भाग Ⅰ: स्ट्रेप्टोज़ोटोकिन-निकोटिनामाइड-प्रेरित मधुमेह चूहों में पुरुष प्रजनन कार्य पर सिस्टैंच ट्यूबुलोसा के अर्क का प्रभाव

संपर्क: ऑड्रे हू Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ईमेल:audrey.hu@wecistanche.com

ज़्वे-लिंग काँग ® अथिरा जॉनसन® फैन-ची को, जिया-लिंग हे और शू-चुन चेंग

सार:मधुमेह एक पुरानी बीमारी है जो हाइपरग्लेसेमिया की विशेषता है जो इंसुलिन के स्तर में कमी या ऊतक की अक्षमता के कारण इसे प्रभावी ढंग से उपयोग करने के कारण होती है। बांझपन को मधुमेह के एक प्रमुख परिणाम के रूप में जाना जाता है और यह शुक्राणु हानि और गोनैडल डिसफंक्शन के कारण पुरुष प्रजनन प्रणाली को प्रभावित करता है।सिस्टैंच ट्यूबुलोसायह एक परजीवी पौधा है जिसमें याददाश्त, प्रतिरोधक क्षमता और यौन क्षमता में सुधार, नपुंसकता को कम करने और कब्ज को कम करने की क्षमता होती है। यह अध्ययन भारत में इचिनाकोसाइड (ईसीएच) के विरोधी भड़काऊ और सुरक्षात्मक प्रभावों की जांच पर केंद्रित थासिस्टैंच ट्यूबुलोसा अर्क(सीटीई) मधुमेह चूहों के पुरुष प्रजनन प्रणाली पर। सीटीई के एंटीऑक्सिडेंट, विरोधी भड़काऊ और सुरक्षात्मक प्रभावों का मूल्यांकन इन विट्रो और विवो दोनों तरीकों से किया गया था। इन विट्रो परिणामों से पता चलता है कि ECH ने प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) के उत्पादन को बाधित किया और StAR, CYP11A1, CYP17A1 और HSD17p3 प्रोटीन अभिव्यक्ति में सुधार किया। इन विवो विश्लेषण सीटीई में इचिनाकोसाइड (ईसीएच) (8 0, 160, और 320 मिलीग्राम / किग्रा) की तीन खुराक के साथ किया गया था। कुल मिलाकर, 0.571 मिलीग्राम/किलोग्राम रोसिग्लिटाज़ोन (आरएसजी) को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रशासित किया गया था। उच्च वसा वाले आहार (45 प्रतिशत) के संयोजन में मधुमेह स्ट्रेप्टोजोटोसीन (एसटीजेड) (65 मिलीग्राम/किलोग्राम) और निकोटीनमाइड (230 मिलीग्राम/किलोग्राम) से प्रेरित था। इन विवो अध्ययनों ने पुष्टि की कि ईसीएच ने रक्त शर्करा के स्तर, इंसुलिन प्रतिरोध, लेप्टिन प्रतिरोध और लिपिड पेरोक्सीडेशन में सुधार किया। यह हाइपोथैलेमस में किसपेप्टिन 1 (KiSS1), G प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर GPR 54, साइटोकाइन सिग्नलिंग 3 (SOCS -3) का शमन, और Sirtuin 1 (SIRT1) मैसेंजर राइबोन्यूक्लिक एसिड (mRNA) अभिव्यक्ति को पुनर्स्थापित कर सकता है और सेक्स को ठीक कर सकता है। हार्मोन का स्तर। इस प्रकार, इस अध्ययन ने सीटीई के एंटीऑक्सिडेंट, विरोधी भड़काऊ और स्टेरॉइडोजेनेसिस प्रभावों की पुष्टि की।

कीवर्ड:मधुमेह; बांझपन;सिस्टैंच ट्यूबुलोसा का सत्त (सीटीई); इचिनाकोसाइड (ईसीएच); विरोधी भड़काऊ गतिविधि; प्रतिउपचारक गतिविधि; स्टेरॉइडोजेनेसिस प्रभाव

मधुमेह के लिए उपचार:सिस्टैंच ट्यूबुलोसा अर्क(सीटीई)

1 परिचय

डायबिटीज मेलिटस (डीएम) एक ऐसी स्थिति है जिसमें पर्याप्त इंसुलिन का उत्पादन करने में अग्न्याशय की अक्षमता या शरीर द्वारा इसे प्रभावी ढंग से उपयोग करने में असमर्थता के कारण रक्त में ग्लूकोज का स्तर बढ़ जाता है। डब्ल्यूएचओ के अनुसार, मधुमेह से पीड़ित लोगों की संख्या 1980 में 108 मिलियन से बढ़कर 2014 में 422 मिलियन हो गई [1]। चार मुख्य श्रेणियां हैं: प्री-डायबिटीज (मधुमेह से पहले का चरण), टाइप 1 (जहां अग्न्याशय इंसुलिन का उत्पादन करने में विफल रहता है), टाइप 2 (शरीर इंसुलिन का उपयोग करने में विफल रहता है), और गर्भकालीन मधुमेह (जो गर्भावस्था के दौरान होता है)। प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) और एंटीऑक्सिडेंट [2] के उत्पादन के बीच असंतुलन के कारण ऑक्सीडेटिव तनाव अंततः मधुमेह की स्थिति का कारण बनता है। मधुमेह की जटिलताओं में गुर्दे की विफलता, तंत्रिका क्षति, अंधापन, स्ट्रोक, दिल का दौरा, भ्रूण की मृत्यु और बांझपन शामिल हैं। [1]. अध्ययनों से पता चलता है कि पुरुष मधुमेह रोगियों [3] में शुक्राणु नाभिक, डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड (डीएनए), और माइटोकॉन्ड्रिया काफी क्षतिग्रस्त हो गए थे। शुक्राणु के परिवहन के दौरान ऑक्सीडेटिव तनाव पुरुष प्रजनन प्रणाली की प्रक्रिया को बदल देगा [4,5]।

शुक्राणुजनन की प्रक्रिया हाइपोथैलेमस-पिट्यूटरी-गोनाडल (एचपीजी) अक्ष द्वारा नियंत्रित होती है। हाइपोथैलेमस द्वारा निर्मित गोनैडोट्रोपिन-रिलीज़िंग हार्मोन (GnRH) ल्यूटिनाइजिंग हार्मोन (LH) और कूप-उत्तेजक हार्मोन (FSH) के उत्पादन को उत्तेजित करता है। लेडिग कोशिकाएं वीर्य नलिका के निकट पाई जाती हैं और एलएच के नियंत्रण में टेस्टोस्टेरोन का उत्पादन करती हैं। एफएसएच एंटीजन-बाइंडिंग प्रोटीन (एबीपी) के उत्पादन को ट्रिगर करता है जो पुरुष हार्मोन को पारित करने में मदद करता है। इस प्रकार, बांझपन और अन्य समस्याएं मुख्य रूप से एचपीजी अक्ष में होने वाली गड़बड़ी के कारण उत्पन्न होती हैं। स्ट्रेप्टोज़ोटोकिन-निकोटिनामाइड के संयोजन का प्रशासन प्रायोगिक चूहों में मधुमेह को प्रेरित करता है। स्ट्रेप्टोज़ोटोकिन अग्न्याशय में इंसुलिन-उत्पादक पी कोशिकाओं के लिए एक रासायनिक यौगिक है और निकोटिनमाइड एक पानी में घुलनशील विटामिन है जो पी कोशिकाओं को पूर्ण क्षति से बचाता है [6]।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा एक रेगिस्तानी पौधे की प्रजाति है जिसे "रू कांग-रोंग" [7] के नाम से भी जाना जाता है। यह एक गैर-क्लोरोफिलिक परजीवी पौधा है जो मुख्य रूप से कैलोट्रोपिस प्रोसेरा पेड़ की जड़ पर उगता है और गांसु, किंघई, झिंजियांग, मंगोलिया, ईरान और भारत की शुष्क भूमि में व्यापक रूप से वितरित किया जाता है। सिस्टैंच ट्यूबुलोसा का सामान्य नाम "रेगिस्तान जलकुंभी" है। यह चीनी पारंपरिक चिकित्सा में व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है और इसे "डेजर्ट का जिनसेंग" नाम दिया गया है। यह व्यापक रूप से रुग्ण ल्यूकोरिया, विपुल मेट्रोरहागिया, पुरानी गुर्दे की बीमारियों, कब्ज, नपुंसकता और बांझपन के इलाज के लिए औषधीय क्षेत्र में उपयोग किया जाता है। के रासायनिक घटकसिस्टैंच ट्यूबुलोसागैर-वाष्पशील फेनिलएथेनॉइड ग्लाइकोसाइड्स (पीएचजी), इरिडोइड्स, लिग्नान, वाष्पशील तेल, एल्डिटोल, ओलिगोसेकेराइड और पॉलीसेकेराइड [8] से मिलकर बनता है। अध्ययनों से पता चलता है कि इस जड़ी बूटी से इचिनाकोसाइड आरओएस स्तरों [9] को विनियमित करके क्षतिग्रस्त फाइब्रोब्लास्ट की रक्षा करता है। यह यौगिक न्यूरोप्रोटेक्शन और ऑस्टियोपोरोसिस की रोकथाम [10,11] के साथ-साथ एंटीऑक्सिडेंट, वासोरेलैक्सेशन और विरोधी भड़काऊ गतिविधियों का उत्पादन करता है।

इस अध्ययन का उद्देश्य जांच करना थासिस्टैंच ट्यूबुलोसा अर्क का प्रभावस्ट्रेप्टोज़ोटोकिन-निकोटिनामाइड-प्रेरित मधुमेह चूहे के प्रजनन संबंधी शिथिलता पर ईसीएच युक्त।

सिस्टैंच ट्यूबुलोसा

2। सामग्री और प्रणालियां

2.1.सामग्री

ECH और CTE को Sinopharm Pharmaceutical Co., Ltd (यिलन, ताइवान) से खरीदा गया था। उन्नत ग्लाइकेशन एंडप्रोडक्ट्स (एजीई) बायोविज़न (सैन फ्रांसिस्को, सीए, यूएसए) से खरीदे गए थे। LC-540 और TM3 सेल लाइनों को खाद्य उद्योग अनुसंधान और विकास संस्थान (Hsinchu, ताइवान) से खरीदा गया था। पांच सप्ताह पुराने स्प्राग-डावले (एसडी) नर चूहों को राष्ट्रीय प्रयोगशाला पशु केंद्र (ताइपे, ताइवान) से खरीदा गया था। फीड लैब डाइट® को पीएमआई न्यूट्रिशन इंटरनेशनल, इंक. (ताइपेई, ताइवान) से खरीदा गया था। 2,2-डाइफिनाइल-1-पिक्रिलहाइड्राजाइल (DPPH) सिग्मा (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से प्राप्त किया गया था। मेथनॉल और 4-(2-हाइड्रॉक्सीएथाइल)-1-पाइपरज़ीनेथेनेसल्फ़ोनिक एसिड (HEPES) भी सिग्मा से खरीदे गए थे। Dulbecco का संशोधित ईगल माध्यम/F12 और ट्रिप्सिन-ईडीटीए GIBCO (न्यूयॉर्क, एनवाई, यूएसए) से प्राप्त किए गए थे। 3-(4, 5-डाइमिथाइलथियाजोल-2-यल)-2, 5-डिपेनहिलटेट्राजोलियम ब्रोमाइड (एमटीटी), डाइक्लोरो-डायहाइड्रो-फ्लोरेसिन डायसेटेट (डीसीएफएच-डीए), डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (DMSO), और नाइट्रोब्लू टेट्राज़ोलियम (NBT) सिग्मा से खरीदे गए थे। ग्लूकोज एंजाइमेटिक किट क्योकुटोसियाकु, टोक्यो, जापान से प्राप्त किए गए थे। इंसुलिन एलिसा किट Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (उप्साला, स्वीडन) से खरीदी गई थी। टी-प्रति ऊतक प्रोटीन निष्कर्षण अभिकर्मक थर्मो साइंटिफिक (शिकागो, आईएल, यूएसए) से प्राप्त किया गया था। मानव-विरोधी/माउस/चूहा परमाणु कारक-कप्पा बी एनएफ-केबी पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी, सांता क्रूज़, सीए, यूएसए से खरीदे गए थे। उन्नत ग्लाइकेशन एंडप्रोडक्ट्स (रेज) पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी, एंटी-ह्यूमन / माउस / रैट स्टार पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी, और एंटी-ह्यूमन / माउस / रैट साइटोक्रोम पी 450 17 के लिए एंटी-माउस / रैट रिसेप्टर जीन टेक्स से खरीदे गए थे। (इरविन, सीए, यूएसए)। मानव-विरोधी/माउस/चूहा CYP11A1 पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी (बेवर्ली, पीए, यूएसए) से प्राप्त किए गए थे। आसान-नीला अभिकर्मक इंविट्रोजन, थर्मो फिशर साइंटिफिक (कार्ल्सबैड, सीए, यूएसए) से खरीदा गया था। Agarose और DNA मार्कर 100 bp Promega, Corporation (Madison, WI, USA) से प्राप्त किए गए थे। RNeasy Lipid Tissue Mini Kit QIAGEN, Hilden, Germany से खरीदी गई थी।

2.2. तरीके

2.2.1. इन विट्रो विश्लेषण

LC{0}} और TM3 सेल कल्चर: LC-540 सेल लाइनों को 37 OC पर अर्ल के बैलेंस्ड सॉल्ट सॉल्यूशन (EBSS) माध्यम में सोडियम बाइकार्बोनेट (1.5 g/L), L के साथ पूरक किया गया था। -ग्लूटामाइन (2 मिमी), गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (0.1 मिमी), सोडियम पाइरूवेट (1.0 मिमी), और भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) (10 प्रतिशत) एक 5 में प्रतिशत CO2 इनक्यूबेटर (CO2 इनक्यूबेटर, नैप्को 5410, ताइवान)। TM3 सेल लाइन को ग्लूकोज (4.5 g/L), सोडियम पाइरूवेट (0.5 mM), L-glutamine (2.5 mM), सोडियम बाइकार्बोनेट (1.2 g/L) के साथ पूरक Dulbecco/s संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) में संवर्धित किया गया था। 4-(2-हाइड्रॉक्सीएथाइल)-1-पाइपरज़ीनेथेनेसल्फ़ोनिक एसिड (HEPES, 15 मिमी), और भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS, 10 प्रतिशत) या हॉर्स सीरम (5 प्रतिशत) 37 OC पर 5 में प्रतिशत CO2 इनक्यूबेटर।

इचिनाकोसाइड (ईसीएच) की सेल व्यवहार्यता का निर्धारण: 3-(4, 5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-yl)-2,5- डिपेनिलटेट्राजोलियम ब्रोमाइड (एमटीटी) अभिकर्मक था सेल व्यवहार्यता परख के लिए उपयोग किया जाता है। सेल एकाग्रता को 96-वेल प्लेट में 2 x 105 कोशिकाओं/एमएल में समायोजित किया गया था। फिर, ईसीएच का 20 L (मध्यम के 2 प्रतिशत में पतला) जोड़ा गया और 5 प्रतिशत सीओ2 इन्क्यूबेटर में 37 ओसी पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। बाद में, 100 L MTT अभिकर्मक को जोड़ा गया और 4hat37 OC के लिए अंधेरे परिस्थितियों में ऊष्मायन किया गया। अवशोषण को 570 एनएम (एलिसा रीडर, डायनाटेक एमआर5000, क्लोटेन, स्विटजरलैंड) में मापा गया था।

रेस्टिव सीईएच वायबिहि (प्रतिशत)=[(570 एनएम पर नमूना — 570 एनएम पर खाली)]/[(570 पर एक नियंत्रण — 570 पर खाली)] x 100।

Nitroblue Tetrazolium (NBT) न्यूनीकरण परख और 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) परख: कोशिकाओं की संख्या को 1x 1{{10}}6 कोशिकाओं/एमएल में समायोजित किया गया था . फिर, 5 0 मिलीग्राम/एमएल ईसीएच, रेस्वेराट्रोल (आरईएस), और उन्नत ग्लाइकेशन एंड-प्रोडक्ट्स (एजीई) (नियंत्रण) को 37ओसी पर 18 घंटे के लिए जोड़ा और सह-सुसंस्कृत किया गया। फिर, एनबीटी समाधान का 0.3 एमएल (0.1 मिलीग्राम/एमएल एनबीटी, 5 प्रतिशत एफबीएस, और 10 एमएल डीएमईएम में भंग 3 प्रतिशत डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ)) जोड़ा गया और 1 घंटे के लिए 5 प्रतिशत सीओ2 में 37 ओसी पर ऊष्मायन किया गया। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद (3 मिनट के लिए 800 xg पर) सतह पर तैरनेवाला हटा दिया गया था और 200 L डीएमएसओ जोड़ा गया था और एक अल्ट्रासोनिक थरथरानवाला (डेल्टा अल्ट्रासोनिक क्लीनर डी 200, कीलुंग, ताइवान) में 5 मिनट के लिए हिलाया गया था। अवशोषण 630 एनएम मापा गया था। DPPH कट्टरपंथी परख के लिए, ट्रॉलॉक्स (95 प्रतिशत अल्कोहल में) को मानक के रूप में लिया गया था। फिर, 0.5 एमएम डीपीपीएच समाधान के 75 L को 25 L नमूनों के साथ मिलाया गया और 30 मिनट के लिए एक अंधेरी जगह में कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया करने की अनुमति दी गई। मिश्रण को हिलाया गया और अवशोषण को 517 एनएम मापा गया।

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजाति (आरओएस) सामग्री विश्लेषण: सेल संख्या को 2 प्रतिशत एफबीएस युक्त एक 12-वेल प्लेट में 2 x 105 कोशिकाओं/एमएल में समायोजित किया गया था। फिर, ईसीएच, आरईएस, और एजीई के 50 L/एमएल को प्लेट में जोड़ा गया और 24 घंटे के लिए 37 ओसी पर इनक्यूबेट किया गया। 24 घंटे के बाद, 2Z, 7Z-dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA) को जोड़ा गया और 30 मिनट के लिए 37 OC पर इनक्यूबेट किया गया। सेंट्रीफ्यूजेशन (400x g, 5 मिनट) के बाद, सतह पर तैरनेवाला हटा दिया गया था और कोशिकाओं को फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ दो बार धोया गया था। पीबीएस के 1 एमएल में कोशिकाओं को निलंबित कर दिए जाने के बाद और आरओएस के स्तर को फ्लो साइटोमीटर (फ्लो साइटोमीटर, बेक्टन डिकिंसन, सीए, यूएसए) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था।

प्रोटीन की पहचान और मात्रात्मक विश्लेषण: प्रोटीन निष्कर्षण अभिकर्मक (T-PER) का उपयोग करके प्रोटीन निकाले गए। सेल घनत्व को 12-वेल प्लेट में 2 x 105 कोशिकाओं/एमएल और ईसीएच, आरईएस के 50 L/एमएल, और उन्नत ग्लाइकेशन एंडप्रोडक्ट (रेज) प्रतिपक्षी के लिए एक रिसेप्टर, और एजीई को जोड़ा गया था। 24 घंटे के लिए 5 प्रतिशत CO2 इनक्यूबेटर में 37 ओसी पर इनक्यूबेट किया गया। इसके बाद, टी-प्रति के 400 L जोड़े गए, कोशिकाओं को स्क्रैप किया गया, और 20 मिनट (4 ओसी) के लिए 125, 000 xg पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था और आगे के विश्लेषण के लिए -80 OC (-80 OC फ्रीजर, नुएरे, प्लायमाउथ, एमएन, यूएसए) में संग्रहीत किया गया था। प्रोटीन की मात्रा का ठहराव के लिए बाइसीनोनिक एसिड (बीसीए) किट का इस्तेमाल किया गया था। फिर, मानक सेल समाधान के 10 L और BCA अभिकर्मक के 200 RL को 8-अच्छी तरह से प्लेटों में जोड़ा गया और 37 O Cin पर 30 मिनट के लिए 5 प्रतिशत CO2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट किया गया। अवशोषण 562 एनएम मापा गया था। प्रोटीन पहचान विश्लेषण सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) -पॉलीक्रिलामाइड जेल (एसडीएस-पेज) वैद्युतकणसंचलन द्वारा किया गया था। प्रोटीन लोडिंग बफर में प्रोटीन लाइसेट जोड़कर नमूने तैयार किए गए और विशिष्ट प्रोटीन का पता लगाने के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण किया गया।

2.2.2. विवो विश्लेषण में

पशु मॉडल डिजाइन: साठ {0}}सप्ताह के नर स्प्राग-डावले (एसडी) चूहों को राष्ट्रीय प्रयोगशाला पशु केंद्र (ताइपेई, ताइवान) से खरीदा गया था। प्रत्येक चूहे को व्यक्तिगत रूप से निस्संक्रामक स्टेनलेस स्टील के पिंजरों में नियंत्रित तापमान (23 डिग्री 1 डिग्री) और आर्द्रता ({5}} प्रतिशत) के तहत 12 घंटे प्रकाश / 12 घंटे के अंधेरे चक्र के साथ रखा गया था। इबिटम में भोजन और पानी मुहैया कराया गया। प्रत्येक चूहे को पहले सप्ताह में पालतू बनाया गया और मुख्य आहार के रूप में प्रयोगशाला कृंतक आहार 5001 दिया गया। सभी प्रक्रियाओं ने राष्ट्रीय ताइवान महासागर विश्वविद्यालय, ताइवान की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी अनुमोदन संख्या 101026) के मानक का पालन किया। पालतू बनाने के बाद, चूहों को दो समूहों में विभाजित किया गया: नियंत्रण समूह (कॉन) जिसे प्रयोगशाला आहार 5001 के साथ खिलाया गया था, और मधुमेह समूह जिसे पूरे प्रयोग के लिए उच्च वसा वाले आहार (एचएफडी, 40 प्रतिशत) से खिलाया गया था। 4 सप्ताह के लिए एचएफडी के साथ खिलाए जाने के बाद, मधुमेह समूह के चूहों को मधुमेह मेलेटस (डीएम) को प्रेरित करने के लिए स्ट्रेप्टोजोटोकिन (65 मिलीग्राम / किग्रा) (एसटीजेड) का इंजेक्शन लगाया गया था। एसटीजेड इंजेक्शन लगाने के 15 मिनट के भीतर, निकोटीनामाइड (230 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन) को इंजेक्ट किया गया। इंजेक्शन के एक हफ्ते बाद, डायबिटिक मेलिटस (डीएम) के सफल इंडक्शन को निर्धारित करने के लिए एक मौखिक ग्लूकोज टॉलरेंस टेस्ट (ओजीटीटी) आयोजित किया गया था। उसके बाद, जानवरों को छह समूहों में विभाजित किया गया: नियंत्रण (प्रयोगशाला आहार 5001 के साथ खिलाया गया); डीएम समूह (डीएम प्लस 45 प्रतिशत एचएफडी); डीएमआर समूह (डीएम प्लस रोसिग्लिटाज़ोन: 0.571 मिलीग्राम/किलोग्राम बीडब्ल्यू) प्लस 45 प्रतिशत एचएफडी; DME1 समूह (DM प्लस CTE: 80 mg/kg BW) प्लस 45 प्रतिशत HFD; DME2 समूह (DM प्लस CTE: 160 mg/kg BW) प्लस 45 प्रतिशत HFD; और DME4 ग्रुप (DM plus CTE: 320 mg/kg BW) प्लस 45 प्रतिशत HFD। Rosiglitazone (RSG) को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में लिया गया था। ताइवान खाद्य एवं औषधि प्रशासन (टीएफडीए) स्वास्थ्य खाद्य कार्यात्मक मूल्यांकन दिशानिर्देशों की सिफारिश के अनुसार सीटीई (80, 160, और 320 मिलीग्राम / किग्रा) की तीन खुराक का उपयोग किया गया था। प्रयोग के अंत तक उपचार दिया गया। सभी प्रायोगिक चूहों की 6 सप्ताह के बाद बलि दी गई। चूहों से रक्त एकत्र किया गया था, जिसे 3000 आरपीएम पर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था।

मियां सिस्टैंच ट्यूबुलोसा के असरदार तत्व

निम्नलिखित विश्लेषण के लिए सतह पर तैरनेवाला की जांच की गई:

कुल ग्लूकोज, ट्राइग्लिसराइड और कोलेस्ट्रॉल का निर्धारण: ग्लूकोज का निर्धारण ग्लूकोज एंजाइमी किट द्वारा किया गया था। फिर, रक्त प्लाज्मा के 20 नमूनों को अभिकर्मकों में जोड़ा गया और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री पर रखा गया। ट्राइग्लिसराइड्स और कोलेस्ट्रॉल एंजाइमेटिक किट का उपयोग करके कुल ट्राइग्लिसराइड्स और कुल कोलेस्ट्रॉल एकाग्रता का निर्धारण किया गया था। फिर, 10 ^ एल रक्त प्लाज्मा को अभिकर्मकों में जोड़ा गया और प्रयोग निर्माता के निर्देश के अनुसार किया गया। अवशोषण 510 एनएम मापा गया था।

प्लाज्मा कुल ग्लूकोज/ट्राइग्लिसराइड/कोलेस्ट्रॉल (मिलीग्राम/डीएल)=(-ABlank)/(Astandard - ABlank) x 200.

एक नमूना: रक्त के नमूनों का अवशोषण, एब्लैंक: एक नमूने के बिना किट का अवशोषण मूल्य, एक मानक: मानक अभिकर्मक का अवशोषण मूल्य, 200: 200 मिलीग्राम / डीएल की एकाग्रता पर मानक अभिकर्मक।

इंसुलिन, लेप्टिन, और होमोस्टैटिक मॉडल आकलन-इंसुलिन प्रतिरोध (HOMA-IR) निर्धारण: इंसुलिन का स्तर इंसुलिन एलिसा किट द्वारा निर्धारित किया गया था। यहां, 25 रक्त प्लाज्मा को अभिकर्मकों में जोड़ा गया और अवशोषण को 450 एनएम पर मापा गया। लेप्टिन एंजाइम इम्यूनोमेट्रिक परख किट का उपयोग करके कुल लेप्टिन सामग्री निर्धारित की गई थी। फिर, 100 प्लाज्मा का विश्लेषण किया गया और एलिसा रीडर का उपयोग करके अवशोषण को 450 एनएम पर मापा गया। पूरा प्रयोग निर्माता के निर्देश के अनुसार किया गया था। HOMA-IR मान होमोस्टैसिस मॉडल मूल्यांकन समीकरण=फास्टिंग प्लाज्मा इंसुलिन सांद्रता (mU/mL) x फास्टिंग प्लाज्मा ग्लूकोज सांद्रता (mmol/L)/22.5 से निर्धारित किया गया था।

प्लाज्मा लिपिड पेरोक्सीडेशन: यहां, {0}.5 एमएल रक्त प्लाज्मा को 1 एमएल अभिकर्मक (15 प्रतिशत, डब्ल्यू/वी ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड 0.25 एन हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) के साथ मिलाया गया था। ) और 0.375 प्रतिशत, w/v थायोबार्बिट्यूरिक एसिड 0.25 N HCl में) और 15 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान (वाटर बाथ, BUCHI461, ज्यूरिख, स्विट्जरलैंड) में रखा गया। ठंडा करने के बाद, 1 एमएल एन-ब्यूटेनॉल मिलाया गया, सख्ती से हिलाया गया, और 10 मिनट के लिए 1500 xg पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था और अवशोषण को 532 एनएम [12] पर मापा गया था।

Malondialdehyde (MDA) सांद्रता (nM/mL)=[(ASample at532 nm - Ablank at532 nm)/ (532 nm पर मानक - 532 nm पर खाली)] x 5.

प्लाज्मा टेस्टोस्टेरोन और ल्यूटिनाइजिंग हार्मोन (LH) स्तरों का निर्धारण: टेस्टोस्टेरोन एलिसा किट का उपयोग रक्त प्लाज्मा में टेस्टोस्टेरोन के स्तर को मापने के लिए किया गया था। LH सांद्रता निर्धारित करने के लिए RIA किट का उपयोग किया गया था। फिर, 50 L प्लाज्मा जोड़ा गया और गणना हार्मोन LH-RP -3 (मानक) की एकाग्रता पर आधारित थी। निर्माता के निर्देशों के अनुसार आगे के कदम उठाए गए।

ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर (TNF)-ए और इंटरल्यूकिन का निर्धारण-6 (IL-6) एकाग्रता: कैप्चर किए गए एंटीबॉडी को कोटिंग बफर में 250 बार पतला किया गया, एक {{4} में जोड़ा गया }वेल प्लेट (100 L/well), और रात भर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा । सतह पर तैरनेवाला महाप्राण था और वाशिंग बफर (1 बार पीबीएस, 0.05 प्रतिशत ट्वीन 20) के साथ पांच बार धोया गया था। परख मंदक के 200 ^ ग्राम के साथ ऊष्मायन (1 एच) के बाद, कोशिकाओं को 5 बार धोने वाले बफर से धोया गया और टीएनएफ के 100 ^ एल-एक मानक समाधान या परीक्षण के नमूने प्रत्येक कुएं में जोड़े गए और 2 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया। धोने के बाद, आईएल -6 के 100 आरएल पाए गए एंटीबॉडी को जोड़ा गया और 1 हैट कमरे के तापमान के लिए ऊष्मायन किया गया। सतह पर तैरनेवाला महाप्राण था और 5 बार धोया गया था। फिर, एंजाइम एविडिन-हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) के 480 आरएल को जोड़ा गया और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया। सतह पर तैरनेवाला महाप्राण था और वाशिंग बफर के साथ पांच बार धोया। फिर, सब्सट्रेट समाधान के 100 आरएल जोड़े गए और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया। बाद में, प्रत्येक कुएं में 50 RL स्टॉप सॉल्यूशन (1M फॉस्फोरिक एसिड) मिलाया गया और अवशोषण को 450 एनएम पर मापा गया।

सिस्टैंच इचिनाकोसाइड का लाभ: एंटी-ऑक्सीडेशन

शुक्राणु और वृषण पैरामीटर्स का विश्लेषण

शुक्राणु नमूना संग्रह: शुक्राणु नमूना संग्रह पहले [13] में बताई गई विधि के अनुसार किया गया था। शुक्राणु सतह पर तैरनेवाला से एकत्र किए गए और आगे के विश्लेषण के लिए उपयोग किए गए।

शुक्राणु की संख्या, शुक्राणु की गतिशीलता और असामान्य शुक्राणु: शुक्राणु की संख्या की गणना हेमोसाइटोमीटर और ट्रिपैन ब्लू सॉल्यूशन का उपयोग करके की गई थी। फिर, 100 आरएल शुक्राणु तरल को ट्रिपैन ब्लू घोल के साथ मिलाया गया, और एक हेमोसाइटोमीटर और माइक्रोस्कोप [14] का उपयोग करके शुक्राणु, गतिशीलता और असामान्य शुक्राणु की संख्या की गणना की गई।

नाइट्रो ब्लू टेट्राजोलियम एनबीटी कमी और शुक्राणु और वृषण का लिपिड पेरोक्सीडेशन: प्लाज्मा विश्लेषण की एक ही प्रक्रिया के अनुसार लिपिड पेरोक्सीडेशन और एनबीटी कमी का विश्लेषण किया गया था।

सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज (एसओडी) और कैटेलेज गतिविधि का निर्धारण: सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज (एसओडी) गतिविधि का विश्लेषण रैनसेल किट का उपयोग करके किया गया था। यहां, {0}}। 0 वृषण समरूपों के 5 एमएल को 1.7 एमएल प्रतिक्रिया समाधान (0.05 मिमी xanthine, 0.025 मिमी 2-({) में जोड़ा गया था। {9}}आयोडोफिनाइल)- 3-(4-नाइट्रोफेनॉल)-5-फेनिलटेट्राजोलियम क्लोराइड (INT))। मिश्रण के बाद, 0.25 मिलीलीटर xanthine ऑक्सीडेज (80 यू / एल) जोड़ा गया और कमरे के तापमान पर कमरे के तापमान पर 30 एस के लिए प्रतिक्रिया की गई। अवशोषण 505 एनएम मापा गया था। टेस्टिकुलर होमोजेनेट की प्रोटीन सांद्रता बायो-रेड डीसी प्रोटीन परख किट द्वारा निर्धारित की गई थी और इसकी विशिष्ट गतिविधि (यू/मिलीग्राम प्रोटीन) की गणना की गई थी। उत्प्रेरित (कैट) गतिविधि पहले बताई गई विधि [15] के अनुसार निर्धारित की गई थी।

एच एंड ई (हेमेटोक्सिलिन और ईओसिन) धुंधला हो जाना

वृषण को 10 प्रतिशत फॉर्मेलिन में 24 घंटे के लिए भिगोया गया और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया। ऊतकों को सूक्ष्म आकार में काट दिया और स्लाइड से जोड़ा। निर्धारण के बाद (95 प्रतिशत मेथनॉल प्लस 5 प्रतिशत एसिटिक एसिड), स्लाइड्स को 3 मिनट के लिए हेमटॉक्सिलिन में डुबोया गया, 5 मिनट के लिए बहते पानी से धोया गया, और फिर उन्हें 50 प्रतिशत, 70 प्रतिशत और 90 प्रतिशत अल्कोहल के साथ एक मिनट के लिए भिगो दिया गया। उसके बाद, स्लाइड्स को 10 एस के लिए ईओसिन के साथ दाग दिया गया और 100 प्रतिशत अल्कोहल में एक मिनट के लिए भिगो दिया गया जब तक कि यह फीका न हो जाए। अंत में, स्लाइड को एक मिनट के लिए जाइलीन में भिगोया गया। बाद में, स्लाइड को हवा में सुखाया गया और सील कर दिया गया। सना हुआ ट्यूब आकृति विज्ञान का निरीक्षण करने के लिए एक उल्टे चरण-विपरीत माइक्रोस्कोप (उल्टे चरण अंतर माइक्रोस्कोप, ओलिंप सीके -2, टोक्यो, जापान) में रखा गया था।

हाइपोथैलेमस का विश्लेषण

माउस KISS1, G-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (GPR) 54, साइटोकाइन सिग्नलिंग 3 (SOCS -3) का शमनकर्ता, और Sirtuin 1 (SIRT1) जीन अनुक्रम NCBI (नेशनल सेंटर फॉर बायोटेक्नोलॉजी इंफॉर्मेशन) जीन डेटाबेस से पहचाने गए थे। और एक विशिष्ट प्राइमर को प्राइमर 5 का उपयोग करके डिजाइन किया गया था। 0 प्रीमियर बायोसॉफ्ट, पालो ऑल्टो, सीए, यूएसए।)। प्रयोग में प्रयुक्त प्राइमरों को तालिका 1 में सूचीबद्ध किया गया है।

हाइपोथैलेमस से राइबोन्यूक्लिक एसिड (आरएनए) का निष्कर्षण। मस्तिष्क के हाइपोथैलेमस से आरएनए का निष्कर्षण RNeasy Lipid Tissue Mini Kit का उपयोग करके किया गया था। प्राप्त mRNAs को मात्रात्मक रूप से रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (RT) और पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (PCR) द्वारा मापा गया था। आरटी विश्लेषण से प्राप्त पूरक डीएनए को बाद में उपयोग के लिए -20 डिग्री पर संग्रहीत किया गया था। निकाले गए डीएनए को टैक पोलीमरेज़ का उपयोग करके पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) विश्लेषण के अधीन किया गया था। फिर, पीसीआर उत्पाद के 5 ~ 10 ^ एल को 1.5 प्रतिशत अगर कोलाइड पर वैद्युतकणसंचलन द्वारा लिया और विश्लेषण किया गया। छवि यूवीपी बायोडॉक-इट इमेजिंग सिस्टम में ली गई थी। रिवर्स-ट्रांसकोडेड पूरक डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड (सीडीएनए) लिया गया और आईक्यू एसवाईबीआर ग्रीन सुपरमिक्स किट का उपयोग करके पीसीआर का प्रदर्शन किया गया। बाद में इसका विश्लेषण आईक्यूटीएम 5 ऑप्टिकल सिस्टम सॉफ्टवेयर से किया गया। प्रोटीन निष्कर्षण अभिकर्मक (T-PER) का उपयोग करके प्रोटीन निकाले गए। फिर, 20 मिलीग्राम टेस्टिकुलर होमोजेनेट को 400 ^ एल टी-पर और सेंट्रीफ्यूज (हाई स्पीड सेंट्रीफ्यूज, हेटिच सीआर -12, टटलिंगन, जर्मनी) में 4 डिग्री (125, 000 xg) पर जोड़ा गया। बीस मिनट। निम्नलिखित विधि इन विट्रो विश्लेषण में "प्रोटीन की पहचान और मात्रा का विश्लेषण" के समान थी।

2.3.सांख्यिकीय विश्लेषण

प्रायोगिक परिणामों को माध्य मानक विचलन (माध्य एसडी) के रूप में व्यक्त किया गया था और डेटा का विश्लेषण सांख्यिकीय उत्पाद और सेवा समाधान (SPSS) 11. 0 सॉफ्टवेयर, IBM, Armonk, न्यूयॉर्क, NY, USA का उपयोग करके किया गया था। समूहों के बीच अंतर का विश्लेषण विचरण (ANOVA) के एकतरफा विश्लेषण द्वारा किया गया था। डंकन के परीक्षण द्वारा विभिन्न समूहों की कई तुलनाओं का विश्लेषण महत्वपूर्ण स्तर के रूप में p <0.05 के="" मान="" पर="" किया="">

अगला भाग जारी रहेगा