मानकीकरण किया गया और कूड़े को आठ पिल्लों तक मार दिया गया। चूँकि पुरुषों में महिलाओं की तुलना में कम उम्र में उच्च रक्तचाप पाया गया है [17], बाद के प्रयोगों में उपयोग के लिए प्रत्येक कूड़े से केवल पुरुष संतान का चयन किया गया था। नर संतान को चार प्रायोगिक समूहों (n {{16%) प्रति समूह) को सौंपा गया था: सी, सीकेडी, एलसी, और डीसी। पिल्लों को 3 सप्ताह में सामान्य चाउ पर छोड़ दिया गया।

सटीकता और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता सुनिश्चित करने के लिए चूहों को प्रयोग से पहले एक सप्ताह के लिए प्रति चूहे 20 चक्रों के लिए सीओडीए गैर-आक्रामक रक्तचाप प्रणाली (एक टेल-कफ विधि, केंट साइंटिफिक कॉर्पोरेशन, टोरिंगटन, सीटी, यूएसए) का आदी बनाया गया था। हमारे प्रोटोकॉल [3] के अनुसार, हर चार सप्ताह में जागरूक चूहों में बीपी मापा जाता था। 12 सप्ताह की आयु में कुल 32 संतानों की बलि दे दी गई। बलि से पहले सुबह शौच के लिए प्रेरित करने के लिए पूंछ को उठाकर और पीछे की ओर घुमाकर मल के नमूने एकत्र किए गए। बाद में मल के नमूनों को निष्कर्षण तक फ्रीजर में -80 ◦C पर संग्रहित किया गया। रक्त के नमूने हेपरिन ट्यूबों में एकत्र किए गए। किडनी को काटा गया और विश्लेषण तक -80 ◦C पर संग्रहीत किया गया। फॉस्फेट-बफ़र्ड सलाइन के छिड़काव के बाद किडनी की कटाई की गई। एक किडनी को हटा दिया गया और कॉर्टेक्स और मेडुला और स्नैप फ्रोज़न में विभाजित कर दिया गया; इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए दूसरी किडनी को ठीक किया गया और हटा दिया गया।

2. उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एचपीएलसी-एमएस/एमएस)

जैसा कि पहले वर्णित है, हमने H2S और थायोसल्फेट के प्लाज्मा स्तर को निर्धारित करने के लिए एगिलेंट 6470 ट्रिपल क्वाड्रुपोल तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी/एमएस, विलमिंगटन, डीई, यूएसए) के साथ मिलकर एगिलेंट टेक्नोलॉजीज 1290 उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) प्रणाली का उपयोग किया। [18]. H2S व्युत्पन्न सल्फाइड डिवाइन (SDB) और थायोसल्फेट व्युत्पन्न पेंटाफ्लोरोबेंज़िल (PFB)-S2O3H निर्धारित किए गए थे। एसडीबी, पीएफबी-एस2ओ3एच और पीएचबी के लिए क्रमशः एम/जेड 415→223, एम/जेड 292.99→81, और एम/जेड 212.99→93 के संक्रमण का उपयोग करके चयनित प्रतिक्रिया निगरानी मोड में लक्ष्य यौगिकों का पता लगाया गया था। हमने आंतरिक मानक के रूप में फिनाइल 4-हाइड्रॉक्सीबेन्जोएट (पीएचबी) का उपयोग किया।

3. तरल क्रोमैटोग्राफ टेंडेम-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस/एमएस)

ट्रिप्टोफैन और इसके मेटाबोलाइट्स के प्लाज्मा स्तर का विश्लेषण एलसी-एमएस/एमएस द्वारा किया गया था। कुल 13 ट्रिप्टोफैन मेटाबोलाइट्स निर्धारित किए गए, जिनमें किन्यूरेनिक एसिड, ज़ैंथ्यूरेनिक एसिड, 3-हाइड्रॉक्सीकिन्यूरेनिन (3-HKN), 3-हाइड्रॉक्सी एंथ्रानिलिक एसिड (3-HAA), {{ 6}}हाइड्रॉक्सीट्रिप्टोफैन (5-HTP), सेरोटोनिन, हाइड्रॉक्सी इंडोल एसिटिक एसिड (5-HIAA), एन-एसिटाइलसेरोटोनिन (N-AS), इंडोक्सिल सल्फेट (IS), इंडोल-3-एसिटामाइड (IAM), इंडोलएसिटिक एसिड (ILA), इंडोल-3-कार्बोक्साल्डिहाइड (ICA), और इंडोलएसिटिक एसिड (IAA)। प्लाज्मा नमूने (200 μL) को 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़ा गया जिसमें 400 μL आंतरिक मानक मिश्रण समाधान, 200 μL एसीटोनिट्राइल और 400 μL मेथनॉल शामिल थे। ट्यूबों को 4 ◦C पर 14,{21}} आरपीएम पर 15 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज पर रखा गया था। सतह पर तैरनेवाला लिया गया और सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा 100 μL तक केंद्रित किया गया। बाद में, 5 एमएम अमोनियम एसीटेट जलीय घोल और मेथनॉल (9:1, वी/वी) का 100 μL जोड़ा गया और अच्छी तरह मिलाया गया। फिर नमूने को 2 μL पर LC-MS/MS में इंजेक्ट किया गया। वाटर एक्विटी यूपीएलसी एचएसएस टी3 कॉलम (2.1 मिमी × 100 मिमी; 1.8 उम; एगिलेंट टेक्नोलॉजीज) से सुसज्जित एगिलेंट 1200 इन्फिनिटी II एचपीएलसी प्रणाली का उपयोग करके क्रोमैटोग्राफी पर पृथक्करण किया गया था। घटकों को विलायक ए (5 मिमी अमोनियम एसीटेट जलीय घोल) और विलायक बी (एसीटोनिट्राइल) के एक ग्रेडिएंट द्वारा निस्तारित किया गया था। एगिलेंट 1200 इन्फिनिटी II एचपीएलसी सिस्टम को एगिलेंट 6470ए ट्रिपल क्वाड्रुपोल एलसी/एमएस (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज) के साथ जोड़ा गया था। विशेषता अग्रदूतों और उत्पाद आयनों के साथ मल्टीपल रिएक्शन मॉनिटरिंग (एमआरएम) डिटेक्शन मोड में ट्रिप्टोफैन मेटाबोलाइट्स के लिए एलुएट की निगरानी की गई थी।

सिस्टैंच अर्क

4. मात्रात्मक आरटी-पीसीआर

चूहे के गुर्दे के कॉर्टेक्स ऊतक को लाइसिस बफर में समरूप बनाया गया था और कुल आरएनए को ट्राइज़ोल विधि (इन्विट्रोजन, कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) का उपयोग करके निकाला गया था, जैसा कि पहले बताया गया है [3]। दो-चरणीय मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर को डुप्लिकेट में iCycler iQ रीयल-टाइम पीसीआर डिटेक्शन सिस्टम (बायो-रेड, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) पर क्वांटिटेक्ट एसवाईबीआर ग्रीन पीसीआर किट (क्यूजेन, वालेंसिया, सीए, यूएसए) का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया था। H2S उत्पादन में शामिल कुल चार जीन निर्धारित किए गए, जिनमें सिस्टैथिओनिन-सिंथेज़ (CBS), सिस्टैथिओनिन-लिसेज़ (CSE), 3-मर्कैप्टो पाइरूवेट सल्फ़रट्रांसफेरेज़ (3MST), और डी-एमिनो एसिड ऑक्सीडेज़ (DAO) शामिल हैं। हमने कई रेनिन-एंजियोटेंसिन सिस्टम (आरएएस) जीनों को भी मापा, जिनमें रेनिन, (प्रो)रेनिन रिसेप्टर (पीआरआर), एंजियोटेंसिन-कन्वर्टिंग एंजाइम (एसीई), एंजियोटेंसिन कनवर्टिंग एंजाइम (एसीई2), एंजियोटेंसिन II टाइप 1 रिसेप्टर शामिल हैं। (एटी1आर), एंजियोटेंसिन II टाइप 2 रिसेप्टर (एटी2आर), और एंजियोटेंसिन-(1-7)/मास रिसेप्टर (एमएएस)। हमने आंतरिक नियंत्रण के रूप में 18S राइबोसोमल RNA (R18S) संदर्भ जीन का उपयोग किया। प्रत्येक नमूना दो प्रतियों में चलाया गया। प्राइमरों को जीनटूल सॉफ्टवेयर (बायोटूल्स, एडमोंटन, एबी, कनाडा) का उपयोग करके डिजाइन किया गया था और तालिका 1 में दिखाया गया है। सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए, तुलनात्मक थ्रेशोल्ड चक्र (सीटी) विधि का उपयोग किया गया था। नियंत्रण के सापेक्ष प्रत्येक एमआरएनए के लिए गुना परिवर्तन की गणना सूत्र 2−∆∆Ct का उपयोग करके की गई थी।

5. आंत-माइक्रोबायोटा संरचना का विश्लेषण

जैसा कि पहले बताया गया है [3], जमे हुए मल नमूनों से बैक्टीरिया डीएनए को इलुमिना मिसेक प्लेटफॉर्म (इलुमिना, सैन डिएगो, सीए, यूएसए) का उपयोग करके बायोटूल्स कंपनी लिमिटेड (ताइपेई, ताइवान) में 16एस आरआरएनए मेटागेनोमिक्स विश्लेषण द्वारा निकाला और विश्लेषण किया गया था। अनुक्रमों को QIIME संस्करण 1.9.1 का उपयोग करके संसाधित किया गया था। 97 प्रतिशत या उससे अधिक की दूरी-आधारित समानता वाले अनुक्रमों को USEARCH एल्गोरिदम द्वारा परिचालन टैक्सोनोमिक इकाइयों (ओटीयू) में क्लस्टर किया गया था। फाइलोजेनेटिक संबंधों का निर्माण फास्टट्री के साथ एक प्रतिनिधि अनुक्रम संरेखण के आधार पर किया गया था। हमने माइक्रोबियल समुदायों के लिए - और -विविधता के पैटर्न की तुलना की। अल्फा विविधता को ACE सूचकांक द्वारा मापा गया था। हमने समानता के विश्लेषण (एएनओएसआईएम) और आंशिक न्यूनतम वर्ग विभेदक विश्लेषण (पीएलएस-डीए) का उपयोग करके समूहों में आंत माइक्रोबायोटा की विविधता का आकलन किया। उच्च-आयामी बायोमार्कर की खोज के लिए रैखिक विभेदक विश्लेषण प्रभाव आकार (LEfSe) का मूल्यांकन किया गया था।

6. नाइट्रिक ऑक्साइड पैरामीटर्स का विश्लेषण

हमने O-phthaaldehyde/3-mercaptopropionic एसिड (OPA/ जैसा कि पहले वर्णित है [3] प्लाज्मा में एनओ-संबंधित मापदंडों को मापने के लिए 3-एमपीए) डेरिवेटिव। इन मापदंडों में एल-आर्जिनिन और एनओ सिंथेज़ अवरोधक असममित और सममित डाइमिथाइलार्गिनिन (एडीएमए और एसडीएमए) शामिल थे। मानकों में 1-100 एमएम एल-आर्जिनिन, 0.5-5 एमएम एडीएमए, और 0.5-5 एमएम एसडीएमए शामिल थे।

7. वृक्क H2S-विमोचन गतिविधि

जैसा कि पहले बताया गया है, किडनी की एच2एस-रिलीजिंग गतिविधि को मेथिलीन ब्लू विधि का उपयोग करके मापा गया था [12]। एकाग्रता की गणना NaHS (3.125-250 µM) के अंशांकन वक्र के विरुद्ध की गई और इसे µM/ग्राम प्रोटीन/मिनट के रूप में दर्शाया गया। सभी नमूने दो प्रतियों में चलाए जा रहे थे।

8. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री स्टेनिंग 8-OHdG के लिए

8-Hydroxydexyguanosine (8-OHdG) एक डीएनए ऑक्सीकरण उत्पाद है जिसे डीएनए क्षति का पता लगाने के लिए निर्धारित किया गया था। जैसा कि हमने पहले बताया था [14], 4 µm मोटाई पर खंडित पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक को ज़ाइलीन में डीपराफिनाइज़ किया गया था और फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा में एक वर्गीकृत इथेनॉल श्रृंखला में पुनर्जलीकरण किया गया था। इम्युनोब्लॉट (BIOTnA बायोटेक, काऊशुंग, ताइवान) के साथ अवरुद्ध करने के बाद, अनुभागों को कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए एंटी {7}}OHdG एंटीबॉडी (1: 100, JaICA, शिज़ुओका, जापान) के साथ ऊष्मायन किया गया था। क्रोमोजेन के रूप में पॉलिमर-हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) लेबलिंग किट (बीआईओटीएनए बायोटेक) और 3, 30 - डायमिनोबेंज़िडाइन (डीएबी) का उपयोग करके इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधलापन का पता लगाया गया था। प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन को छोड़कर समान धुंधलापन का एक नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग किया गया था। जैसा कि हमने पहले बताया था, वृक्क अनुभागों में प्रति सूक्ष्म क्षेत्र में ओएचडीजी-पॉजिटिव कोशिकाओं का मात्रात्मक विश्लेषण किया गया था [14]।

9. सांख्यिकीय विश्लेषण

सभी डेटा को माध्य ± माध्य की मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। जहां उपयुक्त हो, एक-तरफ़ा एनोवा या दो-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण किए गए। तुकी का पोस्ट हॉक परीक्षण लागू किया गया जहां कई तुलनाएं की गईं। बीपी का विश्लेषण दो-तरफा दोहराया-माप एनोवा और तुकी के पोस्ट हॉक परीक्षण द्वारा किया गया था। आर सॉफ्टवेयर का उपयोग करके आंत माइक्रोबायोटा का जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण किया गया। सामान्यीकृत ओटीयू बहुतायत प्रोफ़ाइल के आधार पर, माइक्रोबियल-विविधता को एक-तरफ़ा एनोवा द्वारा मापा गया था, जिसके बाद एसीई सूचकांक का उपयोग करके झूठी खोज दर (एफडीआर) सुधार किया गया था। आर सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पीएलएस-डीए द्वारा समूहों के बीच माइक्रोबियल समुदायों की असमानता का मूल्यांकन किया गया था। विविधता विश्लेषण में नमूना क्लस्टरिंग का परीक्षण आर सॉफ्टवेयर में शाकाहारी पैकेज का उपयोग करके एएनओएसआईएम द्वारा किया गया था। विभिन्न समूहों के बीच भेदभाव के लिए जिम्मेदार प्रमुख जीवाणु टैक्सा की पहचान रैखिक विभेदक विश्लेषण प्रभाव आकार (एलईएफएसई) एल्गोरिदम का उपयोग करके की गई थी। रैखिक विभेदक विश्लेषण (एलडीए) स्कोर थ्रेशोल्ड> 3 और पी <{9}}.05 ने उल्लेखनीय रूप से समृद्ध माइक्रोबियल समुदायों का संकेत दिया। महत्व स्तर 5 प्रतिशत स्तर पर निर्धारित किया गया था। एसपीएसएस सॉफ्टवेयर (एसपीएसएस इंक, शिकागो, आईएल, यूएसए) का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण किए गए।

सिस्टैंच पाउडर

बहस

हमारा अध्ययन मातृ सीकेडी-प्रेरित संतान उच्च रक्तचाप से बचाने के लिए मातृ एल- या डी-सिस्टीन थेरेपी के लाभकारी प्रभावों में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, जिसमें एच2एस सिग्नलिंग मार्ग और आंत रोगाणुओं से प्राप्त ट्रिप्टोफैन मेटाबोलाइट्स पर विशेष जोर दिया गया है। हमारे मुख्य निष्कर्ष इस प्रकार वर्णित हैं: (1) ) मातृ सीकेडी-प्रेरित उच्च रक्तचाप को इसी तरह गर्भावस्था में एल- या डी-सिस्टीन अनुपूरण द्वारा रोका गया था; (2) एल-सिस्टीन थेरेपी ने वयस्क संतानों को उच्च रक्तचाप से बचाया और प्लाज्मा एचएस और थायोसल्फेट स्तर में वृद्धि से संबंधित था; (3) सीकेडी की तुलना में, डी-सिस्टीन उपचार ने कियूरेनिन मार्ग में ट्रिप्टोफैन मेटाबोलाइट्स को बढ़ाया, लेकिन सेरोटोनिन मार्ग में उन्हें कम कर दिया (4) एल- और डी-सिस्टीन दोनों का सुरक्षात्मक प्रभाव गुर्दे के ऑक्सीडेटिव तनाव में कमी के साथ जुड़ा हुआ था, 8-ओएचडीजी धुंधलापन के रूप में दर्शाया गया; (5) मातृ सीकेडी और एल- और डी-सिस्टीन उपचार ने संतानों के आंत माइक्रोबायोटा प्रोफाइल को अलग-अलग आकार दिया, जिसके परिणामस्वरूप चार अलग-अलग एंटरोटाइप प्राप्त हुए; (6) डी-सिस्टीन के लाभकारी प्रभाव जेनेरा बैक्टेरॉइड्स और ओडोरिबैक्टर बहुतायत की वृद्धि के लिए प्रासंगिक थे; (7) एल-सिस्टीन का लाभकारी प्रभाव एल-आर्जिनिन स्तर और प्लाज्मा में एल-आर्जिनिन-टू-एडीएमए अनुपात की बहाली से जुड़ा था; और (8) एल- और डी-सिस्टीन थेरेपी दोनों ने आरएएस के पुनर्संतुलन के साथ मेल खाते हुए मातृ सीकेडी द्वारा क्रमादेशित संतान उच्च रक्तचाप की रक्षा की।

एसएचआर में हमारे पूर्व अध्ययन के समर्थन में [14], एल- और डी-सिस्टीन अनुपूरण ने सीकेडी वाली माताओं से पैदा हुई वयस्क संतानों में समान बीपी-कम करने वाले प्रभावों का खुलासा किया। ध्यान दें, गर्भावस्था के दौरान मां चूहों को एल- या डी-सिस्टीन अनुपूरण दिया गया था, इसलिए वयस्क संतानों में बीपी की कमी तीव्र प्रभाव के बजाय रीप्रोग्रामिंग के कारण हुई थी। हमारा अध्ययन और सबूत प्रदान करता है कि विशिष्ट अमीनो एसिड के साथ प्रारंभिक जीवन अनुपूरण प्रोग्रामिंग प्रक्रियाओं को उलट सकता है और उच्च रक्तचाप के संबंध में लाभ प्रदान कर सकता है [21]।

इस अध्ययन में देखी गई बीपी की कमी एच2एस [10,11,22] के वैसोरेलैक्सेंट गुणों को प्रदर्शित करने वाले पिछले निष्कर्षों के अनुरूप है। H2S को सब्सट्रेट L- या D-सिस्टीन [10,11,22] का उपयोग करके अंतर्जात रूप से उत्पादित किया जा सकता है। हमारे डेटा से, एल-सिस्टीन उपचार ने वृक्क एच2एस-उत्पादक एंजाइम सीबीएस और सीएसई अभिव्यक्ति, वृक्क एच2एस-विमोचन गतिविधि, साथ ही एच2एस और थायोसल्फेट के प्लाज्मा स्तर में वृद्धि की। डी-सिस्टीन ने प्लाज्मा थायोसल्फेट स्तर में सीकेडी-प्रेरित कमी को बहाल किया, जबकि गुर्दे के एच2एस-उत्पादक एंजाइमों पर इसका बहुत कम प्रभाव पड़ा। पिछले अध्ययन की रिपोर्ट के विपरीत कि वृक्क डी-सिस्टीन मार्ग, एल-सिस्टीन मार्ग [23] की तुलना में एच2एस-उत्पादक गतिविधि में 80-गुना अधिक है, हमारे परिणामों से पता चला कि उन दोनों में एच2एस-उत्पादक का विभेदक विनियमन शामिल है। मार्ग लेकिन उनके लाभकारी प्रभाव तुलनीय हैं।

एल- और डी-सिस्टीन के लाभों में आंत माइक्रोबायोम को व्यवस्थित करने की उनकी क्षमता शामिल हो सकती है, जिसमें कुछ लाभकारी रोगाणुओं की प्रचुरता को बढ़ाना और ट्रिप्टोफैन-मेटाबोलाइजिंग बैक्टीरिया की मध्यस्थता शामिल है। उच्च विविधता को उच्च रक्तचाप के लिए अधिक फायदेमंद दिखाया गया है [19]; हालाँकि, हमने देखा कि चारों समूहों के बीच विविधता भिन्न नहीं थी। यद्यपि सीकेडी समूह में देखा गया बढ़ा हुआ एफ/बी अनुपात पिछले निष्कर्षों के अनुरूप है, जिसमें दिखाया गया है कि यह अनुपात उच्च रक्तचाप से जुड़े माइक्रोबियल मार्कर के रूप में काम कर सकता है [19], हमारे डेटा ने उच्च रक्तचाप के बिना एलसी समूह में भी बढ़ा हुआ अनुपात दिखाया है।

इस कार्य के आंकड़ों से पता चला कि एल- या डी-सिस्टीन अनुपूरण ने ब्यूटिरिकोकस, बैक्टेरॉइड्स और ओडोरिबैक्टर एसपीपी जैसे कई लाभकारी बैक्टीरिया की प्रचुरता को बढ़ाया। [24,25]। यह परिणाम आश्चर्यजनक नहीं था क्योंकि पिछले अध्ययन में ब्यूटायरेट-उत्पादक जीनस ओडोरिबैक्टर की प्रचुरता को बीपी के साथ विपरीत रूप से सहसंबद्ध दिखाया गया था [26]। उच्च रक्तचाप रिप्रोग्रामिंग पर एल- या डी-सिस्टीन के लाभकारी प्रभाव, कम से कम आंशिक रूप से, लाभकारी रोगाणुओं की वृद्धि से जुड़े हैं।

हमारे डेटा से पता चला है कि मातृ सीकेडी और सिस्टीन उपचार का इंडोल और सेरोटोनिन मार्गों से प्राप्त संतानों के ट्रिप्टोफैन मेटाबोलाइट्स पर अलग-अलग प्रभाव पड़ता है। विशेष रूप से, हमारे डेटा से पता चला है कि मातृ सीकेडी के कारण प्लाज्मा आईएस, आईएएम और आईएए स्तर में कमी आई है, जो सभी इंडोल डेरिवेटिव हैं। आईएस और आईएए दोनों ट्रिप्टोफैन से प्राप्त प्रसिद्ध यूरेमिक विषाक्त पदार्थ हैं, जो एरिल हाइड्रोकार्बन रिसेप्टर (एएचआर) को बांध सकते हैं, जिनकी सक्रियता उच्च रक्तचाप के बढ़ते जोखिम से संबंधित है [27]। एएचआर सिग्नलिंग के सक्रिय होने से ऑक्सीडेटिव तनाव और सूजन उत्पन्न हो सकती है [6,7,28-30], जिसके द्वारा ट्रिप्टोफैन-व्युत्पन्न यूरीमिक विषाक्त पदार्थ हृदय रोग के विकास से निकटता से जुड़े होते हैं। एएचआर लिगेंड्स के संपर्क में आरओएस-उत्पन्न करने वाले एंजाइमों की अभिव्यक्ति को बढ़ाने, आरओएस उत्पादन में वृद्धि, प्रो-इंफ्लेमेटरी टी हेल्पर 17 अक्षों को ट्रिगर करने और प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स उत्पादन को प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है [29,30]। इसलिए, यह स्पष्ट करने के लिए अतिरिक्त अध्ययन की आवश्यकता है कि क्या ट्रिप्टोफैन-व्युत्पन्न यूरीमिक विषाक्त पदार्थों और एएचआर के बीच परस्पर क्रिया ऑक्सीडेटिव तनाव और सूजन के माध्यम से क्रमादेशित उच्च रक्तचाप के रोगजनन में भूमिका निभाती है। सीकेडी बांधों से पैदा हुई संतानों में देखी गई आईएस, आईएएम और आईएए की कमी उच्च रक्तचाप के साथ मेल खाती है, यह सुझाव देती है कि इंडोल मेटाबोलाइट्स में कमी एक ऑफसेटिंग तंत्र हो सकती है लेकिन सीकेडी-प्रेरित उच्च रक्तचाप का कारण नहीं हो सकती है।

कई प्रकार के आंतों के बैक्टीरिया को ट्रिप्टोफैन चयापचय में शामिल किया गया है [31-33], जैसे एलिस्टिप्स, अक्करमेन्सिया और बैक्टेरॉइड्स। हमने पाया कि एल-सिस्टीन उपचार के जवाब में इंडोल-उत्पादक जेनेरा एलिस्टिप्स और अक्करमेनसिया अपेक्षाकृत कम हो गए थे। जैसा कि एल-सिस्टीन ने जीनस स्तर पर एलिस्टिप्स और अक्करमेन्सिया को कम कर दिया, ट्रिप्टोफैन मेटाबोलाइट्स, आईएएम और आईएए की कमी संभवतः इंडोल-उत्पादक आंत रोगाणुओं की कम बहुतायत के कारण थी। यह ध्यान में रखते हुए कि एच2एस इंडोल में ट्रिप्टोफैन के क्षरण को प्रभावित करने के लिए माइक्रोबियल ट्रिप्टोफैनेज़ गतिविधि को नियंत्रित कर सकता है [11,16], हमारे परिणाम एल-सिस्टीन उपचार द्वारा आंत माइक्रोबायोटा में हेरफेर के माध्यम से इंडोल मेटाबोलाइट्स के उत्पादन को बदलने की व्यवहार्यता प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, हमने देखा कि एल- और डी-सिस्टीन दोनों ने प्लाज्मा सेरोटोनिन के स्तर को समान रूप से कम कर दिया। पिछले एक अध्ययन में बताया गया था कि फॉर्मूला-आहार-संचालित माइक्रोबायोटा ट्रिप्टोफैन चयापचय मार्ग को सेरोटोनिन से ट्रिप्टामाइन में स्थानांतरित कर सकता है, जो कि बढ़े हुए जीनस ब्यूट्रीसिमोनस के साथ मेल खाता है लेकिन होल्डेमेनिया और अक्करमेनसिया में कमी आई है [34]। इसलिए, यह स्पष्ट करने के लिए अतिरिक्त अध्ययन की आवश्यकता है कि कैसे H2S ट्रिप्टोफैन के विभिन्न चयापचय मार्गों को निर्देशित करने के लिए कुछ ट्रिप्टोफैन-मेटाबोलाइजिंग रोगाणुओं की मध्यस्थता करता है।

सिस्टैंच कैप्सूल

पहले के शोध से पता चला है कि उच्च रक्तचाप पर H2S का लाभकारी प्रभाव वैसोकॉन्स्ट्रिक्टर्स (जैसे, आरएएस) और वैसोडिलेटर्स (जैसे, NO) के बीच एक नए संतुलन के रीसेट होने के कारण हो सकता है [12,13]। इस कार्य में हमारे डेटा ने प्रदर्शित किया कि एल-सिस्टीन ने न केवल NO जैवउपलब्धता में सुधार किया बल्कि AT2R और MAS में भी वृद्धि की। यह ज्ञात है कि एटी2आर और एमएएस आरएएस की सुरक्षात्मक शाखा का हिस्सा हैं, जो एंजियोटेंसिन II (एंग II) [35] द्वारा मध्यस्थता वाले हानिकारक प्रभावों को संतुलित कर सकते हैं। दूसरी ओर, डी-सिस्टीन ने रेनिन, पीआरआर और एटी1आर की रीनल एमआरएनए अभिव्यक्ति को कम कर दिया। रेनिन/पीआरआर अक्ष और एंग II/एटी1आर अक्ष दोनों को ध्यान में रखते हुए उच्च रक्तचाप को बढ़ावा देते हैं, यह संभव है कि डी-सिस्टीन अपने बीपी-कम करने वाले लाभ के लिए आरएएस को प्रभावित कर सकता है।

इस मॉडल में क्रमादेशित उच्च रक्तचाप पर एल- और डी-सिस्टीन थेरेपी का एक अन्य सुरक्षात्मक तंत्र ऑक्सीडेटिव तनाव में कमी के साथ जुड़ा हो सकता है। हमने देखा कि एल- और डी-सिस्टीन थेरेपी दोनों ने संतानों की किडनी में सीकेडी-प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव में सुधार किया, जिसे 8-ओएचडीजी धुंधलापन के रूप में दर्शाया गया है। हमारा डेटा पूर्व शोध के अनुरूप है जो दर्शाता है कि किडनी के विकास के दौरान क्रमादेशित उच्च रक्तचाप के रोगजनन में ऑक्सीडेटिव तनाव शामिल है [8]।

इस अध्ययन की कुछ सीमाओं को स्वीकार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, हमने मुख्य रूप से किडनी पर ध्यान केंद्रित किया। इसलिए, इस बारे में बहुत कम जानकारी थी कि मातृ सीकेडी-प्रेरित उच्च रक्तचाप के खिलाफ एल- या डी-सिस्टीन के लाभकारी प्रभाव में अन्य बीपी-नियंत्रित अंग क्या भूमिका निभाते हैं। दूसरे, हमने विकास के विभिन्न चरणों में माइक्रोबायोटा परिवर्तनों की जांच नहीं की। वयस्क संतान में आंत के माइक्रोबियल परिवर्तन मातृ सीकेडी और सिस्टीन अनुपूरण के जवाब में प्राथमिक क्रमादेशित प्रक्रिया के बजाय प्रसवोत्तर प्लास्टिसिटी को प्रतिबिंबित कर सकते हैं। इसके अलावा, हमारी जानकारी के अनुसार, सभी ट्रिप्टोफैन मेटाबोलाइट्स के एक साथ निर्धारण के लिए कोई अध्ययन रिपोर्ट नहीं किया गया है। यद्यपि हमारी विकसित विधि तीन अलग-अलग ट्रिप्टोफैन चयापचय मार्गों से संबंधित 13 मेटाबोलाइट्स की मात्रा निर्धारित कर सकती है, फिर भी क्विनोलिनिक एसिड और मेलाटोनिन जैसे कुछ महत्वपूर्ण मेटाबोलाइट्स हैं, जिन्हें बाहर रखा गया है। अधिकांश ट्रिप्टोफैन मेटाबोलाइट्स की निगरानी के लिए विधि में सुधार करने के लिए अतिरिक्त अध्ययन की आवश्यकता है और ट्रिप्टोफैन का चयापचय तीन चयापचय मार्गों के बीच कैसे भिन्न होता है, जो सीकेडी और संबंधित बीमारियों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। अंत में, माइक्रोबायोटा-होस्ट क्रॉसस्टॉक में जटिल ट्रिप्टोफैन चयापचय पर विचार करते हुए, यह निर्धारित करना कि कौन से ट्रिप्टोफैन मेटाबोलाइट्स मुख्य रूप से मातृ एल- और डी-सिस्टीन उपचार के लाभकारी प्रभाव को बढ़ावा देते हैं, आगे की जांच के योग्य है।

निष्कर्ष

निष्कर्ष में, वर्तमान अध्ययन के नतीजे बताते हैं कि एल- या डी-सिस्टीन के साथ आहार अनुपूरक वयस्क संतानों को मातृ सीकेडी-प्रेरित उच्च रक्तचाप से बचाता है। सिस्टीन अनुपूरण के ये लाभकारी प्रभाव एच2एस उत्पादन में वृद्धि, लाभकारी रोगाणुओं के संवर्धन, ट्रिप्टोफैन मेटाबोलाइजिंग बैक्टीरिया और ट्रिप्टोफैन मेटाबोलाइट्स में परिवर्तन, ऑक्सीडेटिव तनाव में कमी, एनओ जैवउपलब्धता की बहाली और आरएएस के पुनर्संतुलन से जुड़े थे। ट्रिप्टोफैन मेटाबोलाइट्स आंत-किडनी संचार के मध्यस्थ के रूप में कार्य कर सकते हैं, और सीकेडी में आंत माइक्रोबायोटा में परिवर्तन के माध्यम से ट्रिप्टोफैन चयापचय के विनियमन पर अध्ययन की तत्काल आवश्यकता है। उच्च रक्तचाप की प्रोग्रामिंग में शामिल एच2एस और ट्रिप्टोफैन चयापचय के पीछे के तंत्र की अधिक समझ की ओर बढ़ना उच्च रक्तचाप की वैश्विक महामारी को रोकने के लिए एक आदर्श रिप्रोग्रामिंग हस्तक्षेप विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है।

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2 स्कूल ऑफ फार्मेसी, काऊशुंग मेडिकल यूनिवर्सिटी, काऊशुंग 807, ताइवान

3 समुद्री भोजन विज्ञान विभाग, राष्ट्रीय काऊशुंग विज्ञान और प्रौद्योगिकी विश्वविद्यालय, काऊशुंग 811, ताइवान; chihyaohou@webmail.nkmu.edu.tw

4 पर्यावरण विष और उभरते-संदूषक अनुसंधान केंद्र, चेंग शिउ विश्वविद्यालय, काऊशुंग 833, ताइवान; guoping@csu.edu.tw (जी.-पीसी-सी.); linsufan2003@csu.edu.tw (एसएल)

5 सुपर माइक्रो मास रिसर्च एंड टेक्नोलॉजी सेंटर, चेंग शिउ यूनिवर्सिटी, काऊशुंग 833, ताइवान

6 पर्यावरण विष और उभरते-संदूषक संस्थान, चेंग शिउ विश्वविद्यालय, काऊशुंग 833, ताइवान

7 बाल रोग विभाग, काऊशुंग चांग गुंग मेमोरियल अस्पताल और चांग गुंग यूनिवर्सिटी कॉलेज ऑफ मेडिसिन, काऊशुंग 833, ताइवान

8 इंस्टीट्यूट फॉर ट्रांसलेशनल रिसर्च इन बायोमेडिसिन, काऊशुंग चांग गंग मेमोरियल हॉस्पिटल और चांग गंग यूनिवर्सिटी कॉलेज ऑफ मेडिसिन, काऊशुंग 833, ताइवान