उच्च ग्लूकोज उत्तेजना के तहत एचके -2 कोशिकाओं और एक्सोसोम के विभेदक लिपिडोमिक्स

अमूर्त

असामान्य सेलुलर लिपिड चयापचय मधुमेह गुर्दे की बीमारी (डीकेडी) की घटना और प्रगति में बहुत महत्वपूर्ण है। हालाँकि, वृक्क ट्यूबलर कोशिकाओं और उनके एक्सोसोम की उच्च ग्लूकोज उत्तेजना द्वारा लिपिड संरचना और विभेदक अभिव्यक्ति, जो डीकेडी के विकास का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है, काफी हद तक अज्ञात है। इस अध्ययन में, आइसोटोप लेबलिंग और टेंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा लक्षित लिपिड विश्लेषण के आधार पर, कुल 421 और 218 लिपिड प्रजातियों को क्रमशः एचके {2}} कोशिकाओं और एक्सोसोम में मात्राबद्ध किया गया था। अधिक महत्वपूर्ण बात यह है कि परिणामों से पता चला कि GM3 d18:1/22:0, GM3 d18:1/16:0, GM3 d18:0/16:0, GM3 d18:1/22:1 में उल्लेखनीय वृद्धि हुई, जबकि LPE18:1, LPE, CL66:4 (16:1), BMP36:3, CL70:7 (16:1), CL74:8 (16) :1) उच्च ग्लूकोज-उत्तेजित एचके{{4{{90}}}} कोशिकाओं में उल्लेखनीय रूप से कमी आई थी। इसके अलावा, PG36:1, FFA22:5, PC38:3, SM d18:1/16:1, CE-16:1, CE-18:3, CE-20:5, और CE-22:6 में उल्लेखनीय वृद्धि हुई, जबकि GM3 d18:1/24:1, GM3 में उच्च ग्लूकोज-उत्तेजित HK-2 कोशिकाओं द्वारा स्रावित एक्सोसोम में उल्लेखनीय रूप से कमी आई। इसके अलावा, एचके -2 कोशिकाओं और एलपीए18:2, एलपीआई22:5, पीजी32:2, एफएफए16:1, जीएम3 डी18:1/18:1 की तुलना में एक्सोसोम में टीएजी, पीसी और सीएल में काफी कमी आई थी। , GM3 d18:1/20:1, GM3 d18:0/20:0, PC40:6p, TAG52:1(18:1), TAG52:0(18:0), CE{{101 }}:5, CE-20:4, CE-22:6 केवल एक्सोसोम में पाए गए। इसके अलावा, उच्च ग्लूकोज अवस्था के तहत एचके -2 कोशिकाओं में पीआई4पी की अभिव्यक्ति कम हो गई। ये डेटा डीकेडी के तंत्र की खोज के लिए नए लक्ष्य प्रदान करने में उपयोगी हो सकते हैं।

कीवर्ड

लक्षित लिपिडोमिक्स; गुर्दे की नली; एक्सोसोम; मधुमेह गुर्दे की बीमारी.

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परिचय

लिपिड चयापचय संबंधी विकार मधुमेह गुर्दे की बीमारी (डीकेडी) की घटना और विकास में भाग लेते हैं [1, 2]। उच्च ग्लूकोज अवस्था के तहत गुर्दे में सेलुलर लिपिड संरचना में परिवर्तन से सक्रिय ऑक्सीजन उत्पादन में वृद्धि, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन और यहां तक ​​कि एपोप्टोसिस उत्पन्न हो सकता है [3, 4, 5, 6]। हालाँकि कई शोधकर्ताओं ने डीकेडी के विकास और प्रगति में वृक्क नलिकाओं की महत्वपूर्ण भूमिका को स्वीकार किया है, कुछ अध्ययनों ने वृक्क नलिकाओं में समग्र लिपिड अभिव्यक्ति या उच्च ग्लूकोज उत्तेजना के तहत परिवर्तनों को संबोधित किया है [7, 8]। इसलिए, वृक्क नलिकाओं में लिपिड के बारे में व्यापक जानकारी प्राप्त करना बहुत महत्वपूर्ण है, इस प्रकार डीकेडी के रोगजनन में लिपिड की भूमिका को और अधिक स्पष्ट किया जा सकता है।

हाल के वर्षों में, डीकेडी के विकास में एक्सोसोम की भूमिका ने अधिक से अधिक ध्यान आकर्षित किया है। एक्सोसोम जो इंट्रासेल्युलर तनाव को दूर करने के लिए ऑटोफैगी-लाइसोसोम मार्ग के साथ सहयोग कर सकते हैं, सेलुलर होमियोस्टैसिस को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं [9, 10]। इस बीच, वे कोशिकाओं के बीच सामग्री हस्तांतरण और सूचना संचार के लिए वाहक के रूप में कार्य करते हैं [11]। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि नेफ्रॉन में ट्यूबलर कोशिकाओं और अन्य गुर्दे की कोशिका प्रकारों के बीच क्रॉसस्टॉक की रोग की प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका हो सकती है [12, 13]। यद्यपि एक्सोसोम की लिपिड संरचना उनके गुणों को प्रभावित कर सकती है, लेकिन प्रोटीन और आरएनए की तुलना में इसका अध्ययन कुछ हद तक किया गया है [14]। चूँकि विभिन्न कोशिकाओं द्वारा स्रावित एक्सोसोम लिपिड प्रकार, सामग्री और कार्यों में भिन्न होते हैं, उच्च ग्लूकोज अवस्था के तहत वृक्क नलिकाओं द्वारा स्रावित एक्सोसोम की लिपिड संरचना और विभेदक अभिव्यक्ति को स्पष्ट करना वृक्क नलिकाओं से संबंधित एक्सोसोमल संचार के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए एक सैद्धांतिक आधार प्रदान करेगा। .

इसमें, हमने उच्च ग्लूकोज उत्तेजना के तहत गुर्दे की नलिकाओं और उनके एक्सोसोम का एक विभेदक लिपिडोमिक विश्लेषण प्रस्तुत किया और कार्डियोलिपिन (सीएल), मोनोसियालोडीहेक्सोसिल गैंग्लियोसाइड (जीएम 3), और कोलेस्टेरिल एस्टर (सीई) की विभेदित रूप से व्यक्त लिपिड प्रजातियों का पता लगाया। हमने शुरुआत में एक्सोसोमल उत्पादन में फॉस्फॉइनोसाइटाइड्स (पीआईपी) की भूमिका का भी पता लगाया और ग्लोमेरुलर मेसेंजियल कोशिकाओं (जीएमसी) द्वारा ट्यूबलर एक्सोसोम के अवशोषण को देखा।

सिस्टैंच अनुपूरक

तरीकों

1. कोशिका संवर्धन

एचके -2 मानव रीनल प्रॉक्सिमल ट्यूबलर एपिथेलियल सेल लाइन को शंघाई इंस्टीट्यूट फॉर बायोलॉजिकल साइंसेज सेल रिसोर्स सेंटर से खरीदा गया था। एचके -2 कोशिकाओं को सामान्य ग्लूकोज डुलबेको के संशोधित ईगल मीडियम/पोषक तत्व मिश्रण एफ -12 (डीएमईएम/एफ -12) में संवर्धित किया गया था जिसे 10 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस; एफएसपी500) के साथ पूरक किया गया था। एक्ससेल)। सामान्य ग्लूकोज DMEM/F-12 DMEM (11966025, गिब्को) और हैम के F-12 (11765054, गिब्को) का 1:1 मिश्रण था जिसमें 5.56 mmol/L ग्लूकोज था। कोशिकाओं को 5 प्रतिशत CO2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री पर बनाए रखा गया। एक बार जब 80 प्रतिशत संगम हो गया, तो कोशिकाओं को मानक ट्रिप्सिन पाचन प्रक्रिया का उपयोग करके काटा गया और 1:2 के विभाजन अनुपात में पारित किया गया। मार्ग कोशिकाओं को रिक्त नियंत्रण समूह (एनजी) के रूप में 5.5 mmol·L-1 ग्लूकोज और उच्च ग्लूकोज के रूप में 30 mmol·L-1 ग्लूकोज में एक्सोसोम-क्षीण FBS (CMS101.03, सेलमैक्स) के साथ सुसंस्कृत किया गया था। 48 घंटों के लिए समूह (एचजी)।

2. एक्सोसोम अलगाव

विभेदक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग एचके {{0}} सेल कल्चर सतह पर तैरनेवाला से एक्सोसोम निकालने के लिए किया गया था। संक्षेप में, एचके -2 सेल कल्चर सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया और क्रमिक रूप से 10 मिनट के लिए 2 {6 }} × ग्राम, 4 डिग्री पर और फिर 30 मिनट के लिए 10, {{12 }} × ग्राम, 4 डिग्री पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। कोशिकाओं, सेलुलर मलबे और बड़े पुटिकाओं को हटाने के लिए मिनट। सतह पर तैरनेवाला अंशों को 0.22-μm छिद्र आकार फिल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर किया गया था। फ़िल्टर किए गए नमूनों को एक्सोसोम को गोली देने के लिए 75 मिनट के लिए 110,000 × ग्राम पर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के अधीन किया गया, दो बार 4 डिग्री पर। परिणामी एक्सोसोम को फॉस्फेट बफर समाधान (पीबीएस) की एक छोटी मात्रा में फिर से निलंबित कर दिया गया और -80 डिग्री पर संग्रहीत किया गया।

3. नैनोकण ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए)

एक्सोसोम को 25 डिग्री पानी के स्नान में पिघलाया गया और बर्फ पर रखा गया, जिसके बाद ट्यून करने योग्य प्रतिरोधी पल्स सेंसिंग (टीआरपीएस) के साथ पता लगाने के लिए उन्हें सीधे 1 × पीबीएस के साथ पतला कर दिया गया। इज़ोन साइंस के इज़ोन कंट्रोल सूट 3.3.2 के साथ क्यूनैनो गोल्ड का उपयोग करके एक्सोसोम के आकार वितरण और एकाग्रता का विश्लेषण किया गया।

4. प्रोटीन निर्धारण और वेस्टर्न ब्लॉटिंग

लगभग। 100ul प्रीमिक्स्ड क्रैकिंग सॉल्यूशन (RIPA क्रैकिंग सॉल्यूशन और 1 प्रतिशत PMSF इनहिबिटर) को सेल और एक्सोसोम नमूनों में अलग से जोड़ा गया था। 30 मिनट तक क्रैक करने के बाद, उन्हें 20 मिनट के लिए 12, 4 डिग्री, 4 डिग्री पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। सतह पर तैरनेवाला लिया गया था, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार बाइसिनकोनिक एसिड (बीसीए; बेयोटाइम) प्रोटीन परख किट का उपयोग करके प्रोटीन सांद्रता निर्धारित की गई थी। गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन का उपयोग मानक प्रोटीन के रूप में किया गया था।

प्रोटीन के नमूनों को सोडियम-डोडेसिल-सल्फेट पॉलीएक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) द्वारा विभाजित किया गया था। पीवीडीएफ झिल्ली (मिलिपोर) पर स्थानांतरित होने के बाद, उन्हें विभिन्न प्राथमिक एंटीबॉडी, एंटी-सीडी 63 (एक्सओएबी-सीडी 63 ए -1, एसबीआई; 1: 1000), एंटी-एलआईएक्स (वाईटी 6283, इम्यूनोवे; 1: 1000) के साथ जोड़ा गया था। ), एंटी-कैलनेक्सिन (YT0613, इम्यूनोवे; 1:1000), एंटी-पी62 (पी0067, सिग्मा; 1:1000), और एंटी-एलसी3 (एल7543, सिग्मा; 1:1000), इसके बाद बकरी विरोधी खरगोश या चूहे आईजी द्वितीयक एंटीबॉडीज (180202-001, एसबीआई; 1:5000)। उन्नत केमिलुमिनसेंट (ईसीएल; बायोटाइम) सब्सट्रेट का उपयोग करके विशिष्ट बैंड का पता लगाया गया। -एक्टिन (बीएम0627, बोस्टर) का उपयोग आंतरिक नियंत्रण के रूप में किया गया था। ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके सापेक्ष बैंड की तीव्रता मापी गई।

5. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम)

5ul नमूना तांबे के जाल में डाला गया और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखा गया। तांबे के जाल में 2 प्रतिशत यूरेनियम पेरोक्साइड एसीटेट की एक बूंद डाली गई और 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखा गया। फिर इसे कमरे के तापमान पर लगभग 20 मिनट तक सुखाया गया और नैनो-ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टेक्नाई जी2 स्पिरिट बायोट्विन, एफईआई) के तहत देखा गया।

सिस्टैंच अर्क

6. लक्षित लिपिडोमिक्स

ब्लीघ और डायर की विधि [15] के संशोधित संस्करण का उपयोग करके लिपिड निकाले गए। सभी लिपिडोमिक विश्लेषण एक एक्सियन अल्ट्रा-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (यूपीएलसी) पर किए गए, जो एक SCIEX QTRAP 6500 PLUS सिस्टम के साथ मिलकर किया गया। यूपीएलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण निम्नलिखित स्थितियों के साथ इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) मोड में आयोजित किए गए थे: पर्दा गैस=20, आयन स्प्रे वोल्टेज=5,5{21}}0 वी , तापमान=400 डिग्री, आयन स्रोत गैस 1=35, और आयन स्रोत गैस 2=35। ध्रुवीय लिपिड को दो मोबाइल चरणों के साथ फेनोमेनेक्स लूना 3 माइक्रोन सिलिका कॉलम (आंतरिक व्यास 15 {{45 }} × 2. {51 }} मिमी) का उपयोग करके अलग किया गया था: मोबाइल चरण ए (क्लोरोफॉर्म: मेथनॉल: अमोनियम हाइड्रॉक्साइड, 89.5: 10: 0.5) और मोबाइल चरण बी (क्लोरोफॉर्म: मेथनॉल: अमोनियम हाइड्रॉक्साइड: पानी, 55: 39: 0.5: 5.5)। ग्रेडिएंट पृथक्करण इस प्रकार किया गया: ग्रेडिएंट को 5 मिनट के लिए 95 प्रतिशत ए के साथ बनाए रखा गया और फिर 7 मिनट में रैखिक रूप से घटाकर 6 {{71 }} प्रतिशत कर दिया गया और 4 मिनट तक रखा गया, जिसके बाद यह घटकर 3 {{74 }} हो गया। प्रतिशत और फिर 15 मिनट तक रोके रखा गया। अंत में, मूल ग्रेडिएंट लागू किया गया और 5 मिनट तक बनाए रखा गया। विभिन्न लिपिड पहचान और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक मल्टी-रिएक्शन मॉनिटरिंग (एमआरएम) स्थापित की गई थी [16, 17]। व्यक्तिगत ध्रुवीय लिपिड प्रजातियों को पीई-डी31(16:0/18:1), डीएमपीई सहित समान लिपिड वर्ग के नुकीले आंतरिक मानकों के संदर्भ में निर्धारित किया गया था; पीजी-डी31(16:0/18:1), डीएमपीजी; पीआई-डी31(16:0/18:1), डीआइ-सी8- पीआई; पीएस-डी31(16:0/18:1), डीएमपीएस; पीए-डी31(16:{{1{1{{110}}8}}4}}/18:1), पीए(17:0/17:0); बीएमपी-(14:0/14:0); एलपीई-17:1; एलपीआई-17:1; एलपीएस-17:1; एलपीए-17:0; GM3 d18:1/18:0-d3; डी31-16:0, डी8-20:4; पीसी-डी31(16:0/18:1), डीएमपीसी; एसएम डी18:1/ डी31-16:0, एसएम डी18:1/12:0; एलपीसी-17:0; Cer d18:1-d7/15:0; एसपीएच-डी18:1/17:0; सीएल 22:1(3)-14:1.

ग्लिसरॉल लिपिड, जिसमें डायसीलग्लिसरॉल्स (डीएजी) और ट्राईसिलग्लिसरॉल्स (टीएजी) शामिल हैं, को उलट-चरण एचपीएलसी/एमएस/एमएस के संशोधित संस्करण का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। क्लोरोफॉर्म: मेथनॉल: {{19} युक्त एक मोबाइल चरण का उपयोग करके फेनोमेनेक्स काइनेटेक्स-सी18 2.6 µm कॉलम (आईडी 4.6x1{7}}0 मिमी) पर तटस्थ लिपिड का पृथक्करण प्राप्त किया गया था। }.1 एम अमोनियम एसीटेट (100:100:4), 160 μl/मिनट की प्रवाह दर पर। डी5-टैग (16:0)3; डी5-टैग (14:0)3; d5-TAG (18:0)3 का उपयोग व्यक्तिगत स्पाइक TAG के लिए किया गया। डी5-डीएजी (1,3-17:0); न्यूट्रल मिस एमएस/एमएस तकनीक के आधार पर व्यक्तिगत डीएजी को बढ़ाने के लिए डी5-डीएजी (1,{31}}:1) का उपयोग किया गया।

मुक्त कोलेस्ट्रॉल, स्टेरोल्स और उनके एस्टर का विश्लेषण एचपीएलसी-एमएस/एमएस द्वारा किया गया था, जो वायुमंडलीय दबाव रासायनिक आयनीकरण (एपीसीआई) मोड में आयोजित किया गया था, कोलेस्टेरिल -2,2,3,4,4,6-डी6 के साथ ऑक्टाडेकोनेट; आंतरिक मानकों के रूप में कोलेस्ट्रॉल-26,26,26,27,27,27-d6।

क्लोरोफॉर्म: मेथनॉल: (1:1), 2.4 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड, और 0.25 एम ईडीटीए को नमूने में मिलाया गया, इसके बाद कम तापमान पर पीसा गया। नमूने को 4 डिग्री पर 3 घंटे तक ऊष्मायन के बाद सेंट्रीफ्यूज किया गया, जिसके बाद निचले कार्बनिक चरण को निकाला गया। दूसरे निष्कर्षण के लिए क्लोरोफॉर्म मिलाया गया, इसके बाद 1N हाइड्रोक्लोरिक एसिड: मेथनॉल (1:1) का उपयोग करके कार्बनिक चरण को धोया गया। कार्बनिक चरण को वैक्यूम रोटरी सांद्रक में सुखाया गया। जैसा कि पहले बताया गया था, 40 प्रतिशत मिथाइलमाइन: पानी: एन-ब्यूटेनॉल: मेथनॉल (36:8:9:47) का उपयोग डीसिलेशन के लिए किया गया था और थर्मो आईसीएस -5000 आयन क्रोमैटोग्राफी द्वारा विश्लेषण किया गया था। PI4P, PI3P, PI4P, PI(3, 4)P2, PI(3, 5)P2, PI(4, 5)P2, और PI(3, 4,5) P3 का उपयोग मात्रात्मक के लिए बाहरी अंशांकन वक्र बनाने के लिए किया गया था। विश्लेषण। विश्लेषण लिपिडॉल टेक्नोलॉजीज कंपनी लिमिटेड द्वारा समर्थित था।

7. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

जीएमसी (सिसेंसेल) में एक्सोसोम के अवशोषण की कल्पना करने के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार, उच्च ग्लूकोज उत्तेजना के साथ या बिना एचके कोशिकाओं द्वारा स्रावित एक्सोसोम की समान मात्रा को पीकेएच 67 (मिनी 67, सिग्मा) के साथ लेबल किया गया था। लेबल किए गए एक्सोसोम को 24 घंटों के लिए जीएमसी के साथ सुसंस्कृत किया गया। कंफ्लुएंट जीएमसी को पीबीएस के साथ तीन बार धोया गया, जिसके बाद कोशिकाओं को 4 प्रतिशत पैराफॉर्मल्डिहाइड के साथ तय किया गया और 30 मिनट के लिए प्रकाश से दूर रखा गया। कोशिकाओं को पीबीएस से तीन बार धोया गया और डीएपीआई (28718903, सोलरबायो) से 4-6 मिनट तक रंगा गया। तीन बार धोने के बाद, Nikon C2 कन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके संगम GMCs की तस्वीरें खींची गईं।

8. सांख्यिकीय विश्लेषण

ग्राफपैड 7.0 को सांख्यिकीय विश्लेषण और मानचित्रण के लिए लागू किया गया था। डेटा को माध्य ± SEM के रूप में व्यक्त किया जाता है। दोनों समूहों के बीच तुलना के लिए छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग किया गया था। एक पी-वैल्यू <{4}}.05 को सांख्यिकीय महत्व माना जाता था।

सिस्टैंच कैप्सूल

बहस

हमारा अध्ययन उच्च ग्लूकोज उत्तेजना के तहत एचके {{0}} कोशिकाओं और एक्सोसोम की विभेदित रूप से व्यक्त लिपिड प्रजातियां प्रदान करता है, जो पहले रिपोर्ट नहीं की गई थीं। दिलचस्प बात यह है कि GM3 की प्रजातियाँ, जैसे GM3 d18:1/22:0, GM3 d18:1/16:0, GM3 d18:0/16:0 , GM3 d18:1/22:1 उच्च ग्लूकोज-उत्तेजित HK-2 कोशिकाओं में उल्लेखनीय रूप से बढ़ गया था, और GM3 d18:1/24:1, GM3 उनके एक्सोसोम में काफी कम हो गए थे। इसके अलावा, GM3 d18:1 /18:1, GM3 d18:1/20:1, और GM3 d18:0/20:0 केवल एक्सोसोम में पाए गए। जीएम3 शरीर में सबसे व्यापक रूप से वितरित गैंग्लियोसाइड है, जिसमें ग्लूकोज, गैलेक्टोज और सियालिक एसिड होता है, जो सेरामाइड कंकाल संरचना से जुड़े सियालिक समूहों की विशेषता है [18]। यह विभिन्न प्रकार के सेल कार्यों के नियमन में शामिल है, जिसमें सिग्नलिंग ट्रांसडक्शन, प्रसार, विभेदन और एपोप्टोसिस शामिल हैं। हाल के अध्ययनों के अनुसार, टाइप 2 मधुमेह, हाइपरलिपिडिमिया और मोटापे से ग्रस्त रोगियों में GM3 की सीरम सांद्रता अधिक होती है, जबकि GM3 इंसुलिन रिसेप्टर्स को हटाने को बढ़ावा दे सकता है और इंसुलिन सिग्नलिंग को कम कर सकता है [19]। हमारे परिणामों ने उच्च ग्लूकोज उत्तेजना के तहत एचके कोशिकाओं में सभी विभेदित जीएम 3 प्रजातियों के ऊंचे स्तर का संकेत दिया, विशेष रूप से पार्श्व श्रृंखला (22: 0) के साथ जीएम 3 की वृद्धि जो सबसे स्पष्ट थी। झांग एट अल. [20] डायबिटिक नेफ्रोपैथी चूहों के किडनी कॉर्टेक्स में उन्नत जीएम3 डी18:1/22:0 अभिव्यक्ति भी देखी गई, जो हमारे परिणामों के अनुरूप थी। एनेला एट अल द्वारा स्ट्रेप्टोज़ोटोसिन-प्रेरित टाइप 2 मधुमेह चूहों का अध्ययन किया गया। [21] ग्लोमेरुली में अपरिवर्तित जीएम3 पाया गया लेकिन वृक्क नलिकाओं में जीएम3 की अभिव्यक्ति में उल्लेखनीय वृद्धि हुई, जो वृक्क नलिकाओं में जीएम3 परिवर्तनों की हमारी खोज के अनुरूप है। क्वाक एट अल. [22] स्ट्रेप्टोज़ोटोसिन-प्रेरित मधुमेह चूहों की ग्लोमेरुलर सामग्री में जीएम 3 की कमी पाई गई, इसके बाद ग्लोमेरुली में चार्ज चयनात्मक निस्पंदन बाधा का नुकसान हुआ। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि ग्लोमेरुली और वृक्क नलिकाओं में GM3 की भूमिका भिन्न हो सकती है। GM3 भी लिपिड राफ्ट का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है [23]। लिपिड राफ्ट में GM3 अभिव्यक्ति स्तरों में परिवर्तन Na प्लस -ग्लूकोज कोट्रांसपोर्टर टाइप 2 (SGLT2) और रीनल Na प्लस /K प्लस /Cl-कोट्रांसपोर्टर की गतिविधियों को बदल देता है, जो दोनों लिपिड राफ्ट-निर्भर हैं [24]। कुछ शोधकर्ताओं ने माना कि GM3 की उच्च सांद्रता SGLT2 और Na प्लस/K प्लस/Cl-कोट्रांसपोर्टर गतिविधियों को बढ़ाती है, जिससे ट्यूबलर पुनर्अवशोषण और अपवाही धमनी हाइड्रोस्टेटिक दबाव में वृद्धि होती है और फिर ट्यूबलोग्लोमेरुलर संतुलन को नुकसान पहुंचाकर गुर्दे की ट्यूबलर कोशिका को चोट पहुंचती है। कुमारी एट अल. [25] पाया गया कि रोगियों के मूत्र एक्सोसोम में जीएम3 ने डीकेडी और मधुमेह मेलिटस के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर दिखाया। कुल मिलाकर, वृक्क नलिकाओं में उच्च ग्लूकोज के तहत GM3 की उन्नत अभिव्यक्ति की भूमिका को भविष्य के शोध द्वारा संबोधित किया जाना चाहिए।

महत्वपूर्ण रूप से, हमारे परिणामों से यह भी पता चला कि सीएल की कुछ प्रजातियां, जिनमें सीएल66:4(16:1), सीएल70:7(16:1), और सीएल74:8(16:1) शामिल हैं, उच्च ग्लूकोज-उत्तेजित एचके में काफी कम हो गई थीं। {13}} कोशिकाएँ। एचके -2 कोशिकाओं की तुलना में, एक्सोसोम में सीएल में काफी कमी आई थी। सीएल लगभग पूरी तरह से माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली में स्थित है और माइटोकॉन्ड्रियल संरचना को बनाए रखने का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है। इलेक्ट्रॉन चालन, एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट उत्पादन, ऊर्जा चयापचय और एपोप्टोसिस [26, 27] में इसकी महत्वपूर्ण भूमिका है। मधुमेह में, माइटोकॉन्ड्रियल रूपात्मक परिवर्तन और शिथिलता अक्सर पैथोलॉजिकल सीएल परिवर्तन के साथ होती है [28,29]। समीपस्थ वृक्क ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं को विभिन्न पदार्थों के सक्रिय परिवहन और पुनर्अवशोषण को बनाए रखने के लिए पर्याप्त एटीपी की आवश्यकता होती है। उच्च ऊर्जा खपत करने वाली कोशिकाओं के रूप में, समीपस्थ वृक्क ट्यूबलर उपकला कोशिकाएं माइटोकॉन्ड्रिया से समृद्ध होती हैं [30]। प्रारंभिक मधुमेह में समीपस्थ ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन देखा गया है। झांग एट अल. [31] पाया गया कि टाइप 1 मधुमेह वाले चूहों में ट्यूबलर माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को बनाए रखने के लिए सीएल आवश्यक था। हमारे परिणाम डीकेडी के माइटोकॉन्ड्रियल चोट तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक नया सैद्धांतिक आधार प्रदान कर सकते हैं।

ऑटोफैगी-लाइसोसोम मार्ग के साथ सहयोग करके सेलुलर होमोस्टैसिस को बनाए रखने में एक्सोसोम की महत्वपूर्ण भूमिका होती है। पिछले अध्ययनों में पाया गया है कि पीआईपी अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन एमवीबी [32, 33, 34] के परिवर्तन को विनियमित करके एक्सोसोम स्राव और सेलुलर ऑटोफैगी दोनों को प्रभावित कर सकता है। नीना एट अल. [35] पाया गया कि पीसी {{5 }} कोशिकाओं में, PIKfyve का निषेध, जो सब्सट्रेट PI3P है, ने एक्सोसोम के स्राव को बढ़ाया और स्रावी स्वरभंग को प्रेरित किया, इस प्रकार यह पता चला कि ये रास्ते PIP द्वारा निकटता से जुड़े हुए थे। उपर्युक्त के आधार पर, हमने उच्च ग्लूकोज-उत्तेजित एचके -2 कोशिकाओं में पीआईपी, एक्सोसोमल उत्पादन और ऑटोफैगी में परिवर्तन देखा। हमारे परिणामों से पता चला कि उच्च ग्लूकोज-उत्तेजित एक्सोसोम के स्राव और एचके -2 कोशिकाओं में ऑटोफैगी की सक्रियता दोनों को प्रेरित करता है, जबकि पीआई4पी अभिव्यक्ति में एक महत्वपूर्ण कमी पाई गई। उच्च ग्लूकोज उत्तेजना में शामिल पीआईपी के एक्सोसोम-ऑटोफैगी नियामक तंत्र की जांच के लिए आगे के अध्ययन आवश्यक हैं।

संदेशवाहक के रूप में, डीकेडी के विकास में इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग और कार्यात्मक परिवर्तनों में एक्सोसोम की महत्वपूर्ण भूमिका होती है [36, 37, 38]। हमने फ्लोरोसेंट रूप से एचके -2 कोशिकाओं द्वारा जारी एक्सोसोम को लेबल किया और जीएमसी द्वारा उनके पैरासरीन ग्रहण का प्रदर्शन किया। अपनी मातृ कोशिकाओं की तुलना में, एक्सोसोम में एक विशेष संरचना होती है, जो समृद्ध कोलेस्ट्रॉल, स्फिंगोलिपिड्स, संतृप्त फॉस्फोलिपिड्स और लिपिड राफ्ट डोमेन [39] के कारण उन्हें अधिक स्थिर और कार्यात्मक बनाती है। लिपिड संरचना में छोटे-छोटे परिवर्तन भी झिल्ली के गुणों को प्रभावित कर सकते हैं, जिससे इसके कार्य पर बहुत बड़ा प्रभाव पड़ता है। वर्तमान अध्ययन में, हमने पाया कि एचके -2 मातृ कोशिकाओं की तुलना में एक्सोसोम में टीएजी, पीसी और सीएल में काफी कमी आई है, जबकि एलपीए18:2, एलपीआई22:5, पीजी32:2, एफएफए16 सहित लिपिड की 13 प्रजातियां: 1, GM3 d18:1/18:1, GM3 d18:1/20:1, GM3 d18:{{3{38}}}}/2{40}}:0, PC40: 6p, TAG52:1(18:1), TAG52:0(18:0), CE-20:5, CE{43}}:4, CE-22:6 केवल में पाए गए एक्सोसोम। यहां प्रस्तुत कार्य ट्यूबलर कोशिकाओं द्वारा जारी एक्सोसोम की पैराक्राइन भूमिकाओं के आगे के विश्लेषण के लिए एक आधार प्रदान करता है।

सिस्टैंच पाउडर

निष्कर्ष

निष्कर्ष में, हमारे अध्ययन ने डीकेडी के रोगजनन का पता लगाने के लिए नए लक्ष्य प्रदान करने में लिपिडोमिक्स विश्लेषण के महत्व को प्रदर्शित किया। विभेदित व्यक्त लिपिड के कार्य पर आगे के अध्ययन के साथ-साथ नेफ्रॉन और उनके एक्सोसोम में अन्य कोशिकाओं पर व्यापक लिपिड अध्ययन एक नया परिप्रेक्ष्य प्रदान कर सकते हैं जो डीकेडी के तंत्र को और स्पष्ट करेगा।

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वेइडोंग वांग, टिंगटिंग ली, झिजी ली, होंगमियाओ वांग, ज़ियाओदान लियू

नेफ्रोलॉजी विभाग, चाइना मेडिकल यूनिवर्सिटी का पहला संबद्ध अस्पताल, 155 नॉर्थ नानजिंग स्ट्रीट, शेनयांग, लियाओनिंग, पीआर चीन, 110001